HUT64474A - Process for producing pharmaceutical compositions containing oligonukleotides for treating and diagnostising herpes virus invections - Google Patents

Description

A találmány oligonukleotidokat tartalmazó készítményekre vonatkozik, amelyek alkalmasak herpes vírusok által okozott fertőzések kezelésére, valamint diagnosztizálására.

A találmány szerinti antiszenz oligonukleotidok kölcsönhatásba lépnek a herpesz vírus RNS-jének bizonyos részeivel, és ily módon befolyásolják az RNS hatását, ami viszont magának a vírusoknak a hatását is befolyásolja.

Évente körülbelül 500 000 új genitális herpesz fertőzésről tudósítanak, és a becslések szerint 30 000 000 amerikait érint ez a jelenleg még nem gyógyítható betegség. Hasonlóképpen 500 000-re becsülik évente az új herpesz szimplex gingivostomatitis megbetegedéseket, és legalább 100 000 000 szenved visszaesőként a szájon jelentkező herpeszektől. A szeropozitív egyedek előfordulásának száma az ossz populációban körülbelül 70-80 %. Bár a visszaesőként előforduló herpesz szimplex vírus fertőzések a leggyakoribbak az összes herpesz vírus fertőzések között, igen nagy szükség van még specifikusabb kezelési eljárások kifejlesztésére, amelyek alkalmasak a különböző betegségek, így például a herpesz szimplex encephalitis, keratoconjunctivitis, herpesz okozta ujj és körömgyulladás, valamint a csecsemőknél és immuno egyezéses gazda egyedeknél előforduló disszeminált herpesz fertőzések.

Az encephalitis előfordulása igen alacsony (évenként

250 000 egyed esetében 1), a jelenleg rendelkezésre álló terápiákkal a halálozási arány mégis körülbelül 40 %, és körülbelül a túlélők 50 %-a komoly neurológiai károsodást szenved. A szem fertőzések sem nem gyakoriak, sem nem triviálisak. Ezeket általában a HSV-1 vírus váltja ki, és gyakran a világ sok országában vakságot okoz. A herpesz-okozta köröm- illetve ujjgyulladás elsősorban az ápolónők, fogorvosok és orvosok körében jelent foglalkozási betegséget, amely általában erythema-val és az ujjak disztális szegmensének érzékenységével kezdődik, amelyet a képződött hólyagok összeolvadása és terjedése követ. Ismert jellemzője még ezen elváltozásnak a váladékozó nyirokedények gyulladása és a nyirokcsomó megbetegedése. Az újszülöttek HSV-fertőzése általában a fertőzött szülési csatornákon keresztül való szülés eredménye. Ennek előfordulása általában 10 000 szülés közül 1. A korlátozott fertőzéssel született csecsemők között a halálozási arány 20 %, míg a disszeminált fertőzésű újszölüttek között a halálozás még a jelenlegi kezelési módozatok mellett is eléri a 75 %-ot, és nagyon sok túlélő jelentős neurológiai károsodást szenved.

Jelenleg a nukleozid analógok az előnyösnek tekintett gyógyhatású szerek, a HSV fertőzések esetében. Igen sok pirimidin-dezoxiribonukleozid vegyület rendelkezik specifikus affinitással a vírus-kódolt timidin (dCyd) kináz enzimmel szemben. Ezen vegyületek specifikus hatása a foszforilezésre és a vegyületek vírus-fertőzött sejtekkel szembeni vírusellenes hatására szorítkozik. Számos ezen osztályhoz tartozó hatóanyag vagy jelenleg már klinikai alkalmazásban van, vagy nemsokára kerül klinikai felhasználásra, így például a következők: 5-jód-dUrd (IDU), 5-trifluor-metil-dUrd (FMAU), 5-etil-dUrd (EDU), (E)-5-(2-bróm-vinil)-dUrd (BVDU), 5-jód-dCyd (IDC), és 5-trifluor-metil-dUrd (TFT). Ezen vegyületek közül az IDU egy közepesen hatásos topikális vírusellenes szer HSV gingivostomatitis és okuláris stróma-keratitisz esetében, felhasználása azonban a HSV encephalitis tanulmányozásánál igen szabályozott, mivel nagy toxicitású. Bár az 5-arabinofuranozilcitozin (Ara-C) vírusellenes hatása kezdetben igen ígéretes volt, a klinikai jellemzői hasonlóak az IDU-hoz. A klinikai megjelenése az olyan HSV törzseknek, amelyek nem képesek a virális timidin-kinázt szintetizálni, további gondokat eredményezett ezen osztályhoz tartozó vegyületek jövőbeni felhasználására vonatkozóan.

Számos virális célalanyt határoztak meg az anti-HSV vegyületek kifejlesztéséhez. A tioszemikarbazon-vegyületek tanulmányozása kimutatta, hogy a virális ribonukleotid reduktáz enzim gátlása egy hatásos eszköz a HSV in vitro replikációjának gátlására. Továbbá különböző purin-nukleozidőkről igazolták, hogy gátolni képesek a virális DNS replikációt, és így alkalmazhatók humán HSV fertőzések kezelésére. A 9-(B-D-arabinofuranozil)-adenint (Ara-A) alkalmazták a HSV-1 keratitisz, HSV-1 enkefalitisz és újszölüttek herpesz fertőzésének kezelésére. A klinikai hatásosságról szóló tudósítások azonban ellentmondásosak, és a gyakorlati alkalmazás fő akadálya az Ara-A különösen rossz oldhatósága vízben. Nagyobb érdeklődésre ad számot a 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guaninin (Acyclovir, ACV). Humán egyedeknél az ACV-t sikeresen alkalmazták lokalizált és disszeminált HSV fertőzések kezelésére. Mindazonáltal hátrányos ezen vegyületekkel végzett HSV-1 kezeléseknél mind a hatóanyag-rezisztens virális mutánsok megjelenése, valamint a negatív eredmény a kettős vakpróbával kapcsolatosan. Az ACV, hasonlóan az Ara-A-hoz igen gyengén oldódik vízben (0,2 %), és ez a fizikai jellemző határt szab a felhasználható készítményeknek. A purin nukleozid analógok gyakorlati alkalmazása kiterjedt klinikai helyzetekben gátolt a velejáró hatásos katabolizmus által, amely nemcsak csökkenti a biológiai aktivitást, hanem toxikus katabolitok kialakítását is eredményezheti.

Az összes hatásos anti-HSV vegyületek, amelyeket jelenleg a klinikai vizsgálatoknál alkalmaznak, nuklozid analóg. Ezen vegyületek hatásosságát csökkenti a gyenge oldhatóságuk vizes oldatokban, a gyors intracelluláris katabolizmus és a nagy celluláris toxicitás. Egy további ellenjavallat a nukleozid analógok hosszantartó alkalmazásával szemben, hogy az utóbbi időben klinikai HSV izolátumokat mutattak ki, amelyek rezisztensek klinikai vizsgálatok során adagolt nukleozid vegyületek gátló hatásával szemben. A vírusellenes oligonukleotidok lehetőséget adnak a jobb oldhatóságra, alacsonyabb celluláris toxicitásra és kevésbé érzékenyek a cél-génben a nukleotid mutációkkal szemben, mint a nukleozid analógok tipikus képviselői.

Ismert, hogy a herpesz vírus fertőzések kezelésére és diagnosztizálására igen szükségesek új megoldások. Különösen kívánatos olyan készítmények és módszerek kidolgozása, amelyek igen hatásosak, és nincs, vagy csak igen kicsi a mellékhatásuk.

A találmány szerinti antiszensz oligonukleotid készítmények és ezek alkalmazása herpesz vírus fertőzések kezelésére kielégíti ezt a régóta fennálló igényt.

• · · «

- 6 A fentiek alapján a találmányunk célja herpesz vírus okozta fertőzésekre alkalmas kezelés biztosítása, továbbá antiszenz oligonukleotidokat tartalmazó készítmény biztosítása, amelyek gátolni képesek a herpesz vírusok és más hasonló vírusok RNSének szerepét.

Célja továbbá a találmánynak a herpesz vírus fertőzések diagnosztizálására alkalmas készítmények biztosítása is.

A fentiek alapján a találmányunk oligonukleotidokra és oligonukleotid analógokra vonatkozik, amelyek specifikusan hibridizálhatók a herpesz szimplex 1 típusú vírus valamely következő nyitott leolvasási keretének megfelelő génből származó RNS-sel vagy DNS-sel:UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52. A találmány szerinti oligonukleotidok annyi nukleotid egységet tartalmaznak, amelyek azonossága és száma elegendő a specifikus hibridizáció létrehozásához. Előnyös, ha a találmány szerinti oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok specifikusan hibridizálhatók egy transzlációs iniciátor hellyel, és előnyös, ha az oligonukleotid CAT szekvenciát tartalmaz.

Egy előnyös kiviteli formánál az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok olyanok, hogy specifikusan hibridizálhatók a herpesz szimplex vírus 1 típus (HSV-1), herpesz szimplex vírus 2 típus (HSV-2), cytomegalovírus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus (EDV) vagy varicella zoster vírus (VZV) valamely fajtájából származó DNS-sel vagy még előnyösebben RNS-sel. Az ilyen oligonukleotidokat és analógokat különösen előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokkal elkevert formában alkalmazzuk.

A találmány egy különösen előnyös kiviteli módjánál olyan oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat alkalmazunk, amelyek esetében legalább néhány kapcsoló csoport, amely az oligonukleotid egységekben a nukleotid egységeket köti össze, kéntartalmú csoport, így például foszforotioát-csoport.

A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá állatoknál, és különösen humán egyedeknél, amelyek feltehetően herpesz vírus fertőzésben szenvednek, alkalmazható diagnosztikai és gyógyászati eljárás is. Az ilyen eljárásoknál az állatokat vagy humán egyedeket vagy azok testfolyadékát a találmány szerinti oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal érintkeztetjük a szaporodás gátlására, vagy a fertőzés befolyásolására, vagy pedig a diagnosztizálás céljából.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a herpesz vírus 1 típus esetében leírt adott nyitott leolvasási keret megfelelője megtalálható a többi említett vírusban is. Ennek megfelelően mind a herpesz szimplex vírus 2 típus, a citomegalovírus, a humán herpesz vírus típus 6, az Eppstein Barr vírus és a varicella zoster vírus tartalmaz több analóg nyitott leolvasási keretet, amelyek a hasonló funkciójú proteineket kódolják. Ennek megfelelően a találmány vonatkozik egy antiszensz oligonukleotid terápiára, ahol az oligonukleotidok vagy az oligonukleotid analógok az említett vírusokkal vagy bármely, a későbbiek során megismerésre kerülő olyan hasonló vírusokkal szemben hatnak, amelyek egy vagy több ilyen analóg nyitott leolvasási kerettel rendelkeznek. A találmány értelmében az összes ilyen vírust herpesz vírusnak nevezzük.

* ·

- 8 Az 1. ábrán bemutatjuk a herpesz szimplex vírus típus 1 génjének elrendezését, McGeoch, D.J. és munkatársai ismertetése alapjá [J. Gén. Virol., 69, 1531-1574 (1988)].

A 2A. ábrán bemutatjuk a herpesz szimplex vírus típus 1 bizonyos nyitott leolvasási kereteit (ORF), beleértve az UL39 (140 000 d) és UL40 (40 000 d) nyitott leolvasási kereteit.

A 2B. ábrán bemutatjuk az öt 3’-koterminális transzkriptum egyik illesztett készletét, beleértve a HSV-1 17 törzs UL13 génjét.

A 3. ábrán összehasonlítjuk a HSV-1 17 törzs és HSV-2 HG52 törzs UL13 transzlációs nyitott leolvasási kereteit.

A 4. ábrán összehasonlítjuk a HSV-1 17 törzs és HSV-2 333 törzs UL39 gén DNS szekvenciáit, megjelölve a HSV-1 transzlációs iniciációs kodonját a 238 helynél.

Az 5. ábrán összehasonlítjuk a HSV-1 KOS törzs, és HSV-2 333 törzs UL40 génjének DNS szekvenciáit, megjelölve a HSV-1 transzlációs iniciációs kodonját a 138 helynél.

A 6. ábrán táblázatosán összefoglaljuk a HSV-1, VZV és EBV homológ nyitott leolvasási kereteit (ORF), amelyeket publikált DNS szekvencia adatok alapján határoztunk meg.

A 7. ábrán grafikusan bemutatjuk a betegségek átlagos előfordulását különböző időkkel a fertőzést követően. Az egereket 1 x 10⁵ pfu mennyiségű HSV-1 KOS vírussal fertőztünk, a kezelést 4 óra elteltével kezdtük pi. Mindegyik adat az átlagos betegség-előfordulást jelenti az összes egérnél a jelzett napon.

A 8. ábrán grafikusan bemutatjuk a hatóanyag dózisok hatását a betegség előfordulásra. A betegség átlagos • ·· • · · · · ··· ··* ··« ··♦ • · » * «

- 9 előfordulását az ISIS 1082 dózisának függvényében ábrázoltuk 11, 13 és 15 nappal a fertőzést követően.

A 9. ábrán grafikusan bemutatjuk a betegségek átlagos előfordulását különböző idővel a fertőzés után. Az egereket 1 x 10⁵ pfu HSV-1 KOS törzzsel fertőztük, és a kezelést ISIS 1082-vel végeztük 4 órával a fertőzést követően. Mindegyik pont a betegségek átlagos előfordulását jelzi az összes egérnél az adott napon.

A 10. ábrán grafikusan bemutatjuk a különböző ISIS oligonukleotidok hatását a HSV fertőzésekre. HSV-1 (KOS törzs) és HSV-2 (HG52 törzs) vírusokat alkalmaztunk, a kísérletnél a kontroll HSV mennyisége 8,1 x 10⁶ pfu/ml és 8,2 x 10⁷ pfu/ml volt a HSV-1 illetve HSV-2 esetében.

A 14. ábrán fotografikusan bemutatjuk a különböző oligonukleotidok hatását az RNS in vitro transzlációjára. A bal oldalon feltüntetett számok jelzik az 1 sávban mutatott marker protein relatív molekulatömegét. A nagyobb nyíl jelzi a HSV RNS-ből szintetizált fő polipeptid terméket. A kisebb nyíl jelzi a HSV RNS-ből inhibiciós hatású oligonukleotid jelenlétében szintetizált polipeptideket. A transzlációs inhibicióhoz az oligonukleotidok és RNS mólaránya 50:1 volt. (A.) Az oligonukleotid inhibiciós hatásának specificitása A 2-10 sávok tartalmazzák a reticulocyta lizátumokból nyert in vitro transzlációs termékeket, közelebbről a következőképpen: sáv 2, nincs RNS; sáv

3-6, pIP-1 RNS (0,112 pmól); sáv 7-10, 5LO RNS (0,145 pmól). Sáv 4 és 8, ISIS 1049; sáv 5 és 9, ISIS 1082; sáv 6 és 10, ISIS 1238. (B). Az inhibiciós aktivitás spektruma. A sáv-2-8 vonat- • 4 4 ·· ······ • · · · · · * • ··· t*9 ·····♦ · · · 4 *·

- 10 kozik a reticulocyta lizátumokból nyert in vitro transzlációs termékekre, közelebbről a következőkre: sáv 2, nincs RNS; sáv 35, pIP-2 RNS (0,108 pmól); sáv 6-8, pIP 1-RNS (0,112 pmól); sáv 4 és 7, ISIS 1049; sáv 5 és 8, ISIS 1082.

A 12. ábrán bemutatjuk a dózis válasz görbéket, amelyekből kitűnik a HSV-2 replikációjának gátlása, a különböző koncentrációjú ISIS oligonukleotidokkal vagy Acyclovir-ral végzett kezelésnél. A fertőzésekhez HSV-2 (HG52 törzs) vírust alkalmaztunk. A kontroll fertőzésekhez az ACV-kezelt lyukakban a koncentrációt DMSO-val olyan értékre állítottuk be, amely megfelelt az 1 μπιόΐ koncentrációjú ACV-vel kezelt sejteknél alkalmazott DMSO koncentrációnak.

A 13. ábrán bemutatjuk a HSV-1 (KOS törzs) dózisfüggő gátlását ISIS 1082, ACV vagy ISIS 1238 oligonukleotiddal végzett kezelés esetén. A hibahatár a standard deviációt jelzi (p > 0,05), az átlagos értékekre vonatkozóan minden koncentráció értéknél.

A 14. ábrán bemutatjuk a HSV-1 (F törzs) dózisfüggő inhibicióját ISIS 1082, ACV vagy ISIS 1238 oligonukleotiddal végzett kezelés esetén. A hibahatár a standard deviációt jelzi (p > 0,05) az átlagértékekre vonatkozóan minden koncentráció értéknél.

A 15. ábrán bemutatjuk a HSV-1 törzsek dózisfüggő inhibicióját Acyclovir-ral vagy ISIS 1082 oligonukleotiddal végzett kezelés esetén. A kísérletnél DM2.1 törzseket (15B. ábra) és PAAr⁵ (PAAr5) törzseket (15A ábra) alkalmaztunk. A kontroll lyukak nem tartalmaztak DMSO-t.

A legszélesebb körben tanulmányozott humán herpesz vírus a herpesz szimplex vírus. Ez a vírus két hasonló, de jól megkülönböztethető altípus formájában (HSV-1 és HSV-2) létezik, mindegyik altípusnak számos törzse ismeretes. Bár bizonyos HSV törzsek gazda-terjedelme bizonyos szövetekre korlátozódik in vivő, az in vitro gazda-terjedelem minden törzsben magában foglalja a legtöbb humán szövet típust (mind primer, mind transzformált sejtek), valamint a legtöbb nem-humán sejtet. A virális replikációs ciklus gyors, körülbelül 24 óra a HSV-1 és 48 óra a HSV-2 esetében ahhoz, hogy fertőzőképes utódokat termeljen. A HSV gyors replikációja és széles gazda-terjedelme a virális génszerkezet kiterjedt molekulaanalízisét és a fertőzés alatti virális gén expresszió szabályozását eredményezte.

A HSV fertőzések több megkülönböztethető lépcsőből állnak, ezek a következők: a vírus abszorpciója a gazdasejt membránon, a virális burok fúziója virionok penetrációja tának eltávolítása, a a virális genomban, a a celluláris membránnal, a nem burkolt a sejtmagba, a virális nukleinsav bevona virális gének expressziója és replikációja genom nukleáris beépülése az újonnan képződött virális kapszidokba, és végül az érett virion távozása a sejtből. Virálisan kódolt proteinekről megállapították, hogy ezek részlegesen gátolni vagy szabályozni képesek a virális replikációnak ezen lépéseit. Ismertették a HSV-1 genom DNS szek venciáját, és alátámasztottak korábbi megállapításokat, amelyek szerint legalább 71 különböző virális proteint kódolnak a vírusok a tényleges fertőzés alatt [McGeoch, D.J., Dolan, A., Donald, S., és Rixon, F.J., J. Mól. Bioi. 181; 1-13 (1985);

• ·· *· ·« «··« ·· · · · · · • ······ · « ··· • · · · · · · ··· ·· »· ·« ···

McGeoch, D.J., Dolan, A., Donald, S., and Brauer, D.H.K.; Nucleic Acids Rés. 14: 1727-1745 (1986); McGeoch, D.J., Dalrymple, M.A., Davison, A.J., Dolan, A., Frame, M.C. McNab,

D., Perry, L.J., Scott, J.E., and Taylor, P.; J. Gén. Virol. 69: 1531-1574 (1988); és Perry, L.J. and McGeoch, D.J.; J. Gén. Virol. 60: 2831-2846 (1988)].

A HSV gének szerkezete igen egyszerű. Minden egyes ioRNS transzkripciója a promoter szakasz szabályozása alatt közvetlenül a gén 5' mRNS végénél helyezkedik el. Az mRNS-ek illesztése igen ritka, és elsődlegesen a transzkriptumok közvetlen korai osztályára korlátozódik. Egy külön mRNS faj létezik minden egyes vélt protein termékre, amelyet a vírus kódol, és mindegyik virális mRNS-t úgy tekintünk, mint ami monocisztronikus fajként hat még akkor is, ha több nyitott leolvasási keret van jelen a legtöbb mRNS-ben. A virális gén expresszió szabályozása egy finoman beosztott egymást követő folyamat, amelyet három általános lépcsőre oszthatunk: a közvetlen korai, korai és késői fázisokra. A közvetlen korai transzkriptumok a virális replikáció kezdetén szintetizálódnak, még a transzlációs inhibitorok, így például cikloheximid jelenlétében is. így a transzkriptumok ezen osztályának szintézisét meglévő celluláris proteinekkel és/vagy olyan proteinekkel, amelyeket a fertőző virionnal vittünk be a sejtbe, szabályozzuk. A közvetlen korai proteinekről ismert, hogy befolyásolják a celluláris és virális gén expressziókat pozitív és negatív irányban egyaránt, és ezen proteinek expressziója fontos más HSV gének transzkripciós aktiválása szempontjából, különösen vonatkozik ez a korai * ·· »· ·· «··· »· · · · « · • ··· ··« ··♦ ··· • · · · A · · ·»· ·· ·· ·· ···

- 13 génekre. A korai gén transzkriptumok több olyan virális terméket kódolnak, amelyek szükségesek a virális genom replikációjához. Mivel a késői gén transzkriptumok szintézisét mind a közvetlen korai proteinek, mind egy sor templát szabályozza, a késői gének transzkripciója túlnyomórészt a virális DNS szintézise után megy végbe. A késői gének által kódolt proteinek közé tartoznak a burok glükoproteinek, a kapszid proteinek és más proteinek, amelyek szükségesek a virális szerkezet fenntartásához, vagy lehetővé teszik az újonnan képződött virionok távozását a sejtből.

A DNS szekvencia analízis alapján óvatos becsléssel 71 proteint határoztak meg, amelyek a HSV-1 genomon belül vannak kódolva. Az 1. ábrán bemutatjuk a HSV-1 gének nomenklatúráját és az egyetlen hosszú (unique long, UL) és egyetlen rövid (unique short, US) szakaszok genomiális szerkezetét. Bár egy sor virális géntermékről kimutatták, hogy nélkülözhető az in vitro virális replikációnál, csupán a virális timidin kináz szerepéről ismert, hogy nem szükséges a virális növekedéshez humán gazdaszervezetben. Ebből logikusan következik, hogy 70 gén marad, amelyek alkalmasak lehetnek cél-irányított antivirális kemoterápiánál való felhasználásra. A virális replikáció alatt a virális mRNSek jelentik a legkülönbözőbb és a legsokoldalúbban alkalmazható célalanyt az antiszenz oligonukleotid inhibicióhoz.

Mivel a HSV mRNS-ek transzkripciója szorosan szabályozva van a gén expresszió kaszkád folyamatán belül, a HSV mRNS relatív koncentrációja függ az infekció folyamatában a mintavétel idejétől. Általában maximális koncentrációjú mRNS értéket

44·· »444

44 4 444*4

4 4 44 ··· lehet elérni 3-4 órával a szintézis kezdetét követően. Az mRNS bomlásának sebessége nem ismert minden HSV mRNS esetében, az irodalomban közölt adatok igen különböznek a sebességet illetően. A HSV-mRNS-ek számos szerkezeti jellemzője igen fontos a virális proteinek hatásos transzlációjához. A HSV mRNSek 5’ végei együtt a transzlációs iniciós kodonokkal és a 3' poliadenilezett végekkel feltehetően hasonlóképpen működnek, mint a hasonló mRNS szerkezetek, amelyeket számos celluláris mRNS esetében leírtak. A HSV mRNS-ek illesztése vagy kapcsolása igen ritka, de a közvetlen korai transzkriptumok kapcsolási helyei a virális transzkriptumok egy másik szerkezeti jellemzőit jelentik, amelyet az antiszensz inhibició egy valószínűsíthető helyének tarthatunk. A HSV UL48 mRNS egyedülálló szerkezeti jellemzőiről leírták, hogy befolyásolja a burok protein szintézis sebességét [Blair, E.D., Blair, C.C. and Wagner, E.K.;

J. Virol. 61: 2499-2508 (1987)]. Nem vizsgálták azonban a hasonló szerkezetek jelenlétét más HSV mRNS-ekben, vagy ezen szerkezetek képességét arra vonatkozóan, hogy a rokon protein fajok szintézisét befolyásolják. Ily módon a HSV mRNS számos szerkezeti szakaszát célozhatjuk meg, mint potenciális helyét az antiszenz oligonukleotid inhibicóinak. Valóban a fertőzött sejtek kezelésre olyan oligonukleotidokkal, amelyek komplementerek az US1 és US2 gének illesztési helyeivel, vagy az UL48 gén transzlációs iniciációs szakaszával, a HSV replikáció inhibicióját eredményezte in vitro [Smith, C.C., Aurelian, L. Reddy,

M.P., Miller, P.S., and Ts'o, P.O.P; Proc. Natl. Acad. Sci. USA

83: 2787-2792 (1986); és Ceruzzi, M. and Draper, K.: Nucleosides ·> ·· · ♦ ««a··· • -4 · « · f»«

444 ··, 44*«·« • · · · · · · 4*· ·4 4« 4«···

- 15 and Nucleotides 8: 815-818 (1989)].

A virális gén termékeket, amelyekről ismert, hogy biológiai szerepük van a HSV replikádéban, három csoportra oszthatjuk. Ezek: 1. transzkripciós aktivátor vagy represszor proteinek; 2. DNS replikációs proteinek; és 3. szerkezeti proteinek. A HSV transzkriptumok közvetlen korai osztálya olyan proteineket kódol, amelyek transzkripciós aktivátorok és represszorok más virális génekkel kapcsolatban. Ismertettek olyan vírus törzseket, amelyek nem termelnek ilyen proteineket, és az IE175 gén termék kivételével úgy tűnik, hogy a közvetlen korai proteinek nem lényegesek a virális replikációs folyamatban. Más közvetlen korai proteinek működését helyettesíthetjük vagy az IE175 működésével, vagy a gazda működésével. Az IE175 mRNS transzkripciója folytatódik a fertőzött sejtben addig, amíg az IE175 protein koncentrációja eléri azt az értékét, amely gátolja az IE175 mRNS további transzkripcióját, így az IE175 protein szintézisének gátlása egy megfelelő antiszenz oligonukleotiddal eredményezné az IE175 mRNS állandó növekvő szintjét, ami esetenként átlépheti azt a mólkoncentráció küszöböt, amely a hatásos oligonukleotid inhibició határát jelenti. További problémája az antiszenz terápiának, amely a közvetlen korai géneken alapul, hogy a közvetlen korai gének ideiglenes expressziója szükségessé teheti az oligonukleotidok profilaktikus adagolását. Bár ez a típusú adagolás lehetséges, a legtöbb humán fertőzés esetében nem megvalósítható.

A legszélesebb körben vizsgált csoportja a virális proteineknek az, amelyek a genomiális replikációban részt• 4«*· ·· 4« 4 * * 4 · • Λ · * *4 44« Λ α *

- 16 vesznek. Legalább 7 virális protein (UL5, 8, 9, 29, 30, 42 és

52) vesz részt közvetlenül a virális DNS replikációban. A virális DNS polimeráz, a timidin kináz és a ribonukleotid reduktáz enzimek működését gátolták sikeresen nukleozid analógokkal, és jelenleg is állandó kísérletek folynak még hatásosabb vegyület típusok kifejlesztésére. A hatóanyag-ellenálló HSV törzsek kialakulása határt szab a hosszú hatásidejű nukleozid analógok kifejlesztésének megvalósítására a klinikai gyakorlatban. Mivel számos késői virális gén transzkripciója függ a hatásos expresszióhoz szükséges gén dózistól, a virális szerkezeti proteinek szintézisének antiszenz inhibicióját indirekt módon is elvégezhetjük a DNS szintetikus proteinek megcélzásával.

A strukturális proteinek alkalmazása az antivirális folyamatokban a vakcinák kifejlesztésére koncentrálódott, és az antiszenz típusú vegyületekkel végzett kemoterápiás beavatkozások egy még nem feltárt területét jelentenek. Az ezen csoportba sorolt proteinek közé tartoznak azok, amelyekről ismert, hogy szerepet játszanak a virális szerkezetekben és a szerkezeti integritásban, a virális adszorpcióban, a virionok és a gazdasejt membrán fúziójában, valamint a vírus penetrációjában a fertőzött sejtbe.

Az utóbbi időben tudatták, hogy bizonyos virális proteineknek bifunkcionális szerepük lehet a HSV replikációban. A jelen találmány értelmében azt gondoljuk, hogy közvetlenül lehetőség nyílik a virális replikáció számos szintjébe közvetlenül beavatkozni, egyetlen protein termék inhibiciójával. A virális ··*· ♦ *· ·· ·· ·· · · · · • *·· *·· ··*«·4 • · · 9 ·’ ··♦ ·« ·4 ·<··»

- 17 proteinek osztályának ezen tagjai (UL13 és UL39) számukban korlátozottak, de olyan cél alanyt képviselnek, amelyek igen ígéretes jelöltjei az antiszenz inhibiciónak. A virális proteinek, amelyeket a HSV-1 UL13 és UL39 nyitott leolvasási kereteként azonosítunk, nagyfokú nukleotid szekvencia konzerválást mutatnak a különböző HSV-1 és HSV-2 altípusok homológjai között. Az UL13 és UL39 génekről megállapították, hogy a legjobb hely a terápiás beavatkozás céljára. Egy harmadik protein, az UL40, amely az UL39 proteinnel az aktív ribonukleotid reduktáz enzim komplexet alkotja, szintén ígéretes cél az antiszenz inhibició számára.

További proteinekről is úgy gondoljuk, célként szolgálnak az antiszenz oligonukleotid terápia számára. Ilyenek például az UL3, UL8, UL9, UL29, UL30, UL42 és UL52 nyitott leolvasási keretekből származó proteinek. Ennek megfelelően a találmány előnyösen mRNS-ek működésének gátlására vonatkozik, amelyek a herpesz szimplex vírus 1-típusához tartozó alábbi nyitott leolvasási kereteknek megfelelő génekből származnak: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52.

Az UL13 HSV-1 protein egy virion kapszid protein, amely vélhetően kódolja a protein kináz aktivitást, amely felelős a virion kapszid proteinek specifikus foszforilezéséért. Ezt a proteint a 4,1 kb nagyságú mRNS kódolja, amely egyike a 2. ábrán bemutatott öt 3'-koterminális transzkriptumok illesztett együttesének. Az UL13 mRNS egy kisebb virális faj, amely először 3-4 óra után jelenik meg a szövetkultűrákban a virális replikáció kezdetét követően. Az UL13 mRNS mennyisége valamennyire növek18 ·* tf *···«· « · · ·5 ··· ♦·· ······ • · · · * » szik a virális DNS replikációja után, de viszonylag alacsony marad a fő virális mRNS mennyiségéhez viszonyítva, egészen a fertőzés késői szakaszáig. Azt találtuk a DNS szekvencia analízis alapján, hogy az UL13-t kódoló mRNS szekvencia nagymértékben megmarad a HSV-1 és HSV-2 izolátumok között. A becsült molekulatömeg érték a HSV-1 és HSV-2 proteinekre vonatkozóan 57193 illetve 57001. Miután az UL13 protein szintézise nem kimutatható addig, amíg a virális DNS szintézis nem kezdődött meg, feltehető, hogy az UL13 transzlációjának primer kontrollja a 4,1 kb mRNS mennyisége. A 4,1 kb mRNS 5' nem-transzlációs szakaszának szerepét, ha egyáltalán van, az UL13 protein szintézisének sebességével kapcsolatban, nem vizsgáltuk. A HSV-1 és HSV-2 mRNS fajok transzlációs nyitott leolvasási kereteinek (ORF) összehasonlítása, amelyet a 3. ábrán mutatunk be, fölfedi, hogy konzervált nukleotid szekvenciák vannak, amely egy igen kedvező cél a HSV UL13 szintézisének oligonukleotidos inhibiciójára, valamint a virális replikáció inhibiciójára. Ezen szakaszok nukleotid szekvenciájának hasonlósága (eltérés csupán az 1554 nukleotid közül 205-nél van) az mRNS egy igen fontos szerkezeti jellemzőjére mutat rá, amely, mint azt most kimutattuk, kihasználható az antiszenz oligonukleotid terápia által annak érdekében, hogy széles antiszenz inhibíciós aktivitást tudjunk elérni mind a HSV-1, mind a HSV-2 vírusokkal szemben egyetlen oligonukleotid szekvenciával.

A HSV-1 UL39 proteinje szoros összefüggésben egy másik proteinnel, amelyet a szomszédos gén, az UL40 kódol, így egy komplex képződik, amely ribonukleotid reduktáz aktivitású.

·· «· ····«· ·« « » · ·· • «·· ♦·· ··· ··· » · » * · · · 999 99 ·9 99·9»

Frame, M.C., Marsden, H.S., és Dutia, B.M.; J. Gén. Virol. 66: 1581-1587 (1985)]. A proteinek homológ együttesét a HSV-2 kódolja, és hasonló ribonukleotid reduktáz aktivitást mutat. Egyedül az UL39 protein HSV-2 homológja rendelkezik autofoszforilező protein kináz aktivitással. Hasonló kináz aktivitást nem mutattunk ki a HSV-1 UL39 protein esetében. Az UL39 és UL40 proteineket egy pár 3' koterminális mRNS kódol, amelyek 5,2 és 1,2 kb hosszúságúak. Egy HSV-1 fertőzés esetén az

5,2 kb mRNS egy fő mRNS az infekció korai szakaszában, amelynek mennyisége az infekció kései szakaszában csökken. Az 1,2 kb mRNS mennyisége mérsékelt a korai szakaszban, és így is marad a fertőzés teljes idején. HSV-2 fertőzés esetén az 1,2 kb mRNS homológ a nagyobb mennyiségű korai faj és az 5,2 kb mRNS homológ a mérsékeltebb mennyiségű faj. Azonban mind a két fajta mRNS a fertőzés kései szakaszában mérsékelt mennyiségben van jelen. A biológiai jelentősége annak, hogy a HSV fajok között az mRNS-ek mennyisége különbözik, még bizonytalan, de ezen különbségek jelentős hatással lehetnek a virális ribonukleotid reduktáz vagy protein kináz aktivitás oligonukleotid inhibicója esetén a hatásos célalany kiválasztására. A HSV ribonukleotid reduktáz komplex fehérjéit a virális DNS replikációt megelőzően szintetizáljuk, és az enzimatikus aktivitás feltehetően lényeges szerepet játszik a DNS szintézishez szükséges szubsztrátum előállításában. Ezen fontos enzimatikus működés gátlása nemcsak befolyásolja a DNS szintézist, de közvetlenül gátolja az olyan késői protein termékek szintézisét, amelyeket a templátok mennyiségén alapuló gének kódolnak, és így hatásosan szinte20

44 «4 44444« • 4444 ·4

444 444 444444

4 4 4 4 44

444 44 44 44«44 tizálják a megfelelő mRNS-eket. A HSV ribonuklotid reduktáz mRNS-k nyitott leolvasási kereteinek összehasonlítása kimutatja a nukleotidok eltérésének mértékét, mint az a 4. ábrán látható, amely befolyásolhatja az mRNS működésének típuson belüli hatásosságát. Az AUG kodonok körüli nukleotid szekvencia eltérése megkívánhatja, hogy külön nukleotid készítményeket alkalmazzunk HSV-1 és HSV-2 UL39 és UL40 proteinek szintéziséhez. A HSV-1 és HSV-2 UL39 és UL40 nyitott leolvasási keretein belüli más szakaszok kiterjedtebb DNS homológiát mutatnak úgy, hogy az oligonukleotid készítmények, amelyek ezen szakaszokkal homológok, hatásosan gátolhatják a HSV-1 és HSV-2 replikációját.

A HSV-1 genomja mind a cisz- és transz-hatású elemeket tartalmazza, amelyeknek szerepe van a virális DNS replikációban. A cisz-hatású elemek megfelelnek a DNS replikáció kezdetének és a transz-hatású elemek enzimek, amelyek a HSV-1 DNS replikációért felelősek. A HSV-1 genom által kódolt hét nyitott leolvasási keret megfelel a 7 komplementációs csoportnak, amelyekről ismert, hogy fontosak a HSV-1 DNS replikációhoz. Ez a hét nyitott leolvasási keret kódolja a virális DNS polimeráz enzimet (UL30), az egyszálú DNS kötő-proteint (UL29), az ori_s-kötő proteint (UL9), a kétszálú DNS kötő-proteint (UL42), és három proteint amelyek a helicaseprimáz komplexet tartalmazzák (UL5, UL8 és UL52). Ezen gének DNS szekvenciája csupán a HSV-1 genom esetén ismert, de a HSV-1 és HSV-genomok között a kritikus virális funkciókat kódoló szakaszokban általános ko-linearitást és nagymértékű DNS szekvencia homológiát állapítottunk meg, úgy, hogy valószínű, hogy található lesz egy oligonukleotid inhibitor • ·· 4· ·····« • 4 · 4 4 ·« • ··· ·«· I»···· • 4 4 · 4 4·

444 ·4 44 44444

- 21 ezen összes HSV-1 gén funkciók számára, amely a homológ HSV-2 gén funkcionális expresszióját szintén gátolni fogja.

Három cél HSV génről ismertették, hogy érzékenyek az antiszenz inhibitorokkal szemben in vitro vizsgálatok során. Egy oligonukleotid, amely a [dC]28 szekvenciát tartalmazza internukleozidikusan foszforotioát csoportokkal kapcsolódva, gátolja a HSV-2 DNS polimeráz aktivitást, de ezen hatás nem-specifikusnak tűnik, mivel ugyanezen oligonukleotidról kimutatták, hogy befolyásolja a genomiális replikációját egy nem rokon vírusnak a Humán Immunodéiiciency Vírusnak [Cheng, Y-C. , Gao, W., Stein, C.A., Cohen, J.S., Dutschman, G.E., és Hanes, R.N.; Abstract and poster presented at Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression: Therapeutic Implications, held in Rockville, MD (1989); Matsukura, M., Shinozuka, K., Zon, G., Mitsuya, H., Reitz, M., Cohen, J.S., and Broder, S.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7706-7710 (1987)]. Bár erről az oligonukleotidról kimutatták, hogy gátolja a megfelelő virális replikátumokat, virális replikáció gátlás nem lett megállapítva. A metil-foszfonáttal kapcsolt és psoralen-derivatizált oligonukleotidokról, amelyek komplementerek a HSV-1 US1 és US12 mRNS-ek illesztési-kapcsolási helyeivel, kimutatták, hogy gátolják a HSV-1 replikációt in vitro [Kulka, M., Smith. C.C., Aurelian, L., Fishelevich, R., Meade, K., Miller, P., and T'so, P.O.P.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6868-6872 (1989); és Smith, C.C., Aurelian, L., Reddy, M.P., Miller, P.S., and Ts’o, P.O.P.; Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 83, 2787-2792 (1986)]. Ezek az eredmények érdeklődésre tartanak számot, mivel a cél génekről kimutatták, hogy nem lényegesek a HSV replikációhoz. Egy oligonukleotid szekvencia, amely komplementer a vírus replikációjához lényeges génnel, várhatóan jobb gyógyhatású szer, mint azon oligonukleotidok, amelyek nem-lényeges géntermékeket céloznak meg. Ezen feltevés igazolását Ceruzzi és Draper végezték el HSV-1 UL48 mRNS mint cél szekvencia alkalmazásával [Ceruzzi, M., and Draper, K.: Nucleosides and Nucleotides, 8: 815-818 (1989)]. Az antivirális hatásosság, amelyet Ceruzzi és Draper természetes (foszfodiészter-kötésű) oligonukleotiddel értek el, összehasonlítható a Smith és munkatársai által megfigyelt hatásossággal, amelyet ezek módosított oligonukleotidjaival értek el. Az antivirális hatás ezen növekedése feltehetően kapcsolatban van az UL48 protein fontos szerepével, amelyet a vírus közvetlen korai transzkripciójának fokozásában fejt ki.

Az UL13 kapszid protein szintézisre és a virion protein foszforilezésre gátló hatást kifejtő oligonukleotidok kifejlesztése egy új anti-HSV kemoterápiát jelent. A számos független virális működés megcélzása lehetőséget ad széles intertipikus antivirális aktivitás számára a leghatásosabb antiszenz oligonukleotidok felhasználásával, mint azt vizsgálataink során egymással vagy más meglévő nukleozid terápiával kombinálva megállapítottuk. A herpesz szimplex vírus típus 1 (HSV-1), a varciella zoster vírus (VZV) és az Epstein Barr vírus (EBV) DNS szekvenciáinak összehasonlítása kimutatta, hogy a humán herpesz vírusok között fentmaradnak azok a gének, amelyeket legjobb cél alanynak találtunk az antiszenz oligonukleotid támadással szemben. A VZV és EBV géneket, amelyek a HSV-1 génekkel • ·

- 23 homológok, a 6. ábrán mutatjuk be. A nyitott leolvasási kereteket a gén bank adatai alapján publikált DNS szekvenciák alapján adtuk meg [Davison, A.J. & Scott, J.E., J. gén. Virol. 67: 1759-1816 (1987); McGeoch, D.J., Dalrymple, M.A., Davison, A.J., Dolan, A., Frame, M.C., McNab, D., Perry, L.J., Scott, J.E., & Taylor, P., J. Gén. Virol. 69: 1531-1574 (1988); Baer, R., Bankier, A.T., Biggin, M.D., Deininger, P.L., Farrell, P.J., Gibson, T.J., Hatfull, G., Hudson, G.S., Satchwell, S.C., Sequin, C., Tuffnell, P.S., & Barrell, B.G., Natúré 310: 207211 (1984)].

Bár a felsorlt EBV BBRF2 és BORF2 gének homológok a HSV-1 UL9 és UL39 génekkel, ezen gének kódolt aminosavjai nem nagymértékben homológok. Az aminosav homológiának ez a hiánya a kódolt nyitott leolvasási keretekben tükrözheti az EBV nyitott leolvasási keretek széttöredezését, amely az mRNS-k közötti kapcsolódás (összefonódás) következtében jön létre, bár ezen kapcsolódások igazolását még eddig nem végezték el. Most úgy gondoljuk, hogy számos nukleotid homológ szakasz, amelyek a különböző herpesz vírus géneken belül léteznek, igen jó cél az antiszenz oligonukleotid inhibició számára. Úgy gondoljuk, hogy egy oligonukleotid, amely HSV-1 és/vagy HSV-2 gátló, és homológiát mutat akár a VZV, akár az EBV megfelelő nukleotid szekvenciájával, egy igen hatásos inhibitor a VZV és/vagy EBV replikáció számára. Más humán herpesz vírus szekvenciáját eddig még nem publikálták, de a rendelkezésre álló korlátozott nukleotid adatok azt mutatják, hogy a humán cytomegalovírus (HCMV) és a humán herpesz vírus 6 (HHV 6) homológok a HSV-1 UL13

génnel [Lawrence, G.L., Chee, M., Craxton, M.A., Gompels, U.A., Honess, R.W., and Barrell, B.G.; J. Virol. 64: 287-299 (1989)]. Továbbá, a HCMV DNS szekvenciája homológ a HSV-1 UL30 génnel [Kouzarides, T., Bankier, A.T., Satchwell, S.C., Weston, K., Tomlinson, P., and Barrell, B.G.; J. Virol. 61: 125-133 (1987)] és szakaszokat tartalmaz, amelyek homológok a HSV-1 génnel. Ha más humán herpesz vírus szekvenciák is ismertek, úgy gondoljuk, hogy a gének, amelyeket most megcéloztunk, legalább részlegesen meg lesznek benne, és szignifikáns nukleotid homológiát mutatnak az eredeti HSV gén szekvenciákkal. A jelen találmány értelmében oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat alkalmazunk a herpesz vírusok messenger RNS-jeinek működésének antiszenz gátlására. A találmány értelmében az oligonukleotid kifejezés olyan kapcsolt nukleotid egységek összességére utal, amelyek természetes-előfordulásúak, és ciklofuranozil csoportokat tartalmaznak natív foszfodiészter-kötésekkel kapcsolva. Ez a kifejezés különösen utal olyan természetben előforduló vagy szintetikus fajtákra, amelyek természetben előforduló alegységekből vannak megalkotva.

Az oligonukleotid analóg kifejezés a találmány értelmében olyan molekulákra vonatkozik, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan működnek, de nincsenek természetben előforduló részeik. így az oligonukleotid analógok lehetnek módosított cukor molekulák vagy cukron belüli kötések. Ilyenek közé tartoznak példaképpen a foszforotioát- és más kéntartalmú-tagok, amelyek a szakterületen ismertek. Ezek a molekulák tartalmazhatnak még módosított alapegységeket, vagy más olyan módosítá• ·

- 25 sokat, amelyek a találmány lényegétől nem térnek el.

A találmány egy előnyös kiviteli módjánál legalább néhány foszfodiészter kötés az oligonukleotid molekulában szubsztituált olyan szubsztituensekkel, amelyek működése elősegíti a készítmény behatolását azon sejtrészekbe, ahol az az RNS található, amelynek aktivitását módosítani kell. Előnyös, ha az ilyen szerkezeti egységek, kötések kéntartalmúak. Előnyös továbbá, ha ezek a szubsztituensek foszfor-tioát kötéseket tartalmaznak. Más egyéb szerkezetek, így például alkil-foszfortioát kötések, Nalkil-foszforamidátok, foszfor-ditioátok, alkil-foszfonátok, valamint rövidszénláncú alkil- vagy cikloalkil szerkezetek szintén előnyösek. Egy másik előnyös kiviteli mód szerint a foszfordiészter kötések olyan szubsztituensekkel szubsztituáltak, amelyek egyidejűleg lényegében nem-ionosak és nemkirálisak. A szakterületen jártas szakember ki tud választani más egyéb szubsztituenseket, kötéseket is, amelyek a találmány értelmében felhasználhatók.

Az oligonukleotid analógok közé tartoznak továbbá olyan molekulák is, amelyek legalább néhány módosított alap formát tartalmaznak. így például alkalmazhatók purinok és pirimidinek is, amelyek eltérőek a természetben általában megtaláthatóktól. Hasonlóképpen a nukleotid alegység ciklofuranóz részén is elvégezhetők módosítások oly mértékben, hogy a találmány lényegétől ne térjen el.

Az ilyen analógokat leginkább úgy írhatjuk le, hogy funkcionálisan felcserélhetők a természetes oligonukleotidokkal (vagy a természetes módnak megfelelően szintetizált oligonukleo tidokkal), de amelyek egy vagy több különbséget mutatnak a természetes szerkezettől. Az összes ilyen analógok a találmány oltalmi körébe tartoznak, amennyiben azok úgy működnek, hogy hatásosan hibridizálódni képesek a herpesz vírus vagy más rokon vírus messenger RNS-jével, az RNS működésének gátlására.

A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok előnyösen 6-50 alegységet tartalmaznak, még előnyösebben az oligonukleotidok és analógok 8-25 alegységet tartalmaznak. Nyilvánvaló, hogy az alegység egy bázis és egy cukor kombinációja, amely alkalmasan kötődik a szomszédos alegységhez egy foszfordiészter vagy más egyéb kötéssel.

A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok olyanok, hogy hibridizálódni képesek a herpesz vírus messenger RNS-jével. Az ilyen hibridizáció, ha végbement, gátolni képes a messenger RNS normál működését, és ily módon kevésbé felhasználható a vírus számára. A gátolni kívánt messenger RNS funkciók magukban foglalnak minden vitális funkciót, így például az RNS transzlokációját a protein transzlációjához szükséges helyre, a protein tényleges transzlációját az RNS-ből, és esetlegesen egy független katalitikus aktivitást, amelyet az RNS indít el. Az ilyen RNS funkciókba való beavatkozás általános hatása az, hogy a herpesz vírus az RNS-t hasznosítani nem tudja, és általában a virális genom expressziója révén zavaró hatás lép fel. Az ilyen zavaró hatás általában végzetes a vírus számára.

A találmány értelmében előnyösen olyan oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat állítunk elő, amelyek beavatkoznak • ·

- 27 a messenger RNS-k működésébe, és olyanok, hogy fokozott metabolikus jelentőséggel rendelkeznek a fentiekben ismertetett vírusokkal szemben. Azt tapasztaltuk, hogy előnyös, ha a nyitott leolvasási keret egy vagy több transzlációs iniciációs részét célozzuk meg az antiszenz támadás céljára. Nyilvánvaló, hogy az ilyen részek általában magukban foglalják az AUG szekvenciát (RNS-ben), így az oligonukleotid CAT szekvenciája ezzel specifikusan hibridizálható. Ennek megfelelően ezen kiviteli formánál a CAT szekvenciát tartalmazó oligonukleotidok és oligonukleotid analógok az előnyösek. Az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok továbbá előnyösen olyan nukleotid alegységeket tartalmaznak, amely lehetővé teszi, hogy a nukleinsawal való specifikus hibridizáció nagymértékben menjen végbe. Ennek megfelelően az előnyös oligonukleotidok vagy analógok tartalmaznak számos alegységet a CAT szekvencia egyik vagy mindkét oldalán, amely szekvencia úgy van megalkotva, hogy komplementer a hibridizálandó transzlációs iniciációs hellyel szomszédos szekvenciával. Hat-tizenkét ilyen, mindkét oldalon szomszédos alegység megfelelő és előnyös a találmány szempontjából, bár ennél nagyobb vagy kisebb számú alegységek is előnyösen alkalmazhatók, anélkül, hogy a találmány lényegétől eltérnénk.

A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok alkalmazhatók diagnosztikai, valamint gyógyászati készítményekben, valamint felhasználhatók kutatásra alkalmas reagensként és kitként. Gyógyászati felhasználásnál a találmány szerinti oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat az állatoknak és különösen embereknek adagoljuk, amelyek herpesz * · ·

- 28 vírus fertőzésben szenvednek, így például valamely következő fertőzésben: genitális herpesz, herpesz szimplex gingivostomatitis, herpesz labiális, herpesz szimplex enkefalitisz, keratoconjunctivitis, herpeszes köröm és ujjgyulladás vagy disszeminált herpesz fertőzések csecsemőknél és immunoegyezéses gazdaszervezeteknél.

Általában előnyös, ha a találmány szerinti gyógyászati készítményeket topikálisan vagy intralezionálisan adagoljuk. Más egyéb formák is alkalmazhatók azonban, így például az adagolás történhet orálisan, transzdermálisan, intravénásán, vagy intramuszkulárisan. A kúp készítmények formájában történő adagolás szintén előnyös. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok profilaktikus alkalmazása szintén előnyös. Ilyen esetekben a készítményeket például kesztyűk vagy kondomok és más egyebek borítására alkalmazhatjuk. Bizonyos esetekben a készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat is.

A találmány szerinti készítmények alkalmazhatók a diagnosztikában és a kutatásban is. Mivel a találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok a herpesz vírussal hibridizálódnak, ezen tény kihasználására könnyen szerkeszthetünk szendvics vagy más egyéb vizsgálatokat. Az eszközök, amelyek szükségesek az oligonukleotid vagy oligonukleotid analógok és a mintában feltételezetten jelenlévő herpesz vírus hibridizációjának detektálására, rutinszerűen biztosíthatók. Az ilyen eszközök közé tartozik például az enzim konjugáció, a radiojelzés vagy más alkalmas detektáló rendszer. A herpesz vírus • · • · ·*

- 29 jelenlétét vagy távollétét kimutató kitek szintén előállíthatók.

A találmány kitanításának megfelelően számos komplementer oligonukleotidot állítottunk elő, amelyek kiválasztott HSV mRNSek transzlációs iniciációs szakaszait célozzák meg (8.

táblázat). A foszfordiészter vázat tartalmazó természetes oligonukleotidokat az anti-HSV aktivitás számára egy fertőzéses vizsgálattal választottuk ki. Ezen vizsgálatban legjobb aktivitást mutató oligonukleotidet (ISIS 1049) a HSV-1 UL13 génnel homológ HSV-2 belső transzlációs iniciációs kodonjának szántuk. Ezen aktív szekvencia metil-foszfonát és foszforotioát analógjainak szintézise azt mutatta, hogy a foszforotioát váz módosítása nagymértékben fokozza az antivirális aktivitását az oligonukleotidnak, viszonyítva akár a foszfodiészter-, akár a metil-foszfonát-oligonukleotidokhoz. Az in vitro szintetizált HSV-1 és HSV-2 UL13 RNS nyúl retikulocyta transzlációja kimutatta, hogy akár a foszfordiészter (ISIS 1049), akár a foszforotioát (ISIS 1082) vázszerkezetet tartalmazó oligonukleotidok gátolni képesek az UL13 polipeptid szintézisét. Dózis válasz kísérletekkel összehasonlítottuk az ISIS 1082 antivirális aktivitását az az acycloguanosine (ACV) antivirális aktivitásával két HSV-1 PAAr⁵ ACV^r törzs esetében, egy KOS mutáns esetében, amely a virális DNS polimerázban egy módosított nukleotid kötési helyet tartalmaz, és DM2.1 esetében, amely virális timidin kináz gén deléciót tartalmaz. Az ISIS 1082 aktivitása ebben a kísérletben megmutatta, hogy az oligonukleotidot nem szükséges foszforilezni a virális timidin kinázzal az aktiváció érdekében, és kimutatta azt is, hogy az oligonukleotid nem lép kölcsönhatásba a virális ·· * ······ ··* ··« • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ···

- 30 DNS polimerázzal a PAA és ACV kötési helynél. Az ISIS 1082 celluláris toxicitásának in vitro vizsgálata kimutatta, hogy az e vegyületre megjósolt terápiás index ekvivalens vagy még jobb, mint az ACV esetében a parallel kísérletnél megjósolt terápiás index. Annak kimutatása, hogy az ISIS 1082 antivirális aktivitást mutat a vírus ACV-rezisztens törzsei esetében is, valamint az, hogy igen kedvező terápiás indexszel rendelkezik, aláhúzza ezen antivirális vegyületek csoportjának potenciális klinikai értékeit.

Kimutattuk, hogy az antiszenz oligonukleotidok gátolják a vírus replikációt a sejtkultúrában. Kevés ismeretünk van azonban az antiszenz oligonukleotidok hatásosságáról a virális fertőzések állatmodelljeinél. Az ilyen vizsgálatokhoz igen jó modell a HSV indukált keratitisz. Az ilyen okuláris HSV fertőzéseket általában topikálisan kezelik, és ily módon relatíve egyszerűen lehet az antiszenz oligonukleotidok hatásosságát in vivő vizsgálni. A hatóanyagot topikálisan vizes oldat formájában adagoljuk, és a fertőzés különböző paraméterei mutathatók ki. Egér modell esetében vizsgáltuk a találmány szerinti foszforotioát antiszenz oligonukleotidok hatásosságát herpeszes keratitisz esetében. Az oligonukleotidot HSV-1 UL13 gén ellen irányítottuk, amelynek szekvenciája a következő: GCCGAGGTCCATGTCGTACGC (ISIS 1082; SEQ ID NO.: 7). Azt tapasztaltuk, hogy ezen anti-UL13 oligonukleotiddal végzett topikális kezelés jelentősen csökkenti a HSV-indukált sztromális keratitisz komolyságát.

A vizsgálatnál az oligonukleotidot három különböző koncent• ·

- 31 rációban alkalmaztuk, és kontrollként puffért használtunk (50 mmól nátrium-acetát, pH = 5,8, 0,15 mól NaCl), és a fertőzést HSV-1 vírussal végeztük. Minden állatnak 1 x 10⁵ plakkos formájú egységet (pfu) adagoltunk a szaruhártya megkarcolását követően. Azt tapasztaltuk, hogy 0,3 % és 1,0 % ISIS 1082 esetében a blepharitis komolysága nem változott, de a 0,3 % és 1 % ISIS 1082-vel végzett kezelés esetében a gyógyulás valamivel gyorsabb volt (7. ábra). Az ISIS 1082-vel végzett kezelés csökkentette a stromális betegséget, és a vaszkularizációt a fertőzést követő 11., 13. és 15. napon (7. ábra). Ez a csökkenés statisztikusan szignifikáns volt bizonyos napokon, de bizonyos napokon nem, feltehetően a minta kicsinysége és a betegség variációs képessége miatt. A dózis és a betegség előfordulásának összefüggése, mint azt a 8. ábrán bemutatjuk, jelzi, hogy az ISIS 1082 egy szűk koncentráció intervallumban hatásos. A betegség előfordulásának 50 %-os csökkenését kiváltó dózis 0,17 % blepharitis, 0,25 % vaszkularizáció és 0,22 % stromális betegségek esetén. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az találmány szerinti antiszenz oligonukleotidok alkalmazhatók HSV keratitisz kezelésére.

A következő nem korlátozó példákkal a találmány szerinti megoldást illusztráljuk közelebbről.

1. Példa

HeLa (ATCC #CCL2) és Verő (ATCC #CCL81) sejteket szereztünk be az American Tissue Culture Collection-től. A HeLa sejtek kultúráit Dulbecco's Modified Essential Medium-ban (D-MEM) tenyésztettük, amelyet még a következőkkel kiegészítettünk:

% magzati szarvasmarha szérum (FBS), penicillin (100 egység/ml) , szreptomicin (100 ^g/ml) és L-glutamin (2 mmól). A Verő sejteket D-MEM közegben tenyésztettük, amelyet a következőkkel egészítettünk még ki: 5 % FBs, penicillin, sztreptomicin és L-glutamin. A Verő sejtekben HSV-1 (KOS törzs) és HSV-2 (HG52 törzs) törzs kultúráit tenyésztettük alacsony fertőzési érték mellett (multiplicity of infection [M01]=0,02 plakk képző egység [pfu]/sejt/sejt).

Annak meghatározására, hogy az oligonukleotidok mily mértékben képesek a HSV replikációt gátolni, fertőzéses vizsgálatot végeztünk. HeLa sejteket 5 x 10$ sejt/lyuk mennyiségben Falcon 6 szövettenyésztő lemezekre ráoltottunk. A sejtekre 3 ml tápközeget (D-MEM + 10 % FBS) rétegeztünk, és 37 °C hőmérsékleten 18-24 órán át inkubáltuk. Ahol szükséges volt, a sejtekre oligonukleotid készítményt rétegeztünk 1 ml tápközegben 24 órával a lemezek beoltása után. 18 órás inkubáció után a lyukakat foszfáttal pufferolt sóoldattal átmostuk, és megfertőztük vagy HSV-1 vagy HSV-2 vírussal különböző mértékben (MOI), a vírusokat 0,5 ml szérummentes D-MEM tápközegben szuszpendálva. A vírust és a sejteket 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk, esetenkénti rázással. A virális abszorpciót követően a nem abszorbeálódott vírust kiöblítettük, a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mosva. Ahol szükséges volt, 1 ml tápközeget (D-MEM + 10 % FBS) adagoltunk, amely 4 μιηόΐ oligonukleotidot tartalmazott, és a sejteket 48 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A kontroll lyukakhoz 1 ml tápközeget adagoltunk, amely oligonukleotidot nem tartalmazott.

A felhasznált oligonukleotidok olyanok voltak, hogy beavatkozzanak akár az UL13, UL39 vagy UL40 mRNS-jeinek transzlációjába a transzlációs iniciációs szakasznál. A nem módosított oligo-dezoxi-nukleotidokat Applied Biosystems 380B DNA Synthesizer felhasználásával szintetizáltuk standard foszforamidit kémiával jóddal végzett oxidációval. A reagenseket mind a CPG-kötésűt, mind a β-ciano-etil-diizopropil-foszforamiditeket az Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) cégtől szereztük be. A standard oxidációs lombikot 0,2 mólos acetonitriles ³H-l,2-benzoditiol-3-on-l,l-dioxid-oldattal [Iyer és munkatársai, (1990), J. Am. Chem. Soc., 112, 125-1254] helyettesítettük a foszfit kötések lépcsőzetes kénezéséhez (tiacsoportok bevitele). A kénezési ciklus várakozási lépését 68 másodpercre növeltük, és ezt egy semlegesítő lépés követte. A CPG-oszlopról való hasítás és 55 °C hőmérsékleten 18 órán át koncentrált ammónium-hidroxiddal végzett deblokkolás után a foszforotioátokat tritil-on HPLC segítségével PRP-1 oszlopon tisztítottuk 50 mmól-os acetonitriles trietil-ammónium-acetát gradiens alkalmazásával pH = 7 értéknél (4 - 32 % 30 perc alatt, folyási sebesség 1,5 ml/perc). A megfelelő frakciókat egyesítettük, bepároltuk és 5 %-os ecetsavval környezeti hőmérsékleten 15 percen át kezeltük. Az oldatot ezután azonos mennyiségű etil-acetáttal extraháltuk, ammónium-hidroxiddal semlegesítettük, fagyasztottuk és liofilizáltuk. Analitikai gél elektroforézist végeztünk a következő paraméterek mellett: 20 % akrilamid, 8 mól karbamid, 45 mmól trisz-borát puffer, pH = 7, 40 V/cm. Az oligodezoxi-nukleotidokat és ezek foszforotioát analógjait HPLC »» » · ♦ · * • ·····» · ♦· ··· • * · · · · ·

- 34 analízissel és poliakrilamid gél elektroforézissel vizsgáltuk, és megállapítottuk, hogy nagyobb mint 95 % teljes hosszúságú anyag.

A foszforotioát és foszfodiészter kötések relatív mennyiségét, amelyet a szintézisünk során nyertünk ³¹P NMR spektroszkópiával határoztuk meg. A spektrumokat Varian NMR spektrométerrel vettük fel ³¹P-vel 162 MHz frekvenciánál. Általában 1000 tranzienst adagoltunk egyidejűleg. A tranziensek között 7,5 secos relaxációs késleltetést alkalmaztunk a teljesen relaxált spektrum biztosítására. A ³¹P spektrumot környezeti hőmérsékleten vettük fel, deutérium-oxid vagy dimetil-szulfoxid-dg mint oldószer alkalmazásával. A foszforotioát minták kevesebb mint 1 % foszfor-diésztert kötést tartalmaztak.

Az előállított szekvenciákat az 1. táblázatban foglaljuk össze.

- 35 Ο ΊΟ «Ρ -Ρ Ν Ν ΊΟ U) 1/1 Ο Ό Ο ·Η Ό -Ρ 44

		ιη	φ	C0	σι	ο	Η
ΓΊ	η		C-)	ΓΊ	Ο

« · ·> · Λ ··· ··· ··· • · · · · · • · · »a *· · · ·

Ρ <0 Ν Μβ rH Λ Μβ Ε<

-Ρ Φ •Η Ν g ΊΟ φ VÖ 6 44 Ν ρ ρ ω ο Φ τι S Ν Ό ω 44 ο ζ

Q Η

Ο Μ ω

rH	Ν	ΓΊ	V	ιη	χο	Γ'	«
Ο	Ο	Ο	ο	ο	ο	ο	ο

ν m tr ιη νο

		0		0	0	0	0	<
(ύ		0	0	0	0	0	0	2
Ή		0	<	<	0	0	0	0
υ e	υ	0	Ο	0	<	0		0
Μ φ >	0	0	<	0	Εη	0	Ε-·	«5
0	Η	3	<	0	Η	0	2
44	υ	Η	ο	0	0	0	0	ο
Φ	Ε-<	0	&Ί	0	Ε<	0	ΕΊ	ο
Ν ω	0	0	Η	0	0	0	0	Εη
Ε«	Εί	Η	Εί	Η	Εί	Η	Ε«
τι	<	<	<	<	<		<	<
Ή — Ρ η	0	0	0	0	0	0	0	0
0	ο	0	0	0	0	0	0	0
Φ	Ε-ι	Η	0	Ε-<	Ε«	Εη	Εη	0
rH	0	<	0	<	0	<	0	Ο
η	U	0	Εί	<	0	0	0	Ε-ι
F-* c	0		0	Ο	<	Ε«	<	Ε<
Μ 0	U	0	0	ο	0	0	0	0
tp	0	<	0	0	0	<	0	Ο
•Η	&Ί	0	0	0	0	0	0	0
γΗ —	0	0	0	0	<	0	0	Ο

ο ιη

α 'φ ο

rH	«Η	r*H	rH	γΗ	CM	OJ	nj
CO	Ο	σ\	Ο	ΓΊ	ΓΊ	ΓΊ	σ\
	•Η	ΓΊ		γΗ	γΗ	«Η	η
		PJ		Ρ)	»4		ι-Ι
0	0	0	3	0	□	Ο	Ο

ιη • · · • *

- 36 A vírusokat a felüllévő tápközegre gyűjtjük, és minden kísérleti ponthoz három lyuk tartalmát egyesítjük, és 3 ml térfogatra egészítjük ki. A szuszpenziót lefagyasztjuk, majd felengedjük, ezt négyszer ismételjük, majd négyszer 20-as méretű tűn áthúzzuk és -80 °C hőmérsékleten 2 ml-es alikvotok formájában tároljuk. Más módszer szerint mindegyik lyukat begyűjtjük, és minden kísérleti ponthoz ismételt titrálásokat végzünk. Ez utóbbi módszert alkalmaztuk az egyes HSV-1 törzseknél a dózis válasz görbe meghatározásához. A vírus mennyiségét (titerét) plakkos analízissel vizsgáltuk Verő sejt monorétegeken. Az egyes vírus készítményeket hígítottuk, és minden hígításból két alikvot részt vettünk ki és Verő sejteken adszorbeáltuk 1 órán át, esetenkénti rázással. Az adszorpció után a vírus inokulumokat a lemezek mosásával eltávolítottuk, a mosáshoz foszfáttal pufférőit sóoldatot alkalmaztunk, majd a sejteket 2 ml D-MEM tápközegre rétegeztük, amely tápközeg még 5 % FBS-t és 0,75 % metil-cellulózt tartalmazott. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 72 órán át inkubáltuk, mielőtt a plakkokat formaiinnal rögzítettük, kristályos violettel festettük és számláltuk. A kezelt lyukakból származó plakkok számát a kontroll lyukakhoz viszonyítottuk, és ily módon megállapítottuk a vírus replikáció gátlásának mértékét.

A 2. táblázatban összefoglaljuk a kapott adatokat. A táblázatban megadjuk a vírus típusát, HSV-1 vagy HSV-2, a fertőzés mérékét (multiplicity of infection, MOI). A kapott kísérleti adatok és a kontroll értékek összehasonlításával megállapítható a replikáció gátlása.

- 37 ·· · · 4 »» • ·Μ «·♦ ··*·♦· « · · * ·· «»· ·· «* ·· **·

2. Táblázat

Vírus típusa	MOI	Oligomer	Hozam 1	Hozam 2	Átlag
HSV-1	0.5	nőne	5.4E+08	6.2E+08	5.80E+08
HSV-1	0.5	01	6.3E+08	7.0E+08	6.65E+08
HSV-1	0.5	03	7.7E+08	8.0E+08	7.85E+08
HSV-1	0.5	04	3.9E+08	5.7E+08	4.80E+08
HSV-1	0.5	05	7.7E+08	9.3E+08	8.50E+08
HSV-1	0.5	08	7.9E+08	8.9E+08	8.40E+08
HSV-1	0.5	42	5.7E+07	7.5E+07	6.60E+07
HSV-1	0.5	39	1.4E+06	1.7E+06	1.55E+06
HSV-1	0.5	41	1.2E+06	2.6E+06	1.90E+06
HSV-2	0.5	nőne	8.0E+07	9.1E+07	8.55E+07
HSV-2	0.5	01	7.6E+07	8.5E+07	8.05E+07
HSV-2	0.5	03	8.3E+07	9.5E+07	8.90E+07
HSV-2	0.5	04	4.9E+07	6.3E+07	5.60E+07
HSV-2	0.5	05	6.6E+07	7.5E+07	7.05E+07
HSV-2	0.5	08	5.1E+07	6.2E+07	5.65E+07
HSV-2	0.5	39	5.0E+05	7.0E+05	6.00E+05
HSV-2	0.5	41	3.0E+05	7.0E+05	5.00E+05
HSV-1	0.5	nőne	6.0E+07	7.6E+07	6.80E+07
HSV-1	0.5	01	1.2E+08	1.2E+08	1.20E+08
HSV-1	0.5	03	1.3E+08	1.7E+08	1.50E+08
HSV-1	0.5	07	8.9E+07	9.5E+07	9.20E+07
HSV-1	0.5	08	9.0E+07	1.2E+08	1.05E+08
HSV-1	0.5	09	1.5E+08	1.8E+08	1.64E+08
HSV-1	0.5	35	1.7E+07	2.0E+07	1.85E+07
HSV-1	0.5	37	3.5E+07	4.7E+07	4.10E+07
HSV-1	0.5	38	5.7E+06	7.1E+06	6.40E+06
HSV-1	0.5	40	1.7E+09	2.1E+09	1.86E+09
HSV-1	0.05	nőne	2.8E+08	3.3E+08	3.05E+08
HSV-1	0.05	03	3.5E+08	4.7E+08	4.10E+08
HSV-1	0.05	07	2.6E+08	3.2E+08	2.90E+08
HSV-1	0.05	08	3.0E+08	4.3E+08	3.65E+08
HSV-1	0.05	09	3.5E+08	3.7E+08	3.60E+08
HSV-1	0.05	35	4.2E+05	6.0E+05	5.10E+05
HSV-1	0.05	37	2.9E+06	3.2E+06	3.05E+06
HSV-1	0.05	38	2.5E+05	3.9E+05	3.20E+05
HSV-1	2.5	nőne	1.5E+08	2.5E+08	2.00E+08
HSV-1	2.5	01	4.0E+08	7.1E+08	5.55E+08
HSV-1	2.5	02	6.2E+08	7.6E+08	6.90E+08
HSV-1	2.5	03	4.0E+08	4.3E+08	4.15E+08
HSV-1	2.5	04	5.0E+08	6.1E+08	5.55E+08
HSV-1	2.5	06	5.4E+08	6.1E+08	5.75E+08
HSV-1	2.5	07	2.9E+08	4.1E+08	3.50E+08

• i ·

- 38 • · · « · · ♦ ··· *· ·· ·« ««·

2. Táblázat (folytatás)

Vírus típusa MOI

HSV-1 HSV-1	0.25 0.25
HSV-1	0.25
HSV-1	0.25
HSV-1	0.25
HSV-1	0.25
HSV-1	0.25
HSV-2	1.5
HSV-2	1.5
HSV-2	1.5
HSV-2	1.5
HSV-2	1.5
HSV-2	1.5
HSV-2	1.5
HSV-2	1.5
HSV-2	0.15
HSV-2	0.15
HSV-2	0.15
HSV-2	0.15
HSV-2	0.15
HSV-2	0.15
HSV-2	0.15
HSV-2	0.15

Oligomer	Hozam 1
nőne	7.7E+07
01	6.5E+07
02	5.9E+07
03	5.4E+07
04	5.2E+07
06	6.7E+07
07	2.1E+07
nőne	1.3E+08
01	5.9E+07
02	5.3E+07
03	1.1E+08
04	1.3E+08
06	1.1E+08
07	5.0E+07
08	8.7E+07
nőne	8.0E+07
01	2.8E+07
02	7.3E+07
03	4.4E+07
04	6.7E+07
06	4.4E+07
07	5.0E+07
08	4.0E+07

Hozam 2	Átlag
8.4E+07	8.05E+07
7.0E+07	6.75E+07
7.0E+07	6.45E+07
6.4E+07	5.90E+07
7.1E+07	6.15E+07
7.2E+07	6.95E+07
4.3E+07	3.20E+07
1.7E+08	1.48E+08
5.8E+07	5.85E+07
6.4E+07	5.85E+07
1.2E+08	1.15E+08
1.3E+08	1.28E+08
1.2E+08	1.12E+08
5.4E+07	5.20E+07 8.70E+07
8.4E+07	8.20E+07
3.1E+07	2.95E+07
8.5E+07	7.90E+07
5.0E+07	4.70E+07
7.2E+07	6.95E+07
4.8E+07	4.60E+07
5.4E+07	5.20E+07
4.1E+07	4.05E+07

a táblázatban nőne jelentése: nincs ·· · - w · • ··· V·· ♦····· • · « * · · * ·*· ·· ·♦ ·····

A következő táblázatban összefoglalt adatokat hasonlóképpen nyertük, kivéve hogy a sejteket előzőleg nem 18 órán át, hanem 5 órán át kezeltük az oligonukleotiddal. Bizonyos esetekben, ahol külön jelöljük, nagyobb oligonukleotid koncentrációkat alkalmaztunk.

3. Táblázat

Vírus típusa	MOI	Oligomer	Hozam 1	Hozam 2	Átlag
HSV-1	0.5	nőne	6.1E+08	6.8E+08	6.45E+08
HSV-1	0.5	01	6.4E+08	7.4E+08	6.90E+08
HSV-1	0.5	02	6.2E+08	6.5E+08	6.35E+08	8	μΜ
HSV-1	0.5	03	7.9E+08	9.0E+08	8.45E+08	11	μΜ
HSV-1	0.5	06	5.7E+08	7.0E+08	6.35E+08
HSV-1	0.5	07	7.0E+08	8.0E+08	7.50E+08
HSV-1	0.5	08	6.9E+08	8.9E+08	7.90E+08	15	μΜ
HSV-1	0.5	09	6.6E+08	8.1E+08	7.35E+08
HSV-1	0.5	35	4.0E+05	5.0E+05	4.50E+05
HSV-1	0.5	37	1.8E+06		1.8E+06
HSV-1	0.5	38	3.2E+06	3.8E+06	3.50E+06
HSV-1	0.05	nőne	6.7E+08	8.6E+08	7.65E+08
HSV-1	0.05	03	7.8E+07	9.0E+07	8.40E+07	11	μΜ
HSV-1	0.05	06	7.6E+07	7.7E+07	7.65E+07
HSV-1	0.05	07	8.4E+07	8.4E+07	8.40E+07
HSV-1	0.05	08	6.5E+07	8.3E+07	7.40E+07	15	μΜ
HSV-1	0.05	09	3.8E+07	4.5E+07	4.15E+07
HSV-1	0.05	35	4.5E+04	4.8E+04	4.65E+04
HSV-1	0.05	37	9.5E+04	1.0E+05	9.95E+04
HSV-1	0.05	38	2.3E+04	2.7E+04	2.50E+04
HSV-2	0.5	nőne	5.3E+07	6.3E+07	5.80E+07
HSV-2	0.5	07	2.8E+07	3.0E+07	2.90E+07
HSV-2	0.5	38	6.5E+06	7.1E+06	6.80E+06
HSV-2	0.05	nőne	4.3E+07	4.3E+07	4.30E+07
HSV-2	0.05	07	1.6E+07	1.8E+07	1.70E+07
HSV-2	0.05	38	6.7E+04	8.0E+04	7.35E+04

• · ♦ * 4 Λ9 • ··· ··♦ ·····» • 4 · · · · * ··· *· ·· ····♦

Az előző adatokból látható, hogy a találmány szerinti oligonukleotidok alkalmazásával a vírus replikáció jelentős csökkenése érhető el.

2. Példa

A következő kísérletnél az antiszenz oligonukleotid hatásosságát vizsgáltuk egér modellen okuláris HSV fertőzés esetén, amely oligonukleotid komplementer a HSV-1 UL13 génnel.

Kezelési módszer

Az anti-UL13 oligonukleotidot, amelynek szekvenciája a következő: GCCGAGGTCCATGTCGTACGC (ISIS 1082; SEQ ID NO.: 7), 50 mmól nátrium-acetátot (pH = 5,8) és 0,15 mól NaCl-t tartalmazó pufferban oldottuk, és 4-5 hetes nőstény BALB/c egereknek adagoltuk. Három különböző ISIS 1082 koncentrációt vizsgáltunk, és a kezelést 4 órával a fertőzést követően (pi) végeztük, a fertőzéshez HSV-1 laboratóriumi törzset alkalmaztunk, amely komoly okuláris fertőzést vált ki. A kísérleteknél felhasznált HSV-1 KOS törzset [Grau és munkatársai, Invest. Ophthalmol. vis. Sci., 30:2474-2480 (1989)] 1 x 10⁵ plakk képző egység (pfu) inokulum mennyiségben alkalmaztuk.

A vizsgálandó vegyületek adagolásához az egereket halothane (2,5 %) inhalációval elaltattuk. 10 μΐ mennyiségű oldatot helyeztünk minden szaruhártyára, és a szemet 15 percen át nyitva tartottuk. Az egereket ezután visszahelyeztük a ketrecekbe. A felesleges hatóanyagot nem távolítottuk el. A kezelést 16 órán át minden 2 órában elvégeztük naponta (8 dózis összesen naponta) az első 7 napon át, majd a kezelés második hetében minden 4 órában végeztük a kezelést naponta 16 órán át (4 dózis naponta) .

Az egereket a fertőzés után 30 napon át tartottuk, ekkor a trigeminális gangliát (TG) aszeptikusán eltávolítottuk. A minták felét homogenizáltuk, fagyasztottuk és szárítottuk, ezt háromszor ismételtük, majd meghatároztuk a fertőzött vírusok mennyiségét [Brandt és Grau módszere szerint, Invest. Ophthal mól. Vis. Sci., 31:2214-2223 (1990)]. Minden mintát 600 μΐ mennyiségű sejt tápközegbe helyeztünk a vizsgálat elvégzését megelőzően. Minden vizsgálati ponthoz három egeret alkalmaztunk. A mennyiségeket átlagosan totál log₁₀ pfu per szövet értékben adtuk meg.

A megmaradt mintákat összevagdaltuk, és tenyésztő csészékbe tettük, amelyek Verő sejt monorétegeket tartalmaztak 2 % szérumot tartalmazó tápközegben. A ko-tenyésztést minden második nap figyeltük 2 héten át a citopatikus hatás bizonyítására.

A kezelés hatása az okulárig betegségre

Három különböző dózisú ISIS 1082-t, puffért és kereskedelmi forgalomban beszerezhető trifluor-timidin oldatot (TFT), 1 %, Viroptic, Burroughs-Wellcome) vizsgáltunk. A különböző kezelési csoportokat a 4. táblázatban foglaljuk össze.

4. Táblázat

Csoport	Állatok száma	Kezelés
A	10	csak puffer
B	10	0,1 % ISIS 1082
C	10	0,3% ISIS 1082
D	9	1,0 % ISIS 1082
E	9	Viroptic (1,0 %)
F	10	Látszat-fertőzés
G	10	Nincs kezelés

A 7. ábrán bemutatjuk a kapott eredményeket blepharitis, a szaruhártya vaszkularizációja és stromális keretitisz esetén. A blepharitis először a fertőzést követő 3. napon volt látható az A, B, C, D és G csoportnál, a komolysága növekedett, a csúcsot a 7. napon érte el, majd egy javulás indult meg. A blepharitis mértéke a 7. napon az A, B, C, D és G esetében nem különbözött egymástól szignifikánsan (p > 0,05), jelezve, hogy az ISIS 1082 kis hatással van, vagy egyáltalán nincs hatásai a blepharitis komolyságának kifejlődésére. A blepharitis teljesen a 15. napon gyógyult meg a C és D csoportnál, 28 napig tartott a gyógyulás a B és G csoportnál, míg teljes gyógyulás nem volt kimutatható a D csoportnál. A betegség jelei szignifikáns mértékben különböztek a 15. napon (p > 0,05), az A, B, C, D és G csoportok esetében, jelezve, hogy az ISIS 1082-vel végzett kezelés csökkenti a gyógyulási időt. A TFT esetén (E csoport) szignifikáns blepharitis kialakulása akadályozva volt.

Az ISIS 1082 által okozott gyulladások meghatározására 10 egér esetében 1 %-os ISIS 1082 oldattal látszat-fertőzést végeztünk. A hatóanyagot 7 napon át naponta minden második órában adagoltuk (8 dózis naponta), és a blepharitist naponta értékeltük. Egyik egér esetében sem volt látható blepharitis vagy gyulladás kialakulása. Tehát az ISIS 1082 esetében kimutatható blepharitist (7. ábra) nem a hatóanyag okozta.

A szaruhártya vaszkularizációját először az 5. és 7. nap között figyeltük meg megnövekedett mértékben az A, B, C, D és G csoportnál. A vaszkularizáció legnagyobb értéke a 11. napon volt kimutatható a kezeletlen, fertőzött egereknél (G csoport), kismértékben csökkent a 13. napon, de még mindig elegendően magas értékű volt a fertőzést követő 28. napon (pontérték 1,2). A vaszkularizáció a 13. napon volt a legnagyobb (pontérték 1,7), és magas értékű maradt a csak pufferral kezelt egerek esetében. Az ISIS 1082-vel kezelt egerek esetében a kifejlődött vaszkularizáció a 13. napon volt a legnagyobb, és konstans értékű maradt a 28. napig, függetlenül a dózistól. Azonban az ISIS 1082-vel kezelt egerek esetében a vaszkularizáció mértéke kisebb volt, mint a kezeletlen vagy pufferral kezelt egereknél (0,8 -

1,2 pont, szemben az 1,7 ponttal a 13. napon), jelezve, hogy bár az ISIS 1082 nem akadályozza meg a vaszkularizációt, mégis csökkenti a betegség komolyságát. Enyhe vaszkularációt figyeltünk meg a 15. napon a TFT-vel kezelt egerek esetében (F csoport), de ez is gyorsan kitisztult.

Az A, B, C, D és G csoportok mindegyikénél stromális keratitisz fejlődött ki. A stromális keratitiszt először a 7. és 8.

napon figyeltük meg megnövekedett mértékben, és az A és G csoportok esetében a 11. és 15. napon volt a legnagyobb. Az ISIS 1082-vel kezelt egerek esetében a stromális keratitisz nem ért el maximumot a 15. vagy 21. napig, és kevésbé volt komoly a

11., 13. és 15. napon a kezeletlen vagy pufferral kezelt egerekhez viszonyítva. A TFT-vel kezelt egerek esetében enyhe stromális keratitisz kifejlődését állapítottuk meg a 15. napon, ez a 21. napon kitisztult.

A 11., 13. és 15. napokon kapott adatok időbeli lefutását statisztikus szignifikáns differenciákra vonatkozóan ANOVA teszttel vizsgáltuk a 95, 90 és 85 %-os bizonyossági szinteknél. A kapott eredményeket a következő 5. táblázatban foglaljuk össze.

• · • · ·

- 45 5. Táblázat

Stromális keratitisz

Vaszkularizáció

11.	nap	11.	nap
	A B C D E F G§		ABCDEFG
A	- 0 + + * * 0	A	- 0 0 0 **0
B	-00** +	B	-00** +
C	- 0 # # *	C	-0**0
D	- # + *	D	- * * 0
E	- 0 *	E	- 0 *
F	- *	F	- *
G		G	—
13.	nap	13.	nap
	ABCDEFG		ABCDEFG
A	- 0 + 0 * * 0	A	- 0 + # * * 0
B	- 0 0 * * 0	B	- 0 # * * 0
C	- 0 0 0 *	C	- 0 # + *
D	- 0 # *	D	- + * +
E	- 0 *	E	- 0 *
F	- *	F	- *
G	-	G	-
15.	nap	15.	nap
	ABCDEFG		ABCDEFG
A	- 0 * 0 * * 0	A	- 0 * 0 * * 0
B	- # 0 * * 0	B	- 0 0 * * 0
C	- 0 0 0 *	C	-00#*
D	- + * 0	D	- # * 0
E	- 0 *	E	- 0 *
F	- A	F	- *
G	-	G

* = 95 % bizonyság + = 90 % bizonyság # = 85 % bizonyság

Blepharitis

11. nap

A B C D E F G A -000**0 B - 0 0 # + 0

C - 0 0 0 +

D - + * 0

E - 0 *

F - *

G

13. nap

A B C D E F G A - 0 # + * * 0 B - 0 0 + * 0 C - 0 0 0 # D -00 + E - 0 * F - * G

15. nap

ABCDEFG

A - 0 * * * *0

B - * * * *o

C - 0 0 0+

D“00#

E- 0 #

F- + • ·· ·* · · · ·· • · · · · · * • ··· · · · · · · ··· • · · · · ·

- 46 Ezzel a vizsgálattal kimutattuk, hogy a 0,3 %-os és 1,0 %os ISIS 1082 oldattal végzett kezelés szignifikánsan csökkenti a stromális keratitisz és a szaruhártya vaszkularizációjának mértékét a 11., 13. és 15. napon a kezeletlen vagy pufferral kezelt egerekhez viszonyítva. Bizonyos esetekben a betegség szignifikánsan különbözik az egyik napon, de nem különbözik a másik napon. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy csoportok, amelyek között szignifikáns differencia kellett volna hogy legyen, nem volt található. így például a stromális keratitisz a 0,3 %-os ISIS 1082 oldattal kezelt egereknél szignifikánsan különbözött a pufferral kezelt egerektől a 15. napon, de az 1 %-os ISIS 1082 oldattal kezelt egerek esetében nem volt ilyen szignifikáns differencia, bár a két csoportnál a betegség előfordulás hasonló volt. Ezen nehézségeket, amelyek az adatok statisztikus értelmezésével kapcsolatban léptek fel, a betegség előfordulás variációs tulajdonságai okozták, amely ilyen típusú tanulmányozásoknál általában előfordul, továbbá a minta nagysága.

A kezelés hatása az in vivő replikációra

Egereket 1 x 10⁵ pfu mennyiségű HSV-1 KOS törzssel megfertőztünk, és a fertőzést követő 1., 2., 3., 6., 8. és 10. napon eltávolítottuk a szemet, a TG-t és a szemhéjat, és meghatároztuk a fentiekben leírtak szerint a fertőzés mértékét. A kapott eredményeket a következő 6. táblázatban foglaljuk össze.

Szem titerek⁺

Csop. Kezelés Nap

Zx	Z—X			Z“^	z·^
CM	CM	CM	CM	CM	CM
X	X	X	X	X	X
o	O	o	o	O	O
Kz4	o		K_Z	o
o	o	o	o	o	o
		4·^
n	CM	n	CM	n	«
X	X	X	X	X	X
o	CM	o	H	o	o
X»z	xz		*Z*		x—z
o	CO	o	Cl	o	o
	Cl		tn
	•		•
	rH		CM
Γ)	(*)	n	γί	γί	r>
X	X	X	X	X	X
n	CM	CM	CM		γί
	Ke*	kZ	N-/	o	»kZ
in	CO	CO	rM		o
v>	tn		rH		VD
•	•	«	•		•	+
CM	CM	CM	Γ)		CM
						Φ
4—S	4-¼	<—»	/—A	4—X	4“X	Φ
ΓΊ	cn	γί	CM	γί	cn	4J
X	•	X	X	X	X
n	CM	n	rH	o	CM	«μ
%-z		s_4			^-4
in		t'	ΓΊ	o	xy	•o 'Φ
XT	Cl	γί •	’T		10
CM	D	n	CM		n	Λ e φ
						N
Z»»	z·*.	z*.	Z^k		zs	ω
n	r>	γί	r>	r>	γί
X	X	X	X	X	X
r>	n		ΓΊ	CM	γί
*—4		\z	x—z	^z	X«4
Γ'		r·	Cl	CO
*3·	o	CM	rH	Cl	CM
-M*	r>			CM
«
	z·^	ZX		z·^	4-^
r>	cn	n	CM	γί	cn
X	X	X	X	X	X
r>	cn	<n	CM	n	γί
	X.Z	SeZ	XkZ*	X—4	S-4
vo	n	CO	10	**	10
cn		n	ΓΊ	o	o
			n	ΓΊ	’T
	CM	CM	CM
	io	CO	CO
	o	O	o
	H	rM	rM
	1	«	1	H
	w	w	ω	u<
L	H	H	H		cn
V
<u	Z	44	44	44	ω
	H	n	O	O	c
J5	•	•	•	•	•r~<
Q_	o	o	H	t-4	z
<c	®	U	Q	u	ü

CM X ο ^4 ο	CM X ο ο	CM X ο ο	ζ—. CM X ο ο	CM X ο ^ζ* ο	ζ^ CM X ο ο
				ζ^
η	ο	η	<Μ	CM	CM
X	X	X	X	X	X
rH	•Η	CM	ο	Ο	ο
νζ	χ-ζ	Χζ»		*ζ*
\ο	C0	Ο	ο	ο	ο
rM	r*	CM
•	•	•
CM	ο	CM
η	η	ΓΊ	η	η	η
X	X	X	X	X	X
CM	ο	CM	γΜ	Ο	rH
Χ-4»	%ΙΖ*	χζ		•^ζ
\0	Ο	CM	Ο	ο	Ο
Ο			Γ*		10
•		•	•		•
rM		ΓΊ	CM		ο
			ζ-^
γί	ΓΊ	CM	η	CM	CM
X	X	X	X	X	X
•Η	rH	ΓΜ	γΜ	Ο	r-1
*—*	ΧΖ	ΧζΖ	^ζ»	*~ζ	SzZ
\0	ΓΊ	CM	ιη	ο	C0
ιη	ω	σ\	τΤ
•	•	•	•		•
η	γΗ	η	η		ο
			ζ—.	*—>	ζ^
γί	η	η	η	η	CM
X	X	X	X	X	X
1-Η	Ο	Ο	CM	Ο	rH
%-ζ	χζ·		^ζ	^ζ	^4
χο	Ο	Ο	η	ο	ΓΊ
ο			Η
«			•		•
CM			CM		CM
Z-fc			ζ^.	ζ^
η	η	η	η	η	η
X	X	X	X	X	X
ιΗ	ο	ο	ο	ο	Ο
χζ	'Χ-Ζ		ν-ζ		Χζ*
Η	Ο	Ο	ο	ο	Ο
Γ*
•
CM
	CM	CM	CM
	C0	C0	C0
	ο	ο	ο
	r—<	rH	γΜ
	1	1	1	F·
	W	ω	ω	u<
U	Η	Η	Η	Η
φ					ω
<Μ	44	44	44	44	ο
ΜΜ	<1	η	ο	Ο	c
J5	•	•	•	•	C—<
Q-	Ο	Ο	rH	Η
<	m	υ	ο	Μ	0

rM	Ν	η	Οί	Γ4	Ν
X	X	X	X	X	X
ο	ο	ο	ο	ο	Ο
Χ-Ζ		ΧΖ	Χ-*		Χ-*
Ο	ο	Ο	ο	ο	ο

ζχ		^χ	χχ	ΖΧ	XX
η	Μ	η	<Ν	η	Μ
X	X	X	X	X	X
Ν	η	CS	ο	ο	ο
	χ^	XX	^χ	χ-*	χχ
ιη	10	ts	ο	ο	ω
r*	10	η
•	•	•			•
	π	<Ν			Ν

Trigeminális ganglia titerek

			*-χ	ζχ	ζ·χ
η	η	ΓΊ	η	η	η
\	X	\	X	X	X
Γ>	r>	rH	Μ	«Η	η
	χ^*	S—ζ	χ«ζ	χ-ζ	Χ»Ζ
	σι	Ο	Φ	ο	σι
Γ*	η	η	Φ	η	α>
•	•	•	•	•	•
Μ	η	ο	Οί	ο	η

<N X a H

N

η	OJ	Γ>	η	η
X	X	X	X	X
Ο	rH	Ο	Ο	rH
	ΧχΖ	χ·*	XX	χ-*
ο	φ	ο	ο	ω
	na			ιη
	•			•
	Γϊ			CM

<*»	ζ-χ			χχ	Ζ»Χ
<Ν	η	η	η	Γ»	η
X	X	X	X	X	X
ο	ο	ο	Ο	ο	ο
χ-ζ	χζ	X.>*	Χ-*	χ-*	Χ-Ζ
ο	ο	Ο	Ο	ο	ο

ζ*χ	ζΧ		ζ«χ	ζ-χ
η	Γ)	η	Γ>	Γ>	η
X	X	X	X	X	X
ο	ο	ο	ο	ο	ο
χ»χ	Χζ	χ-ζ	X—*	ΧμΖ	χ-ζ
ο	ο	ο	ο	Ο	ο

	(Μ	<Μ	(Ν
	0	0	0
	Ο	Ο	Ο
	<—<	Η	«Η
	1	1	1	Α
	0	0	ω	Ε
ti	Μ	Η	Η	&
CD ςμ_|	<*	Ζ>	<*	* 2
Ψ-Ι	r-{ •	Π •	ο •	°. C.
□ 0_	ο	ο	Η
<	0	υ	ο	Μ Ο

rO C

C (U Λ νβ σ>

Π5 γΗ Ρ '<0

Ρ r—i

L. νθ 'Φ σ> σ> ω Φ Ν •Η cn >

χ · οο rd C ο > pH \Η Ρ b ·Η Μ Ν Λ Ο Λ

Ν

Φ · ω ο :Ο X + * • ·

- 49 Dózis válasz az ISIS 1082-re

A 7. ábrán bemutatott eredmények mutatják, hogy a hatóanyag dózisa bizonyos befolyással van az okuláris betegségre. A 8. ábrán látható a hatóanyag dózisa a betegség előfordulásának függvényében blepharitis, vaszkularizáció és stromális keratitisz esetében a 11., 13. és a 15. napon a fertőzés után. Általában a betegség komolysága csökkent 0,3 és 1,0 % ISIS 1082 dózis esetén. A magasabb dózisú ISIS 1082 (1 %) nem tűnt hatásosabbnak, mint az alacsonyabb dózis (0,3 %). Az 5 % ISIS 1082 tartalmú oldat antivirális hatását az alacsonyabb koncentrációkhoz viszonyítva HSV-1, KOS törzs esetén egér okuláris modellnél stromális keratitiszre vonatkozóan a 9. ábrán mutatjuk be. Mint látható, az 5 %-os ISIS 1082 oldat jelentős mértékben növeli a betegség átlagos jeleit stromális keratitisz esetében a 11. pi napon. A betegség csökkenése 5 %-os oldat esetében nagyobb volt, mint a 0,3 %-os oldat esetében, aminél viszont nagyobb csökkenés mutatkozott, mint a 0,1 %-os oldat esetében. EZ a dózisfüggő hatásosság hasonló a korábbi kísérletek eredményeihez, amit a 7. és 8. ábrákon foglaltunk össze.

Lappangási idő meghatározása

A hatóanyaggal való kezelés hatását a lappangási időre szintén visgáltuk. A TG-t a 28. napon a fertőzés után eltávolítottuk. A szövet felét vizsgáltuk közvetlenül a fertőző vírusra, és a megmaradó mintát ko-tenyésztettük verő sejteken a reaktiválható latens fertőzés meghatározására. A szövetek egyike sem volt pozitív, ha közvetlenül vírusra vizsgáltuk. Mint az a ·«·

7. táblázatból látható, az 1 % TFT-vel kezelt egerekből származó

TG egyike sem volt pozitív a reaktiválható vírus szempontjából. A

TG-ben reaktiválható vírust mutattunk ki minden egyéb kezelt csoport esetében. A ko-tenyésztés 14. napján a minták 60-100 %-a volt pozitív.

7. Táblázat

Csoport	Vírus	Kezelés	Reaktiválás
7. nap	14. nap
A	+	puffér	3/5# (60)§	3/5 (60)
C	+	0,3% IS-1082	3/5 (60)	5/5 (100)
D	+	1,0 %IS-1082	3/5 (60)	4/5 (80)
E	+	TFT	0/5 (0)	0/5 (0)
F	-	nincs	ND* -	ND* -
G	+	nincs	3/5 (60)	4/5 (80)

Napok száma a ko-tenyésztés után # No. pozitív/No. vizsgált * nincs vizsgálat § a pozitív minták %-a

3. Példa

A különböző oligonukleotidok hatása a HSV fertőzésre

Különböző oligonukleotidok hatását vizsgáltuk a HSV replikációra fertőzési vizsgálat alkalmazásával, amit általánosságban az 1. példában írtunk le.

A HSV-1 PAAr^ és Dm.2.1. törzseket a Burroughs Wellcome

Company-tól szereztük be.

A HSV-1 és HSV-2 UL13 RNS-sek in vitro szintéziséhez felhasználásra kerülő plazmidokat a HSV gének megfelelő részeinek a pSP72 transzkripciós vektor (Promaga Corporation) polilinker szakaszának KpnI és BamHI restrikciós endonukleáz helyeire való klónozásával állítottuk elő. A pIP-1 plazmidba való inszertált rész a HSV-1 DNS 3245 nukleotid KpnI-BglII fragmenséből áll, amelyet a plBOl plazmidból vettünk (ezt a plazmidot S. Weller, University of Connecticut Health Center, Farmington, CN bocsájtotta rendelkezésünkre), amely plazmid a DNS HSV-1 BglII fragmensét tartalmazta. A KpnI-BglII fragmens kódoló szekvenciákat tartalmaz, amelyek a +68 nukleotidnál az 5' részen belül és a HSV-1 UL13 mRNS nem-transzIáit részével kezdődnek, keresztezik az UL13 proteint kódoló teljes nyitott leolasási keretet, és az UL13 mRNS-en belül a +3313 nukleotidnál végződnek. A pIP-2 plazmid inszertuma a HSV-2 DNS 1684 nukleotid KpnI-Bam Hl fragmenséből áll, amelyet a BEDJ plazmidból vettünk, amelyet E. Wagner (University of California, Irvine, CA) bocsátott rendelkezésünkre, és amely az UL13 génnel homológ HSV-2 kódoló szakaszát tartalmazza. A KpnI-BamHI fragmens kódoló szakaszokat tartalmaz, amelyek az 5' részen belül a +68 nukletoiddal és a HSV-2 mRNS nem-transzIáit részével kezdődnek, keresztezik az UL13 proteint kódoló teljes nyitott leolvasási keretet, és az UL13 mRNS-én belül a +1752 nukleotidnál végződnek. A pIP-1 és pIP-2 plazmidokba inszertált HSV DNS inszertumok úgy vannak orientálva, hogy a plazmidokon belüli T7 promoterről induló transzkripció virális szenz-szál transzkriptumokat

- 52 biztosít.

A transzkripciós reagenseket a Promega Corporation-től szereztük be, és a gyártó cég előírásai szerint jártunk el. A pIP-1 és pIP-2 RNS-ek előállításánál, amelyek a HSV-1 és HSV-2 UL13 leolvasási kereteket kódolják, a pIP-1 és pIP-2 plazmidokat linearizáltuk Xbal enzimmel végzett emésztéssel, amely a DNS szekvenciák egyedülálló 3' helyénél hasítanak, és amely szekvenciákat a pSP72 plazmidba klónoztuk. Ezeket a linearizált plazmidokat alkalmaztuk templátként a T7 RNS polimerázzal való in vitro transzkripcióhoz. Az in vitro transzkriptumokat a templát DNS RQ1 DNS-ázzal való emésztéssel tisztítottuk (20 perc, 37 °C), kétszer extraháltuk fenol/kloroform/izoamil-alkohol = 25:24:1 eleggyel, egyszer kloroform/izoamil-alkohol = 24:1 eleggyel, majd 3,75 mólos ammónium-acetát és 70 %-os etanol eleggyel kicsaptuk, majd dietil-pirokarbonáttal (DEPC)-kezelt vízben reszuszpendáltuk. Az RNS készítmények integritását és tisztaságát egy alikvot rész denaturált formaldehid agaróz gélen végzett elektroforézissel igazoltuk standard eljárások szerint.

Az in vitro transzlációs reagenseket a Promega Corporationtől szereztük be. A transzlációs reakcióban a következő reagenseket alkalmaztuk: 120 ng megfelelő RNS minta, 4 μΐ nyúl reticulocyta lizátum, 1 μΐ metionin-mentes aminosav keverék, 1 μΐ [³⁵S] metionin (5 μϋί > 1000 Ci/mmól, New England Nuclear), ez összesen 12 μΐ. A transzlációs keveréket 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A transzláció után 12 μΐ transzlációs keveréket elkevertünk 12 μΐ 2x Laemmli Loading Pufferral (lx = ·«· ··· · • · · ·

- 53 88 trisz-HCl, pH = 6,8; 2 % nátrium-dodecil-szulfát [SDS]; 5,0 % β-merkapto-etanol; 10 % glicerin; 0,001 % bróm-fenol-kék); a keveréket forró vízfürdőn 10 percen át melegítettük, majd az in vitro transzlációs terméket elektroforézissel 10 % poliakrilamid-SDS (Laemmli) gélen elektroforizáltuk. A kapott gélt vákuumban szárítottuk, majd autoradiográfiát végeztünk Kodak XRP-5 filmmel. Az in vitro transzlációhoz alkalmazott RNS mintákat 1 órán át 37 °C hőmérsékleten előinkubáltuk oligonukleotiddal és oligonukleotid nélkül, közvetlen a transzlációs keverékhez való adagolás előtt.

Az oligonukleotidokat automatizált DNS szintetizátoron (Applied Biosystems model 380B) szintetizáltuk foszforamidit kémiával az 1. példában leírtak szerint. A foszforotioát oligonukleotidok előállításához a kénezést minden kapcsolás után végeztük 0,2 mól ³H-1,2-benzoditiol-3-on-l,1-dioxid acetonitriles oldatával Beaucage és munkatársai szerint [Ann. N.Y., Acad. Se. (1989)]. A teljes kénezés biztosítására a növekvő oligonukleotid molekulákat minden kénezési lépés után semlegesítés céljából kezeltük. A metil-foszfonát oligonukleotidok előállításához szükséges metil-foszforamidit bázisokat a Glen Research Corporation-től szereztük be. Minden oligonukleotidot liofilizálással tisztítottunk, és két etanolos kicsapást végeztünk a felhasználás előtt. Az oligonukleotid készítmények tisztaságát és integritását akrilamid gél elektroforézissel határoztuk meg.

A klonogén vizsgálatoknál minden kísérleti ponthoz Hela sejteket (2000 sejt 5 ml DMEM-10 % FCS-ben) oltottunk három « · *

- 54 párhuzamossal 60 mm² nagyságú szövettenyésztő lemezekre, és 18 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Egy éjszakán át végzett inkubálás után a sejtekre 1,5 ml friss tápközeget rétegeztünk, amely vagy ISIS 1082-t vagy Acyclovir-t tartalmazott, és 3 napon át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A hatóanyaggal való kezelés után a sejtekre friss tápközeget rétegeztünk, és 6 napon át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk a fixálás és a kristály-violettel való festést megelőzően. A vegyületek Hela sejtekre kifejtett toxikus hatás meghatározásához a festett sejteket számláltuk, majd összehasonlítottuk a sejtszámokat a kezeletlen Hela sejteket tartalmazó párhuzamos tenyészetekkel.

A különböző nukleotid szekvenciákat és váz kompozíciókat tartalmazó különböző oligonukleotid készítmények antivirális aktivitását az ISIS 1043 tartalmú készítmény inhibiciós hatásával hasonlítottuk össze, amelyről kimutattuk, hogy in vitro anti-HSV akivitása van. Az oligo-dezoxi-ribonukleotid szekvenciákat, ezek célzott mRNS szakaszait és a vizsgált oligonukleotidok váz összetételét a 8. táblázatban foglaljuk össze.

• · ·· ·· ···· • * · · ♦ ··· ··· ··· ··· » « * « · · « ·· ·· ·* «·

- 55 r>

>4 (0 X Ό

x>

•rH

>1

H

N

rH

N

<H

Cí

H

Oí

N ü

r—(

c

1

1

1

1

1

1

1

1

>41 MŰ

φ

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

r-H

a

x

x

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

• M

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

C U)

Φ c

c

co

r>

o\

o

r>

r>

n

M

O\

o

r>

n

r>

Λ kJ

\φ

T?

<H

n

Ti

rH

rH

rH

rH

r>

Ti

rH

rH

rH

1 P

0

P)

A

»4

.4

►3

.4

|4

►4

>4

t4

X

CO -P

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X E C ·

0 rH

cn W mű HOC

rH

i4

r4

rH

rH

o

Oi

rH

rH

rH

rH

CH

η

i4 <0 /4

r—( \φ

1 >

1 >

>

>

1 >

1 >

1 >

1 >

>

1 >

1 >

l >

>

X Η '0 (0 «rH

U

co

co

<0

co

co

CO

CO

co

co

w

ω

W

w

ΟΝ Ο cn kJ ><mö

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

x .

Ο frlrH

• ·

H c Φ N

•

— ο ω

o

Ό >H X

a

4· 0 Η (Ű ιο Φ μ

Q

Ή Ε -Ρ

P

H

N

in

Φ

1 (0 Φ

kJ

rH

r>

*r

Γ'

M

n

in

Φ

t

ΗΟ 0

N

&

m ·η - ρ

'KJ

a

η υ c -Ρ

rH

ω

MQ 0 -Η

A

—·

••Η Ό >

MŰ

η υ Ο

H

η·η λ; c

C ·Η

•

•·Η W

co

0

<

0

υ

0

o

0

<

0

0

0

0

U) Ό Ν

0

0

0

0

0

0

0

0

o

Ο

0

0

Φ W -<η kJ

0

0

<

Jí

υ

0

0

0

<

O

0

0

«Ό 0

0

U

0

<

0

<

0

0

0

<

0

<

•Η MŰ rH

ο

O

Ǥ

O

Eh

0

Eh

0

<

0

Eh

0

Eh

rH 0 -rHO

o

Eh

< 0

<

0

Eh

0

Eh

<

<

0

EH

0

(0 MŰ 0 Q

u

H

u

0

0

0

Eh

0

0

0

0

Ο

Ρ Η ·Η | •Η Ν C C0 > V) ·Η Ζ

Eh

0

Eh

0

Eh

U

Eh

0

Eh

0

Eh

0

Eh

0

0

Eh

0

0

U

0

0

Eh

0

0

0

0

KJ

H

H

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

•rH C Ρ5

•H

0

U

0

0

0

0

U

0

0

0

0

0

0

-Ρ <0 ω Ε

O

0

0

0

U

0

U

0

0

0

0

0

0

0

G Ρ '0

C

H

Eh

0

Eh

Eh

Eh

Eh

Eh

0

Eh

Eh

Eh

Eh

< ρ ·γ| Μ

Φ

U

<

0

<

0

<

0

0

<

0

<

0

0 ΓΗ

>

U

0

A

<

0

0

0

0

Eh

2

0

0

0

- ρ Μθ μ4

*

Ο

Eh

0

0

<

Eh

<

Eh

0

o

<

Eh

<

•Η φ Η Ρ

Φ

U

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

KJ Ε Ν

N

0

<

0

0

0

<

0

<

0

0

0

<

0

10 ·Η (Λ Ν

CO

Eh

0

0

0

U

0

0

0

0

0

0

0

0

Ρ Ρ C (Ö

0

0

0

0

<

0

0

0

0

0

<

0

0

MŰ (X Φ -Ρ Ρ Ρ»

Φ Φ -Ρ Ή X C Η Λί C 5 1 Η κί Ε 0 Ό Ρ

N

O

O

O

O

O

O

O

W

CO

W

CO

CO

CO

0 0-rH

vű

II

II

II

II

II

II

II

II

II

II

II

II

II

w < ω

>

X

X

Λ

x

0«

X

X

x

X

X

X

X

X

'Φ mű .ρ

η g ίο

PH Μβ Φ >4 Φ -Ρ

ÍXX ·Η

O

Φ <Ν >

tn e

r>

in

10

cn

0

Ρ Ν 1 -Ρ

•H MŰ

r~

co

co

o

rH

n

Q < 0 -Ρ

rH N

Ti

Tf

TÍ

Ti

ΤΪ

TT

nr

r-'

0

0

0

X Λ4 Φ Λ < Φ

O 10

o rH

o fH

O rH

o rH

O rH

o rH

o rH

o rH

o rH

o rH

o rH

O rH

o rH

• I» · · 4

444 ··· *·· ··· « « 4 · · · «« 4· ·* ···

Ezen aktivitás meghatározásokhoz 0,5 pfu/sejt virális koncentrációt alkalmaztunk. A HSV-1 és HSV-2 antivirális aktivitásának összehasonlítását a 10. ábrán mutatjuk be. A P=0 vázakat tartalmazó oligonukleotidok antivirális hatásának összehasonlítása azt mutatja, hogy a HSV fertőzések csökkenése függ mind az alkalmazott HSV altípustól, mind az oligonukleotid szekvenciától. A legszélesebb antivirális aktivitást az ISIS 1049 esetében mutattunk ki. Meglepetésszerűen az ISIS 1047, amelynek nukleotid szekvenciája az ISIS 1049 szekvenciájától csak az 5' terminális bázisban különbözik, nem volt olyan hatásos, mint az ISIS 1049 a fertőzés mértékének gátlásában. Bár a P=0 oligonukleotidok esetében megfigyelt inhibiciós trend konzisztens volt minden kísérletnél, az inhibiciós aktivitás tényleges mértéke jelentős mértékben különbözött (például az ISIS 1049 volt mindig a legjobb inhibitor a HSV replikációnál, de az inhibició mértéke a 18 % alacsony értéktől a 63 % magas értékig terjedt az öt kísérlet során). Azt tapasztaltuk, hogy ez az eltérőség elsősorban azon hőmérséklet különbségeknek tudható be, amelynél a magzati borjúszérumot (SCS) hőkezeltük. Az 1. ábrán bemutatott inhibiciós szinteket olyan SCS mellett kaptuk, amelyet 65 °C hőmérsékleten hőkezeltünk. A szérumnak ezt a kezelését standardizáltuk minden következő kísérlet számára.

A P=0 oligonukleotid vázszerkezet P=S szerkezetté való átalakítása nagymértékű anti-HSV aktivitás növekedést eredményezett minden új, vizsgált oligonukleotid esetében (10. ábra). A P=O oligonukleotidoknál megfigyelt szérum hatással ellentétben és a P=S oligonukleotidoknak a szérum nukleázzal való emésztés- 57 sel szembeni megnövekedett ellenállásával egyezően, azt találtuk, hogy a P=S oligonukleotidok inhibiciós aktivitása független az FCS hőkezelésénél mutatkozó különbségektől.

A virális koncentráció hatása a HSV-1 replikációra ISIS 1082 esetén

A kezdeti virális koncentráció vagy terhelés hatását az

ISIS 1082 antivirális aktivitására fertozéses vizsgálattal határoztuk meg. A sejteket 0,05, 0,1, 0,25, 1 vagy 2,5 pfu/sejt koncentrációval fertőztük 4 μιηόΐ mennyiségű ISIS 1082 jelenlétében, vagy ISIS 1082 nélkül. Az ISIS 1082-t azért választottuk ehhez a kísérlethez, mivel analógjának az ISIS 1049-nek igen széles anti-HSV aktivitása van, valamint megnövekedett nukleázrezisztenciával rendelkezik a P=S oligonukleotidoknak megfelelően. A HeLa sejtek HSV-1 fertőzésével, amelyekhez a fenti koncentrációkat alkalmaztuk, csupán háromszoros fertőző vírustermelést kaptunk a legalacsonyabb (0,05 pfu/sejt) és a legmagasabb (2,5 pfu/sejt) koncentrációk között annak ellenére, hogy a fertőzés mértéke 50-szeres volt (lásd 9. táblázat).

9. táblázat

Bevitt fertőzés (pfu/sejt)	ISIS 1082	Kapott vírus mennyisége (pfu/ml)	% Kontroll Kihozatal
2.5	-	58.5 + 5.5 x 107
	+	56.5 + 6.0 X 106	9.7
1.0	-	46.0 + 4.0 x 107
	+	44.5 + 0.5 X 106	9.7
0.5	-	42.0 ± 7.0 x 107
	+	71.0 + 3.0 X 105	1.7
0.25	-	35.0 + 3.0 X 107
	+	11.1 ± 0.5 X 10®	3.2
0.1	-	35.0 + 1.0 X 107
	+	18.5 + 3.5 x 105	0.5
0.05	-	19.5 + 0.5 X 107
	+	15.5 ± 3.5 X 10s	0.8

^a A kísérleteknél HSV-1 (KOS törzs) vírust alkalmaztunk.

Ugyanezen koncentráció-tartományban az ISIS 1082 antivirális hatása az alacsony 90,3 %-os gátlási értéktől, amelyet 1,0 pfu/sejt-nél mutatott, a magas inhibiciós szintig (99,5 %) terjedt, amelyet 0,1 pfu/sejt esetében mutatott. így ha a vírus koncentráció 0,1 és 1,0 pfu/sejt közötti érték, a termelt fertőző vírusok mennyisége nem mutat egyszerű matematikai összefüggést a bevitt vírusok számával. Az ISIS 1082 antivirális hatása azonban fordítottan arányos a bevitt vírus mennyiségével, az egész koncentráció tartományban.

A vázösszetétel hatása az oligonukleotidok antivirális aktivitására

A vázösszetétel hatását az oligonukleotidok antivirális aktivitására három oligonukleotid szekvencia különböző analógjainak összehasonlításával vizsgáltuk. Az ISIS 1047 nukleotid szekvenciáját és ezen szekvencia rövidített változatát, amely az ISIS 1301-ben található, P=0, P=S és MeP vázakkal szintetizáltuk. Ezen oligonukleotidok antivirális aktivitását fertőzéses vizsgálatban vizsgáltuk, és összehasonlítottuk Kulka és munkatársai által ismertetett MeP oligonukleotidok hatásával [Kulka et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6868-6872] (lásd 10. táblázat).

σΡ Λ CM I > w (SEQ ID NO.:) Szekvencia Oligo Váz- Kontroll kihozatal· <e

i > cn

X (U cn 'Φ P :o

X t—<

rí in in rí σι σι	rH 0 ρ	Ρ	Ρ Ό •d	X 'φ Ρ
t' v ro in	ν ο ο ιη			Ρ	'Φ	υ		Ρ
o <n σ>	η Η >» ο			α	Λ	•d		φ
				0				Ρ
				X	X	•Η		Ρ
					φ	Ρ		(1)
				X	β	β		ε	•
				Ό>	•d	•d		φ	β
				rH	'φ			•d	'Φ
				φ	Ρ				Ρ
				Μ	C			C	0
				χΦ	•d	σχ		φ	ω
» ·ν· Η	® Η			Η	ε	σ*		Ρ
				φ		Λ		Ρ	Ρ
tn σι ο η Ο CM νο	Ο Η ιη Μ ιη η ο				Ρ Ρ φ	*Η χφ		χφ d 0	Φ r—1 χφ
·—1	«Η			•	Ρ	fi		X	θ'
				X	xd	Ό			φ
				3	Φ	•d		cd	Ν
				Ρ	Φ	Ρ		Ό	•d
				Ν	Ν	0		Ρ	>
				Φ	Φ	φ		'Φ
			Ρ	ε	Φ	rH		•ΓΊ	φ
ocutnocLwtLw ιι α> ιι ιι βι ιι φ ιι CLSCLCLSQcSCU	Ρ •r> Φ ω	•m Φ 0)	rH Φ ,Μ γ-I	:0 Ρ Φ	X 3 fi 0		Ο Ό rd Φ	'0 •d ο Λ!
			3	Φ	r-1	σ>		β	3
		3	Μ-ί		Ρ	•d		φ	Ό
		Μ-Ι	CU	C	'φ	r—I			Φ
		CL		φ	0)	0		Ρ	d
			ιη	Λ	xd			'Φ
Γ' Γ' Ο r-(	r* γμ χο ιη	ιη	·*	Ό	X	c		β	X
ν η μ ο Ο (Μ ο η	> ο η η (Μ ΓΊ (Μ (Μ	ο	ο ||	•Η υ	ε ο	φ Τ5 c		0 Μ-Ι	Λί Φ
Η Η Η Η	γΗ rd «Η Η	II		Ρ	Ρ	•d		φ	Λ
			Ό	Ρ	'φ	X		0
		Ό	•Η	β	Ρ			χρ	φ
		•Η	Ο	φ	I	t		1
υ		ο	χφ	υ	Ρ	X		rd	X
0		χΦ	Μ	C	'φ	3	•	•Η	‘d
ο		Μ	Ρ	0	X	Ρ	c	Ρ
	Ρ	C	X		Ν	'Φ	φ	φ
		3	φ		Ν	Φ	Ρ	ε	X
Η		α>	ο	<d	0	ε	φ		ι~4
υ		ο	fi	Ό	X	«Η	Μ	Φ	Φ
ο <		fi	0	ε	χφ	Φ	φ	•Η	Ό
Ε-ι Ε-ι		0	X	3.	η	X		ο	β
ϋ 0		X			«0	ι—I	Ό	β	φ
Ε-< U < Μ Ο ο	ο ο ο	«Ρ Ρ	Ρ Ρ •Ή	-ί Ρ	Ν 0 Ρ	Φ Ρ	•d υ 'Φ	φ > X	d rH
•d	>	ο	'φ	χφ	$4	φ	Φ
0 Η	0	>	φ	Ό	Ρ	Ο	Ρ	Μ	ω
Η <	Εη	φ	Ρ	•Η	φ	φ	C	ω	ω
ο υ	ο	η		Ρ	Ρ	ί-1	φ		'Φ
υ υ	ο		«.	0	σ>	Ρ	υ	η	Ρ
< Η	Η			α>	φ	Χφ	C	•d	•Η
υ ο	υ	*-*	Φ	·—I	ε		0	Ρ	>
υ ϋ y < < ο	ο	φ Ν Ρ	Ν Ρ :0	3 α	X φ	X φ C	X ι-Η	0 φ	•d Ρ X
Ε«	:θ	Ρ	0	X	•d	ο	X	φ
		Ρ		σ	ιφ	φ	ε	3
			(Μ	♦d	Ρ	X	4.	β	>
		CQ	ιη	rH	Ρ	Ό)		ο	V)
		ο	0	0	Ό	Ρ	ο	σ	X
		X	X			Ρ	ο	•d	1
					,—I	ιφ	r-1	Γ—ί	•Η
				α	Φ			0	Ρ
		rH	(Μ	φ	Ρ	φ	X		β
		I	I	Ό	φ	0	C	α	φ
		>	>	C	Ν	ε	3	φ
		W	W	•Ρ	0	Φ	Ρ	Ν	s
	ο	X	X	X	Ρ	bJ	&	Μ	cn
ιη σι		<8			•d	3	φ		0
	Ρ	0	X	Ρ	X	Ό	Ρ

A HSV-1 vírus szaporulat gátlásának mértéke 4 μιηόΐ vagy

100 μπιόΐ oligonukleotid koncentrációnál durván azonos volt minden metil-foszfonát oligonukleotid esetében (ISIS 1237, 1277 és 1236) . 4 μιηόΐ oligonukleotid koncentrációnál, az MeP oligonukleotidok esetében az anti-HSV aktivitás azonos volt minden vizsgált HSV altípus esetében. Az ISIS 1237 és 1277 esetében az MeP analógok antivirális aktivitása jobb volt, mint a megfelelő P=0 analógok esetében, azaz az ISIS 1047 és 1301 esetében. A 21és 15-nukleotid szekvenciák foszforotioát analógjai (ISIS 1080 és ISIS 1302) nagymértékben megnövekedett antivirális aktivitást mutatnak az ISIS 1237 vagy ISIS 1277 oligonukleotidokhoz viszonyítva. Meglepetésszerűen sem a HSV-1, sem a HSV-2 replikációt nem gátolta az ISIS 1235, ami az ISIS 1236 P-S analógja. Az antivirális aktivitást sokkal jelentősebben befolyásolta az oligonukleotid vázban vagy a nukleotid szekvenciában bekövetkezett változás, mint az oligonukleotid hosszában mutatkozó változás.

ISIS 1049 és 1082 hatása az UL13RNS in vitro transzlációjára

Az ISIS 1049 és 1082 oligonukleotidok azon képességét, hogy specifikusan kötődnek a célzott UL13 RNS-hez (pIP-1 vagy pIP-2 transzkriptum) és gátolják a transzlációt, in vitro transzlációval vizsgáltuk, amelyhez nyúl retikulocita lizátumot alkalmaztunk. A nem specifikus foszforotioát oligonukleotidoknak a transzlációs aktivitásra kifejtett hatásának vizsgá0 latánál kontrollként ISIS 1238-at alkalmaztunk, amely az ISIS

1080 nukleotid szekvencia kevert változata. A humán 5-lipoxigenáz transzkriptum RNS szekvenciáját tartalmazó in vitro szintetizált transzkriptumot (5L0) alkalmaztuk az ISIS nukleotidoknak a heterológ RNS transzlációjára kifejtett hatás megállapítására.

A pIP-1 RNS transzlációja (11a. ábra) egy fő polipeptid termék, amely kb. 61 kD tömegű, és több kisebb termék szintézisét eredményezte, amely utóbbiak közül a legfontosabb a 33 kD tömegű polipeptid, amely az ISIS 1080 (1082) és 1047 (1049) oligonukleotidokkal komplementer szekunder AUG kodon szakasznál kezdődik. Számszerűen, az ISIS 1049 jobb inhibiciós hatással volt a pIP-1 RNS transzlációjára, mint az ISIS 1082, amely viszont jobb inhibitor volt, mint az ISIS 1238. Minőségileg az ISIS 1049 és 1082-vel végzett inhibició a pIP-1 RNS transzlációjára látszólagosan valamivel különböző molekula mechanizmuson alapul. Mind az ISIS 1082 és 1049 esetében az oligonukleotidok adagolása a pIP-1 RNS-ből szintetizált polipeptid teljes hosszának redukcióját eredményezi. Továbbá az ISIS 1049-cél végzett inhibició észrevehető növekedést eredményez mind a három kisebb polipeptid termék esetén, amelyek molekulatömeges, 28 illetve 26 kD. A 33 kD polipeptid ugyanaz a polipeptid, amely kis mennyiségben a nem kezelt mintákban is szintetizálódik. A 28 kD polipeptid feltehetően a 61 kD csonkított változata, és a 26 kD polipeptidről pedig úgy gondoljuk, hogy egy másik AUG kodonnal indul, amely az ISIS 1049 cél szakaszhoz a 3' helyen helyezkedik el. Hasonló inhibiciós eredményeket figyeltünk meg ha a pIP-2 plazmidból nyert homológ in vitro • ·

- 63 transzkriptumot (11b. ábra) pIP-1 RNS-sel helyettesítettük a hibridizációs keverékben, és ha a transzlációt búzacsíra lizátummal végeztük.

Az oligonukleotidoknak az RNS transzlációjára kifejtett nem specifikus inhibiciós hatása minimális volt. Az ISIS 1238 enyhe, de kimutatható inhibiciós hatással van a pIP-1 RNS transzlációjára, míg egyik nukleotid sem volt inhibiciós hatással a heterológ 5L0 RNS transzlációjára.

Az Acyclovir és az ISIS oligonukleotidok antivirális hatásának összehasonlítása HSV-2 replikációjára

Fertőzéses vizsgálattal meghatároztuk a dózis válasz görbéket Acyclovir (ACV), ISIS 1302, ISIS 1080 és ISIS 1082 esetében HSV-2, HG52 törzzsel kapcsolatban. Mivel az ACV törzsoldatot (4 mmól) dimetil-szulfoxiddal (DMSO) készítettük, az ACV-kezelt mintákban a vírus mennyiségét olyan fertőzött kontrollokhoz viszonyítottuk, amelyet 0,025 % DMSO-val kezeltünk. A kontroll vírus kihozatal a DMSO-kezelt minták esetében kb. 30 %-kal nagyobb volt, mint a kezeletlen minták esetében. A dózis válasz görbéket a 13. ábrán mutatjuk be. Mind a négy vegyület a HSV-2 replikációt dózis-függő módon befolyásolta. A 12. ábra adatai alapján számoltuk ezen vegyületek IC5Q értékeit, és azok 600 mmól, 2 μιηόΐ, 430 nmól és 250 nmól értékűek voltak ACV, illetve ISIS 1302, ISIS 1082 és ISIS 1080 esetében. A dózis válasz görbék meredeksége az ISIS 1080 és 1082 esetében megváltozott, ha a HSV-1 vagy HSV-2 vírusok más törzseit alkalmaztuk a fertőzéshez (lásd például 12. ábra).

• ·

- 64 Az ISIS 1082 dózisfüggő hatása két HSV-1 törzs replikációjára

Az ISIS 1082 antivirális hatását két HSV-1 törzs (KOS és F) esetében összehasonlítottuk ismert anti-HSV vegyület, az ACV, valamint egy nem komplementer foszforotioát oligonukleotid, az ISIS 1238 antivirális hatásával. Ez utóbbi nukleotid az ISIS 1080 kevert változata, és kontrollként szolgál a nem specifikus oligonukleotid transzlációs aktivitásra kifejtett hatásra. Az ISIS 1238-nak sokkal kisebb inhibiciós hatása volt, mint akár az ISIS 1042-nek vagy az ACV-nek. Az ISIS 1082 és az ACV gátló hatású volt a KOS törzsekkel szemben, itt az ICg₀ érték 2,73, illetve 2,57 Mmól volt (lásd 13. ábra). Az ICgQ értékek az ACV és az ISIS 1082 esetében extrapolálva lettek a vírus F törzsére vonatkozóan, ezek az értékek 3,6, illetve 5,8 Mmól (lásd 14. ábra). Bár az ACV és ISIS 1082 esetében meghatározott ICqq értékek hasonlóak voltak minden vírus törzs esetében, a dózis válasz görbék azt mutatták, hogy a HSV törzsek között ezen vegyületekkel való kezelésnél törzs-specifikus inhibició van.

ISIS 1082 dózisfüggő hatása a HSV-1 ACV-rezisztens törzseinek replikációjára

Vizsgáltuk az ISIS 1082 antivirális hatásosságát két HSV-1 ACV^r törzs, a DM2.1 törzs (ez nem tartalmaz virális timidin-kináz gént) és a PAAr⁵ törzs esetében, amely a virális DNS polimerázban egy megváltozott nukleotid kötési helyet expresszál. Mindegyik vírus törzset 400 nmól, 800 nmól vagy 4 Mmól ISIS 1082-vel kezeltünk. Összehasonlításképpen párhuzamos • ···

- 65 fertőzésekben minden törzset azonos koncentrációjú ACV-vel kezeltünk. A vizsgált koncentráció értékeknél az ACV egyik törzs esetében sem hatott dózis-függő módon, míg az ISIS 1082vel végzett kezelés mindegyik törzs esetében dózisfüggő módon gátolta a vírus kihozatalt (lásd 15. ábra). Az ISIS 1082 esetében az ICsq értékeket 300 nmól, illetve 600 nmól-ra becsültük a HSV-1 DM2.1 és PAAr⁵ törzsek esetében. Az a tény, hogy a DM2.1 törzs esetében a kihozatal csökkenésének mértéke hasonló volt ahhoz, mint amikor más HSV-1 (13., 14. ábra) vagy HSV-2 törzseket (12. ábra) kezeltünk, azt mutatja, hogy az ISIS 1082 antivirális hatásához nem szükséges az oligonukleotid virális timidin-kináz enzimmel való foszforilezése.

Az ISIS 1082 és az ACV celluláris toxicitásának összehasonlítása

Az ISIS 1082 és az ACV celluláris toxicitását hasonlítottuk össze a HeLa sejtekben végzett klonogén vizsgálattal, amely kimutatta a vegyületnek való kitétel idejét a fertőzéses vizsgálatnál. 100 Mmól vegyület koncentráció értéknél sem az ISIS 1082, sem az ACV nem okozott 50 %-os csökkenést a HeLa sejtek klonogén kapacitásában. A 275 nmól, illetve 300 nmól IC5Q értékeket, amelyeket az ISIS 1082, illetve ACV esetében határoztunk meg, a HSV-2 esetében (12. ábra) számoltuk a gyógyhatású indexeket (Therapeutic Indices (TIs, Ti = LC₅₀/IC5₀), és a számítás szerint ez >360 ISIS 1082 és >334 ACV esetében. Ily módon a várható TI érték ISIS 1082 esetében összemérhető az ACV TI értékével.

* ·

- 66 Szekvenciák ismertetése (1) Általános információk:

(i) Bejelentő: Draper et al.

(ii) Találmányunk címe: Oligonukleotid terápiák herpesz vírusok hatásának módosítására (iii) Szekvenciák száma: 12 (iv) Megfelelő cím:

(A) Címzett: Woodcock Washburn Kurtz

Mackiewich & Norris (B) Utca: One Liberty Piacé - 46th Floor (C) Város: Philadelphia (D) Állam: PA (E) Ország: USA (F) Irányítószám: 19103 (v) Komputer adatok:

(A) Médium típus: Diskette, 3,5 Inch, 1,44 Mb storage (B) Komputer: IBM PS/2 (C) Rendszer: PC-DOS (D) Software: Wordperfect 5.0 (vi) A jelen bejelentés adatai (a) Bejelentési szám: n/a (b) Bejelentési nap:

(c) Klasszifikáció:

(vii) Elsőbbségi bejelentés adatai:

(A) Bejelentés száma: 485,297 (B) Bejelentés napja: 1990. 02. 26.

- 67 (viii) Szabadalmi ügyvivő adatai:

(A) Név: Jane Massey Licata (B) Regisztrálási szám: 32 257 (C) Aktaszám: ISIS-0085 (ix) Telekommunikációs adatok:

(A) Telefon: (215) 568-3100 (B) Telefax: (215) 568-3439 (2) Információ az SEQ ID No: 1 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 18 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 1:

GTCCGCGTCC ATGTCGGC 18 (2) Információ az SEQ ID No: 2 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 2:

GGACTCATCC ATCCTTCGGC C • ·

- 68 (2) Információ az SEQ ID No: 3 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 3:

GCGGCTGGCC ATTTCAACAG A 21 (2) Információ az SEQ ID No: 4 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 4:

CGCGGAATCC ATGGCAGCAG G 21 (2) Információ az SEQ ID No: 5 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 5:

ACCGAGGTCC ATGTCGTACG C 21

- 69 (2) Információ az SEQ ID No: 6 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 6:

GGACTCATCC ATCCGTCCGC C 21 (2) Információ az SEQ ID No: 7 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 7:

GCCGAGGTCC ATGTCGTACG C 21 (2) Információ az SEQ ID No: 8 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 8:

GCGGTTGGCC ATTGGAACCA A

- 70 (2) Információ az SEQ ID No: 9 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 9:

GAGGTCCATG TCGTA 15 (2) Információ az SEQ ID No: 10 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 10:

TTCCTCCTGC GG 12 (2) Információ az SEQ ID No: 11 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 11:

ATGGATGAGT CCCGCAGACA GCGACCTGCT GGTCATGTGG CAGCTAAC CAGCCCCCAA GGTGCACGCC AACGGTCCTT CAAGGATTGG CTCGCATC ACGTACACTC CAACCCCCAC GGGGCCTCCG GGCGCCCCAG CGGCCCCT • ·

CTCCAGGACG	CCGCCGTCTC	CCGCTCCTCC	CACGGGTCCC	GCCACCGATC	200
CGGCCTCCGC	GAGCGGCTTC	GCGCGGGACT	ATCCCGATGG	CGAATGAGCC	250
GCTCGTCTCA	TCGCCGCGCG	TCCCCCGAGA	CGCCCGGTAC	GGCGGCCAAA	300
CTGAACCGCC	CGCCCCTGCG	CAGATCCCAG	GCGGCGTTAA	CCGCACCCCC	350
CTCGTCCCCC	TCGCACATCC	TCACCCTCAC	GCGCATCCGC	AAGCTATGCA	400
GCCCCGTGTT	CGCCATCAAC	CCCGCCCTAC	ACTACACGAC	CCTCGAGATC	450
CCCGGGGCCC	GAAGCTTCGG	GGGGTCTGGG	GGATACGGTG	ACGTCCAACT	500
GATTCGCGAA	CATAAGCTTG	CCGTTAAGAC	CATAAAGGAA	AAGGAGTGGT	550
TTGCCGTTGA	GCTCATCGCG	ACCCTGTTGG	TCGGGGAGTG	CGTTCTACGC	600
GCCGGCCGCA	CCCACAACAT	CCGCGGCTTC	ATCGCGCCCC	TCGGGTTCTC	650
GCTGCAACAA	CGACAGATAG	TGTTCCCCGC	GTACGACATG	GACCTCGGTA	700
AGTATATCGG	CCAACTGGCG	TCCCTGCGCA	CAACAAACCC	CTCGGTCTCG	750
ACGGCCCTCC	ACCAGTGCTT	CACGGAGCTG	GCCCGCGCCG	TTGTGTTTTT	800
AAACACCACC	TGCGGGATCA	GCCACCTGGA	TATCAAGTGC	GCCAACATCC	850
TCGTCATGCT	GCGGTCGGAC	GCCGTCTCGC	TCCGGCGGGC	CGTCCTCGCC	900
GACTTTAGCC	TCGTCACCCT	CAACTCCAAC	TCCACGATCG	CCCGGGGGCA	950
GTTTTGCCTC	CAGGAGCCGG	ACCTCAAGTC	CCCCCGGATG	TTTGGCATGC	1000
CCACCGCCCT	AACCACAGCC	AACTTTCACA	CCCTGGTGGG	TCACGGGTAT	1050
AACCAGCCCC	CGGAGCTGTT	GGTGAAATAC	CTTAACAACG	AACGGGCCGA	1100
ATTTACCAAC	CACCGCCTGA	AGCACGACGT	CGGGTTAGCG	GTTGACCTGT	1150
ACGCCCTGGG	CCAGACGCTG	CTGGAGTTGG	TGGTTAGCGT	GTACGTCGCC	1200
CCGAGCCTGG	GCGTACCCGT	GACCCGGTTT	CCCGGTTACC	AGTATTTTAA	1250
CAACCAGCTG	TCGCCGGACT	TCGCCCTGGC	CCTGCTCGCC	TATCGCTGCG	1300
TGCTGCACCC	AGCCCTGTTT	GTCAACTCGG	CCGAGACCAA	CACCCACGGC	1350
CTGGCGTATG	ACGTCCCAGA	GGGCATCCGG	CGCCACCTCC	GCAATCCCAA	1400
GATTCGGCGC	GCGTTTACGG	ATCGGTGTAT	AAATTACCAG	CACACACACA	1450
AGGCGATACT	GTCGTCGGTG	GCGCTGCCTC	CCGAGCTTAA	GCCTCTCCTG	1500

»*·♦

- 72 GTGCTGGTGT CCCGCCTGTG TCACACCAAC CCGTGCGCGC GGCACGCGCT 1550

GTCGTGA

1557 (2) Információ az SEQ ID No: 12 szekvenciával kapcsolatban:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 12:

ATGGATGAGT	CCGGGCGACA	GCGACCTGCT	GGTCGTGTGG	CAGCTGACAT	50
CAGCCCCCAA	GGTGCACACC	GACGCTCCTT	CAAGGCCTGG	CTCGCGTCCT	100
ACATACACTC	CCTCAGCCGC	CGGGCGTCCG	GACGCCCAAG	CGGCCCCTCC	150
CCCCGAGACG	GCGCCGTCTC	CGGAGCCCGC	CCCGGGTCCC	GCCGCCGATC	200
CAGCTTCCGG	GAGCGGCTTC	GCGCGGGACT	GTCCCGATGG	CGAGTGAGCC	250
GCTCGTCTCG	TCGCCGCTCG	TCCCCCGAGG	CCCCCGGCCC	TGCGGCCAAG	300
CTAAGGCGCC	CGCCCCTGCG	CAGGTCCGAG	ACGGCCATGA	CCTCGCCCCC	350
GTCGCCCCCC	TCGCACATCC	TGTCCCTCGC	GCGCATCCAC	AAGCTATGCA	400
TCCCCGTATT	CGCCGTCAAC	CCCGCCCTCC	GCTACACGAC	CTCGGAGATC	450
CCCGGGGCCC	GCAGCTTCGG	GGGCTCGGGG	GGGTACGGCG	AGGTGCAGTT	500
GATTCGCGAA	CACAAACTCG	CCGTGAAGAC	CATCCGGGAA	AAAGAGTGGT	550
TTGCCGTGGA	GCTCGTCGCG	ACCCTGCTCG	TGGGGGAGTG	CGCTCTTCGC	600
GGCGGCCGCA	CCCACGACAT	CCGCGGCTTT	ATCACCCCGC	TCGGGTTCTC	650
GCTGCAGCAG	CGCCAGATCG	TGTTCCCCGC	GTACGÁCATG	GACCTCGGCA	700
AGTACATCGG	CCAGCTGGCG	TCCCTGCGCG	CGACCACCCC	CTCCGTCGCG	750
ACGGCCCTCC	ACCACTGCTT	CACAGACCTG	GCGCGCGCCG	TGGTGTTCCT	800
GAACACCAGG	TGCGGGATCA	GCCACCTGGA	CATCAAGTGC	GCCAACGTCC	850
TCGTGATGCT	GCGATCGGAC	GCGGTGTCGC	TCCGGCGGGC	CGTCCTGGCC	900

GACTTTAGCC	TGGTGACCCT	GAACTCCAAC	TCCACGATAT	CCCGGGGCCA	950
gttttgcctc	CAGGAGCCGG	ACCTCGAGTC	CCCCCGGGGG	TTTGGGATGC	1000
CCGCCGCCCT	GACCACGGCC	AACTTTCACA	CTCTGGTGGG	GCACGGGTAC	1050
AACCAGCCAC	CGGAGCTCTC	GGTAAAGTAC	CTCAACAACG	AGCGGGCCGA	1100
GTTTAACAAC	CGCCCCCTGA	AGCACGACGT	CGGGCTGGCG	GTCGATCTCT	1150
ACGCCCTGGG	GCAGACGCTG	CTGGAGCTGC	TGGTTAGCGT	GTACGTGGCC	1200
CCGAGCCTGG	GCGTCCCCGT	GACCCGCGTC	CCGGGCTACC	AGTACTTTAA	1250
CAACCAGCTC	TCGCCGGACT	TTGCCGTGGC	CCTCCTCGCC	TATCGCCGCG	1300
TTCTGCACCC	CGCCCTCTTT	GTCAACTCGG	CCGAGACCAA	CACCCACGGC	1350
CTGGCGTATG	ACGTGCCGGA	GGGCATCCGG	CGCCACCTTC	GCAATCCCAA	1400
GATTCGGCGC	GCGTTCACGG	AGCAGTGTAT	AAATTACCAG	CGCACGCACA	1450
AGGCCGTCCT	GTCGTCGGTG	TCGCTGCCGC	CCGAGCTGAG	GCCGCTGCTG	1500
GTGCTGGTCT	CCCGCCTCTG	TCACGCCAAC	CCGGCCGCGC	GCCACTCTCT	1550

GTCGTGA

Claims (26)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely specifikusan hibridizálható a herpesz vírus génjéből származó RNS-sel vagy DNS-sel, amely gén megfelel a herpesz simplex vírus 1 típus valamely következő nyitott leolvasási keretének: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52, amely oligonukleotid annyi nukleotid egységet tartalmaz, amely azonosságában és számában elegendő az említett specifikus hibridizáció létrehozásához.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely a transzlációs iniciációs helyen specifikusan hibridizálható.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely CAT szekvenciát tartalmaz.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a gén valamely következő vírusból származik: herpesz szimplex vírus típus 1, herpesz szimplex vírus típus 2, cytomegalovirus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus vagy varicella zoster vírus.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal elkeverve.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább néhánya kéntarttalmú csoport.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok legalább néhánya foszforotioát csoportot tartalmaz.
8. 8. Oligonukleotid, amely valamely következő szekvenciák ·«

   - 75 közül egyet tartalmaz:

   5.- -3'

   GGA CTC ATC CAT CCT TCG GCC, SEQ ID NO. : 2, GCG GCT GGC CAT TTC AAC AGA, SEQ ID NO. : 3, CGC GGA ATC CAT GGC AGC AGG, SEQ ID NO.: 4, ACC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO. : 5, GGA CTC ATC CAT CCG TCC GCC, SEQ ID NO. : 6, GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 7, GCG GTT GGC CAT TGG AAC CAA, SEQ ID NO.: 8.
9. 9. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal elkeverve.
10. 10. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoport.
11. 11. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszforotioát csoportot tartalmaz.
12. 12. Eljárás herpesz vírus aktivitásának módosítására, azzal jellemezve, hogy a vírust vagy a vírussal fertőzött állatot egy oligonukleotiddal érintkeztetjük, amely oligonukleotid specifikusan hibridizálható egy herpesz vírus génről származó RNS-sel, vagy DNS-sel, amely gén a herpesz szimplex vírus 1 típus valamely következő nyitott leolvasási keretének felel meg: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52, és amely oligonukleotid annyi nukleotid egységet tartalmaz, hogy az azonosságában és számában biztosítani tudja az említett specifikus hibridizációt.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, ♦

    4 · ··

    4·» ··«···

    4 · · ·♦ •4·· :- • 44 • •4 hogy az oligonukleotid specifikusan hibridizálható a transzlációs iniciációs hellyel.
14. 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid CAT szekvenciát tartalmaz.
15. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a herpesz vírus valamely következő vírus: herpesz szimplex vírus típus 1, herpesz szimplex vírus típus 2, cytómegalovirus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus vagy varicella zoster vírus.
16. 16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid valamely következő szekvenciát tartalmazza:

    5'- -3' GGA CTC ATC CAT CCT TCG GCC, SEQ ID NO.: 2, GCG GCT GGC CAT TTC AAC AGA, SEQ ID NO.: 3, CGC GGA ATC CAT GGC AGC AGG, SEQ ID NO.: 4» ACC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 5, GGA CTC ATC CAT CCG TCC GCC, SEQ ID NO.: 6, GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: Ί, GCG GTT GGC CAT TGG AAC CAA, SEQ ID NO.: 8.
17. 17. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidban lévő nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok legalább néhánya kéntartalmú csoport.
18. 18. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidban lévő nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszforotioát csoportot tartalmaz.
19. 19. Eljárás állatok kezelésére, amelyek feltehetően herpesz vírussal fertőzöttek, azzal jellemezve, hogy az állatot egy oligonukleotiddal érintkeztetjük, amely oligonukleotid • «· ·· 4····· ·· · · 4 ·<

    • ··· 4·· *···♦· • · · · · *φ ··· ·· ·· ····· specifikusan hibridizálható egy herpesz vírus génből származó RNS-vel vagy DNS-sel, amely gén megfelel a herpesz szimplex vírus típus 1 valamely következő nyitott leolvasási keretének: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52, és amely oligonukleotid annyi és olyan nukleotid egységet tartalmaz, amely elegendő az említett specifikus hibridizáció létrehozásához.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás amelynél az oligonukleotid specifikusan hibridizálható a transzlációs iniciációs hellyel.
21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynél az oligonukleotid CAT szekvenciát tartalmaz.
22. 22. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelyben a herpesz vírus valamely következő vírus: herpesz szimplex vírus típus 1, herpesz szimplex vírus típus 2, cytomegalovirus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus vagy varicella zoster vírus.
23. 23. A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid gyógyászatilag hordozóanyaggal van elkeverve.
24. 24. A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid valamely követekző szekvenciát tartalmazza:

    5‘- -3'

    GGA CTC ATC CAT CCT TCG GCC, SEQ ID NO. : 2, GCG GCT GGC CAT TTC AAC AGA, SEQ ID NO. : 3, CGC GGA ATC CAT GGC AGC AGG, SEQ ID NO. : 4, ACC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 5, GGA CTC ATC CAT CCG TCC GCC, SEQ ID NO.: 6, GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 7, GCG GTT GGC CAT TGG AAC CAA, SEQ ID NO.: 8.

    ·· ·· ·· 2·»· • · · · á ··« ··· ··· ♦·· • * · · · *
25. 25. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynél az oligonukleotidban a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoport.
26. 26. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynél az oligonukleotidban lévő nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszforotioát-csoportot tartalmaz.