JPH05503016A - ヘルペスウイルスの効果を変調するオリゴヌクレオチド治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘルペスウィルスの効果を変調するオリゴヌクレオチド治療法発明の分野 本発明はヘルペスウィルス感染に関する治療法および診断に関する。より詳細に は、本発明はＲＮＡの活性変調を引き越し、ゆえにウィルス自体の効果を変調す ると発見されたヘルペスウィルスＲＮＡの特定部分と相互反応するアンチセンス オリゴヌクレオチドに関する。本出願は１９９０年２月２６日に出願された米国 特許出願番号第４８５，２９７の一部継続出願である。

発明の背景 毎年新たに約５００，０００もの生殖器ウィルスの症例が報告され、３０．Ｏｏ ｏ、Ｏｏｏ人の米国人がこの現在不治の疾患にかかっている。同様に年ごとに５ ００．０００もの新たなヘルペス単純口内炎の罹病率があり、少なくとも１０ｏ 、ｏｏｏ、Ｏｏｏ人の米国人が再発性のヘルペス唇音に罹患していると推定され る。血清陽性患者の一般人口中の流行は全体で約７０〜８０％である。しかし不 治のヘルペス単純ウィルス感染はすべてのヘルペス感染の中でもっとも流行して おり、ヘルペス単純脳炎、角結膜炎、庖疹性ひょうそ、ならびに新生児および免 疫無防備状態にある宿主の散在性ヘルペス感染のような疾患に関する、より特別 な形の治療の開発が必要とされる。

脳炎の発病は低いが（１年に２５０，０００患者のうち１例）、シかし現存する 治療で、死亡率は高くても４０％であり、約５０％の生存者には重度の神経的後 遺症が残る。目の感染は希かまたはささいである。それらは主にＨ８Ｖ−１に引 き起こされ、および世界中の各国で失明を引き起している。庖疹性ひょうそは看 護婦、歯医者および外科医の職業病（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ　ｈａｚａｒｄ ）であり、指の遠位部の紅斑および圧痛に始まり、引き続き小庖の癒着と拡大が おこる。流れるリンパ液に伴うリンパ管炎およびリンパ節症は共通の特徴である 。新生児Ｈ３Ｖ感染は、通常感染した産道を通って生まれた子供に結果として生 じる。この罹病率は１０．０００の出生に対して約１である。限定感染による乳 児の死亡は高（でも２０％になるが、一方散在住感染からの新生児の死亡率は、 現在の治療でも７５％に違し、残る多くの生存者が重症な神経障害を有する。

現在、ヌクレオシド類似体はＨ５Ｖ感染に対する明らかに好ましい治療剤である 。多くのピリミジンデオキシリボヌクレオシド化合物は、ウィルスがコードする （ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ）チミジン（ｄＣｙｄ）キナーゼ酵素に対する特 異的親和性を有する。

これらの化合物の活性の特異性はこれらの化合物のウィルス−感染細胞に対する リン酸化および抗ウィルス活性を制限する。この種の多くの薬剤から、例えば５ −イオドーｄＵｒｄ（ＩＤ［Ｉ）、５−トリフルオロメチル−ｄＵｒｄ（ＦＭＡ Ｕ）、５−エチル−ｄＵｒｄ（ＥＤＵ）、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）− ｄＵｒＤ（ＢＶＤＵ）、５−イオドーｄＣｙｄ（ＩＤＣ）、および５−トリフル オロメチル−ｄＵｒｄ（ＴＰＴ）は、臨床的使用または近く臨床的使用ができる ことになるであろう。ＩＤＵはａＳＶ口内炎および目の間質角膜炎（ｏｃｕｌａ ｒ　５ｔｒｏｉａｌ　ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）に適用した時、緩やかに効果的な局 部的抗ウィルス剤であるが、ａＳＶ脳炎についての制御された臨床研究において のその使用は、ＩＤＵに伴う高い毒性が発見された。

しかし５−アラビノフラノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ）の抗ウイルス特異性は当 初有望であったが、その臨床的歴史はＩＤＵに匹敵する。ウィルスチミジンキナ ーゼを合成する能力を欠＜　Ｈ３Ｖ種の臨床的外観は、この種の化合物の将来の 効力に関してさらに感心事を生み出した。

多くのウィルス標的の利用性は、抗−Ｈ５ｖ化合物の開発に限定されてきた。チ オセミカルバゾン化合物の研究は、ウィルスリボヌクレオチド還元酵素の阻害が １ｎｖｉｔｒｏでのＨ３Ｖの複製を阻害する有効な手段であることを示した。さ らにウィルスＤＮＡ複製を妨害する多くのプリンヌクレオシドは、ヒトＨＳｖ感 染の治療に許可された。９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン（Ａｒａ −Ａ）は、Ｈ３Ｖ−１角膜炎、Ｈ８Ｖ−１脳炎および新生児ヘルペス感染の治療 に使用されてきた。臨床的効力の報告は矛盾し、ならびに実際的使用の主な不利 はＡｒａ−Ａが水に極めて溶解し難いことである。９−（２−ヒドロキシエトキ シメチル）グアニン（アシクロバー；　Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ、ＡＣＶ）が主な注 目の的である。ヒトでは、ＡＣＶは限局性および散在性Ｈ８ｖ感染の治療に好結 果で使用された。しかし、薬剤耐性ウィルス変異体の存在、およびＡＣＶで治療 したＨ３Ｖ−に２重盲検での陰性結果の両方が存在することが判明した。ＡＣＶ はＡｒａ−＾のように水に解は難＜　（０，２％）、この物理的特徴がＡＣＶの 応用形態を制限する。広汎な臨床的状況においてプリンヌクレオシド類似体の実 際的応用は、その固有の効果的異化作用を被り、これは薬剤の生物的活性の低下 だけでなく、毒性異化物の形成を生じるであろう。

現在使用または臨床試験されているすべての効果的な抗−Ｈ３Ｖ化合物はヌクレ オチド類似体である。これらの化合物の効力は、それらに固有の水溶性液への溶 解性の低さから減じられ、急速な細胞内異化作用および高度な細胞毒性である。

任意の与えられたヌクレオシド類似体を長期にわたって使用するさらなる注意点 は、臨床的試験で投与されたヌクレオシド化合物による阻害に抵抗性の新たなＨ ８Ｖの臨床的単離物の検出である。抗ウイルスオリゴヌクレオチドは、従来のヌ クレオシド類似体より良好な化合物の溶解可能性、低い細胞毒性および標的遺伝 子中でヌクレオチドポイント変異への低い感受性を提供する。

ヘルペスウィルス感染の診断および治療に対する新しい経路が非常に望まれてい ることは明らかである。−回で高度に効果的で、副作用がないかわずかに有する 治療の組成物および方法が好ましく所望される。このように、本発明によるヘル ペスウィルス感染についてのアンチセンスオリゴヌクレオチド治療の対策は、か かる治療に関して長い間感じられた必要性を満たすものである。

本発明の目的 本発明の主目的は、ヘルペスウィルスおよび関連する感染についての治療法を提 供することである。

さらに本発明の目的は、ヘルペスウィルスおよび関連ウィルスのＲＮＡの機能を 阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する事である。

さらに本発明の目的はヘルペスウィルス感染の診断手段を確立することである。

本発明のこれらのおよび他の目的はこの明細書の全体から明らかとなろう。

本発明の要約 本発明によれば、ヘルペス単純ウィルス１型のオーブンリーディングフレイムで ある限、　ＵＬ８．　ＵＬ９．　ＵＬ１３．　ＵＬ２９．　Ｕ′Ｌ３０．　ｔｒ Ｌ３９．几４０．園２および限２のひとつに対応する遺伝子由来のＲＮＡまたは ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ チド類似体が提供される。オリゴヌクレオチドはかかるハイブリダイゼーション を行うために十分な同一性および数のヌクレオチド単位から成る。翻訳開始部位 に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類 似体であって、そのオリゴヌクレオチドはＣＡＴＥ列から成ることが好ましい。

好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は ＤＮＡに特異的にハイブリダイズできるよう設計され、より好ましくは、ヘルペ ス単純ウィルス１型（ＨＳＶ−１）、ヘルペス単純ウィルス２型（ＨＳＶ−２） 、サイトメガウィルス、ヒトヘルペスウィルス６、ニブスティンバーウィルス（ Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）または水痘帯状庖疹腫ウィルス（ＶＺ Ｖ）のうちのひとつからのＲＮＡである。

好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は 、オリゴヌクレオチド単位のヌクレオチド単位間の少なくともい（つかの結合基 がホスホチオエート部分のようなイオウ含有種から成るように形成される。

発明の他の観点は、ヘルペスウィルス感染を有すると疑われる動物、特にヒトの 診断および治療法に関する。このような方法は、かかる感染の増殖または効果を 阻害するために、またはそれらの診断を行うために動物または動物体液を本発明 のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させることから成 る。おそらく当業者は、ヘルペス単純ウィルス１型に関して描かれた特定のオー ブンリーディングフレイムが他の名前のウィルス中に対を見いだすと認識するで あろう。これゆえに、ヘルペス単純ウィルス２型、サイトメガウィルス、ヒトヘ ルペスウィルス６型、ニブスティンバーウィルスおよび水痘帯状庖疹腫ウィルス は、同様な感染を有するたんぼ（質をコードする類似の多（のオーブンリーディ ングフレイムを有すると思われる。従って、本発明はオリゴヌクレオチド治療に 関し、ここでオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は前述の任意 のウィルス、または今後知られるであろうまさに任意の同様なウィルスに関し、 それは１つ以上のかかる類似のオーブンリーディングフレイムを有する。本発明 に関し、便宜的にこのようなウィルスをヘルペスウィルスと呼ぶ。

図面の簡単な説明 図１は、　ＭｃＧｅｏｃｈ、　Ｄ、　Ｊ、ら；Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　 、　６９．１５３１−１５７４（１９８８）の情報によるヘ■ ペス単純ウィルス１型の遺伝子配置を図示する。

図２Ａはヘルペス単純ウィルス１型中ノＵＬ３９（１４０，００（１）およびＵ Ｌ４０（４０，０００）ノオーブンリーディングフレイム（ＯＲＦｓ）を含有す る特定の０ＲＦｓである。

図２Ｂは、　ＨＳＶ−１，１７株のＵＬ１３遺伝子を含有する５つの３°−共通 終始転写を表す。

図３　ハ１ｌｓＶ−１，１７株オヨヒ１ｌｓＶ−２，ｌｌＧ５２　ｄＮＡ種の１ １３翻訳オープンリーデイングフレイム（ＯＲＦｓ）の比較を図示する。

図４ハＨ３Ｖ−１ノ２３８ヲ目立りｆり翻訳開始コドンを持ッＨｓＶ−１，１７ 株および１１ＳＶ−２゜３３３株のＵＬ３９遺伝子ＤＮＡの配列比較である。

図５１：１Ｈ５Ｖ−１ノ１３８を目立タセタ翻訳開始コドンを持ッＨ３Ｖ−１． ＫＯＳ株オ、Ｊ、ヒＨＳＶ−２゜３３３株のＵＬ３９遺伝子ＤＮＡの配列比較で ある。

図６は、公表されたＤＮＡ配列情報から予想されるＨＳＶ−１，ＶＺＶおよびＥ ＢＶ間の相同的０ＲＦｓの図表化である。

図７は感染後の種々の時間における平均疾患点数を表すグラフを示す。マウスを ｌＸ１０’ｐｆｕのＨＳＶ−１ＫＯ８で感染させ、ならびに処置は感染後（ｐｉ ）４時間で開始した。

おのおのの情報点は、示された日の群中のすべてのマウスの平均疾患点数を表す 。

図８は疾患点数についての薬剤投与の効果を表すグラフを示す。平均疾患点数は 感染後１１．１３および１５日のｌ５ＩＳ　１０８２投与に対してプロットされ る。

図９は感染後の種々の平均疾患点数を表すグラフを示す。マウスを１ｘｌＯ５ｐ ｆｕのＨＳＶ−Ｉ　ＮＯ３で感染させ、ならびにｒｓＩｓ　１０８２での処置は 感染後（ｐＤ４時間で開始した。おのおのの情報点は、与えられたヨの群中のす べてのマウスの平均疾患点数を表す。

図１０はＨ３Ｖ感染生産量について種々のｌ５ＩＳオリゴヌクレオチドの効果を 表すグラフである。ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）およびＨＳＶ−２（ＢＧ５２）を使用 した。これらの実験でのＨＳｖ（７）対照生産量１ｔｌｌＳＶ−１ｉ：−ツイテ ハ（−れぞれ、８．１Ｘ１０’ｐｆｕ／ｍｌ、ＨＳＶ−２ｉ：：ツいテハ８．２ Ｘ１０’ｐｆｕ／ａｌｔ’あツタ。

図１１はＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳について種々のオリゴヌクレオチドの効 果を示すグラフである。左のゲルの番号は、レーン１に示されるマーカーたんば く賞の相対分子量を示す。太い矢印はＨＳＶ　ＲＮＡ５から合成された主要ポリ ペプチド産物を指す。細い矢印は、阻害剤の存在でＨＳＶ　ＲＮＡ５から合成さ れたポリペプチド産物を指す。翻訳阻害に関し、オリゴヌクレオチド・Ｉ？Ｎ＾ のモル比は５０：１であった。（Ａ、）オリゴヌクレオチド阻害効果の特異性。

レーン２−１０は、以下のものを使用した赤面ＩＲＮ＾（０，１１２ｐｍｏｌｅ ｓ）　；レーン７−１Ｏ１５ＬＯＲＮＡ（０，１４５ｐｍｏｌｅｓ）。レーン４ および８、ｌ５ＩＳ　１０４９：　レ−ン５オヨヒ９．　ｌ５ＩＳ　１０８２； 　Ｉｉ　−ン６オよび１０、ｌ５ＩＳ　１２３８゜（Ｂ、）阻害活性のスペクト ル。レーン２−８は、以下のものを使用した赤血球溶解物からの１ｎｖｉ　ｔｒ ｏ＠ＩＲ’ｉ度物を含むレーン２、ＲＮＡなし：レーン３−５、ｐＩＰ−２ＲＮ Ａ（０，１０８ｐｍｏ１０８ｐ；レーン６−８、ｐＩＰ−Ｉ　ＲＮＡ（０，１１ ２ｐｍｏｌｅｓ）。レーン４および７、ｌ５ＩＳ　１０４９：レーン５および８ ．　ｌ５ＩＳ　１０８２゜ 図１２は、種々の濃度のｌ５ＩＳオリゴヌクレオチドまたはアシクロバー（Ａｃ ｙｃｌ。

ｖｉｒ）での処置によりＨＳＶ−２複製の阻害を表す投与−反応曲線を表す。Ｈ ＳＶ−２（ＢＧ−５２株）はこれらの感染に使用された。へ〇ｖ−処置の対照感 染に関し、ウェルはＩｇｊｌ濃度のＡＣＶで処置をした細胞内に存在するＤＩＩ ＳＯの水準に合うように調整された。

図１３ハＢＳＶ−１（ＫＯＳ株）ノｌ５Ｉ３１０ｇ２、ＡＣＶまたはｌ５ＩＳ　 １２３８処置による投与−依存阻害を説明する。誤差棒（Ｅｒｒｏｒ　ｂａｒ） は各々の化合物濃度についての平均値の標準偏差（ｐ＞、０５）を表す。

図１４ハ１ｌｌＳＶ−１（琳）（７）ＩＳＩＳ　１０８２、ＡＣＶまたハ１ｓＩ ｓ　１２：（８処置による投与−依存阻害を説明する。誤差欅（Ｅｒｒｏｒ　ｂ ａｒ）は各々の化合物濃度についての平均値の標準偏差（ｐ＞、０５）を表す。

図１５はＨＳＶ−１のアシクロバーまたはｌ５Ｉ３１０ｇ２処置による投与依存 性阻害を表す。０Ｍ２．１（図１５Ｂ）およびＰＡＡｒ’　（ＰＡＡｒ５）　（ 図１５Ａ）を使用した。対照ウェルはＤＭＳＯを含有しなかった。

発明の詳細な説明 ヘルペス単純ウィルスはヒトヘルペスウィルスの中で最も研究されている。ウィ ルスにはふたつの同様な、しかし区別できる血清型（ＨＳｖ−１およびＨＳＶ− ２）が存在し：各々のサブタイプについて多くの株が知られている。しかし同じ ＨＳＶ株の宿主範囲は特定の功」１四組織に限られ、すべてのｉｎ　ｖｉｔｒｏ 宿主範囲はほとんどのヒト組織型（原発性および形質転換細胞の両方）を多くの 非−ヒト細胞と同様に含む。

ウィルスの複製サイクルは早く、感染性後代検定を作るためにＨＳＶ−１で約２ ４時間、およびｌｌ５Ｖ−２で４８時間を要す。迅速な複製および広範なＦｉｓ ｖ宿主範囲は、ウィルス遺伝子構造および感染中のウィルス遺伝子発現制御の徹 底的な分子分析をもたらした。ＨＳＶの生産的感染は、ウィルスの宿生細胞膜へ の吸着、ウィルスエンベロツブと細胞性膜の融合、非−エンベロツブピリオンの 細胞核への浸透、ウィルス核酸の脱外被、ウィルス遺伝子の発現およびウィルス ゲノムの複製、新たに形成されたウィルスカプシド中へのゲノムの核酸パッケー ジング、そして最後に細胞から成熟ピリオンの流出、の多くの各分化段階から成 る。ウィルス的にコードされた、ウィルス複製のこれらの各々の段階を、部分的 に制御するタンパク質が同定された。［ＩＳＶ〜１ゲノムのＤＮＡ配列は、公表 され、少なくとも７１の独自のウィルスタンパク質が生産的感染の間にウィルス によってコードされるという以前の予想を支持する。ＩｃＧｅｏｃｈ、　Ｄ、　 Ｊ、　、　ＤｏＬａｎ、　Ａ、　、　Ｄｏｎａｌｄ、　Ｓ、　、およびＢｒａｕ ｅｒ、　Ｄ、　Ｈ，Ｌ@；Ｎｕｃｌｅｆｃ Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ、　１４：　１７２７−１７４５（１９８Ｂ＞　：ＭｃＧｅｏ ｃｈ、　Ｄ、　Ｊ、　、　Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ、　Ｍ、Ａ、A　Ｄａｖｉｓｏｎ 、　Ａ、　Ｊ、　、　Ｄｏｌａｎ、　Ａ、　、Ｆｒａｍｅ、　Ｍ、　Ｃ，、Ｍｃ Ｎａｂ、　Ｄ、　、　Ｐｅｒｒｙル、　Ｉ、　、　５ｃｏｔｔ、　Ｊ、　Ｅ、　 、お謔■sａｙｌｏｒ、Ｐ、　；Ｊ、Ｇ ■Ｓｖ遺伝子の構造はきわめて単純である。各々の■ＩｉＮ＾の転写は、その遺 伝子についてのｄＮＡキャブ部位の５′のすぐ近くに位置するプロモーター領域 で制御される。ｄＮＡのスプライシングはまれで、転写の極めて初期に第一に制 限される。独自のｄＮＡ種は、ウィルスにコードされる各々の推定上のタンパク 質産物について存在し、ならびに多くのｄＮＡｓ中にマルチプルオープンリーデ ィングフレイムが存在しても、各々のウィルスｍＲＮＡはモノジストロニック（ ■ｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）種のごとく活動すると考えられる。ウィルス遺伝 子発現の制御は、３つの一般的段階、極めて初期、初期および後期、に分けられ る、最大限の効果が得られるように最終的に編成されたカスケードである。極め て初期の転写は、シクロヘキシイミドのような転写阻害剤が存在しても、ウィル ス複製の着手で合成される。これゆえに、この種の転写は細胞性タンパク質およ び／または感染ピリオンによる細胞内に持ち込まれたタンパク質の存在で制御さ れる。極めて初期のタンパク質は細胞およびウィルス遺伝子発現において、正お よび負の双方の様式で影響するとして知られ、ならびにこれらのタンパク質は他 のＨＳＶ遺伝子、特に初期遺伝子の転写活性に関して重要である。初期遺伝子転 写物はウィルスゲノムの複製に必要な多くのウィルス産物をコードする。後期遺 伝子転写物の合成は極めて初期のタンパク質および鋳型生産量の両方で制御され るので、後期遺伝子はウィルスＤＮＡ合成の後にのみ最大限に転写される。後期 遺伝子にコードされるタンパク質には、エンベロツブ、糖タンパク質、カプシド タンパク質およびウィルス構造を維持するために必要、または新たに形成された どりオンが細胞から流出することを可能とする他のタンパク質がある。

ＤＮＡ配列分析は、ＨＳＶ−１ゲノム内にコードされる７１タンパク質のこれま での推定を予言する。図１はＨＳＶ−１遺伝子の命名および独自の長（［ＪＬ） および短（ＵＳ）領域のゲノム配置を説明する。多くのウィルス遺伝子産物は、 ｉｎ　ｖｉｔｒｏウィルス複製に必須であると示されて来たが、唯一ウィルスチ ミジンキナーゼ機能が、宿主中のウィルスの成長に関して必須であると知られて いる。理論的には、これは標的一対象抗ウイルス化学療法に制し易い７０遺伝子 標的を残す。ウィルス複製中、ウィルスｄＮＡは最も多様で汎用性のある、アン チセンスオリゴヌクレオチド阻害用標的を表す。

ＨＳＶ　ａＲＮＡの転写は、遺伝子発現のカルケートパターン中で厳重に制御さ れるので、ｌｌｌ５Ｖ　ｄＮＡの相対濃度は感染経過の期間中のサンプリング時 間に依存する。一般的に、ｍＲＮ＾ＲＮＡ、その合成着手後３−４時間に最大レ ベルに達する。ｍＲＮＡ減少の速度は、すべてのＦｉＳＶ　ｔａＲＮ＾に関して 知られてはいはいが、文献に述べられる例の間でさまざまである。ＨＳＶ　ａＲ ＮＡの構造上の特徴はウィルスタンパク質の効率的な翻訳に重要である。５′キ ヤツプコンセンサス翻訳開始コドン、およびＨＳＶ　ａＲＮＡの３′ポリアデニ ル化テイルは、多（の細胞性ｄＮＡに関して述べられて来た同様なｄＮ＾構造に 類似する様式で機能すると思われる。ＨＳＶ　ｄＮＡのスプライシングはまれた が、極めて初期の転写のスプライス部位は、アンチセンス阻害に使用できると思 われるウィルス転写のもう一つの構造上の特徴を表す。加えてＨＳＶ　ＵＬ４ｇ 　ｌｌｌＲＮＡ　独自構造上の特徴は、外皮タンパク質合成の速度に影響を与え ると報告された。Ｂｌａｉｒ　Ｅ、Ｄ、、Ｂｌａｉｒ、Ｃ，Ｃ，およびｌａｇｎ ｅｒ、　Ｅ、　Ｋ、　：Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：２４９９−２５０８i１９ ８７）。

他のＨＳＶ　ｌｌｌＲＮＡ中の同様な構造の存在またはこれらの構造が、それら の複合体タンパク質種の合成に影響する能力については検討されていない。これ ゆえに多くの有力なＨＳＶ　ｍＲＮ＾ＲＮＡ域が、ｍＲＮ＾ＲＮＡアンチセンス オリゴヌクレオチド阻害のための推定上の部位として標的にできる。実際、ＤＳ ＬおよびＵＳ２遺伝子のスプライス部位またはＵＬ４ｇ遺伝子の翻訳開始領域に 相補的なオリゴヌクレオチドでの、感染細胞の処置は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＢＳ Ｖ複製を阻害した。Ｓｍ１ｔｈ、　Ｃ，Ｃ，、Ａｕｒｅｌｉａｎ、　Ｌ、　、　 Ｒｅｄｄｙ、　Ｍ、　Ｐ、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、　Ｓ、およＵＴｓ’　ｏ、　Ｐ 、　ＯｌＰ；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　tＳＡ　８３ ：２７８７−２ ７９２（１９８６）　：およびＣｅｒｕｚｚｉ、墓、および叶ａ凶ｒ、Ｌ；ヌク レオシドおよびヌクレオチド８：８１５−８１８（１９８９）。

Ｈ３Ｖ複製の生物的機能に貢献すると知られるウィルス遺伝子産物は、３群に分 類される。１．転写活性剤およびリプレッサータンパク質、２．ＤＮＡ複製タン パク質、および３．構造タンパク質、がある。極めて初期のクラスのＩＬｓｖ転 写は、転写活性剤および他のウィルス遺伝子リプレッサーとして機能するタンパ ク質をコードする。これらのタンパク質生産を欠くウィルス株は報告されており 、ＩＥ１７５遺伝子産物を除いて、極めて初期のタンパク質はウィルス複製に必 須ではないことが明らかである。他の極めて初期のタンパク質の処理機能は、Ｉ Ｅ１７５または宿主機能で代替できる。ＩＥ１７５ｍｌ？ＮＡの転写は、ＩＥ１ ７５タンパク質が感染細胞中でＩＥ１７ＳａＲＮ＾のさらなる転写が阻害される 濃度に達するまで続く。これゆえに適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドによ るＩＥ　１７５タンパク質の阻害は、ＩＥ　１７５ｄＮＡの安定した増加を生じ 、効果的なオリゴヌクレオチド阻害について限界を表すモル閾値濃度を最終的に 越えるであろう。極めて初期の遺伝子について言われる、アンチセンス治療のさ らなる問題は極めて初期の遺伝子の一時的発現が、効力についてオリゴヌクレオ チドの予防接種的投与を必要とすることである。この型の投与は可能であるが、 ヒト感染については実行可能でない。

最も研究されたウィルスタンパク質の群は、ゲノム複製に関与するものである。

少な（とも７つのウィルスタンパク質（Ｕｌ５．８．９．２９．３０．４２．５ ２）ハ”ｙ　イルスノ１））ｔＡ［製に直接関与する。ウィルスＤＮＡポリメラ ーゼ、チミジンキナーゼおよびリボヌクレオチド還元酵素の機能はヌクレオチド 類似体でうまく阻害され、これらの化合物のより有力な変形を発見する研究が続 く。ＨＳＶの薬剤−抵抗性株の開発は、臨床的使用において長期間効力を有する ヌクレオシドの開発の実行に限界がある。

い（つかの後期ウィルス遺伝子の転写は、効果的な発現のための遺伝子投与に依 存するので、ウィルス構造タンパク質合成のアンチセンス阻害も、ＤＮＡ合成タ ンパク質を標的にすることにより完成できるであろう。

抗ウイルス研究における構造タンパク質の使用は、ワクチンの開発に中心がおか れ、アンチセンス化合物での化学治療の介在について未踏査であることを示す。

この群に分類されるたんばく質は、ウィルスの集成および構造保全、ウィルス吸 着、ピリオンの宿主細胞膜との融合および感染細胞へのウィルス浸透に役割を果 たすと知られている。

最近いくつかのウィルスタンパク質が■Ｓｖ複製に二機能的役割を果たすであろ うと報告された。本発明によれば、これらは今単−タンパク質生産の阻害によっ て、ウィルス複製の多数のレベルに直接影響を与える好機であると思われる。こ の種類のウィルスタンパク質（（Ｕｌ１３および［３９）の員の数は限られるが 、しかしアンチセンス阻害についてのたんへん有望な候補と思われる標的を表す 。ＨＳＶ−１の［ｒＬ１３および［３９０ＲＦｓと同定されたウィルスタンパク 質は、種々のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２サブタイプ相同性間の高度なヌクレオ チド配列保持を表す。［１Ｌ１３およびＵＬ３９遺伝子は治療攻撃用の最も良い 部位になるだろうとして、今決定された。第三のタンパク質ＩＪＬ４０は、ＵＬ ３９タンパク質との活性リボヌクレオチド還元酵素複合体を形成するが、アンチ センス阻害用の有望な標的に成るだろうど今思われる。

さらにタンパク質はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療攻撃用のよい標 的となるであろうと思われる。これらはオープンリーディングフレームＵＬ５゜ 限、　ｔｒＬ９．　Ｕｌ２９．　［ｒＬ３０．　［ＩＬ４２およびＵｌ５２から のタンパク質を含む。したがって本発明は好ましくは、ヘルペス単純ウィルス１ 型のオープンリーディングフレームである眼、　［８，Ｕｌ９．　Ｕｌ１３．几 ２９．　［ＩＬ３０．几３９．几仙、几ｄおよび限２のなかのひとつに対応する 遺伝子からのａＲＮＡの機能阻害を対象とする。

１１ＳＶ−１のＵＬ１３タンパク質は、ピリオンカプシドタンパク質の特異的り ん酸化の原因となるタンパク質キナーゼ活性を推定上コードするピリオンカプシ ドタンパク質である。このタンパク質は、図２に描かれた５つの３−共通終止転 写物の組の中のひとつである４、　ＩＫｂのａＲＮＡにコードされる。ＩＪＬ１ ３　ｄＮＡは少数のウィルス種であって、組織培養のウィルス複製の開始後３− ４時間で始めて出現する。ウィルスＤＮＡ複製後に、Ｌ１３瀧ＲＮＡの発生量の 増加が起こるが、感染の後期にわたる主要ウィルスｄＮＡ発生量比較して低く留 まる。ＤＮＡ配列分析を通じて、ＩＪＬ１３をコードする一ＲＮ＾配列は、ＨＳ Ｖ−１および四Ｖ−２単離物間で高度に保持されると今発見された。ＨＳＶ−１ およびＨＳＶ−２タンパク質の予想される分子量はそれぞれ５７１９３および５ ７００１である。１ＪＬ１３タンパク質の合成はウィルスＤＮＡ合成の開始後ま で検出されないので、ＵＬ１３翻訳の主要な制御は４．　ＩＫｂのｄＮＡの発生 量にあると思われる。ＵＬ１３タンパク質合成の速度を制御することにおいて、 ４．　ＩＫｂ　＋ｍＲＮ＾の５−非一翻訳領域の役割は、もしあるとしても研究 されなかった。図３の■５Ｖ−１およびＨＳＶ−２のａＲＮＡ種の翻訳オープン リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の比較は、ＨＳＶ　ＵＬ１３合成およびウィ ルス複製のオリゴヌクレオチド阻害に関する魅力ある標的である保存されたヌク レオチド配列を示す。この領域のヌクレオチド配列における同一性は（ミスマツ チは１５５４ヌクレオチドのうちの２０５のみ）、ｄＮＡの重要な構造上の特徴 を反映する、それは今見いだされたが、単一のオリゴヌクレオチド配列でＨＳＶ −１およびＨＳＶ−２に対する広いアンチセンス阻害活性を達成する、オリゴヌ クレオチド治療により開発されることができる。

ＨＳＶ−１のＵＬ３９タンパク質は隣の遺伝子、Ｕｌ４０によりコードされる第 二タンパク質と緊密に会合し、リボヌクレオチド還元酵素活性を表す。Ｆｒａｓ ｅ、　Ｍ、　Ｃ，、Ｍａｒｓｄｅｎ、Ｉｌ、Ｓ、およびＤｕｔｉａ、Ｂ、Ｍ、　 ；Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６＋１５８１−１５８７Ｇ９８５）。タン パク質が相同的な組は、ＨＳＶ−２によりコードされ、同様なりボヌクレオチド 還元酵素活性を表す。単独で、ＵＬ３９タンパク質のｆｌｓＶ−２相同体は、自 己りん酸化タンパク質キナーゼ活性を有する。同様なキナーゼ活性はＨＳＶ−Ｉ ＴＩＬ３９タンパク質には示されない。Ｕｌ３９およびＵｌ、４０タンパク質は 、それぞれ５．２および１．２ｋ１４の３′共通吐Ｎ＾Ｓ対によりコードされる 。ＨＳＶ−１感染において、５．２ｋｂ　ｄＮＡは感染初期の主要ｍＲＮＡであ り、感染後期で発生量が減少する。１．２ｋｂ　ｄＮＡは初期に緩やかに発生す るようになるが、感染を通じてそのようにとどまる。ＨＳＶ−２感染において、 １．２ｋｂ　ｉＲＮ＾ＲＮＡは初期種が豊富であり、および５．２ｋｂ　ｄＮ＾ 相同体はただ緩やかに豊富である。再度、双方の種類の■ＲＮＡは感染後期には 緩やかに豊富なだけである。ＨＳＶ種間のａＲＮＡ発生において較差の生物的重 要性は不明瞭であるが、これらの較差は、ウィルスリボヌクレオチド還元酵素ま たはタンパク質キナーゼ活性についての効果的な標的を選択するうえで意味のあ る効果を持つであろう。■ｓＶリボヌクレオチド還元酵素複合体のタンパク質は ウィルスＤＮＡ複製の前に起こり、酵素活性はおそら＜　ＤＮＡ合成に必要な基 質を生成する点において必須な役割を果たすであろう。この重要な酵素的機能の 阻害はＤＮＡ合成を妨害するだけでなく、これら後期タンパク質生産物（それを コードする遺伝子は効率的に適当なｄＮＡを合成するための鋳型発生量に依存す る）の合成を間接的に妨害するであろう。Ｈ５Ｖリボヌクレオチド還元酵素−Ｎ ＾の０ＲＦｓの比較は、図４に示すようにヌクレオチド相違の程度を示し、これ はｄＮ八へ能のインターティビック（ｉｎｔｅｒｔｙｐｉｃ）な効力に影響する であろう。Ａ［ＩＧコドン周辺のヌクレオチド配列の相違は、ＢＳＶ−１および ＢＳＶ−２ＵＬ３９、およびＵＬ４０タンパク質合成の開始を阻害するために使 用される別個のヌクレオチド治療調製物を必要とするであろう。ＨＳＶ−１およ びＨＳＶ−２［ＴＬ３９、およびＵＬ４００ＲＦｓ体中にある他の領域は、これ らの領域に対して相同性を有するオリゴヌクレオチド調製物がｌｌ５Ｖ−１およ びＢＳＶ−２の複製を効果的に阻害できるように、より徹底的なりＮＡ相同性を 示す。

■５Ｖ−１のゲノムは、ウィルスＤＮＡ複製において機能するシス−およびトラ ンス−活性化要素の両方を含有する。シス−活性化要素は、ＤＮＡ複製のオリジ ンに対応し、およびトランス−活性化要素は１１３ｖ−Ｉ　ＤＮＡ複製の原因と なる酵素である。ｌｌｌ５Ｖ−１ゲノムにコードされる７つのオープンリーディ ングフレームはＢＳＶ−Ｉ　ＤＮＡ複製に必須と知られる７つの相補群である。

７つのオーブンリーディングフレームはウィルスＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＵＬ ３０）、−末鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＬ２９）、オリー結合タンパク質（［ ９）、二重鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＬ４２）およびへりカーゼープライマー ゼ複合体（ＵＬ５．　ＵＬ８および孔５２）から成る３つのタンパク質をコード する。これらの遺伝子のＤＮＡ配列は、ＢＳＶ−１ゲノムについてのみ知られる が、決定的なウィルス機能をコードする領域中のＢＳＶ−１およびＢＳＶ−２の 一般的な共直線性およびＤＮＡ配列相同体の総量（ｇｒｏｓｓ）は、これらのそ れぞれのＥ［５Ｖ−１遺伝子機能に関するオリゴヌクレオチド阻害剤が、相同的 Ｈ３Ｖ−２遺伝子の機能的発現も阻害するように見いだされるよう確立された。

３つのＨＳＶ遺伝子標的は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイでアンチセンスに感受性 であると報告された。ホスホロチオエート基によりヌクレオシド間に結合された ［ｄＣ］ｚａの配列から成るオリゴヌクレオチドは、ｌｌｌ５Ｖ−２ＤＮＡポリ メラーゼ活性を阻害するが、同様なオリゴヌクレオチドが関連性のないウィルス 、ヒト免疫不全ウィルスのゲノム複製も妨害することが示されたので、この作用 は非特異的と分かる。Ｃｈｅｎｇ。

Ｙ（、、Ｇａｏ、　？、　、　５ｔｅｉｎ、　Ｃ，＾、　、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ 、　Ｓ、　、　Ｄｕｔｓｃｈｍａｎ、　Ｇ、　Ｅ、　、およ■gａｎｅｓ、　Ｒ ，Ｎ、　；遺伝 子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴヌクレオチドでのアブストラクトお よびポスターコロツクビレ、ＭＤ　（１９８９）で開催された治療関連（Ｔｈｅ ｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）：１ｌａｔｕｋｕｒａ、　Ｍ、 、５ｈｉｎｏｚｕｋａ、　Ｌ、Ｚｏｎ、　Ｇ、、　ｌ［１ｔｓｕｙａ、■、、　 Ｒｅ１ｔｚAＭ、、　Ｃｏｈｅｎ。

Ｊ、　Ｓ、　、およ）ｒｏｏｄｅｒ、　Ｓ、　：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４ニア７０６−７７１０　（P９８７）、こ のオリゴヌクレオチドはおのおののウィルスレブリカーゼを阻害すると示される が、ウィルス複製の阻害は現実的ではない。ＨＳＶ−Ｉ　ＵＳＩおよびＵＳＩ２ １ＲＮＡｓのスプライス連結受容部位に相補的であるメチルホスホネート結合お よびソラレンーデリビイタイズド（ｄｅｒｉｖｉｔＬｚｅｄ）オリゴヌクレオチ ドが■５ｖ−１のｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製を阻害することが示された。Ｋｕｌｋａ 、　Ｍ、　、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｃ，Ｃ，、Ａｕｒｅｌｉａｎ、　Ｌ、　、　Ｆｉ ｓｈｅｌｅｖｉｃｈ、　qｏ、　Ｍｅ ａｄｅ、　Ｌ　、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、　、およびＴ’　ｓｏ、　Ｐ、　Ｏ， Ｐ、　；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵrＡ　８６：６８６ ｇ−６８７２ （１９８９）　：およびＳｍ１ｔｈ、　Ｃ，Ｃ，、Ａｕｒｅｌｉａｎル、　、Ｒ ｅｄｄｙ、　Ｍ、　Ｐ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、　Ｓ、およ■嘯唐潤A　Ｐ、　 Ｏ。

Ｐ、　；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｉｔｓ＾８３：２７８７ −２７９２（１９８６）。標的遺伝子はＨ９Ｖ複製に必須でないと示されたため これらの結果は興味深い。ウィルスの複製に必須である遺伝子に相補的なオリゴ ヌクレオチドは、非−必須遺伝子産物に対し標的とされたオリゴヌクレオチドよ りも、よりよい治療剤であると期待される。この推測の証明は、Ｃｅｒｕｚｚｉ およびＤｒａｐｅｒによりＨＳＶ−Ｉ　ＵＬ４８　ｄＮＡを標的配列として使用 して示された。Ｃｅｒｕｚｚｉ、　Ｍ、およびＤｒａｐｅｒ、　ＩＬ　；　Ｎｕ ｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、　８：８P５−８１８ （１９８９）。ＣｅｒｕｚｚｉおよびＤｒａｐｅｒにより自然の（ホスホジエス テル−結合）オリゴヌクレオチドを使用して達成された抗ウイルス効力は、Ｓｍ ｉｔｈらによってそれらの修飾オリゴヌクレオチドを使用して観察された効力に 匹敵すると報告された。この抗ウィルス活性の増加は恐らくウィルスの極めて初 期の転写の増強におけるＵＬ４８タンパク質の重要な役割に関連すると思われた 。

ＵＬ１３カプシドタンパク質およびピリオンタンパク質りん酸化のオリゴヌクレ オチド阻害剤のセットの開発は、新規な抗Ｈ３Ｖ化学療法を表す。多くの独立し たウィルス機能の標的化は、我々の研究または存在するヌクレオチド治療を組み 合わせて、決定された最も効果が高いアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供す る。

ヘルペス単純ウィルス１型（ＩＩＳＶ−１）、水痘帯状痘疹（ＶＺＶ）およびニ ブスティンバーウィルス（ＥＢＶ−１）の比較は、アンチセンスオリゴヌクレオ チド攻撃に関し最も良いであろう標的がヒトヘルペスウィルス中に保存されるに とを明らかにした。ＢＳＶ−１遺伝子に相同的なこのｖｚｖおよびＥＢＶ遺伝子 は図６に説明される。０ＲＦｓの予想は公表されたＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ の注釈から採用した。Ｄａｖｉｓｏｎ、＾、　Ｊ、　＆５ｃｏｔｔ、　Ｊ、　Ｅ 、　、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ　６７　：　１７５９−１８１６（０９８ ７）　；ＭｃＧｅｏｃｈ、　Ｄ、　Ｊ、　、　Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ、　Ｍ、＾、 @、Ｄａｖｉｓｏｎ、　Ａ、　Ｊ、　、　Ｄｏｌａｎ、＾、　、　Ｆｒａｍｅ、 　Ｍ、　Ｃ，ＭｃＮａｂ、　Ｄ、　、　Ｐｅｒｒｙル、Ｊ、　、　５ｃｏｔｔＪ 、　Ｅ、　、　＆ＴａｙｌｏｒA　Ｐ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９ 　：１５３１−１５７４（１９８ｇ）　；Ｂａｅｒ、　Ｒ，、Ｂａｎｋｉｅｒ、 　Ａ、　Ｔ、　Ｂｆｇｇｉｎ、　Ｍ、　Ｄ、　、　Ｄｅｉｎｉｎｇｅ秩A　Ｐ、 　Ｌ、　、　Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ、　Ｊ、　（Ｈａｔｆｕｌｌ、　Ｇ、　、　 Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｇ、　Ｓ、　、　Ｓａｔｃｈｗｅｌｌ、　Ｓ、　Ｃ，、Ｓｅｇ ｕｉｎ、　Ｃ，、Ｔｕ■■■撃戟A　Ｐ、　Ｓ、　、　＆Ｂａｒｒｅｌｌ。

Ｂ、Ｇ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：２０７−２１１（１９８４）。

ＥＢｖＢＢＲＦ２オヨヒＢＯＲＦ２遺ｆｉＪ−ハ、それぞれＨＳＶ−ＩＵＬ９お よびＵＬ３９遺伝子に相同的であると列挙されているが、これら遺伝子のコード されたアミノ酸は高度には相同的ではない。コードされた０ＲＦｓ中のこのアミ ノ酸の相同性の欠如は、スプライシングという出来事によるＥＢＶ　０ＲＦｓの 破壊を反映するものであろうが、これら吐ＮＡ内のスプライスの立証はなされて いない。これら種々のヘルペスウィルス遺伝子中に存在するヌクレオチド相同性 の多くの領域は、今アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の良い標的になると思 われる。ＨＳＶ−１および／またはＢＳＶ−２を阻害し、ならびにｖＺｖまたは ＥＢＶのどちらかに対応するヌクレオチド配列に対し相同性を有するオリゴヌク レオチドは、ｖｚｖおよび／またはＥＢＶ複製の効果的阻害剤ともなろう。他の ヒトヘルペスウィルスは完全に公表されていないが、入手できる限定されたヌク レオチドデータはヒトサイトメガウィルス（ＢＣＭＶ）およびヒトヘルペスウィ ルス６（ＥＢＶ６）がＨＳＶ−Ｉ　ＵＬ１３遺伝子に相同性を有することを示し た。Ｌａｗｒｅｎｃｅ、　Ｇ。

Ｌ、　、　（：１１ｅｅ」、　、　Ｃｒａｘｔｏｎ、　Ｍ、＾、　、　Ｇｏｍｐ ｌ可、Ｕ、　Ａ、　、　Ｈｏｎｅｓｓ、　Ｒ，１，、およびaａｒｒｅｌｌ、　 Ｂ、　Ｇ、；Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　６４：２８７−２９９（１９８８）。加えて、ｌｌｌ５Ｖ−Ｉ　 ＵＬ３０遺伝子ノＨＣＭｖ相同体ノＤＮＡ配列ハ、公表されており（Ｋｏｕｚａ ｒｒｉｄｅｓ、　Ｔ、　、　ｈｎｋｉｅｒ、　Ａ、　Ｔ、　、　５ａｔｃｈｖｅ １１．　Ｓ、　Ｃ，、Ｗｅｓｔ盾氏A　Ｋ、　Ｔｏｍｌ　１ ｎｓｏｎ、　Ｐ、　、　ＪＧＹＩＢａｒｒｅｌｌ、　Ｂ、　Ｇ、Ｊ、　ｌ’１ｒ ｏ１．６１　：１２５−１３３（１９８７）、ならびにＨＳu−１遺伝子に 対する相同性領域が存在することを示した。一旦ヒトヘルペスウイルスの配列が 公知になれば、今標的にされた遺伝子は少なくとも部分的には保持され、もとの Ｈ８ｖ遺伝子配列に対する十分なヌクレオチド相同性を示すであろう。本発明は ヘルペスウィルスのメツセンジャーＲＮ＾の機能のアンチセンス阻害に利用する ためのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を採用する。本発明 中の関係において、”オリゴヌクレオチド０という用語は、天然に存在する塩基 から形成された複数の結合したヌクレオチド単位を言い、ならびにシクロフラノ シル基が天然のホスホジエステル結合に結合している。この用語は事実上、天然 に存在する種または天然に存在するサブユニットから形成される合成種を言う。

本発明に関連して使用される用語としての”オリゴヌクレオチド類似体２は、オ リゴヌクレオチドと同様に機能する部分を言うが、天然に存在する部分ではない 。

これゆえにオリゴヌクレオチド類似体は、糖部分または糖量の結合を変更させる ことができる。これらの例としては、ホスホチオエートおよび他のイオウ含有種 であって当業者に公知である。それらは本発明の精神に構成される変更された塩 基単位または他の修飾を含む事もできる。

特定の好ましい態様に従って、ホスホジエステル結合のいくつかは、変調される べき活性を有するＲＮＡが存在する細胞中に組成物が細胞の領域に浸透する能力 を増強するために機能する構造に置換される。このような結合はイオウ含有が好 ましい。そのような置換はホスホチオエート結合が好ましい。他のアルキルホス ホチオエート結合、Ｎ−アルキルホスホアミダイト、ホスホロジチオエート、ア ルキルホスホネートおよび短鎖アルキル、またはシクロアルキル構造もまた有用 であり得る。他の好適な態様によれば、ホスホジエステル結合は、同時に、実質 的に非−イオン性および非−キラルである構造に置換される。当業者は本発明の 実施において使用する他の結合を選択できるであろう。

ヌクレオチド類似体は、幾つかの修飾塩基形態を含む種を含有できる。これゆえ に、天然に通常見いだされる以外のプリンおよびピリミジンを採用できる。同様 に、ヌクレオチドサブユニットのフラノース環上部分の修飾も、本発明に本質的 な付着に適していると支持される限り、行われる。

このような類似体は、天然のオリゴヌクレオチド（または天然系に沿った合成オ リゴヌクレオチド）で機能的に内部交換できると最も良く説明されるが、それは １つ以上の自然構造由来の違いを有する。本発明によりすべてのそのような類似 体は、ヘルペスウィルスまたは関連ウィルスのＲＮＡの機能を阻害するメツセン ジャーＲＡＭと効果的にハイブリダイズする限り包含される。

本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、好ましくは約 ６から約５０サブユニツトから成る。より好ましくはそのようなオリゴヌクレオ チドおよび類似体は、約８から約５０のサブユニットから成る。サブユニットは 塩基および糖の結合体であり、隣のサブユニットとホスホジエステル結合を通じ て適当に結合されると理解されるであろう。

本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、ヘルペスウィ ルスのメツセンジャーＲＮＡとハイブリダイズするように設計される。そのよう なハイブリダイゼーションは、完了した時、メツセンジャーＲＮ＾の通常の機能 を妨害し、ウィルスに対するその利用性の損失を引き起こす。妨害されるメツセ ンジャーＲＮＡの機能は、タンパク賀翻訳のためのその場所へのＲＮＡの転位、 ＲＮＡからタンパク質の実際の翻訳、および可能であればＲＮＡによって運営さ れ得る独立的な異化作用のようなすべての重要な機能を含む。このようなＫＮ八 へ能妨害のすべての効果は、ヘルペスウィルスがＲＮＡの利点を失うことを引き 起こしならびに、全体で、ウィルスゲノムの発現妨害を行う。このような妨害は 、ウィルスにとって致命的である。

本発明によれば、上述したように、ウィルスにとって増強された代謝的重要性と なると決定されたメツセンジャーＲＮ＾を妨害するように設計されたオリゴヌク レオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を提供することが望ましい。アンチセ ンス攻撃に対して、オーブンリーディングフレームの１以上の翻訳開始部位を標 的とすることが好ましい。そのような部分は、オリゴヌクレオチド配列ＣＡＴが それと特異的にハイブリダイズするようにＡＵＧ配列（ＲＮＡ中の）を一般的に 含む。したがって、ＣＡＴ配列から成るオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ オチド類似体がこれらの態様のために好ましい。付加的なヌクレオチドサブユニ ットは好ましくはオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体中には、 核酸との特異的ハイブリダイゼーションが高度に達成されるように含まれる。従 って、ハイブリダイズするために翻訳開始部位に隣接する配列と相補的となるよ うに設計された、ＣＡＴ配列のひとつまたは何れかの側−５ｉｄｅ”は、好適な オリゴヌクレオチドまたは類似体に含有される。何れかの鋼上にそのように隣接 した６から１２のサブユニットは、便利であり、ならびに現在好適であるが、本 発明の精神から逸脱することなく、より多くのまたは少ない数も好適に採用され る。

本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療お よび研究用試薬およびキットとして使用できる。治療用の使用には、オリゴヌク レオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、動物に適用され、好ましくは性器 ヘルペス、ヘルペス単純口内炎、ヘルペス唇音、ヘルペス単純脳炎、角結膜炎、 庖疹性ひょうそ、または新生児および免疫無防備状態にある宿主の散在性ヘルペ ス感染に罹患しているヒトである。

本発明の治療用薬剤は局所的または内部外傷的に適用される。適用の他の形態は 、たとえば経口、経皮、静脈内または筋肉内も有効と成り得る。本発明のオリゴ ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、予防措置においても有効とな るだろう。例えばそのれは、手袋、コンドーム等のコーティングとして薬剤によ り提供される。本発明は診断および研究においても宵用である。本発明のオリゴ ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、ヘルペスウィルスに対しハイ ブリダイズし、この事実を利用してサンドイッチおよび他のアッセイが容易に構 成できる。オリゴヌクレオチドおよび類似体とヘルペスウィルスが含有されてい ると疑われる試料とのハイブリダイゼーションを検出する手段の装備は日常的に 達成できる。そのような装備には、酵素複合体、放射標識化または他の適当な検 出システムを含むことができる。ヘルペスウィルスの存在または非存在を検出す るキットも作成できる。

本発明の教示により、選択されたＨ３Ｖ　ｄＮＡの翻訳開始領域を標的とする多 くの相補的オリゴヌクレオチドが作られた（表８）。ホスホジエステル主鎖を含 む天然のオリゴヌクレオチドは、感染収量アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｙ ｉｅｌｄ　ａｓｓｅｙ）で抗−ＵＳＶ活性についてスクリーンされた。このアッ セイで最高の活性を示したオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ　１０４９）は、ｌｌ ５Ｖ−Ｉ　ＵＬ１３　遺伝子（７）ＩｌＳＶ−２相１ｍ体ノＭＳ翻訳開始：ｌ　 ）’ンに対する標的とされた。この活性配列のメチルホスホネートおよびホスホ チオエート類似体は、ホスホジエステルまたはメチルホスホネートオリゴヌクレ オチドで観察されるよりも、ホスホロチオエート主鎖修飾がオリゴヌクレオチド の抗ウィルス活性を大いに増大したことを示す。ｉｌ　ＶｉＶＯ合成されたＨ３ Ｖ−１およびｌｌ［５Ｖ−２ＵＬ１３　ＲＮＡのウサギ網赤血球翻訳は、ホスホ ジエステル（ＩＳＩＳ　１０４９）またはホスホロチオエート（１０８２）主鎖 構造のいずれかを含有するオリゴヌクレオチドがＵＬ１３ポリペプチドの合成を 阻害できることを示した。投与応答実験では、ｌ５Ｉ３１０８２の抗ウィルス活 性と、ｌ１ｓＶ−Ｉ　ＰＡＡｒＳのふたつのＡＣＶ゛株、ウィルス［ｌＮＡポリ メラーゼ遺伝子中に変更されたヌクレオチド結合部位を有するＫＯ３変異体、お よびウィルスチミジンキナーゼ遺伝子の欠損を含有するＤＭ２．１におけるアシ クログアノンン（ＡＣＶ）のそれを比較した。これらの実験でｌ５ＩＳ　１０８ ２の活性は、オリゴヌクレオチドはウィルスチミジンキナーゼによる活性化のた めのりん酸化を必要としないことを示し、ならびにオリゴヌクレオチドはウィル スＤＮＡポリメラーゼとＰＡＡおよび＾Ｃｖ部位で相互反応しないことを示した 。ｌ５ＩＳ　１０８２の釦ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価によれば、化合物に関する予 想された治療的指標は、平行アッセイでＡＣＶについて予想されたものと等しい かまたは良いことを示した。ｌ５Ｉ３１０ｇ２が、ウィルスのへＣｖ−耐性株で の抗ウィルス活性、およびこの化合物で観察される好ましい治療的指標を示すこ との立証はこの種の抗ウィルス化合物の有望な臨床的価値を強調する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞カルチャー中でウィルスの複製を阻害す ることが示された。しかし、動物モデルのウィルス感染ではアンチセンスオリゴ ヌクレオチドの効果については知られていない。そのような研究に関して、ＨＳ Ｖ誘導角膜炎の動物モデルはよ（適する。そのような目の感染は、通常局所的に 処置され、これゆえに初」１四でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を試 験する比較的簡単な方法を提供する。薬剤は水性溶液中で局所的に適用され、感 染の幾つかのパラメーターを監督できる。マウスのモデルを使用して本発明の教 示で作成されたホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果が、 ヘルペスの角膜炎に関して試験された。オリゴヌクレオチドは、ＧＣＣＧＡＧＧ ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＡＣＧＣ（ＩＳＩＳ　１０８２；配列番号＝７）を有する ＵＬ１３遺伝子に対して向けられた。この抗−ＵＬ１３オリゴヌクレオチドの局 所的処置はＨ８ｖに誘導された間質角膜炎の程度を軽減した。

３種の異なる濃度のオリゴヌクレオチド、同じく緩衝液対照（５０ｄ酢酸ナトリ ウム、ｐＨ５，８，０，１５１１ＮａＣ１）および未処置■５Ｖ−１で感染動物 を試験した。すべての動物をｌＸｌ０’プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）で感染させ 、次いで角膜を掻いた。０．３％および１．０％ｌ５ＩＳ　１０８２は眼瞼浮腫 の程度に影響を与えなかったが、０，３％および１．０％のｌ５Ｉ３１０８２で はいくぶん早く治癒した（図７）。ｌ５ＩＳ　１０８２の処置は、感染後１１． １３および１５日の間質疾患および血管新生を減少させた。疾患の軽減は統計的 には何日間かは十分であったが、他はそうではないこともあり、恐らく試料サイ ズが小さいことと、および疾患の多様性によるものであろう。疾患点数に対する 投与の比較を表８に示すが、ｌ５ＩＳ　１０８２が狭い有効濃度範囲を有するこ とが示された。感染後１５日に疾患点数の５幅減少を引き起こす投与は、眼瞼浮 腫、間質疾患および血管新生に関してそれぞれ０．１７％、　０．２５％および ０．２２％であった。これらの結果は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド が■Ｓｖ眼瞼浮腫に有効である得ることを示す。

本発明はさらに以下の実施例によって説明されるが、これらは説明の目的のみで あって、本発明を特異的態様に限定することを意図しない。

使用したＨｅＬａ（ＡＴＣ（ＪＣＣＬ２）およびＶｅｒｏ（＾ＴＣＣ［ＣＬ８１ ）細胞はアメリカンティシュカルチャーコクジョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉ５ ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手した。Ｈｅ−細胞の カルチャーはダルベツコの改良必須培地中に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）。

ペニシリン（１００単位／＋ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００マイクログラ ム／＋＊１）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を懸濁させた培地で成長させた。

Ｖｅｒｏ細胞のカルチャーは、５．０１兇、ペニシリン、ストレプトマイシンお よびＬ−グルタミンを懸濁したＤ−１［ＥＭ培地中で成長させた。低い多重感染 （感染多重度［１１０Ｉ］−０，０２プラ一ク形成単位［ｐｆｕｌ　／細胞）を 使用ＬｒＶｅｒｏ［１胞中Ｔ１１ＳＶ−１（ＫＯＳ株）およびＨ３Ｖ−２（ＨＧ ５２株）の保存（ｓｔａｃｋ）カルチャーを生育させた。

オリゴヌクレオチドがＨ３Ｖ複製を阻害する能力を評価するために、感染生産量 アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｙｉｅｌｄ　ａｓｓａｙ）を採用した。Ｈｅ Ｌａ細胞をファルコン６ウエル組織カルチャープレート中のウェル当たり５Ｘ１ ０’の密度で植えた。細胞を３ｍＭの培地（Ｄ−ＭＥＭ、　１０％ＦＢＳ）で被 覆し、３７℃で１８−２４時間インキュベートした。適当な場所で、細胞はプレ ートに機種され、２４時間後１ｍｌのカルチャー培地中のオリゴヌクレオチド調 製物で被覆された。１８時間のインキュベーションの後、すべてのウェルはリン 酸緩衝化塩溶液で洗われ、ｌｌ５Ｖ−１またはＨ３Ｖ−２のいずれかを、０．５ ｇ＋１の血清無しのＤ−１１日Ｍに懸濁した種々の感染多重度（蓋ＯＩ）で感染 させた。ウィルス及び細胞は３７ｔで１時間、時折揺すってインキュベートした 。ウィルス吸着の後、吸着しないウィルスをリン酸緩衝化塩溶液で洗い去った。

適宜、４ａＭの濃度のオリゴヌクレオチドを含有する１■１の培地（Ｄ−ＭＥＮ と１０％ＦＢＳ）をウェルに加え、細胞は４８時間３７℃でインキュベートされ た。再度対照ウェルはオリゴヌクレオチドを含有しない１ｍｌの培地を受容した 。

使用したオリゴヌクレオチドは、ＵＬ１３．　ＵＬ３９またはＵＬ４０　ｍＲＮ ＾のいずれかの翻訳を翻訳開始領域で妨害するために設計された。非−修飾オリ ゴヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機（＾ｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｒ）で、ヨードによる酸化で標準的ホスホアミダイト化学を使用して合成した。

試薬である、ＣＰＧ−結合およびβ−シアノエチルジイソプロビルホスホアミダ イトの両方はアプライドバイオシステムズ社（フォスター市、カリフォルニア） から購入した。標準酸化ボトルはホスファイツト結合の段階的チェージョン（ｔ ｈｉａｔｉｏｎ）のために、アセトニトリル中０，２Ｍの’ＩＩＩ−Ｌ　２−ベ ンゾジチオール−３−オン１゜１−ジオキ／ドに交換した（Ｉｙｅｒら（１９８ ０）Ｊ、　Ａｔ　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、　１１２．１２５３−１２５４）。チ ェーシタンサイクル待ち段階を６８秒に増加し、引き続きキャビング工程をおこ なった。ＣＰＧ−カラムからの切断および５５℃（１８時間）で、濃い水酸化ア ンモニウム中での脱保護の後、ホスホロチオエートは、トリチル−オン１１ＰＬ Ｃ（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ　ＩＵＰＬｃ）でＰＲＰ−１カラムを使用した５０ＩＩ ＩＩＩＩのトリエチルアンモニウム酢酸中のアセトニトリル勾配を使用して、ｐ Ｈ７で（４％から３２％を３０分で、流速１．５１１７分）精製された。適当な 画分をプールし、蒸発させ、モして５，０％の酢酸で周辺温度で１５分処理した 。溶液を酢酸エチルの等用量で抽出し、水酸化アンモニウムで中和し、凍結そし て乾燥した。分析ゲル電気泳動を２０％アクリルアミド、舖尿素、４５■Ｍトリ スー硼酸緩衝液、ｐＨ７，４０Ｖ／ｃ＋＊で行った。オリゴヌクレオチドおよび それらのホスホロチオエート類似体は、ＨＴ’ＬＣ分析から判定され、ならびに ポリアクリルアミドゲル電気泳動では９５％完全長物質より大きった。

我々の合成により得たホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量 を、”ＰＮＭＲ分光光度計で測定した。スペクトルは、パリアンＮ１１Ｒ分光光 度計で１６２ＭＨｚの３１ｐ周波数で得た。典型的に、１０００−　トランジェ ント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）ヲ共に加えた（ｃｏ−ａｄｄｅｄ）。トランジェン トの間に７．５秒の緩和遅延（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｄｅｌａｙ）を使用して 完全に緩和したスペクトルを確実にする。この３１ｐスペクトルは、酸化シュウ チリウムまたはジメチルスルホキサイドを溶媒として使用し、周辺温度で得られ る。ホスホロチオエート試料は、典型的には１パ一セント未満のホスホジエステ ル結合を含有した。

調製した配列を表１に表す。

セ ＋　井 そ　− を 米 ８　さ　ｇｇＢ２ ａ＜＜ｕａ　ＣＪ　ｕ ウィルスは被覆培地中に収穫され、各実験点に於ける３つのウェルが混合され、 そして３ｍｌの容量に標準化された。懸濁液を４回凍結、融解し、つぎに２０ゲ イジの針で４回抜き取り、２ｍｌのアリコートを一８０℃で保存した。別に、各 ウェルは収穫され各実験点での複製滴定法のために調製された。この後者の手順 は、個々のａＳＶ−１株に関しての投与応答曲線の作成に使用された。ウィルス 力価はＶｅｒＯ細胞単層に関するプラークアッセイにより測定された。各ウィル スの希釈物が調製され、各希釈の２つのアリコートをＶｅｒｏ細胞に１時間、時 折揺すって吸着させた。吸着後、プレートをりん酸緩衝化塩溶液で洗うことによ ってウィルス接菌を除去し、細胞は５．０％ＦＢＳおよび０．７５％メチルセル ロースを含有する２１１のＤ−１１Ｅ舅で被覆された。プラークをホルマリンで 固定し、クリスタルバイオレットで染色して計数する前に細胞を３７℃で７２時 間インキュベートした。処理ウェルからのプラーク計数を、対照ウェルからの計 数と比較してウィルス複製の阻害の程度を確定した。

表２に回収データを示す。ウィルス型、ＨＳＶ−１またはｌｌ５Ｖ−２、および 感染多重度。

ＭＯｌ、が記載されている。複製の阻害は実験および対照値の比較を通して理解 される。

ウィルス型Ｍロエオリゴ　生産量１　生産量２　平均ウィルス型　ＭＯエ　オリ ゴ　生産量１　生産量２　平均以下のデーターは、細胞を予めオリゴヌクレオチ ドに５時間（１８時間ではな（）し被爆たことを除き、同様な様式で回収された 。指示するようにより高濃度のオリゴヌクレオチドを採用した。

表３ ウィルス型　Ｍｏエ　オリゴ　生産量１　生産量２　平均上記により、実質的な ウィルス複製の減少が本発明のオリゴヌクレオチドの適用により行えることが容 易に明らかである。

実施例２ 以下の実験は、Ｉｌ［Ｓｖの目の疾患のマウスモデルに於ける目の［ＩＳＶ感染 に関して、Ｈ３ｖ−Ｉ　ＵＬ１３遺伝子に相補的であるアンチセンスオリゴヌク レオチドの効力を試験するために設計された。

処置手順 ４力ラ５週齢ノメスＢＡＬＡ／Ｃマウスニ適用するために、ＧＣＣＧＡＧＧＴＣ ＣＡＴＧＴＣＧＴＡＣＧＣ（ＩＳＩＳ　１０８２：配列番号７）を有する抗−Ｕ Ｌ１３オリゴヌクレオチドを、５０ｍ１ｌの酢酸ナトリウムおよび０．１５Ｍの ＮａＣ１を含有する緩衝液（ｐＨ５，８）に溶解した。ｌ５Ｉ３１０８２の３種 の異なる投与を試験し、処理は感染後（ｐｉ）４時間に重症の目の感染を引き起 こすの接菌で使用された。

試験薬剤を投与するために、マウスはハロタン（２，５％）吸入により麻酔をか けられた。１０１１１の溶液滴が角膜に落とされ、目を１５秒間開いたままにし た。マウスは継ぎに籠に戻された。過剰の薬剤は除去されなかった。処置は最初 の７日間は１日あたり１６時間、２時間毎に投与を行い（１日あたり８投与）、 処置の第二週目は１日あたり１６時間、４時間毎に投与した（１日あたり４投与 ）。

マウスは感染後（ｐｉ）３０日間保管された。その時、三叉結節腫（ＴＧ）は無 菌的に取り出された。試料の半分をホモゲナイズし、凍結、融解を３回行い、Ｂ ｒａｎｄｔおよびＧｒａｕ、Ｉｎｖｅｓｔ、ｈｔｈａｌｓｏｌ、Ｖｉｓ、Ｓｃｉ 、３１：２２１４−２２２３（１９９０）に記載されているように感染ウィルス に関して滴定した。すべての試料をアッセイ工程の前に６００μｍの細胞カルチ ャー培地に置いた。二兎のマウスを各群の各時間点で使用した。力価は、組織あ たり平均縁１０ｇ１゜ｐｆｕとして報告された。

残りの試料を細か（切り刻み、２％血清を含有する培地中の単層Ｖｅｒｏ細胞を 含有するカルチャー皿に置いた。コーカルチャー（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）は− 日おきに２週間、細胞変性効果について観察された。

目め疾患に関する処置の効果 ｌ５ＩＳ　１０８２、緩衝液および市販のトリフルオロチミジン（ＴＰＴ）の３ 度の投与に関し試験された。種々の処置群を表４に掲げる。

１５　Ａ　１０　ＩＩ衝液のみ Ｂ１０　０．１ｔ　Ｘ５Ｘ５１０１１２Ｃ１００ｊｌ　Ｘ５ＸＳ　１０８２ Ｄ　９　１．０１１５ｘ５１０８２ ０　９　ピロブチイック（１，０％） ２０　Ｆ　１０　Ｍｏｃｋ惑染 Ｇ　１０　処置なし 図７は、角膜の眼瞼炎、血管新生および間質角膜炎に関し、マウスからの点数に 由来する結果を示す。眼瞼炎は、群＾、　Ｂ、　Ｃ，ＤおよびＧでｐｉ３日に初 めて視覚で確認され、症状は重（なり、７日にピークとなり、つぎに治癒し始め た。群Ａ、　Ｂ、　Ｃ，ＤおよびＧの７日のの点数は有意に異ならないが（ｐ＞ ０．０５）、ｌ５Ｉ３１０８２が、もしあれば、わずかに眼瞼炎の悪化の進行に 効果を与えることを示す。群ＣおよびＤでは１５日までに眼瞼炎は完全に治癒し たが、群ＢおよびＧでは少なくとも２８日かかり、群りでは完全に治癒しなかっ た。群＾、　Ｂ、　Ｃ，および０間の疾患点数の差異は、１５日（ｐ〉１５）に 有意に異なり、ｌ５ＩＳ　１０８２での処置が治癒時間を短縮したことを示す。

ＴＰＴ（群Ｅ）は眼瞼炎の症状の進行を防御した。

ｌ５ＩＳ　１０８２が炎症を引き起こすかどうかを決定するため、１０兎のマウ スを１．０％のｌ５ＩＳ　１０８２溶液でｍｏｃｋ感染した。薬剤を２時間毎に ７日間与え（１日あたり８投与）、毎日眼瞼炎を数えた。いずれのマウスも眼瞼 炎または炎症を起こさなかった。これゆえに、ｌ５Ｉ３１０８２処置動物に見ら れる眼瞼炎はは薬剤では引き起こされなかった。角膜の血管新生は、群＾、　Ｂ 、　Ｃ，Ｄ、およびＧで５日から７日の間に初めて検出され、症状が悪化した。

未処置、感染マウス（群Ｇ）で、血管新生は１１日にピークに達し、１３日にわ ずかに下隆したが、ｐｉ　２８日でさえも高いままである（点数１．２）。血管 新生は、１３日にピーク（１，７）となり、緩衝液だけで処置したマウスで高（ 留まった。

ｒｓＩ３１０８２で処置したマウスは血管新生を起こし、１３日にピークとなり 、投与にかかわらず、ｐｉ　２８日まで一定のままである。しかしｌ５ＩＳ　１ ０８２で処置した群の血管新生は、非処理または緩衝液で処理したマウスよりも より軽度であり（１３日の点数はそれぞれ０，８から１．２対１．７）、ｌ５Ｉ ３１０８２は血管新生を防御しなかったが、疾患の程度は減少したことを示す。

軽度の血管新生がＴＰＴ（群Ｆ）で処理したマウスで１５日に観察されたが、す ぐにきれいになった。

群Ａ、　Ｂ、　Ｃ，Ｄ、およびＧのマウスは、はべて間質角膜炎を起こした。間 質角膜炎は群ＡおよびＧで７日および８日に検出され、１１日と１５日の間でピ ークになった。間質角膜炎は、ｌ５ＩＳ　１０８２で処理したマウスでは１５ま たは２１日までピークにならず、および未処理および緩衝液処理マウスに比べて １１．１３および１５日の症状がより軽かった。ＴＰＴで処理したマウスは軽い 間質角膜炎を１５日に起こしたが、２１日までにきれいになった。

１１、１３および１５日の時間経過データは、統計的に有意な差異に関し、９５ Ｌ　９０％および８５％の信頼水準（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ　１ｅｖｅｌｓ）で アッパ（ＡＮＯＶＡ）により分析された。結果を表５に示す。

表５ この分析では１１．１３および１５日における角膜の間質角膜炎および血管新生 の症状を、未処置および緩衝液処理マウスよりもｌ５ＩＳ　１０８２溶液が有意 に減じたことを示す。幾つかの例では、疾患点数は１日は有意に異なっていても 、他日はそうではないであろう。有意に差があるべきであったのにそうでない群 も見いだされた。例えば、０．３％ｌ５ＩＳ　１０８２処置マウスについての間 質角膜炎点数は、１５日において緩衝液処置マウスよりも有意に差があったが、 １．０％ｌ５ＩＳ　１０８２処置マウスは、二つの群で同じ疾患点数を有するに もかかわらず、有意に差がない。このデータの統計的解釈の難しさは疾患点数の 多様性、および、このような研究には通常の、試料サイズの大きさによって引き 起こされる。

Ｉｎ　ｖｉｖｏ複製に対する処置の効果マウスをＨ３Ｖ−Ｉ　ＫＯ３ｌＸｌ０’ 　ｐｆｕで感染し、感染後１．２．３．６．８および１０日に、目、ＴＧ、およ びまぶたを取り出し、感染ウィルスの量を上述のように測定した。結果を表６に 表す。

ｌ５ＩＳ　１０８２に対する投与応答 図７に表される結果は、ある程度の薬剤投与効果が目の疾患に対しであることを 示す。図８は、眼瞼炎、血管新生、および間質角膜炎に関して、感染後１１．１ ３および１５日の薬剤点数対疾患点数を表す。一般的に疾患の症状は０．３％お よび１．０％ｌ５ＩＳ　１０８２（’）投与ニヨッ”：ｍ少する。ｌ５ＩＳ　１ ０８２１７）高投与（１，０％）は、低投与（０，３％）よりもより効果的では なかった。ｆｌｓＶ−１，Ｋ２Ｓ株に対して、間質角膜炎のマウスの目のモデル については、ｌ５ＩＳ　５．０％溶液と低い濃度との比較の抗ウイルス効果が、 図９にまとめられている。そこに示されるように、ｌ５ＩＳ　１０８２５．０囃 液が、感染後１１日に平均疾患点数において有意に改良を与える。５．０寝液で の症状の軽減は、０．３％よりも高く、そして、０．１％溶液での軽減よりも高 かった。投与依存効力曲線は、初期実験で観察された効果と同様で、これは図７ および８にまとめられた。

潜伏期間の確立 潜伏期間に対する薬剤処置効果も測定された。ＴＧはＩ）ｉ　２８日に取り出さ れた。

組織の半分で直接感染ウィルスのアッセイを行い、残りの試料はＶｅｒＯ細胞と コーカルチベーシジンを行うことによって再反応性潜伏感染に関してアッセイさ れた。

ウィルスに関して直接滴定した時、陽性の組織はなかった。表７に示される、１ ゜０％ＴＰＴで処置されたいずれのマウスのＴＧも、再反応性ウィルスに関して 陽性ではなかった。再反応性ウィルスはすべての他の処置群のマウスのＴＧで検 出された。

１４日までのコーカルチベーシジンにより、６０と１００％との間の試料が陽性 であった。

表７ ａ　ウィルス　処置　再反応性 ７日　１４日 なし　コ１５（６０１４１５（Ｍｏｌ コーカルチャー確立後の日 Ｉ陽性数ｌ試験数 実施例３ ＨＳＶＳ産生に対する種々のオリゴヌクレオチドの効果種々のオリゴヌクレオチ ドの効果をｌ１ｌＳｖの複製に関して、感染生産量アッセイを使用して一般的に 実施例１に記載されるように検討した。

ＨＳＶ−１株、Ｐ＾＾ｒ５およびＤＭ、　２．１はプローツウニルカム社（Ｂｕ ｒｒｏｕｇｈｓ　Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から得た。ｌｌ５Ｖ−１ およびＨＳＶ−２１ＪＬ１３　ＲＮＡ５のｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成について使用し たプラスミドは、■Ｓｖ遺伝子に関連する片を、転写ベクターｐｓＰ７２（プロ メガコーポレーション：Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のポリリン カー領域中のＫｐｎ　ＩおよびＢａｍｆｌｌ制限酵素エンドヌクレアーゼ部位に クローニングして構築した。プラスミドｐＩＰ−１中への挿入は、ＨＳＶ−Ｉ　 ＤＮＡの３２４５ヌクレオチドＫｐｎｌ−ＢｇｌＨ断片からなり、この断片は■ ＳＶ−ＩＢｇｌｆｉ断片ＯＤＮＡを含有するプラスミドｐＩＢＯ１（コネクチカ ット州、コネクチカット健康センター大学のＳ、　ｆｅｌｌｏｓｌｕｅｒの好意 より提供された。）から得た。

このＫｐｎｌ−Ｂｇｌｌ断片は、ＨＳＶ−Ｉ　ＵＬ１３　＋ｆＮＡの５′非翻訳 部分中の＋６８ヌクレオチドから始まるコード配列を含み、ＵＬ１３タンパク質 をコードする全オープンリーディングフレイムを越えて、［ＪＬ１３　ｄＮＡ中 の＋３３１３ヌクレオチドで終止する。プラスミドｐＩＰ−２内の挿入は、ＨＳ Ｖ−２ＤＮＡの１６８４ヌクレオチドＫｐｎｌ−Ｂａｇ　Ｈｌ断片から成り、こ の断片はｔｌＬ１３遺伝子に相同的であるＨＳＶ−２のコード領域を含有するプ ラスミドＢＥＤＪ（カリフォルニア州、イルビン、カリフォルニア大学のＥ、　 Ｗａｇｎｅｒの好意より提供）から得た。このＫｐｎｌ−Ｂａｓａｌ断片は、Ｈ ＳＶ−２ｄＮＡの５′非翻訳部分中の＋６８ヌクレオチドから始まるコード配列 を含み、［１３タンパク質をコードする全オープンリーディングフレイムを越え て、ＵＬ１３　ｄＮＡ中の＋１７５２ヌクレオチドで終止する。プラスミドｐＩ Ｐ−１およびｐＩＰ−２内のこのＤＮＡ挿入物は、プラスミドに含有されている Ｔ７プロモーターからの転写がウィルスセンス−鎖（ｓｅｎｓｅ−ｓｔｒａｎｄ ）転写物を与えるように配置される。

転写試薬はプロメガコーポレーションから得、操作手順は製造元が指示するよう に行フた。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ＵＬ１３リーディングフレイムをそれぞ れコードする、ｐＩＰ−１およびｐＩＰ−Ｚ　ＲＮＡ５を製造するために、プラ スミドｐＩＰ−１およびｐＩＰ−２は制限酵素Ｘｂａｌでの消化（これはｐｓ７ ２０にクローンされたＨＳＶ　ＤＮＡ配置の単一３°部位でＤＮＡを切る）によ り直線状する。この直線状プラスミドはＴ７　ＲＮＡポリメラーゼでのｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ転写用の鋳型として使用された。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写物は、鋳型ＤＮ ＡをＲＱＩ　ＤＮａｓｅで消化して精製しく２０分、３７℃）フェノール、クロ ロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２度抽出し、クロロホル ム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、３．７５Ｍ酢酸アンモニウム および７０％エタノールで沈殿し、ジエチルピロカーボネイト（ＤＥＰＣ）−処 理水中に再懸濁した。ＲＮＡ調製物の保全度および純度は、常法に従い変性ホル ムアルデヒドアガロースゲルでアリコートの電気泳動により確証１２０ｎＨの適 当なＲＮ＾試料、４μｍのラビット赤血球溶解物、１μｍのメチオニンフリーア ミノ酸混合物、１μｍの［３５Ｓ］メチオニン（５μＣｉ、　＞１０００　Ｃｉ ／ｍｍｏ１．ニューイングランドヌクレアー：Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ ｌｅａｒ）、を全容量１２μｍに含んだ。翻訳混合物を１時間３″ｒｃでインキ ュベートした。翻訳後、１２μｍの翻訳混合物を１２Ｉｌｌの２ｘレムリーロー デイング緩衝液（ＬＸ−８８トリス−塩酸、ｐＨ６，８；２％ドデシル硫酸ナト リウム［ＳＤＳ］　；　５゜０％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロー ル：および０．００１％ブロモフェノールブルー）に加え、沸騰湯浴中で１０分 間加熱し、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳生産物を１０％ポリアクリルアミド−３ ＤＳ（レムリー）ゲルで解析した。生成したゲルを真空下で乾燥角えずに１時間 ３７℃で予めインキュベートした。

オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムダ３８０ Ｂモデル）で実施例１に記載されたように標準ホスホアミダイト化学を使用して 合成された。ホスホチオエートオリゴヌクレオチドに関しては、各カップリング の後、０、２Ｍ　”Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキ シドをアセトニトリルに溶解ために、伸長するオリゴヌクレオチドを各スルファ リゼーシジン工程後にキャップした。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドに 関しては、メチルホスホアミダイト塩基をグレンリサーチコーポレーション（Ｇ ｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得た。すべてのオリ ゴヌクレオチドを凍結乾燥によって精製し、使用直前に工タノール沈殿を２度行 った。オリゴヌクレオチド調製物の純度および保全度はアクリルアミドゲル電気 泳動で決定した。

クローン原性アブセイの各実験点について、ＨｅＬａ細胞（５ｍｌ　Ｄｌ［ＥＩ Ｉ−１０％心中に２５００細胞）を３連で６軸■２組織カルチャープレートに植 え、１８時間３７℃でインキュベートした。−昼夜のインキュベーションの後、 細胞を新鮮な培地（ＩＳＩＳ　１０８２またはアシクロベアー（Ａｃｙｃｌｏｖ ｉｒ）を適宜含む）の上に被覆し、３Ｅ１．３’′ｒｃでインキュベートした。

薬剤処理の後、細胞を新鮮な培地の上に被覆し、固定およびクリスタルバイオレ ットでの染色に先立ち６Ｂ、３ＴＣでインキュベートした。化合物のＨｅＬａ細 胞に対する毒性効果を測定するために、染色された細胞を数え、未処理ＨｅＬａ 細胞の平行カルチャーからの計数と比較した。

種々のヌクレオチド配列および主鎖組成を含む多様なオリゴヌクレオチドの抗ウ ィルス活性は、抗−Ｈ５Ｖ活性をｔｎ　ｖｉｔｒｏで有するｌ５ＩＳ　１０４３ の阻害活性と比較された。試験したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配 列、それらの標的ＩＩＲＮ＾領域および主鎖組成を表８に掲げる。

！８ オリゴ 番号　［配列　Ｌ星ユ１Ｌ二五　弗孟チー≧！ニー１０４：ｌ　Ｐ−ＯＣ；ＴＣ ＣＧＣＭＣＣＡＴＣ；ＴＣＣＣＣＩ　ＨＳＶ−１ＵｔＡ８　λυＣ，’１０４４ 　Ｐ−０’ＧＧＡｃＴｃＡＴｃｃＡＴｃＣＴＴＣＣＧｃｃ　）１５ｖ−１０ＬＤ 　ＡＵＧ−１”１０７６Ｐ−５０ＣＡＣ＋ｒＣＪｋＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＧＧＣ ＣＭＳＶ−ＩＷｌコ＾υＧ−１”（２）翻訳での０Ｌ１３　＠Ｒ１１＾からの低 い翻訳活性水準を指揮する第二■訳開始コドンである。

０、５ｐｆｕ／細胞のウィルス多重度をこれらの活性スクリーニングに使用した 。ＨＳＶ−１およびＨｓＶ−２に対して表された抗ウィルス活性の比較を図１０ に表す。Ｐ−０主鎖を有するオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果の比較は、使 用したｎｓｙサブタイプおよびオリゴヌクレオチド配列の両方に依存したＨｓｖ 感染生産量の減少を示した。

広い抗ウィルス活性はｌ５ＩＳ　１０４９の使用に観察された。驚くべきことに 、ｌ５ＩＳ　１０４７はそのヌクレオチド配列がｌ５ＩＳ　１０４９とは単に５ °末端塩基が異なるだけであるのに、感染ウィルス生産量阻害形成においてｌ５ ＩＳ　１０４９はど効果的ではなかった。

Ｐ−０オリゴヌクレオチドで観察される阻害の傾向は、すべての実験で一致し、 阻害活性の絶対的水準はかなり変化する（すなわち、ｌ５ＩＳ　１０４９はＨＳ Ｖ複製の普遍的に最高な阻害剤であるが、５つの実験において、その阻害の水準 は１８％の低さから６３％の高さの範囲であった。この可変性は、ウシ胎児血清 （ＦＣＳ）が熱不活性化された時の温度の差異によることが分かった。図１に示 される阻害の水準は、６５℃で熱処理された芭３を使用して得たものであった。

この血清の処理は、その後のすべての実験で標準化された。

オリゴヌクレオチド主鎖のＰｗｏ構造からＰ−３構造への変換は、試験したすべ ての新規オリゴヌクレオチドの抗−、ＥＳＶ活性を大幅に増大した（図１０）。

Ｐ−０オリゴヌクレオチドで観察された血清の効果と比較して、ならびに血清ヌ クレアーゼによる消化に対するＰ−Ｓオリゴヌクレオチドの耐性増加に一致して 、Ｐ−Ｓオリゴヌクレオチドの阻害活性は玖Σ熱−処理の温度変化には依存しな いことが分かった。

ＨＳＶ−１複製のｌ５Ｉ３１０８２阻害に関するウィルス多重度の効果ｌ５ＩＳ 　１０８２の抗ウィルス活性に関する初期ウィルス負荷（ｂｕｒｄｅｎ）の効果 を、感染生産量アッセイを使用して検討した。細胞を０．０５．０．１．０．２ ５．０．５．１．０または２．５ｐｆｕ／細胞のいずれかの酊０で、４ｇＭ濃度 のｌ５ＩＳ　１０１１！２の存在または非存在下で感染させた。ｌ５ＩＳ　１０ ８２をこの実験に選択したのはその類似体、ｌ５ＩＳ　１０４９、の広い抗−Ｈ ３Ｖ活性およびＰ−Ｓオリゴヌクレオチドの持つ増加したヌクレアーゼ耐性から である。この多重度範囲にまたがるＨＳＶ（でのＢｅＬａ細胞の感染は、多重度 が５０倍増加したのに対し、最低ＭＩＯ（０，０５ｐｆｕ／細胞）から最高ＭＩ Ｏ（２，５ｐｆｕ／細胞）の間で３倍の感染ウィルス生度量の増加をもたらした に過ぎない（表９）。

表９ 投入　閾工４　工５１５１０Ｂ２　ウィルス生産量　１対照（ｐｆｕ／細胞）　 （ｐｆｕ／ｍｌ）　生、。

０．５　４２．０　土フ、Ｏｘ　１０’＋　７１０　土コ、Ｏｘ　１０５　１． ７ｏ、２５　−　３５．０　土　３．Ｏｘ　ＬＯ’＋１１．１　＋　０．５　ｘ 　１０”　３．２０．１　−　３５．０　＋　１．０　Ｘ　１０’＋　１１１． ５　土コ−５ｘ　１０’　０．５０．０５　−　ＩＬｓ土０．５　ｘ　１０’＋ 　１５．５土３．５　ｘ　１０’　０．８この多重度の同じ範囲にまたがり、ｌ ５Ｉ３１０８２の抗ウイルス効果は、ｌｌｌ０１．Ｏｐｆｕ／細胞での９０．３ ％の低い阻害から酊００．１　ｐｆｕ／細胞での最高水準の阻害（９９，５％） まで変化した。これゆえに、０．１とｌ、Ｑｐｆｕ／細胞の間のＭＩＯを使用し た時、生産された感染ウィルスの量は、投入ウィルスの量に対する単純な数学的 関連を反映しなかった。しかし逆に、ｌ５ＩＳ　１０８２の抗ウイルス効果は、 ＩＩＯのこの範囲にわたって投入ウィルスの量を反対に反映した。

オリゴヌクレオチドの抗ウィルス活性に対する主鎖組成の効果オリゴヌクレオチ ドの抗ウィルス活性に対する主鎖組成の効果を、平行アッセイで３種のオリゴヌ クレオチド配列の種々の類似体を比較することによって検討した。ｌ５ＩＳ　１ ０４７のヌクレオチド配列およびこの配列を短く変更した物は、ｌ５ＩＳ−１３ ０１に見い出されたが、Ｐ−０，Ｐ−３およびＭｅＰ主鐘を有して合成された。

感染生産量アッセイにおけるこれらのオリゴヌクレオチドの抗ウィルス活性を、 Ｋｕｌｋａら、表１０ 、１１１０−０．５ｐｆｕ／細胞投入量で使用されたＢ５１−１　（１０５株） 決定するために使用した値は、２−３の実験のプールした試料からの二つの膚定 の平均を計算して達成した。すべてのオリゴヌクレオチドは、１００ｆｆ１の濃 ｆテ９９ｘ＞以上の阻害を与えた。

一のオリゴヌクレオチド配列のメチルホスホネート層似体はプラーク減少アラ七 イニオいて抗−Ｈ５Ｔ活性を表すと以前報告された。

４ｔｉＭまたは１０ｈｉｌのいずれかのオリゴヌクレオチド濃度で、ｕｓｖ−１ プロジェニシス（ｐｒｏｇｅｎｓｉｓ）の阻害の程度はおおざっばに各メチルホ スネートオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ　１２３７１２７７および１２３６）と 等しい。４μＭのオリゴヌクレオチド濃度で、１１ｅＰオリゴヌクレオチドによ り示される抗−Ｈ３Ｖ活性は、試験した両方の■Ｓｖサブタイプで同様であった 。ｌ５ＩＳ　１２３７および１２７７に関し、ＭｅＰ類似体の抗ウィルス活性は 対応するそれぞれのＰ→類似体、ｌ５ＩＳ　１０４７及び１３０１、で観察れる それよりも良かった。２１−および１５−ヌクレオチド配列のホスホロチオエー ト類似体は（それぞれｌ５ＩＳ　１０８０およびｌ５ＩＳ　１３０２）は、ｌ５ ＩＳ　１２３７又はｌ５ＩＳ　１２７７のいずれかを使用して観察した時よりも はるかに増大した抗ウィルス活性を示した。驚くべきことに、ＨＳＶ−１おヨヒ ｌｌ５Ｖ−２複製ノイずれもがｌ５ＩＳ　１２３５、ｌ５ＩＳ　１２３６ノＰ＝ Ｓ類似体、ニ１ｔｌｌｌｌ害されなかった。比較的すると、抗ウィルス活性の水 準は、オリゴヌクレオチドの長さの差異よりも、オリゴヌクレオチドの主鎖組成 又はヌクレオチド配列組成の変化により太き（影響された。

ＵＬ１３１？Ｎ＾のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳に対するｌ５ＩＳ　１０４９および１ ０８２の効果ｒＳＩＳ１０４９及ヒ■５ＩＳ１０８２オリコヌクレオチドカ特Ｍ 的ｔ：標的ＵＬ１３ＲＮＡ（ｐＩＰ−１ｔたはｐＩＰ−２転写物）に結合する能 力および翻訳阻害をする能力を、ウサギ赤血球溶解物を使用して、ｉｎ　ｖｆｔ ｒｏ翻訳に関して検討した。ｌ５ＩＳ　１２３８、これはｌ５ＩＳ　１０８０ヌ クレオチド配列を交ぜた変更体から成るが、を翻訳活性について影響を与える非 特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド用の対照として含んだ。ヒト５− リポキンゲナーゼ転写物のＲＮＡ配列を含有するｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成転写物（ ５ＬＯ）を、ｌ５ＩＳオリゴヌクレオチドの異種構造のＲＮＡ５翻訳に対する効 果を決定するために使用した。

ｐＩＰ−Ｉ　ＲＮＡ（図１１人）の翻訳は、約６１ｋＤの大きさくｍａｓｓ）の 主要ポリペプチド産物および多くのより小さい産物、最も顕著なポリペプチドは ３３ｋＤの大きさでｌ５ＩＳ　１０８０（１０８２）および１９４７（１０４９ ）オリゴヌクレオチドに相補的な第二ＡＵＧコドン領域から始まる、の合成をも たらした。定量的に、ｌ５ＩＳ　１０４９はｌ５ＩＳ　１０８２よりもｐＩＰ− Ｉ　ＲＮＡ翻訳のより良い阻害剤であったが、これはさらにｌ５ＩＳ　１２３８ よりも良い阻害剤であった。定性的に、ｌ５ＩＳ　１０４９および１０８２によ るｐＩＰ−ＩＲＮ＾ＲＮＡ翻訳は、わずかに異なる分子機構によって操作される ようだ。ｌ５ＩＳ　１０８２および１０４９の両方で、さらにオリゴヌクレオチ ドの添加はｐＩＰ−Ｉ　ＲＮＡから合成された完全長ポリペプチドの量の減少を もたらした。加えて、ｌ５ＩＳ　１０４９での阻害は、３つの小さなポリペプチ ド産物、３３．２８および２６ｋＤの大きさの注目すべき増加をもたらす。この ３３ｋＤポリペプチドは未処理試料中で低濃度で合成されるポリペプチドと同じ である。

この２８ｋＤのポリペプチドは、６１ｋＤの短縮変更体と思われ、ならびに２６ ｋＤポリペプチドはｌ５ＩＳ　１０４９標的領域に対して３′に位置するもう一 つのインフェイズ（１ｎｐｈａｓｅ）ＡＵＧから始まると思われる。同様な阻害 パターンが、ｐｒｐ−２からの両方の相同的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写物（ｖ！Ａ１ １１Ｂ）がハイブリダイゼーション混合物中でｐＩＰ−Ｉ　ＲＮＡに置換される と観察される時、ならびに翻訳が小麦胚芽溶解物を使用して行われた時に観察さ れた。

ＲＮＡの翻訳についてオリゴヌクレオチドの非特異的阻害効果は最小であった。

工ＳＩＳ　１２３８は、ｐＩＰ−Ｉ　ＲＮＡの翻訳のわずかな、しかし検出し得 る阻害を表したが、いずれのオリゴヌクレオチドも異種構造の５ＬＯＲＮＡの翻 訳に対する阻害剤ではなかった。

ＨＳＶ−２複製に対するアシクロベアーおよびｌ５ＩＳオリゴヌクレオチドの比 較抗ウイルス効果 ＨＳＶ−２（ＢＧ５２株）に対ｔ　ルア　シフｏへ７　（ＡＣＶ）、　ｌ５ＩＳ 　１３０２．　ｌ５ＩＳ　１０８０．およびｌ５ＩＳ　１０ｇ２についての投与 応答曲線は、感染生産量アッセイを使用して決定された。

ＡＣＶ保存溶液（４ｍＭ）をジメチルスルホキサイド（ＤＭＳのに溶解したので 、Ａ（Ｊ−処置試料のウィルス力価を０．０２５％のＤＭＳＯで処置した対照感 染からの力価と比較した。Ｄｌ［Ｓ〇−処置試料に対して計算された対照ウィル ス生産量は、未処理試料で観察された生産量より約３０％大きかった。表された 投与応答曲線を図１３に示す。４つの化合物の各々は投与−依存様式でＨＳＶ− ２複製に影響を与えた。図１２からのデータに示されるように、これらの化合物 １ｎ−）ＬＮテノＩＣ，。値は、ＡＣＶ、　ｌ５ＩＳ　１３０２．　ｌ５ＩＳ　 １０８２オよびｌ５ＩＳ　１０８０についてそれぞれ６００ｍＭ、　２ｇＭ、　 ４３０ｎＭおよび２５０ｎＭと計算された。ｌ５Ｉ３１０８０およびｌ５Ｉ３１ ０８２１：関する投与応答曲線の勾配は、感染＋：ａｓｖ−１ま７’：　ＩｔＨ ３Ｖ−２の他の株を使用した時変化した（例えば図１２）。

２種のｆｌｓＶ−１株の複製に対するｌ５ｒＳ　１０８２の投与依存効果２主の ＨＳＶ−１株、ＫＯ３およびＦに対するｌ５ＩＳ　１０１１！２の抗ウイルス効 力が、既知の抗−Ｈ５Ｖ化合物、八Ｃｖおよび非相補的ホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチド、ｌ５ＩＳ　１２３８の両方の抗ウイルス効力と比較された：こ のオリゴヌクレオチドは、ｌ５ＩＳ　１０８０の混合変更体（ｓｃｒａｍｂｌｅ 　ｖｅｒｓｉｏｎ）から成るが、翻訳活性についての非特異的オリゴヌクレオチ ド効果のために対照として提供される。これらの研究において、ｌ５Ｉｓ　１２ ３８はｌ５ＩＳ　１０８２またはＡＣＶのいずれよりも、たいへん低い阻害剤で あった。ｒＳＩＳ　１０８２およびＡＣＶはＫＯＳ株を予言されたＩＣ，。Ｓが それぞれ２．７３および２，５７μ舅で阻害した（図１３）。ＡＣＶおよびｌ５ ＩＳ　１０８２のＩＣ，ｏｓはウィルスのＦ株に関してそれぞれ３６および５． ８μ麗と補作された（図１４）。ＡＣＶおよびｌ５ＩＳ　１９８２のＩＣ，。値 は両方のウィルス株について同様であるが、投与応答曲線は、株−特異的阻害パ ターンがこれらの化合物で処置したＨＳＶ株の間に存在することを示す。

ＨＳＶ−１のへＣｖ−耐性株の複製に対するｌ５ＩＳ　１０８２の投与依存効果 ｌ５ＩＳ　１０８２の抗ウイルス効力は、フタツノＨｓＶ−１ノＡＣｒ株テアル ＤＭ２．１株（ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子を欠いている）およびＰＡＡｒ ’　（ウィルスＤＮＡポリメラーゼ中に変更ヌクレオチド結合部位を発現する） を使用して検討した。両方のウィルス株とも、４００ｎＭ、　８００ｎｉｌまた は４μ麗の濃度のｌ５ＩＳ　１０８２で処置した。比較のために、各棟を同濃度 の八Ｃｖで平行感染させて処置した。試験した濃度で、Ａ（Ｊはいずれの株にも 投与−依存様式では影響を与えず、一方ｌ５ＩＳ　１０８２は両方の株のウィル ス生産量を投与−依存様式で阻害した（図１５）。ｌ５Ｉ３１０８２に関するＩ Ｃ，。値は、このデータから、ＨＳＶ−１のＤＭ２．１およびＰＡＡｒ’株それ ぞれで３００ｎｌｌおよび６００ｎｉｌになると予想された。他のＨＳＶ−１株 （図１３．１４）または［ｆＳＶ−２Ｃ図１２）を処理した時に観察されるのと 同じ水準のＤ）１２．１株での生産量の減少は、ｌ５ＩＳ　１０８２がウィルス チミジンキナーゼ酵素によるオリゴヌクレオチドのリン酸化を要求しないことを 示した。

ｌ５ＩＳ　１０８２およびＡＣＶの比較細胞毒性ｌ５ＩＳ　１０８２およびＡＣ Ｖの細胞毒性は、ＨｅＬａ細胞中でのクローン原性アッセイを使用して評価し、 これは感染生産量アッセイに関して使用された化合物の被爆時間を反映した。こ のアッセイにおいて化合物濃度１０ｈｌｌで、ｌ５ＩＳ　１０８２およびＡＣＶ のいずれもＢｅｔａ細胞のクローン原性能力の５０％減少を引き起こした。ｌ５ ＩＳ　１０８２およびＡＣＶのそれぞれについて、ＨＳＶ−２（図１２）に対し て平均ＩＣ，。値である２７５ｎＭおよび３００ｎＭを使用して、化合物の治療 指数（ＴＩｓ、　ＴＩ−ＬＣ５６／ＩＣ５ｏ）が計算され、ｌ５ＩＳ　１０８２ に関しては〉３６０、ならびに八Ｃｖに関しては〉３３４となった。これゆえに 、これらの実験からのｌ５ＩＳ　１０８２について予想されたＴＩはＡＣＶのそ れに匹敵した。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人・ドラパーら（Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）（１、発明の名称 、ヘルペスウィルスの効果を調節するためのオリゴヌクレオチド治療法 （ｆｆｌ）配列の数：１２ （ｔｖ）宛先： （Ａ）住所、ウッドコック・ウォシュバーン・カーラ、マンキーヴッッ＆ノリス （ｌｌｏｏｄｃｏｃｋ　ｆａｓｈｂｕｒｎ　Ｋｕｒｔｚ、Ｍａｃｋｉｅｖｆｃｚ 　＆　Ｎｏｒｒｉｓ）（Ｂ）地区：ワン・リバティ”ブレイス、４６階（Ｏｎｅ 　Ｌｉｂｅｒｔｙ　Ｐｌａｃｅ−４６ｔｈ）（Ｃ）市：フィラデルフィア （Ｄ）州：ペンシルバニア （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （Ｙ）コンピューター読み取り形式： （＾）中型：小型ディスク、３．５インチ、記憶装置１．４４Ｍｂ（Ｂ）コンピ ューター：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯ３ （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト５．０（ｖｉ）現在の出願試料： （Ａ）出願番号：　ｎ／ａ （Ｂ）出願日：これに添えて （Ｃ）分類 （ｖｉ）先行出願資料： （＾）出願番号：　４ｇ５，２９７ （Ｂ）出願日＋　１９９０年２月２６日（ｖｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名ジエイン・マシー・リカタ（Ｊａｎｅ　Ｍａｓｓｅｙ　Ｌｉｃａｔａ ）（Ｂ）登録番号・３２．２５７ （Ｃ）照会／事件整理番号：ｌ５ＩＳ−００８５（Ｘ）通信情報： （＾）電話（２１５）５６８−３１００（Ｂ）ファクシミリ（２１５）５６８− ３４３９（２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝１８ （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖の数−末鎖 （Ｄ）トポロジー・未知 （ｉｖ）アンチ−センスＹ （Ｘｌ）配列種類配列番号Ｉ ＧＴＣＣＧＣＧＴＣＣＡＴＧＴＣＧＧＣ１８（２）配列番号２の情報 （１）配列の特徴 （＾）配列の長さ：２１ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数−末鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｖ）アンチ−センスＹ （ＸＩＩ）配列種類：配列番号２ ＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＧＧＣＣ２１（２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、２１ （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・未知 （ｔｖ）アンチ−センス：Ｙ （ｘｉ）配列種類：配列番号３ ＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴｒＣＡＡＣＡＧ　Ａ　２１（２）配列番号４の情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝２１ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・未知 （■）アンチ−センス、Ｙ （ｎ）配列種類：配列番号４ ＣＧＣＧＧＡＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧ　Ｇ　２１（２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝２１ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー、未知 （汁）アンチ−センス、Ｙ （ｘｉ）配列種類：配列番号５ ＾ＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＡＣＧ　Ｃ２１（２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｔｖ）アンチ−センスＹ （ｎ）配列種類：配列番号６ ＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＧＣＣ２１（２）配列番号７の情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝２１ （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｆｖ）アンチ−センス・Ｙ （ｘｉ）配列種類・配列番号７ ＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＡＣＧ　Ｃ２１（２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：２１ （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖の数−末鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （汁）アンチ−センス：Ｙ （Ｘｌ）配列種類：配列番号８ ＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡ＾　２１（２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１５ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｘｉ）配列種類：配列番号９ ＧＡＧＧＴＣＣＡＴＧ　ＴＣＧＴ＾　１５（２）配列番号１０の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１２ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・未知 （ｎ）配列種類：配列番号１０ ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧ　１２ （２）配列番号１１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１５５７ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数・−末鎖 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｎ）配列種類：配列番号１１ ＡＣにＴＡＣＡＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＧＣＣＴＣＣＧ　ＧＧＣＧＣ ＣＣＣＡＧ　ＣＧＧＣＣＣＣつ（？ＣＣＡＧｆＪＣＧ　ＣＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣ ＣＣＣ’！’ＣＣＩＣ（ＪＣＧＧＧ？ＣＣＣ（：ＣＣＡＣＣＧＡＴＣ２００ＧＡ ＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＴＴＴＡＣＧＧ　Ａ’ｌ”ＣにＣＴＣＴＡＴ　λＡＡ’ ｒｒＡＣＣＡＧ　ＣＡＣＡＣλＣＡＣＡ　１４５０にＴＣＧ’ＴＧＡ　１５５７ （２）配列番号１２の情報 （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ　１５５７ （Ｂ）種類°核酸 （Ｃ）鎖の数−水路 （Ｄ）トポロジー未知 （ｘｌ）配列種類配列番号１２ ＴＣＧＴＧＡＴＧＣＴ　ＧＣＧＡＴＣＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＴＣＧＣＴＣＣＧＧ ＣＧＧＧＣＣＧＴＣσに心ＣＣ９００Ｇ入ＣＴＩＴＡＧＣＣＴ（、ＧＴにＡＣＣ ＣＴ　ＧＭＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＡＣＧＡ’！’ＡＴ　ＣＣＣＧＧＧＧＣＣＡ　 ９５０ＧＴＣＧＴＩＩ；Ａ　１５５７ い　ト　い　ト　い　ト　い　ト　膿　さ　い　さ　１　トド　ＯＮ　ぐ　ト　 ω　へ　−ｆ　ｈ　Ｏｈ　へ　臂　ト　の１”’ｌ　Ｍ　？　？　臂　！　い　 １　い　い　噛　１　１　１ｒｒ１σ　吋 −Ｓ＋１１１つ ＦＩＧ、ｌｌＡ ２００　−ｍ−１智− −Ｌ々、／Ｊ 要約書 ヘルペスウィルス感染の処置および診断に関する方法が提供される。好適な態様 によれば、ヘルペス単純ウィルス１型のオーブンリーディングフレームＵＬ５． 　ＩＪＬ８、　ＵＬ９．　ＵＬ１３．　ＵＬ２９．　ＵＬ３０．　ＵＬ３９．　 ＵＬ４０．　ＩＩＬ４２．および孔５２のひとつに対応する遺伝子由来のＲＮＡ またはＤＮＡと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。

オリゴヌクレオチドは該特異的ハイブリダイゼーションを生じるために十分な同 一性および数のヌクレオチド単位から成る。他の好適な態様によれば、オリゴヌ クレオチドは翻訳開始部位に特異的にハイブリダイズする；それらはＣＡＴ配列 であることも好ましい。ヘルペスウィルスに感染していると疑われる動物を処置 する方法であって、動物を前述したヘルペスウィルスの遺伝子由来のＲＮＡまた はＤＮＡと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させることか ら成る方法が開示される。ヘルペス単純ウィルス１型、ヘルペス単純ウィルス２ 型、サイトメガウィルス、ヒトヘルペスウィルス６、エブスタンンバーウイルス または水痘帯状庖疹ウィルスにより引き起こされる感染の処置法が開示される。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　８月、ｌ−７日 特１庁長官　麻　生　渡　′　Ｄ暫 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０１３２７ ２、発明の名称 ヘルペスウィルスの効果を変調するオリゴヌクレオチド治療法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国カリフォルニア用９２００８．カールズパッド。

ファラデイ感アベニュー　２２８０ 名　称　アイシス・ファーマシューティカルス・インコーホレーテッド４、代理 人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ０、５ｐｆｕ／細胞のウィルス多重度をこれらの活性スクリーニングに使用した 。ＨＳＶ−１およびＦｉＳＶ−２に対して表された抗ウィルス活性の比較を図１ ０に表す。Ｐ＝０生鎖を有するオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果の比較は、 使用した）ＩＳＶサブタイプおよびオリゴヌクレオチド旧刊の両方に依存した■ Ｓｖ感染生産量の減少を示した。

広い抗ウィルス活性はｌ５ＩＳ　１０４９の使用に観察された。驚くべきことに 、ｌ５ＩＳ　１０４７はそのヌクレオチド配列がｌ５ＩＳ　１０４９とは単に５ °末端塩基が異なるだけであるのに、感染ウィルス生産量阻害形成においてｌ５ ＩＳ　１０４９はど効果的ではなかった。

Ｐ−０オリゴヌクレオチドで観察される阻害の傾向は、すべての実験で一致し、 阻害活性の絶対的水準はかなり変化する（すなわち、ｌ５ＩＳ　１０４９はＨ３ Ｖ複製の普遍的に最高な阻害剤であるが、５つの実験において、その阻害の水準 は１８％の低さから６３％の高さの範囲であった。この可変性は、ウシ胎児血清 （ＦＯ）が熱不活性化された時の温度の差異によることが分かった。図１０に示 される阻害の水準は、６５℃で熱処理されたＦｅ２を使用して得たものであった 。この血清の処理は、その後のすべての実験で標準化された。

オリゴヌクレオチド主鎖のＰ−０構造からＰ＝Ｓ構造への変換は、試験したすべ ての新規オリゴヌクレオチドの抗〜Ｈ３Ｖ活性を大幅に増大した（図１０）。Ｐ −〇オリゴヌクレオチドで観察された血清の効果と比較して、ならびに血清ヌク レアーゼによる消化に対するＰ−Ｓオリゴヌクレオチドの耐性増加に一致して、 Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドの阻害活性はＦ０熱−処理の温度変化には依存しない ことが分かった。

手続補正書 平成　４年　８月ユ１日 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０１３２７ ２、発明の名称 ヘルペスウィルスの効果を変調するオリゴヌクレオチド治療法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国カリフォルニア用９２００８゜カールズパッド、ファラ デイ・アベニュー名　称　アイシス・ファーマシューティカルス・インコーホレ ーテッド ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正の対象 請求の範囲 （別紙） １．特許請求の範囲を次のとおり訂正する。

「１．ヘルペス単純ウィルス１型のオープンリーディングフレームＵＬ５．　Ｕ Ｌ８．　ＵＬ９．　ＵＬ１３．　ＵＬ２９．　ＵＬ３０゜ＵＬ３９．　ＵＬ４０ ．　ＵＬ４２およびＵＬ５２のひとつに対応する遺伝子由来のＲＮＡまたはＤＮ Ａと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド 類似体であって、該オリゴヌクレオチドが該特異的ハイブリダイゼーションを生 じるために十分な同一性および数のヌクレオチド単位から成るオリゴヌクレオチ ドおよびオリゴヌクレオチド類ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＧＧＣＣＡＴ　ＴＴＣＡＡＣ入 Ｇ袖配列番号３）ＣＧＣＧＧＡ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＧＣＡＧＣＡＧＧ、配列番号 ４・入。。ＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＡ　ＣＧＣ配列番号５・（、ＧＡ 　ＣＴＣＡＴＣＣＡＴ　ＣＣＧ　ＴＣＣＧ（Ｃ，配列番号６・ＧＣＣＧＡＧ　Ｇ ＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＡ　ＣＧＣ，配列番号７・およびＧＣＧ　ＧＴＴ　ＧＧ ＣＣＡＴ　ＴＧＧ　ＡＡＣＣＡＡ、配列番号８から成るオリゴヌクレオチド。

３、ウィルスまたはウィルスに感染している動物を、ヘルペス単純ウィルス１型 のオープンリーディングフレイムＵＬ５．　ＵＬ８．　ＵＬ９．　ＵＬ１３．　 ＵＬ２９．　ＵＬ３０．　ＵＬ３９゜ＵＬ４０．　ＵＬ４２およびＵＬ５２のひ とつに対応する遺伝子由来のＲＮＡまたはＤＮＡと特異的にハイブリダイズする オリゴヌクレオチドと接触させる工程からヘルペスウィルスの活性を変調する方 法であって、該オリゴヌクレオチドは特異的ハイブリダイゼーションを生じるた めに十分な同一性および数のヌクレオチド単位から成るオリゴヌクレオチドであ る方法。」 以上 国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘルペス単純ウィルス１型のオープンリーディングフレームＵＬ５，ＵＬ８ ，ＵＬ９，ＵＬ１３，ＵＬ２９，ＵＬ３０，ＵＬ３９，ＵＬ４０，ＵＬ４２，お よびＵＬ５２のひとつに対応する遺伝子由来のＲＮＡまたはＤＮＡと特異的にハ イブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体であって 、該オリゴヌクレオチドが該特異的ハイブリダイゼーションを生じるために十分 な同一性および数のヌクレオチド単位から成るオリゴヌクレオチドおよびオリゴ ヌクレオチド類似体。
2. ２．翻訳開始部位と特異的にハイブリダイズする請求項１に記載のオリゴヌクレ オチド。
3. ３．ＣＡＴ配列から成る請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
4. ４．遺伝子がヘルペス単純ウィルス１型、ヘルペス単純ウィルス２型、サイトメ ガウィルス、ヒトヘルペス６、エプスタシンバーウィルスまたは水痘帯状疱疹ウ ィルスである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
5. ５．医薬的に受容されるキャリアー中の請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
6. ６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結合基が 硫黄含有種から成る請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
7. ７．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結合基が ホスホロチオエート部分から成る請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
8. ８．以下のひとつの配列； 【配列があります】，配列番号２、 【配列があります】，配列番号３、 【配列があります】，配列番号４、 【配列があります】，配列番号５、 【配列があります】，配列番号６、 【配列があります】，配列番号７、および【配列があります】，配列番号８ から成るオリゴヌクレオチド。
9. ９．医薬的に受容されるキャリアー中の請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
10. １０．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結合基 が硫黄含有種から成る請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
11. １１．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結合基 がホスホロチオエート部分から成る請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
12. １２．ウィルスまたはウィルスに感染している動物を、ヘルペス単純ウィルス１ 型のオープンリーディングフレームＵＬ５，ＵＬ８，ＵＬ９，ＵＬ１３，ＵＬ２ ９，ＵＬ３０，ＵＬ３９，ＵＬ４０，ＵＬ４２，およびＵＬ５２のひとつに対応 する遺伝子由来のＲＮＡまたはＤＮＡと特異的にハイブリダイズするオリゴヌク レオチドと接触させる工程から成るヘルペスウィルスの活性を変調する方法であ って、 該オリゴヌクレオチドは該特異的ハイブリダイゼーションを生じるために十分な 同一性および数のヌクレオチド単位から成るオリゴヌクレオチドである方法。
13. １３．翻訳開始部位と特異的にハイブリダイズできる請求項１２に記載の方法。
14. １４．上記オリゴヌクレオチドがＣＡＴ配列から成る請求項１２に記載の方法。
15. １５．ヘルペスウィルスがヘルペス単純ウィルス１型、ヘルペス単純ウィルス２ 型、サイトメガウィルス、ヒトヘルペス６、エプスタシンバーウィルスまたは水 痘帯状疱疹ウィルスである、請求項１２に記載の方法。
16. １６．オリゴヌクレオチドが以下のひとつの配列；【配列があります】，配列番 号２、 【配列があります】，配列番号３、 【配列があります】，配列番号４、 【配列があります】，配列番号５、 【配列があります】，配列番号６、 【配列があります】，配列番号７、および【配列があります】，配列番号８ から成る請求項１２に記載の方法。
17. １７．上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結 合基が硫黄含有種から成る請求項１２に記載の方法。
18. １８．上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結 合基がホスホロチオエート部分から成る請求項１２に記載の方法。
19. １９．ヘルペスウィルス感染を有すると疑われる動物の処置方法であって、該動 物を、ヘルペス単純ウィルス１型のオープンリーディングフレームＵＬ５，ＵＬ ８，ＵＬ９，ＵＬ１３，ＵＬ２９，ＵＬ３０，ＵＬ３９，ＵＬ４０，ＵＬ４２， およびＵＬ５２のひとつに対応する遺伝子由来のＲＮＡまたはＤＮＡと特異的に ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程から成り、 該オリゴヌクレオチドは該特異的ハイブリダイゼーションを生じるために十分な 同一性および数のヌクレオチド単位から成るオリゴヌクレオチドである方法。
20. ２０．翻訳開始部位と特異的にハイブリダイズする請求項１９に記載の方法。
21. ２１．上記オリゴヌクレオチドがＣＡＴ配列から成る請求項１９に記載の方法。
22. ２２．上記ヘルペスウィルスがヘルペス単純ウィルス１型、ヘルペス単純ウィル ス２型、サイトメガウィルス、ヒトヘルペス６、エプスタシンバーウィルスまた は水痘帯状疱疹ウィルスである、請求項１９に記載の方法。
23. ２３．オリゴヌクレオチドが医薬的に受容されるキャリアー中の請求項１９に記 載の方法。
24. ２４．オリゴヌクレオチドが以下のひとつの配列；【配列があります】，配列番 号２、 【配列があります】，配列番号３、 【配列があります】，配列番号４、 【配列があります】，配列番号５、 【配列があります】，配列番号６、 【配列があります】，配列番号７、および【配列があります】，配列番号８ から成る請求項１９に記載の方法。
25. ２５．上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結 合基が硫黄含有種から成る請求項１９に記載の方法。
26. ２６．上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくともいくつかの結 合基がホスホロチオエート部分から成る請求項１９に記載の方法。