HUT64474A - Process for producing pharmaceutical compositions containing oligonukleotides for treating and diagnostising herpes virus invections - Google Patents
Process for producing pharmaceutical compositions containing oligonukleotides for treating and diagnostising herpes virus invections Download PDFInfo
- Publication number
- HUT64474A HUT64474A HU9202746A HU274692A HUT64474A HU T64474 A HUT64474 A HU T64474A HU 9202746 A HU9202746 A HU 9202746A HU 274692 A HU274692 A HU 274692A HU T64474 A HUT64474 A HU T64474A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- hsv
- woman
- seq
- virus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims abstract description 156
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims abstract description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 41
- 101150093137 UL13 gene Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101150093191 RIR1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101100427508 Human cytomegalovirus (strain AD169) UL39 gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101150100826 UL40 gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims abstract description 13
- 101150030723 RIR2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 10
- 101150026859 UL9 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 9
- 101150026402 DBP gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150064935 HELI gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150008036 UL29 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150068034 UL30 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150099321 UL42 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150099617 UL5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150011902 UL52 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150033561 UL8 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000701027 Human herpesvirus 6 Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 54
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 9
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 71
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 55
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 26
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 116
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 116
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 116
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 116
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical group N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 37
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 35
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 35
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 33
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 31
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 21
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 21
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 18
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 18
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 17
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 208000010217 blepharitis Diseases 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 208000025889 stromal keratitis Diseases 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 230000003622 anti-hsv Effects 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 8
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 8
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 8
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 7
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 210000000427 trigeminal ganglion Anatomy 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- -1 Ara-A Chemical compound 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 108700026039 Simplexvirus UL13 Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150004685 UL48 gene Proteins 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000000903 Herpes simplex encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 3
- VSQQQLOSPVPRAZ-RRKCRQDMSA-N trifluridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C(F)(F)F)=C1 VSQQQLOSPVPRAZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000009643 clonogenic assay Methods 0.000 description 2
- 231100000096 clonogenic assay Toxicity 0.000 description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XACKNLSZYYIACO-DJLDLDEBSA-N edoxudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XACKNLSZYYIACO-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 201000010666 keratoconjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000007442 viral DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 230000033041 viral attachment to host cell Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- 229940099269 viroptic Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-PKJMTWSGSA-N (2R,4R,5R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)C1O OIRDTQYFTABQOQ-PKJMTWSGSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GBBJCSTXCAQSSJ-JVZYCSMKSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@@H](F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 GBBJCSTXCAQSSJ-JVZYCSMKSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- DZHQWVMWRUHHFF-FTFTVQOISA-N 6-amino-5-[(3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1C1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DZHQWVMWRUHHFF-FTFTVQOISA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 101150106783 BBRF2 gene Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- ODZBBRURCPAEIQ-DJLDLDEBSA-N Brivudine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C=CBr)=C1 ODZBBRURCPAEIQ-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 101710160937 DNA replication protein Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710149498 Double-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101100229963 Drosophila melanogaster grau gene Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000700589 Herpes simplex virus (type 1 / strain 17) Species 0.000 description 1
- 208000037018 Herpes simplex virus encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010019972 Herpes viral infections Diseases 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 101710135007 Histone-like protein p6 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000620009 Homo sapiens Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase Proteins 0.000 description 1
- 241000701072 Human herpesvirus 2 strain HG52 Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010007403 Immediate-Early Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101001068640 Nicotiana tabacum Basic form of pathogenesis-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000028571 Occupational disease Diseases 0.000 description 1
- 206010067152 Oral herpes Diseases 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 1
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 1
- 241000566107 Scolopax Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000534944 Thia Species 0.000 description 1
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 101150101554 UL3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150032932 UL39 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- JGJBTOUVZMRNGR-UHFFFAOYSA-N [(4-cyano-2-methylbutan-2-yl)-propan-2-ylamino]phosphonous acid Chemical class C(#N)CCC(C)(C)N(P(O)O)C(C)C JGJBTOUVZMRNGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIHUOJZDKZENCP-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;triethylazanium;acetate Chemical compound CC#N.CC(O)=O.CCN(CC)CC CIHUOJZDKZENCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000022788 double-stranded DNA binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- ODZBBRURCPAEIQ-PIXDULNESA-N helpin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(\C=C\Br)=C1 ODZBBRURCPAEIQ-PIXDULNESA-N 0.000 description 1
- 201000010884 herpes simplex virus keratitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000010949 lymph node disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- RXMBKOPBFXCPDD-UHFFFAOYSA-N methoxyphosphonamidous acid Chemical compound COP(N)O RXMBKOPBFXCPDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003834 purine nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 150000003584 thiosemicarbazones Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229960003962 trifluridine Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000005866 tritylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008478 viral entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 230000019540 viral envelope fusion with host membrane Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
- C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/312—Phosphonates
- C12N2310/3125—Methylphosphonates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány oligonukleotidokat tartalmazó készítményekre vonatkozik, amelyek alkalmasak herpes vírusok által okozott fertőzések kezelésére, valamint diagnosztizálására.
A találmány szerinti antiszenz oligonukleotidok kölcsönhatásba lépnek a herpesz vírus RNS-jének bizonyos részeivel, és ily módon befolyásolják az RNS hatását, ami viszont magának a vírusoknak a hatását is befolyásolja.
Évente körülbelül 500 000 új genitális herpesz fertőzésről tudósítanak, és a becslések szerint 30 000 000 amerikait érint ez a jelenleg még nem gyógyítható betegség. Hasonlóképpen 500 000-re becsülik évente az új herpesz szimplex gingivostomatitis megbetegedéseket, és legalább 100 000 000 szenved visszaesőként a szájon jelentkező herpeszektől. A szeropozitív egyedek előfordulásának száma az ossz populációban körülbelül 70-80 %. Bár a visszaesőként előforduló herpesz szimplex vírus fertőzések a leggyakoribbak az összes herpesz vírus fertőzések között, igen nagy szükség van még specifikusabb kezelési eljárások kifejlesztésére, amelyek alkalmasak a különböző betegségek, így például a herpesz szimplex encephalitis, keratoconjunctivitis, herpesz okozta ujj és körömgyulladás, valamint a csecsemőknél és immuno egyezéses gazda egyedeknél előforduló disszeminált herpesz fertőzések.
Az encephalitis előfordulása igen alacsony (évenként
250 000 egyed esetében 1), a jelenleg rendelkezésre álló terápiákkal a halálozási arány mégis körülbelül 40 %, és körülbelül a túlélők 50 %-a komoly neurológiai károsodást szenved. A szem fertőzések sem nem gyakoriak, sem nem triviálisak. Ezeket általában a HSV-1 vírus váltja ki, és gyakran a világ sok országában vakságot okoz. A herpesz-okozta köröm- illetve ujjgyulladás elsősorban az ápolónők, fogorvosok és orvosok körében jelent foglalkozási betegséget, amely általában erythema-val és az ujjak disztális szegmensének érzékenységével kezdődik, amelyet a képződött hólyagok összeolvadása és terjedése követ. Ismert jellemzője még ezen elváltozásnak a váladékozó nyirokedények gyulladása és a nyirokcsomó megbetegedése. Az újszülöttek HSV-fertőzése általában a fertőzött szülési csatornákon keresztül való szülés eredménye. Ennek előfordulása általában 10 000 szülés közül 1. A korlátozott fertőzéssel született csecsemők között a halálozási arány 20 %, míg a disszeminált fertőzésű újszölüttek között a halálozás még a jelenlegi kezelési módozatok mellett is eléri a 75 %-ot, és nagyon sok túlélő jelentős neurológiai károsodást szenved.
Jelenleg a nukleozid analógok az előnyösnek tekintett gyógyhatású szerek, a HSV fertőzések esetében. Igen sok pirimidin-dezoxiribonukleozid vegyület rendelkezik specifikus affinitással a vírus-kódolt timidin (dCyd) kináz enzimmel szemben. Ezen vegyületek specifikus hatása a foszforilezésre és a vegyületek vírus-fertőzött sejtekkel szembeni vírusellenes hatására szorítkozik. Számos ezen osztályhoz tartozó hatóanyag vagy jelenleg már klinikai alkalmazásban van, vagy nemsokára kerül klinikai felhasználásra, így például a következők: 5-jód-dUrd (IDU), 5-trifluor-metil-dUrd (FMAU), 5-etil-dUrd (EDU), (E)-5-(2-bróm-vinil)-dUrd (BVDU), 5-jód-dCyd (IDC), és 5-trifluor-metil-dUrd (TFT). Ezen vegyületek közül az IDU egy közepesen hatásos topikális vírusellenes szer HSV gingivostomatitis és okuláris stróma-keratitisz esetében, felhasználása azonban a HSV encephalitis tanulmányozásánál igen szabályozott, mivel nagy toxicitású. Bár az 5-arabinofuranozilcitozin (Ara-C) vírusellenes hatása kezdetben igen ígéretes volt, a klinikai jellemzői hasonlóak az IDU-hoz. A klinikai megjelenése az olyan HSV törzseknek, amelyek nem képesek a virális timidin-kinázt szintetizálni, további gondokat eredményezett ezen osztályhoz tartozó vegyületek jövőbeni felhasználására vonatkozóan.
Számos virális célalanyt határoztak meg az anti-HSV vegyületek kifejlesztéséhez. A tioszemikarbazon-vegyületek tanulmányozása kimutatta, hogy a virális ribonukleotid reduktáz enzim gátlása egy hatásos eszköz a HSV in vitro replikációjának gátlására. Továbbá különböző purin-nukleozidőkről igazolták, hogy gátolni képesek a virális DNS replikációt, és így alkalmazhatók humán HSV fertőzések kezelésére. A 9-(B-D-arabinofuranozil)-adenint (Ara-A) alkalmazták a HSV-1 keratitisz, HSV-1 enkefalitisz és újszölüttek herpesz fertőzésének kezelésére. A klinikai hatásosságról szóló tudósítások azonban ellentmondásosak, és a gyakorlati alkalmazás fő akadálya az Ara-A különösen rossz oldhatósága vízben. Nagyobb érdeklődésre ad számot a 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guaninin (Acyclovir, ACV). Humán egyedeknél az ACV-t sikeresen alkalmazták lokalizált és disszeminált HSV fertőzések kezelésére. Mindazonáltal hátrányos ezen vegyületekkel végzett HSV-1 kezeléseknél mind a hatóanyag-rezisztens virális mutánsok megjelenése, valamint a negatív eredmény a kettős vakpróbával kapcsolatosan. Az ACV, hasonlóan az Ara-A-hoz igen gyengén oldódik vízben (0,2 %), és ez a fizikai jellemző határt szab a felhasználható készítményeknek. A purin nukleozid analógok gyakorlati alkalmazása kiterjedt klinikai helyzetekben gátolt a velejáró hatásos katabolizmus által, amely nemcsak csökkenti a biológiai aktivitást, hanem toxikus katabolitok kialakítását is eredményezheti.
Az összes hatásos anti-HSV vegyületek, amelyeket jelenleg a klinikai vizsgálatoknál alkalmaznak, nuklozid analóg. Ezen vegyületek hatásosságát csökkenti a gyenge oldhatóságuk vizes oldatokban, a gyors intracelluláris katabolizmus és a nagy celluláris toxicitás. Egy további ellenjavallat a nukleozid analógok hosszantartó alkalmazásával szemben, hogy az utóbbi időben klinikai HSV izolátumokat mutattak ki, amelyek rezisztensek klinikai vizsgálatok során adagolt nukleozid vegyületek gátló hatásával szemben. A vírusellenes oligonukleotidok lehetőséget adnak a jobb oldhatóságra, alacsonyabb celluláris toxicitásra és kevésbé érzékenyek a cél-génben a nukleotid mutációkkal szemben, mint a nukleozid analógok tipikus képviselői.
Ismert, hogy a herpesz vírus fertőzések kezelésére és diagnosztizálására igen szükségesek új megoldások. Különösen kívánatos olyan készítmények és módszerek kidolgozása, amelyek igen hatásosak, és nincs, vagy csak igen kicsi a mellékhatásuk.
A találmány szerinti antiszensz oligonukleotid készítmények és ezek alkalmazása herpesz vírus fertőzések kezelésére kielégíti ezt a régóta fennálló igényt.
• · · «
- 6 A fentiek alapján a találmányunk célja herpesz vírus okozta fertőzésekre alkalmas kezelés biztosítása, továbbá antiszenz oligonukleotidokat tartalmazó készítmény biztosítása, amelyek gátolni képesek a herpesz vírusok és más hasonló vírusok RNSének szerepét.
Célja továbbá a találmánynak a herpesz vírus fertőzések diagnosztizálására alkalmas készítmények biztosítása is.
A fentiek alapján a találmányunk oligonukleotidokra és oligonukleotid analógokra vonatkozik, amelyek specifikusan hibridizálhatók a herpesz szimplex 1 típusú vírus valamely következő nyitott leolvasási keretének megfelelő génből származó RNS-sel vagy DNS-sel:UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52. A találmány szerinti oligonukleotidok annyi nukleotid egységet tartalmaznak, amelyek azonossága és száma elegendő a specifikus hibridizáció létrehozásához. Előnyös, ha a találmány szerinti oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok specifikusan hibridizálhatók egy transzlációs iniciátor hellyel, és előnyös, ha az oligonukleotid CAT szekvenciát tartalmaz.
Egy előnyös kiviteli formánál az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok olyanok, hogy specifikusan hibridizálhatók a herpesz szimplex vírus 1 típus (HSV-1), herpesz szimplex vírus 2 típus (HSV-2), cytomegalovírus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus (EDV) vagy varicella zoster vírus (VZV) valamely fajtájából származó DNS-sel vagy még előnyösebben RNS-sel. Az ilyen oligonukleotidokat és analógokat különösen előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokkal elkevert formában alkalmazzuk.
A találmány egy különösen előnyös kiviteli módjánál olyan oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat alkalmazunk, amelyek esetében legalább néhány kapcsoló csoport, amely az oligonukleotid egységekben a nukleotid egységeket köti össze, kéntartalmú csoport, így például foszforotioát-csoport.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá állatoknál, és különösen humán egyedeknél, amelyek feltehetően herpesz vírus fertőzésben szenvednek, alkalmazható diagnosztikai és gyógyászati eljárás is. Az ilyen eljárásoknál az állatokat vagy humán egyedeket vagy azok testfolyadékát a találmány szerinti oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal érintkeztetjük a szaporodás gátlására, vagy a fertőzés befolyásolására, vagy pedig a diagnosztizálás céljából.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a herpesz vírus 1 típus esetében leírt adott nyitott leolvasási keret megfelelője megtalálható a többi említett vírusban is. Ennek megfelelően mind a herpesz szimplex vírus 2 típus, a citomegalovírus, a humán herpesz vírus típus 6, az Eppstein Barr vírus és a varicella zoster vírus tartalmaz több analóg nyitott leolvasási keretet, amelyek a hasonló funkciójú proteineket kódolják. Ennek megfelelően a találmány vonatkozik egy antiszensz oligonukleotid terápiára, ahol az oligonukleotidok vagy az oligonukleotid analógok az említett vírusokkal vagy bármely, a későbbiek során megismerésre kerülő olyan hasonló vírusokkal szemben hatnak, amelyek egy vagy több ilyen analóg nyitott leolvasási kerettel rendelkeznek. A találmány értelmében az összes ilyen vírust herpesz vírusnak nevezzük.
* ·
- 8 Az 1. ábrán bemutatjuk a herpesz szimplex vírus típus 1 génjének elrendezését, McGeoch, D.J. és munkatársai ismertetése alapjá [J. Gén. Virol., 69, 1531-1574 (1988)].
A 2A. ábrán bemutatjuk a herpesz szimplex vírus típus 1 bizonyos nyitott leolvasási kereteit (ORF), beleértve az UL39 (140 000 d) és UL40 (40 000 d) nyitott leolvasási kereteit.
A 2B. ábrán bemutatjuk az öt 3’-koterminális transzkriptum egyik illesztett készletét, beleértve a HSV-1 17 törzs UL13 génjét.
A 3. ábrán összehasonlítjuk a HSV-1 17 törzs és HSV-2 HG52 törzs UL13 transzlációs nyitott leolvasási kereteit.
A 4. ábrán összehasonlítjuk a HSV-1 17 törzs és HSV-2 333 törzs UL39 gén DNS szekvenciáit, megjelölve a HSV-1 transzlációs iniciációs kodonját a 238 helynél.
Az 5. ábrán összehasonlítjuk a HSV-1 KOS törzs, és HSV-2 333 törzs UL40 génjének DNS szekvenciáit, megjelölve a HSV-1 transzlációs iniciációs kodonját a 138 helynél.
A 6. ábrán táblázatosán összefoglaljuk a HSV-1, VZV és EBV homológ nyitott leolvasási kereteit (ORF), amelyeket publikált DNS szekvencia adatok alapján határoztunk meg.
A 7. ábrán grafikusan bemutatjuk a betegségek átlagos előfordulását különböző időkkel a fertőzést követően. Az egereket 1 x 105 pfu mennyiségű HSV-1 KOS vírussal fertőztünk, a kezelést 4 óra elteltével kezdtük pi. Mindegyik adat az átlagos betegség-előfordulást jelenti az összes egérnél a jelzett napon.
A 8. ábrán grafikusan bemutatjuk a hatóanyag dózisok hatását a betegség előfordulásra. A betegség átlagos • ·· • · · · · ··· ··* ··« ··♦ • · » * «
- 9 előfordulását az ISIS 1082 dózisának függvényében ábrázoltuk 11, 13 és 15 nappal a fertőzést követően.
A 9. ábrán grafikusan bemutatjuk a betegségek átlagos előfordulását különböző idővel a fertőzés után. Az egereket 1 x 105 pfu HSV-1 KOS törzzsel fertőztük, és a kezelést ISIS 1082-vel végeztük 4 órával a fertőzést követően. Mindegyik pont a betegségek átlagos előfordulását jelzi az összes egérnél az adott napon.
A 10. ábrán grafikusan bemutatjuk a különböző ISIS oligonukleotidok hatását a HSV fertőzésekre. HSV-1 (KOS törzs) és HSV-2 (HG52 törzs) vírusokat alkalmaztunk, a kísérletnél a kontroll HSV mennyisége 8,1 x 106 pfu/ml és 8,2 x 107 pfu/ml volt a HSV-1 illetve HSV-2 esetében.
A 14. ábrán fotografikusan bemutatjuk a különböző oligonukleotidok hatását az RNS in vitro transzlációjára. A bal oldalon feltüntetett számok jelzik az 1 sávban mutatott marker protein relatív molekulatömegét. A nagyobb nyíl jelzi a HSV RNS-ből szintetizált fő polipeptid terméket. A kisebb nyíl jelzi a HSV RNS-ből inhibiciós hatású oligonukleotid jelenlétében szintetizált polipeptideket. A transzlációs inhibicióhoz az oligonukleotidok és RNS mólaránya 50:1 volt. (A.) Az oligonukleotid inhibiciós hatásának specificitása A 2-10 sávok tartalmazzák a reticulocyta lizátumokból nyert in vitro transzlációs termékeket, közelebbről a következőképpen: sáv 2, nincs RNS; sáv
3-6, pIP-1 RNS (0,112 pmól); sáv 7-10, 5LO RNS (0,145 pmól). Sáv 4 és 8, ISIS 1049; sáv 5 és 9, ISIS 1082; sáv 6 és 10, ISIS 1238. (B). Az inhibiciós aktivitás spektruma. A sáv-2-8 vonat- • 4 4 ·· ······ • · · · · · * • ··· t*9 ·····♦ · · · 4 *·
- 10 kozik a reticulocyta lizátumokból nyert in vitro transzlációs termékekre, közelebbről a következőkre: sáv 2, nincs RNS; sáv 35, pIP-2 RNS (0,108 pmól); sáv 6-8, pIP 1-RNS (0,112 pmól); sáv 4 és 7, ISIS 1049; sáv 5 és 8, ISIS 1082.
A 12. ábrán bemutatjuk a dózis válasz görbéket, amelyekből kitűnik a HSV-2 replikációjának gátlása, a különböző koncentrációjú ISIS oligonukleotidokkal vagy Acyclovir-ral végzett kezelésnél. A fertőzésekhez HSV-2 (HG52 törzs) vírust alkalmaztunk. A kontroll fertőzésekhez az ACV-kezelt lyukakban a koncentrációt DMSO-val olyan értékre állítottuk be, amely megfelelt az 1 μπιόΐ koncentrációjú ACV-vel kezelt sejteknél alkalmazott DMSO koncentrációnak.
A 13. ábrán bemutatjuk a HSV-1 (KOS törzs) dózisfüggő gátlását ISIS 1082, ACV vagy ISIS 1238 oligonukleotiddal végzett kezelés esetén. A hibahatár a standard deviációt jelzi (p > 0,05), az átlagos értékekre vonatkozóan minden koncentráció értéknél.
A 14. ábrán bemutatjuk a HSV-1 (F törzs) dózisfüggő inhibicióját ISIS 1082, ACV vagy ISIS 1238 oligonukleotiddal végzett kezelés esetén. A hibahatár a standard deviációt jelzi (p > 0,05) az átlagértékekre vonatkozóan minden koncentráció értéknél.
A 15. ábrán bemutatjuk a HSV-1 törzsek dózisfüggő inhibicióját Acyclovir-ral vagy ISIS 1082 oligonukleotiddal végzett kezelés esetén. A kísérletnél DM2.1 törzseket (15B. ábra) és PAAr5 (PAAr5) törzseket (15A ábra) alkalmaztunk. A kontroll lyukak nem tartalmaztak DMSO-t.
A legszélesebb körben tanulmányozott humán herpesz vírus a herpesz szimplex vírus. Ez a vírus két hasonló, de jól megkülönböztethető altípus formájában (HSV-1 és HSV-2) létezik, mindegyik altípusnak számos törzse ismeretes. Bár bizonyos HSV törzsek gazda-terjedelme bizonyos szövetekre korlátozódik in vivő, az in vitro gazda-terjedelem minden törzsben magában foglalja a legtöbb humán szövet típust (mind primer, mind transzformált sejtek), valamint a legtöbb nem-humán sejtet. A virális replikációs ciklus gyors, körülbelül 24 óra a HSV-1 és 48 óra a HSV-2 esetében ahhoz, hogy fertőzőképes utódokat termeljen. A HSV gyors replikációja és széles gazda-terjedelme a virális génszerkezet kiterjedt molekulaanalízisét és a fertőzés alatti virális gén expresszió szabályozását eredményezte.
A HSV fertőzések több megkülönböztethető lépcsőből állnak, ezek a következők: a vírus abszorpciója a gazdasejt membránon, a virális burok fúziója virionok penetrációja tának eltávolítása, a a virális genomban, a a celluláris membránnal, a nem burkolt a sejtmagba, a virális nukleinsav bevona virális gének expressziója és replikációja genom nukleáris beépülése az újonnan képződött virális kapszidokba, és végül az érett virion távozása a sejtből. Virálisan kódolt proteinekről megállapították, hogy ezek részlegesen gátolni vagy szabályozni képesek a virális replikációnak ezen lépéseit. Ismertették a HSV-1 genom DNS szek venciáját, és alátámasztottak korábbi megállapításokat, amelyek szerint legalább 71 különböző virális proteint kódolnak a vírusok a tényleges fertőzés alatt [McGeoch, D.J., Dolan, A., Donald, S., és Rixon, F.J., J. Mól. Bioi. 181; 1-13 (1985);
• ·· *· ·« «··« ·· · · · · · • ······ · « ··· • · · · · · · ··· ·· »· ·« ···
McGeoch, D.J., Dolan, A., Donald, S., and Brauer, D.H.K.; Nucleic Acids Rés. 14: 1727-1745 (1986); McGeoch, D.J., Dalrymple, M.A., Davison, A.J., Dolan, A., Frame, M.C. McNab,
D., Perry, L.J., Scott, J.E., and Taylor, P.; J. Gén. Virol. 69: 1531-1574 (1988); és Perry, L.J. and McGeoch, D.J.; J. Gén. Virol. 60: 2831-2846 (1988)].
A HSV gének szerkezete igen egyszerű. Minden egyes ioRNS transzkripciója a promoter szakasz szabályozása alatt közvetlenül a gén 5' mRNS végénél helyezkedik el. Az mRNS-ek illesztése igen ritka, és elsődlegesen a transzkriptumok közvetlen korai osztályára korlátozódik. Egy külön mRNS faj létezik minden egyes vélt protein termékre, amelyet a vírus kódol, és mindegyik virális mRNS-t úgy tekintünk, mint ami monocisztronikus fajként hat még akkor is, ha több nyitott leolvasási keret van jelen a legtöbb mRNS-ben. A virális gén expresszió szabályozása egy finoman beosztott egymást követő folyamat, amelyet három általános lépcsőre oszthatunk: a közvetlen korai, korai és késői fázisokra. A közvetlen korai transzkriptumok a virális replikáció kezdetén szintetizálódnak, még a transzlációs inhibitorok, így például cikloheximid jelenlétében is. így a transzkriptumok ezen osztályának szintézisét meglévő celluláris proteinekkel és/vagy olyan proteinekkel, amelyeket a fertőző virionnal vittünk be a sejtbe, szabályozzuk. A közvetlen korai proteinekről ismert, hogy befolyásolják a celluláris és virális gén expressziókat pozitív és negatív irányban egyaránt, és ezen proteinek expressziója fontos más HSV gének transzkripciós aktiválása szempontjából, különösen vonatkozik ez a korai * ·· »· ·· «··· »· · · · « · • ··· ··« ··♦ ··· • · · · A · · ·»· ·· ·· ·· ···
- 13 génekre. A korai gén transzkriptumok több olyan virális terméket kódolnak, amelyek szükségesek a virális genom replikációjához. Mivel a késői gén transzkriptumok szintézisét mind a közvetlen korai proteinek, mind egy sor templát szabályozza, a késői gének transzkripciója túlnyomórészt a virális DNS szintézise után megy végbe. A késői gének által kódolt proteinek közé tartoznak a burok glükoproteinek, a kapszid proteinek és más proteinek, amelyek szükségesek a virális szerkezet fenntartásához, vagy lehetővé teszik az újonnan képződött virionok távozását a sejtből.
A DNS szekvencia analízis alapján óvatos becsléssel 71 proteint határoztak meg, amelyek a HSV-1 genomon belül vannak kódolva. Az 1. ábrán bemutatjuk a HSV-1 gének nomenklatúráját és az egyetlen hosszú (unique long, UL) és egyetlen rövid (unique short, US) szakaszok genomiális szerkezetét. Bár egy sor virális géntermékről kimutatták, hogy nélkülözhető az in vitro virális replikációnál, csupán a virális timidin kináz szerepéről ismert, hogy nem szükséges a virális növekedéshez humán gazdaszervezetben. Ebből logikusan következik, hogy 70 gén marad, amelyek alkalmasak lehetnek cél-irányított antivirális kemoterápiánál való felhasználásra. A virális replikáció alatt a virális mRNSek jelentik a legkülönbözőbb és a legsokoldalúbban alkalmazható célalanyt az antiszenz oligonukleotid inhibicióhoz.
Mivel a HSV mRNS-ek transzkripciója szorosan szabályozva van a gén expresszió kaszkád folyamatán belül, a HSV mRNS relatív koncentrációja függ az infekció folyamatában a mintavétel idejétől. Általában maximális koncentrációjú mRNS értéket
44·· »444
44 4 444*4
4 4 44 ··· lehet elérni 3-4 órával a szintézis kezdetét követően. Az mRNS bomlásának sebessége nem ismert minden HSV mRNS esetében, az irodalomban közölt adatok igen különböznek a sebességet illetően. A HSV-mRNS-ek számos szerkezeti jellemzője igen fontos a virális proteinek hatásos transzlációjához. A HSV mRNSek 5’ végei együtt a transzlációs iniciós kodonokkal és a 3' poliadenilezett végekkel feltehetően hasonlóképpen működnek, mint a hasonló mRNS szerkezetek, amelyeket számos celluláris mRNS esetében leírtak. A HSV mRNS-ek illesztése vagy kapcsolása igen ritka, de a közvetlen korai transzkriptumok kapcsolási helyei a virális transzkriptumok egy másik szerkezeti jellemzőit jelentik, amelyet az antiszensz inhibició egy valószínűsíthető helyének tarthatunk. A HSV UL48 mRNS egyedülálló szerkezeti jellemzőiről leírták, hogy befolyásolja a burok protein szintézis sebességét [Blair, E.D., Blair, C.C. and Wagner, E.K.;
J. Virol. 61: 2499-2508 (1987)]. Nem vizsgálták azonban a hasonló szerkezetek jelenlétét más HSV mRNS-ekben, vagy ezen szerkezetek képességét arra vonatkozóan, hogy a rokon protein fajok szintézisét befolyásolják. Ily módon a HSV mRNS számos szerkezeti szakaszát célozhatjuk meg, mint potenciális helyét az antiszenz oligonukleotid inhibicóinak. Valóban a fertőzött sejtek kezelésre olyan oligonukleotidokkal, amelyek komplementerek az US1 és US2 gének illesztési helyeivel, vagy az UL48 gén transzlációs iniciációs szakaszával, a HSV replikáció inhibicióját eredményezte in vitro [Smith, C.C., Aurelian, L. Reddy,
M.P., Miller, P.S., and Ts'o, P.O.P; Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83: 2787-2792 (1986); és Ceruzzi, M. and Draper, K.: Nucleosides ·> ·· · ♦ ««a··· • -4 · « · f»«
444 ··, 44*«·« • · · · · · · 4*· ·4 4« 4«···
- 15 and Nucleotides 8: 815-818 (1989)].
A virális gén termékeket, amelyekről ismert, hogy biológiai szerepük van a HSV replikádéban, három csoportra oszthatjuk. Ezek: 1. transzkripciós aktivátor vagy represszor proteinek; 2. DNS replikációs proteinek; és 3. szerkezeti proteinek. A HSV transzkriptumok közvetlen korai osztálya olyan proteineket kódol, amelyek transzkripciós aktivátorok és represszorok más virális génekkel kapcsolatban. Ismertettek olyan vírus törzseket, amelyek nem termelnek ilyen proteineket, és az IE175 gén termék kivételével úgy tűnik, hogy a közvetlen korai proteinek nem lényegesek a virális replikációs folyamatban. Más közvetlen korai proteinek működését helyettesíthetjük vagy az IE175 működésével, vagy a gazda működésével. Az IE175 mRNS transzkripciója folytatódik a fertőzött sejtben addig, amíg az IE175 protein koncentrációja eléri azt az értékét, amely gátolja az IE175 mRNS további transzkripcióját, így az IE175 protein szintézisének gátlása egy megfelelő antiszenz oligonukleotiddal eredményezné az IE175 mRNS állandó növekvő szintjét, ami esetenként átlépheti azt a mólkoncentráció küszöböt, amely a hatásos oligonukleotid inhibició határát jelenti. További problémája az antiszenz terápiának, amely a közvetlen korai géneken alapul, hogy a közvetlen korai gének ideiglenes expressziója szükségessé teheti az oligonukleotidok profilaktikus adagolását. Bár ez a típusú adagolás lehetséges, a legtöbb humán fertőzés esetében nem megvalósítható.
A legszélesebb körben vizsgált csoportja a virális proteineknek az, amelyek a genomiális replikációban részt• 4«*· ·· 4« 4 * * 4 · • Λ · * *4 44« Λ α *
- 16 vesznek. Legalább 7 virális protein (UL5, 8, 9, 29, 30, 42 és
52) vesz részt közvetlenül a virális DNS replikációban. A virális DNS polimeráz, a timidin kináz és a ribonukleotid reduktáz enzimek működését gátolták sikeresen nukleozid analógokkal, és jelenleg is állandó kísérletek folynak még hatásosabb vegyület típusok kifejlesztésére. A hatóanyag-ellenálló HSV törzsek kialakulása határt szab a hosszú hatásidejű nukleozid analógok kifejlesztésének megvalósítására a klinikai gyakorlatban. Mivel számos késői virális gén transzkripciója függ a hatásos expresszióhoz szükséges gén dózistól, a virális szerkezeti proteinek szintézisének antiszenz inhibicióját indirekt módon is elvégezhetjük a DNS szintetikus proteinek megcélzásával.
A strukturális proteinek alkalmazása az antivirális folyamatokban a vakcinák kifejlesztésére koncentrálódott, és az antiszenz típusú vegyületekkel végzett kemoterápiás beavatkozások egy még nem feltárt területét jelentenek. Az ezen csoportba sorolt proteinek közé tartoznak azok, amelyekről ismert, hogy szerepet játszanak a virális szerkezetekben és a szerkezeti integritásban, a virális adszorpcióban, a virionok és a gazdasejt membrán fúziójában, valamint a vírus penetrációjában a fertőzött sejtbe.
Az utóbbi időben tudatták, hogy bizonyos virális proteineknek bifunkcionális szerepük lehet a HSV replikációban. A jelen találmány értelmében azt gondoljuk, hogy közvetlenül lehetőség nyílik a virális replikáció számos szintjébe közvetlenül beavatkozni, egyetlen protein termék inhibiciójával. A virális ··*· ♦ *· ·· ·· ·· · · · · • *·· *·· ··*«·4 • · · 9 ·’ ··♦ ·« ·4 ·<··»
- 17 proteinek osztályának ezen tagjai (UL13 és UL39) számukban korlátozottak, de olyan cél alanyt képviselnek, amelyek igen ígéretes jelöltjei az antiszenz inhibiciónak. A virális proteinek, amelyeket a HSV-1 UL13 és UL39 nyitott leolvasási kereteként azonosítunk, nagyfokú nukleotid szekvencia konzerválást mutatnak a különböző HSV-1 és HSV-2 altípusok homológjai között. Az UL13 és UL39 génekről megállapították, hogy a legjobb hely a terápiás beavatkozás céljára. Egy harmadik protein, az UL40, amely az UL39 proteinnel az aktív ribonukleotid reduktáz enzim komplexet alkotja, szintén ígéretes cél az antiszenz inhibició számára.
További proteinekről is úgy gondoljuk, célként szolgálnak az antiszenz oligonukleotid terápia számára. Ilyenek például az UL3, UL8, UL9, UL29, UL30, UL42 és UL52 nyitott leolvasási keretekből származó proteinek. Ennek megfelelően a találmány előnyösen mRNS-ek működésének gátlására vonatkozik, amelyek a herpesz szimplex vírus 1-típusához tartozó alábbi nyitott leolvasási kereteknek megfelelő génekből származnak: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52.
Az UL13 HSV-1 protein egy virion kapszid protein, amely vélhetően kódolja a protein kináz aktivitást, amely felelős a virion kapszid proteinek specifikus foszforilezéséért. Ezt a proteint a 4,1 kb nagyságú mRNS kódolja, amely egyike a 2. ábrán bemutatott öt 3'-koterminális transzkriptumok illesztett együttesének. Az UL13 mRNS egy kisebb virális faj, amely először 3-4 óra után jelenik meg a szövetkultűrákban a virális replikáció kezdetét követően. Az UL13 mRNS mennyisége valamennyire növek18 ·* tf *···«· « · · ·5 ··· ♦·· ······ • · · · * » szik a virális DNS replikációja után, de viszonylag alacsony marad a fő virális mRNS mennyiségéhez viszonyítva, egészen a fertőzés késői szakaszáig. Azt találtuk a DNS szekvencia analízis alapján, hogy az UL13-t kódoló mRNS szekvencia nagymértékben megmarad a HSV-1 és HSV-2 izolátumok között. A becsült molekulatömeg érték a HSV-1 és HSV-2 proteinekre vonatkozóan 57193 illetve 57001. Miután az UL13 protein szintézise nem kimutatható addig, amíg a virális DNS szintézis nem kezdődött meg, feltehető, hogy az UL13 transzlációjának primer kontrollja a 4,1 kb mRNS mennyisége. A 4,1 kb mRNS 5' nem-transzlációs szakaszának szerepét, ha egyáltalán van, az UL13 protein szintézisének sebességével kapcsolatban, nem vizsgáltuk. A HSV-1 és HSV-2 mRNS fajok transzlációs nyitott leolvasási kereteinek (ORF) összehasonlítása, amelyet a 3. ábrán mutatunk be, fölfedi, hogy konzervált nukleotid szekvenciák vannak, amely egy igen kedvező cél a HSV UL13 szintézisének oligonukleotidos inhibiciójára, valamint a virális replikáció inhibiciójára. Ezen szakaszok nukleotid szekvenciájának hasonlósága (eltérés csupán az 1554 nukleotid közül 205-nél van) az mRNS egy igen fontos szerkezeti jellemzőjére mutat rá, amely, mint azt most kimutattuk, kihasználható az antiszenz oligonukleotid terápia által annak érdekében, hogy széles antiszenz inhibíciós aktivitást tudjunk elérni mind a HSV-1, mind a HSV-2 vírusokkal szemben egyetlen oligonukleotid szekvenciával.
A HSV-1 UL39 proteinje szoros összefüggésben egy másik proteinnel, amelyet a szomszédos gén, az UL40 kódol, így egy komplex képződik, amely ribonukleotid reduktáz aktivitású.
·· «· ····«· ·« « » · ·· • «·· ♦·· ··· ··· » · » * · · · 999 99 ·9 99·9»
Frame, M.C., Marsden, H.S., és Dutia, B.M.; J. Gén. Virol. 66: 1581-1587 (1985)]. A proteinek homológ együttesét a HSV-2 kódolja, és hasonló ribonukleotid reduktáz aktivitást mutat. Egyedül az UL39 protein HSV-2 homológja rendelkezik autofoszforilező protein kináz aktivitással. Hasonló kináz aktivitást nem mutattunk ki a HSV-1 UL39 protein esetében. Az UL39 és UL40 proteineket egy pár 3' koterminális mRNS kódol, amelyek 5,2 és 1,2 kb hosszúságúak. Egy HSV-1 fertőzés esetén az
5,2 kb mRNS egy fő mRNS az infekció korai szakaszában, amelynek mennyisége az infekció kései szakaszában csökken. Az 1,2 kb mRNS mennyisége mérsékelt a korai szakaszban, és így is marad a fertőzés teljes idején. HSV-2 fertőzés esetén az 1,2 kb mRNS homológ a nagyobb mennyiségű korai faj és az 5,2 kb mRNS homológ a mérsékeltebb mennyiségű faj. Azonban mind a két fajta mRNS a fertőzés kései szakaszában mérsékelt mennyiségben van jelen. A biológiai jelentősége annak, hogy a HSV fajok között az mRNS-ek mennyisége különbözik, még bizonytalan, de ezen különbségek jelentős hatással lehetnek a virális ribonukleotid reduktáz vagy protein kináz aktivitás oligonukleotid inhibicója esetén a hatásos célalany kiválasztására. A HSV ribonukleotid reduktáz komplex fehérjéit a virális DNS replikációt megelőzően szintetizáljuk, és az enzimatikus aktivitás feltehetően lényeges szerepet játszik a DNS szintézishez szükséges szubsztrátum előállításában. Ezen fontos enzimatikus működés gátlása nemcsak befolyásolja a DNS szintézist, de közvetlenül gátolja az olyan késői protein termékek szintézisét, amelyeket a templátok mennyiségén alapuló gének kódolnak, és így hatásosan szinte20
44 «4 44444« • 4444 ·4
444 444 444444
4 4 4 4 44
444 44 44 44«44 tizálják a megfelelő mRNS-eket. A HSV ribonuklotid reduktáz mRNS-k nyitott leolvasási kereteinek összehasonlítása kimutatja a nukleotidok eltérésének mértékét, mint az a 4. ábrán látható, amely befolyásolhatja az mRNS működésének típuson belüli hatásosságát. Az AUG kodonok körüli nukleotid szekvencia eltérése megkívánhatja, hogy külön nukleotid készítményeket alkalmazzunk HSV-1 és HSV-2 UL39 és UL40 proteinek szintéziséhez. A HSV-1 és HSV-2 UL39 és UL40 nyitott leolvasási keretein belüli más szakaszok kiterjedtebb DNS homológiát mutatnak úgy, hogy az oligonukleotid készítmények, amelyek ezen szakaszokkal homológok, hatásosan gátolhatják a HSV-1 és HSV-2 replikációját.
A HSV-1 genomja mind a cisz- és transz-hatású elemeket tartalmazza, amelyeknek szerepe van a virális DNS replikációban. A cisz-hatású elemek megfelelnek a DNS replikáció kezdetének és a transz-hatású elemek enzimek, amelyek a HSV-1 DNS replikációért felelősek. A HSV-1 genom által kódolt hét nyitott leolvasási keret megfelel a 7 komplementációs csoportnak, amelyekről ismert, hogy fontosak a HSV-1 DNS replikációhoz. Ez a hét nyitott leolvasási keret kódolja a virális DNS polimeráz enzimet (UL30), az egyszálú DNS kötő-proteint (UL29), az oris-kötő proteint (UL9), a kétszálú DNS kötő-proteint (UL42), és három proteint amelyek a helicaseprimáz komplexet tartalmazzák (UL5, UL8 és UL52). Ezen gének DNS szekvenciája csupán a HSV-1 genom esetén ismert, de a HSV-1 és HSV-genomok között a kritikus virális funkciókat kódoló szakaszokban általános ko-linearitást és nagymértékű DNS szekvencia homológiát állapítottunk meg, úgy, hogy valószínű, hogy található lesz egy oligonukleotid inhibitor • ·· 4· ·····« • 4 · 4 4 ·« • ··· ·«· I»···· • 4 4 · 4 4·
444 ·4 44 44444
- 21 ezen összes HSV-1 gén funkciók számára, amely a homológ HSV-2 gén funkcionális expresszióját szintén gátolni fogja.
Három cél HSV génről ismertették, hogy érzékenyek az antiszenz inhibitorokkal szemben in vitro vizsgálatok során. Egy oligonukleotid, amely a [dC]28 szekvenciát tartalmazza internukleozidikusan foszforotioát csoportokkal kapcsolódva, gátolja a HSV-2 DNS polimeráz aktivitást, de ezen hatás nem-specifikusnak tűnik, mivel ugyanezen oligonukleotidról kimutatták, hogy befolyásolja a genomiális replikációját egy nem rokon vírusnak a Humán Immunodéiiciency Vírusnak [Cheng, Y-C. , Gao, W., Stein, C.A., Cohen, J.S., Dutschman, G.E., és Hanes, R.N.; Abstract and poster presented at Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression: Therapeutic Implications, held in Rockville, MD (1989); Matsukura, M., Shinozuka, K., Zon, G., Mitsuya, H., Reitz, M., Cohen, J.S., and Broder, S.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7706-7710 (1987)]. Bár erről az oligonukleotidról kimutatták, hogy gátolja a megfelelő virális replikátumokat, virális replikáció gátlás nem lett megállapítva. A metil-foszfonáttal kapcsolt és psoralen-derivatizált oligonukleotidokról, amelyek komplementerek a HSV-1 US1 és US12 mRNS-ek illesztési-kapcsolási helyeivel, kimutatták, hogy gátolják a HSV-1 replikációt in vitro [Kulka, M., Smith. C.C., Aurelian, L., Fishelevich, R., Meade, K., Miller, P., and T'so, P.O.P.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6868-6872 (1989); és Smith, C.C., Aurelian, L., Reddy, M.P., Miller, P.S., and Ts’o, P.O.P.; Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 83, 2787-2792 (1986)]. Ezek az eredmények érdeklődésre tartanak számot, mivel a cél génekről kimutatták, hogy nem lényegesek a HSV replikációhoz. Egy oligonukleotid szekvencia, amely komplementer a vírus replikációjához lényeges génnel, várhatóan jobb gyógyhatású szer, mint azon oligonukleotidok, amelyek nem-lényeges géntermékeket céloznak meg. Ezen feltevés igazolását Ceruzzi és Draper végezték el HSV-1 UL48 mRNS mint cél szekvencia alkalmazásával [Ceruzzi, M., and Draper, K.: Nucleosides and Nucleotides, 8: 815-818 (1989)]. Az antivirális hatásosság, amelyet Ceruzzi és Draper természetes (foszfodiészter-kötésű) oligonukleotiddel értek el, összehasonlítható a Smith és munkatársai által megfigyelt hatásossággal, amelyet ezek módosított oligonukleotidjaival értek el. Az antivirális hatás ezen növekedése feltehetően kapcsolatban van az UL48 protein fontos szerepével, amelyet a vírus közvetlen korai transzkripciójának fokozásában fejt ki.
Az UL13 kapszid protein szintézisre és a virion protein foszforilezésre gátló hatást kifejtő oligonukleotidok kifejlesztése egy új anti-HSV kemoterápiát jelent. A számos független virális működés megcélzása lehetőséget ad széles intertipikus antivirális aktivitás számára a leghatásosabb antiszenz oligonukleotidok felhasználásával, mint azt vizsgálataink során egymással vagy más meglévő nukleozid terápiával kombinálva megállapítottuk. A herpesz szimplex vírus típus 1 (HSV-1), a varciella zoster vírus (VZV) és az Epstein Barr vírus (EBV) DNS szekvenciáinak összehasonlítása kimutatta, hogy a humán herpesz vírusok között fentmaradnak azok a gének, amelyeket legjobb cél alanynak találtunk az antiszenz oligonukleotid támadással szemben. A VZV és EBV géneket, amelyek a HSV-1 génekkel • ·
- 23 homológok, a 6. ábrán mutatjuk be. A nyitott leolvasási kereteket a gén bank adatai alapján publikált DNS szekvenciák alapján adtuk meg [Davison, A.J. & Scott, J.E., J. gén. Virol. 67: 1759-1816 (1987); McGeoch, D.J., Dalrymple, M.A., Davison, A.J., Dolan, A., Frame, M.C., McNab, D., Perry, L.J., Scott, J.E., & Taylor, P., J. Gén. Virol. 69: 1531-1574 (1988); Baer, R., Bankier, A.T., Biggin, M.D., Deininger, P.L., Farrell, P.J., Gibson, T.J., Hatfull, G., Hudson, G.S., Satchwell, S.C., Sequin, C., Tuffnell, P.S., & Barrell, B.G., Natúré 310: 207211 (1984)].
Bár a felsorlt EBV BBRF2 és BORF2 gének homológok a HSV-1 UL9 és UL39 génekkel, ezen gének kódolt aminosavjai nem nagymértékben homológok. Az aminosav homológiának ez a hiánya a kódolt nyitott leolvasási keretekben tükrözheti az EBV nyitott leolvasási keretek széttöredezését, amely az mRNS-k közötti kapcsolódás (összefonódás) következtében jön létre, bár ezen kapcsolódások igazolását még eddig nem végezték el. Most úgy gondoljuk, hogy számos nukleotid homológ szakasz, amelyek a különböző herpesz vírus géneken belül léteznek, igen jó cél az antiszenz oligonukleotid inhibició számára. Úgy gondoljuk, hogy egy oligonukleotid, amely HSV-1 és/vagy HSV-2 gátló, és homológiát mutat akár a VZV, akár az EBV megfelelő nukleotid szekvenciájával, egy igen hatásos inhibitor a VZV és/vagy EBV replikáció számára. Más humán herpesz vírus szekvenciáját eddig még nem publikálták, de a rendelkezésre álló korlátozott nukleotid adatok azt mutatják, hogy a humán cytomegalovírus (HCMV) és a humán herpesz vírus 6 (HHV 6) homológok a HSV-1 UL13
génnel [Lawrence, G.L., Chee, M., Craxton, M.A., Gompels, U.A., Honess, R.W., and Barrell, B.G.; J. Virol. 64: 287-299 (1989)]. Továbbá, a HCMV DNS szekvenciája homológ a HSV-1 UL30 génnel [Kouzarides, T., Bankier, A.T., Satchwell, S.C., Weston, K., Tomlinson, P., and Barrell, B.G.; J. Virol. 61: 125-133 (1987)] és szakaszokat tartalmaz, amelyek homológok a HSV-1 génnel. Ha más humán herpesz vírus szekvenciák is ismertek, úgy gondoljuk, hogy a gének, amelyeket most megcéloztunk, legalább részlegesen meg lesznek benne, és szignifikáns nukleotid homológiát mutatnak az eredeti HSV gén szekvenciákkal. A jelen találmány értelmében oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat alkalmazunk a herpesz vírusok messenger RNS-jeinek működésének antiszenz gátlására. A találmány értelmében az oligonukleotid kifejezés olyan kapcsolt nukleotid egységek összességére utal, amelyek természetes-előfordulásúak, és ciklofuranozil csoportokat tartalmaznak natív foszfodiészter-kötésekkel kapcsolva. Ez a kifejezés különösen utal olyan természetben előforduló vagy szintetikus fajtákra, amelyek természetben előforduló alegységekből vannak megalkotva.
Az oligonukleotid analóg kifejezés a találmány értelmében olyan molekulákra vonatkozik, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan működnek, de nincsenek természetben előforduló részeik. így az oligonukleotid analógok lehetnek módosított cukor molekulák vagy cukron belüli kötések. Ilyenek közé tartoznak példaképpen a foszforotioát- és más kéntartalmú-tagok, amelyek a szakterületen ismertek. Ezek a molekulák tartalmazhatnak még módosított alapegységeket, vagy más olyan módosítá• ·
- 25 sokat, amelyek a találmány lényegétől nem térnek el.
A találmány egy előnyös kiviteli módjánál legalább néhány foszfodiészter kötés az oligonukleotid molekulában szubsztituált olyan szubsztituensekkel, amelyek működése elősegíti a készítmény behatolását azon sejtrészekbe, ahol az az RNS található, amelynek aktivitását módosítani kell. Előnyös, ha az ilyen szerkezeti egységek, kötések kéntartalmúak. Előnyös továbbá, ha ezek a szubsztituensek foszfor-tioát kötéseket tartalmaznak. Más egyéb szerkezetek, így például alkil-foszfortioát kötések, Nalkil-foszforamidátok, foszfor-ditioátok, alkil-foszfonátok, valamint rövidszénláncú alkil- vagy cikloalkil szerkezetek szintén előnyösek. Egy másik előnyös kiviteli mód szerint a foszfordiészter kötések olyan szubsztituensekkel szubsztituáltak, amelyek egyidejűleg lényegében nem-ionosak és nemkirálisak. A szakterületen jártas szakember ki tud választani más egyéb szubsztituenseket, kötéseket is, amelyek a találmány értelmében felhasználhatók.
Az oligonukleotid analógok közé tartoznak továbbá olyan molekulák is, amelyek legalább néhány módosított alap formát tartalmaznak. így például alkalmazhatók purinok és pirimidinek is, amelyek eltérőek a természetben általában megtaláthatóktól. Hasonlóképpen a nukleotid alegység ciklofuranóz részén is elvégezhetők módosítások oly mértékben, hogy a találmány lényegétől ne térjen el.
Az ilyen analógokat leginkább úgy írhatjuk le, hogy funkcionálisan felcserélhetők a természetes oligonukleotidokkal (vagy a természetes módnak megfelelően szintetizált oligonukleo tidokkal), de amelyek egy vagy több különbséget mutatnak a természetes szerkezettől. Az összes ilyen analógok a találmány oltalmi körébe tartoznak, amennyiben azok úgy működnek, hogy hatásosan hibridizálódni képesek a herpesz vírus vagy más rokon vírus messenger RNS-jével, az RNS működésének gátlására.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok előnyösen 6-50 alegységet tartalmaznak, még előnyösebben az oligonukleotidok és analógok 8-25 alegységet tartalmaznak. Nyilvánvaló, hogy az alegység egy bázis és egy cukor kombinációja, amely alkalmasan kötődik a szomszédos alegységhez egy foszfordiészter vagy más egyéb kötéssel.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok olyanok, hogy hibridizálódni képesek a herpesz vírus messenger RNS-jével. Az ilyen hibridizáció, ha végbement, gátolni képes a messenger RNS normál működését, és ily módon kevésbé felhasználható a vírus számára. A gátolni kívánt messenger RNS funkciók magukban foglalnak minden vitális funkciót, így például az RNS transzlokációját a protein transzlációjához szükséges helyre, a protein tényleges transzlációját az RNS-ből, és esetlegesen egy független katalitikus aktivitást, amelyet az RNS indít el. Az ilyen RNS funkciókba való beavatkozás általános hatása az, hogy a herpesz vírus az RNS-t hasznosítani nem tudja, és általában a virális genom expressziója révén zavaró hatás lép fel. Az ilyen zavaró hatás általában végzetes a vírus számára.
A találmány értelmében előnyösen olyan oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat állítunk elő, amelyek beavatkoznak • ·
- 27 a messenger RNS-k működésébe, és olyanok, hogy fokozott metabolikus jelentőséggel rendelkeznek a fentiekben ismertetett vírusokkal szemben. Azt tapasztaltuk, hogy előnyös, ha a nyitott leolvasási keret egy vagy több transzlációs iniciációs részét célozzuk meg az antiszenz támadás céljára. Nyilvánvaló, hogy az ilyen részek általában magukban foglalják az AUG szekvenciát (RNS-ben), így az oligonukleotid CAT szekvenciája ezzel specifikusan hibridizálható. Ennek megfelelően ezen kiviteli formánál a CAT szekvenciát tartalmazó oligonukleotidok és oligonukleotid analógok az előnyösek. Az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok továbbá előnyösen olyan nukleotid alegységeket tartalmaznak, amely lehetővé teszi, hogy a nukleinsawal való specifikus hibridizáció nagymértékben menjen végbe. Ennek megfelelően az előnyös oligonukleotidok vagy analógok tartalmaznak számos alegységet a CAT szekvencia egyik vagy mindkét oldalán, amely szekvencia úgy van megalkotva, hogy komplementer a hibridizálandó transzlációs iniciációs hellyel szomszédos szekvenciával. Hat-tizenkét ilyen, mindkét oldalon szomszédos alegység megfelelő és előnyös a találmány szempontjából, bár ennél nagyobb vagy kisebb számú alegységek is előnyösen alkalmazhatók, anélkül, hogy a találmány lényegétől eltérnénk.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok alkalmazhatók diagnosztikai, valamint gyógyászati készítményekben, valamint felhasználhatók kutatásra alkalmas reagensként és kitként. Gyógyászati felhasználásnál a találmány szerinti oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat az állatoknak és különösen embereknek adagoljuk, amelyek herpesz * · ·
- 28 vírus fertőzésben szenvednek, így például valamely következő fertőzésben: genitális herpesz, herpesz szimplex gingivostomatitis, herpesz labiális, herpesz szimplex enkefalitisz, keratoconjunctivitis, herpeszes köröm és ujjgyulladás vagy disszeminált herpesz fertőzések csecsemőknél és immunoegyezéses gazdaszervezeteknél.
Általában előnyös, ha a találmány szerinti gyógyászati készítményeket topikálisan vagy intralezionálisan adagoljuk. Más egyéb formák is alkalmazhatók azonban, így például az adagolás történhet orálisan, transzdermálisan, intravénásán, vagy intramuszkulárisan. A kúp készítmények formájában történő adagolás szintén előnyös. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok profilaktikus alkalmazása szintén előnyös. Ilyen esetekben a készítményeket például kesztyűk vagy kondomok és más egyebek borítására alkalmazhatjuk. Bizonyos esetekben a készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat is.
A találmány szerinti készítmények alkalmazhatók a diagnosztikában és a kutatásban is. Mivel a találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok a herpesz vírussal hibridizálódnak, ezen tény kihasználására könnyen szerkeszthetünk szendvics vagy más egyéb vizsgálatokat. Az eszközök, amelyek szükségesek az oligonukleotid vagy oligonukleotid analógok és a mintában feltételezetten jelenlévő herpesz vírus hibridizációjának detektálására, rutinszerűen biztosíthatók. Az ilyen eszközök közé tartozik például az enzim konjugáció, a radiojelzés vagy más alkalmas detektáló rendszer. A herpesz vírus • · • · ·*
- 29 jelenlétét vagy távollétét kimutató kitek szintén előállíthatók.
A találmány kitanításának megfelelően számos komplementer oligonukleotidot állítottunk elő, amelyek kiválasztott HSV mRNSek transzlációs iniciációs szakaszait célozzák meg (8.
táblázat). A foszfordiészter vázat tartalmazó természetes oligonukleotidokat az anti-HSV aktivitás számára egy fertőzéses vizsgálattal választottuk ki. Ezen vizsgálatban legjobb aktivitást mutató oligonukleotidet (ISIS 1049) a HSV-1 UL13 génnel homológ HSV-2 belső transzlációs iniciációs kodonjának szántuk. Ezen aktív szekvencia metil-foszfonát és foszforotioát analógjainak szintézise azt mutatta, hogy a foszforotioát váz módosítása nagymértékben fokozza az antivirális aktivitását az oligonukleotidnak, viszonyítva akár a foszfodiészter-, akár a metil-foszfonát-oligonukleotidokhoz. Az in vitro szintetizált HSV-1 és HSV-2 UL13 RNS nyúl retikulocyta transzlációja kimutatta, hogy akár a foszfordiészter (ISIS 1049), akár a foszforotioát (ISIS 1082) vázszerkezetet tartalmazó oligonukleotidok gátolni képesek az UL13 polipeptid szintézisét. Dózis válasz kísérletekkel összehasonlítottuk az ISIS 1082 antivirális aktivitását az az acycloguanosine (ACV) antivirális aktivitásával két HSV-1 PAAr5 ACVr törzs esetében, egy KOS mutáns esetében, amely a virális DNS polimerázban egy módosított nukleotid kötési helyet tartalmaz, és DM2.1 esetében, amely virális timidin kináz gén deléciót tartalmaz. Az ISIS 1082 aktivitása ebben a kísérletben megmutatta, hogy az oligonukleotidot nem szükséges foszforilezni a virális timidin kinázzal az aktiváció érdekében, és kimutatta azt is, hogy az oligonukleotid nem lép kölcsönhatásba a virális ·· * ······ ··* ··« • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ···
- 30 DNS polimerázzal a PAA és ACV kötési helynél. Az ISIS 1082 celluláris toxicitásának in vitro vizsgálata kimutatta, hogy az e vegyületre megjósolt terápiás index ekvivalens vagy még jobb, mint az ACV esetében a parallel kísérletnél megjósolt terápiás index. Annak kimutatása, hogy az ISIS 1082 antivirális aktivitást mutat a vírus ACV-rezisztens törzsei esetében is, valamint az, hogy igen kedvező terápiás indexszel rendelkezik, aláhúzza ezen antivirális vegyületek csoportjának potenciális klinikai értékeit.
Kimutattuk, hogy az antiszenz oligonukleotidok gátolják a vírus replikációt a sejtkultúrában. Kevés ismeretünk van azonban az antiszenz oligonukleotidok hatásosságáról a virális fertőzések állatmodelljeinél. Az ilyen vizsgálatokhoz igen jó modell a HSV indukált keratitisz. Az ilyen okuláris HSV fertőzéseket általában topikálisan kezelik, és ily módon relatíve egyszerűen lehet az antiszenz oligonukleotidok hatásosságát in vivő vizsgálni. A hatóanyagot topikálisan vizes oldat formájában adagoljuk, és a fertőzés különböző paraméterei mutathatók ki. Egér modell esetében vizsgáltuk a találmány szerinti foszforotioát antiszenz oligonukleotidok hatásosságát herpeszes keratitisz esetében. Az oligonukleotidot HSV-1 UL13 gén ellen irányítottuk, amelynek szekvenciája a következő: GCCGAGGTCCATGTCGTACGC (ISIS 1082; SEQ ID NO.: 7). Azt tapasztaltuk, hogy ezen anti-UL13 oligonukleotiddal végzett topikális kezelés jelentősen csökkenti a HSV-indukált sztromális keratitisz komolyságát.
A vizsgálatnál az oligonukleotidot három különböző koncent• ·
- 31 rációban alkalmaztuk, és kontrollként puffért használtunk (50 mmól nátrium-acetát, pH = 5,8, 0,15 mól NaCl), és a fertőzést HSV-1 vírussal végeztük. Minden állatnak 1 x 105 plakkos formájú egységet (pfu) adagoltunk a szaruhártya megkarcolását követően. Azt tapasztaltuk, hogy 0,3 % és 1,0 % ISIS 1082 esetében a blepharitis komolysága nem változott, de a 0,3 % és 1 % ISIS 1082-vel végzett kezelés esetében a gyógyulás valamivel gyorsabb volt (7. ábra). Az ISIS 1082-vel végzett kezelés csökkentette a stromális betegséget, és a vaszkularizációt a fertőzést követő 11., 13. és 15. napon (7. ábra). Ez a csökkenés statisztikusan szignifikáns volt bizonyos napokon, de bizonyos napokon nem, feltehetően a minta kicsinysége és a betegség variációs képessége miatt. A dózis és a betegség előfordulásának összefüggése, mint azt a 8. ábrán bemutatjuk, jelzi, hogy az ISIS 1082 egy szűk koncentráció intervallumban hatásos. A betegség előfordulásának 50 %-os csökkenését kiváltó dózis 0,17 % blepharitis, 0,25 % vaszkularizáció és 0,22 % stromális betegségek esetén. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az találmány szerinti antiszenz oligonukleotidok alkalmazhatók HSV keratitisz kezelésére.
A következő nem korlátozó példákkal a találmány szerinti megoldást illusztráljuk közelebbről.
1. Példa
HeLa (ATCC #CCL2) és Verő (ATCC #CCL81) sejteket szereztünk be az American Tissue Culture Collection-től. A HeLa sejtek kultúráit Dulbecco's Modified Essential Medium-ban (D-MEM) tenyésztettük, amelyet még a következőkkel kiegészítettünk:
% magzati szarvasmarha szérum (FBS), penicillin (100 egység/ml) , szreptomicin (100 ^g/ml) és L-glutamin (2 mmól). A Verő sejteket D-MEM közegben tenyésztettük, amelyet a következőkkel egészítettünk még ki: 5 % FBs, penicillin, sztreptomicin és L-glutamin. A Verő sejtekben HSV-1 (KOS törzs) és HSV-2 (HG52 törzs) törzs kultúráit tenyésztettük alacsony fertőzési érték mellett (multiplicity of infection [M01]=0,02 plakk képző egység [pfu]/sejt/sejt).
Annak meghatározására, hogy az oligonukleotidok mily mértékben képesek a HSV replikációt gátolni, fertőzéses vizsgálatot végeztünk. HeLa sejteket 5 x 10$ sejt/lyuk mennyiségben Falcon 6 szövettenyésztő lemezekre ráoltottunk. A sejtekre 3 ml tápközeget (D-MEM + 10 % FBS) rétegeztünk, és 37 °C hőmérsékleten 18-24 órán át inkubáltuk. Ahol szükséges volt, a sejtekre oligonukleotid készítményt rétegeztünk 1 ml tápközegben 24 órával a lemezek beoltása után. 18 órás inkubáció után a lyukakat foszfáttal pufferolt sóoldattal átmostuk, és megfertőztük vagy HSV-1 vagy HSV-2 vírussal különböző mértékben (MOI), a vírusokat 0,5 ml szérummentes D-MEM tápközegben szuszpendálva. A vírust és a sejteket 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk, esetenkénti rázással. A virális abszorpciót követően a nem abszorbeálódott vírust kiöblítettük, a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mosva. Ahol szükséges volt, 1 ml tápközeget (D-MEM + 10 % FBS) adagoltunk, amely 4 μιηόΐ oligonukleotidot tartalmazott, és a sejteket 48 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A kontroll lyukakhoz 1 ml tápközeget adagoltunk, amely oligonukleotidot nem tartalmazott.
A felhasznált oligonukleotidok olyanok voltak, hogy beavatkozzanak akár az UL13, UL39 vagy UL40 mRNS-jeinek transzlációjába a transzlációs iniciációs szakasznál. A nem módosított oligo-dezoxi-nukleotidokat Applied Biosystems 380B DNA Synthesizer felhasználásával szintetizáltuk standard foszforamidit kémiával jóddal végzett oxidációval. A reagenseket mind a CPG-kötésűt, mind a β-ciano-etil-diizopropil-foszforamiditeket az Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) cégtől szereztük be. A standard oxidációs lombikot 0,2 mólos acetonitriles 3H-l,2-benzoditiol-3-on-l,l-dioxid-oldattal [Iyer és munkatársai, (1990), J. Am. Chem. Soc., 112, 125-1254] helyettesítettük a foszfit kötések lépcsőzetes kénezéséhez (tiacsoportok bevitele). A kénezési ciklus várakozási lépését 68 másodpercre növeltük, és ezt egy semlegesítő lépés követte. A CPG-oszlopról való hasítás és 55 °C hőmérsékleten 18 órán át koncentrált ammónium-hidroxiddal végzett deblokkolás után a foszforotioátokat tritil-on HPLC segítségével PRP-1 oszlopon tisztítottuk 50 mmól-os acetonitriles trietil-ammónium-acetát gradiens alkalmazásával pH = 7 értéknél (4 - 32 % 30 perc alatt, folyási sebesség 1,5 ml/perc). A megfelelő frakciókat egyesítettük, bepároltuk és 5 %-os ecetsavval környezeti hőmérsékleten 15 percen át kezeltük. Az oldatot ezután azonos mennyiségű etil-acetáttal extraháltuk, ammónium-hidroxiddal semlegesítettük, fagyasztottuk és liofilizáltuk. Analitikai gél elektroforézist végeztünk a következő paraméterek mellett: 20 % akrilamid, 8 mól karbamid, 45 mmól trisz-borát puffer, pH = 7, 40 V/cm. Az oligodezoxi-nukleotidokat és ezek foszforotioát analógjait HPLC »» » · ♦ · * • ·····» · ♦· ··· • * · · · · ·
- 34 analízissel és poliakrilamid gél elektroforézissel vizsgáltuk, és megállapítottuk, hogy nagyobb mint 95 % teljes hosszúságú anyag.
A foszforotioát és foszfodiészter kötések relatív mennyiségét, amelyet a szintézisünk során nyertünk 31P NMR spektroszkópiával határoztuk meg. A spektrumokat Varian NMR spektrométerrel vettük fel 31P-vel 162 MHz frekvenciánál. Általában 1000 tranzienst adagoltunk egyidejűleg. A tranziensek között 7,5 secos relaxációs késleltetést alkalmaztunk a teljesen relaxált spektrum biztosítására. A 31P spektrumot környezeti hőmérsékleten vettük fel, deutérium-oxid vagy dimetil-szulfoxid-dg mint oldószer alkalmazásával. A foszforotioát minták kevesebb mint 1 % foszfor-diésztert kötést tartalmaztak.
Az előállított szekvenciákat az 1. táblázatban foglaljuk össze.
- 35 Ο ΊΟ «Ρ -Ρ Ν Ν ΊΟ U) 1/1 Ο Ό Ο ·Η Ό -Ρ 44
| ιη | φ | C0 | σι | ο | Η | ||
| ΓΊ | η | C-) | ΓΊ | Ο |
« · ·> · Λ ··· ··· ··· • · · · · · • · · »a *· · · ·
Ρ <0 Ν Μβ rH Λ Μβ Ε<
-Ρ Φ •Η Ν g ΊΟ φ VÖ 6 44 Ν ρ ρ ω ο Φ τι S Ν Ό ω 44 ο ζ
Q Η
Ο Μ ω
| rH | Ν | ΓΊ | V | ιη | χο | Γ' | « |
| Ο | Ο | Ο | ο | ο | ο | ο | ο |
ν m tr ιη νο
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | < | |||
| (ύ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | |
| Ή | 0 | < | < | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| υ e | υ | 0 | Ο | 0 | < | 0 | 0 | |
| Μ φ > | 0 | 0 | < | 0 | Εη | 0 | Ε-· | «5 |
| 0 | Η | 3 | < | 0 | Η | 0 | 2 | |
| 44 | υ | Η | ο | 0 | 0 | 0 | 0 | ο |
| Φ | Ε-< | 0 | &Ί | 0 | Ε< | 0 | ΕΊ | ο |
| Ν ω | 0 | 0 | Η | 0 | 0 | 0 | 0 | Εη |
| Ε« | Εί | Η | Εί | Η | Εί | Η | Ε« | |
| τι | < | < | < | < | < | < | < | |
| Ή — Ρ η | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | ο | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Φ | Ε-ι | Η | 0 | Ε-< | Ε« | Εη | Εη | 0 |
| rH | 0 | < | 0 | < | 0 | < | 0 | Ο |
| η | U | 0 | Εί | < | 0 | 0 | 0 | Ε-ι |
| F-* c | 0 | 0 | Ο | < | Ε« | < | Ε< | |
| Μ 0 | U | 0 | 0 | ο | 0 | 0 | 0 | 0 |
| tp | 0 | < | 0 | 0 | 0 | < | 0 | Ο |
| •Η | &Ί | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| γΗ — | 0 | 0 | 0 | 0 | < | 0 | 0 | Ο |
ο ιη
α 'φ ο
| rH | «Η | r*H | rH | γΗ | CM | OJ | nj |
| CO | Ο | σ\ | Ο | ΓΊ | ΓΊ | ΓΊ | σ\ |
| •Η | ΓΊ | γΗ | γΗ | «Η | η | ||
| PJ | Ρ) | »4 | ι-Ι | ||||
| 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | □ | Ο | Ο |
ιη • · · • *
- 36 A vírusokat a felüllévő tápközegre gyűjtjük, és minden kísérleti ponthoz három lyuk tartalmát egyesítjük, és 3 ml térfogatra egészítjük ki. A szuszpenziót lefagyasztjuk, majd felengedjük, ezt négyszer ismételjük, majd négyszer 20-as méretű tűn áthúzzuk és -80 °C hőmérsékleten 2 ml-es alikvotok formájában tároljuk. Más módszer szerint mindegyik lyukat begyűjtjük, és minden kísérleti ponthoz ismételt titrálásokat végzünk. Ez utóbbi módszert alkalmaztuk az egyes HSV-1 törzseknél a dózis válasz görbe meghatározásához. A vírus mennyiségét (titerét) plakkos analízissel vizsgáltuk Verő sejt monorétegeken. Az egyes vírus készítményeket hígítottuk, és minden hígításból két alikvot részt vettünk ki és Verő sejteken adszorbeáltuk 1 órán át, esetenkénti rázással. Az adszorpció után a vírus inokulumokat a lemezek mosásával eltávolítottuk, a mosáshoz foszfáttal pufférőit sóoldatot alkalmaztunk, majd a sejteket 2 ml D-MEM tápközegre rétegeztük, amely tápközeg még 5 % FBS-t és 0,75 % metil-cellulózt tartalmazott. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 72 órán át inkubáltuk, mielőtt a plakkokat formaiinnal rögzítettük, kristályos violettel festettük és számláltuk. A kezelt lyukakból származó plakkok számát a kontroll lyukakhoz viszonyítottuk, és ily módon megállapítottuk a vírus replikáció gátlásának mértékét.
A 2. táblázatban összefoglaljuk a kapott adatokat. A táblázatban megadjuk a vírus típusát, HSV-1 vagy HSV-2, a fertőzés mérékét (multiplicity of infection, MOI). A kapott kísérleti adatok és a kontroll értékek összehasonlításával megállapítható a replikáció gátlása.
- 37 ·· · · 4 »» • ·Μ «·♦ ··*·♦· « · · * ·· «»· ·· «* ·· **·
2. Táblázat
| Vírus típusa | MOI | Oligomer | Hozam 1 | Hozam 2 | Átlag |
| HSV-1 | 0.5 | nőne | 5.4E+08 | 6.2E+08 | 5.80E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 01 | 6.3E+08 | 7.0E+08 | 6.65E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 03 | 7.7E+08 | 8.0E+08 | 7.85E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 04 | 3.9E+08 | 5.7E+08 | 4.80E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 05 | 7.7E+08 | 9.3E+08 | 8.50E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 08 | 7.9E+08 | 8.9E+08 | 8.40E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 42 | 5.7E+07 | 7.5E+07 | 6.60E+07 |
| HSV-1 | 0.5 | 39 | 1.4E+06 | 1.7E+06 | 1.55E+06 |
| HSV-1 | 0.5 | 41 | 1.2E+06 | 2.6E+06 | 1.90E+06 |
| HSV-2 | 0.5 | nőne | 8.0E+07 | 9.1E+07 | 8.55E+07 |
| HSV-2 | 0.5 | 01 | 7.6E+07 | 8.5E+07 | 8.05E+07 |
| HSV-2 | 0.5 | 03 | 8.3E+07 | 9.5E+07 | 8.90E+07 |
| HSV-2 | 0.5 | 04 | 4.9E+07 | 6.3E+07 | 5.60E+07 |
| HSV-2 | 0.5 | 05 | 6.6E+07 | 7.5E+07 | 7.05E+07 |
| HSV-2 | 0.5 | 08 | 5.1E+07 | 6.2E+07 | 5.65E+07 |
| HSV-2 | 0.5 | 39 | 5.0E+05 | 7.0E+05 | 6.00E+05 |
| HSV-2 | 0.5 | 41 | 3.0E+05 | 7.0E+05 | 5.00E+05 |
| HSV-1 | 0.5 | nőne | 6.0E+07 | 7.6E+07 | 6.80E+07 |
| HSV-1 | 0.5 | 01 | 1.2E+08 | 1.2E+08 | 1.20E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 03 | 1.3E+08 | 1.7E+08 | 1.50E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 07 | 8.9E+07 | 9.5E+07 | 9.20E+07 |
| HSV-1 | 0.5 | 08 | 9.0E+07 | 1.2E+08 | 1.05E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 09 | 1.5E+08 | 1.8E+08 | 1.64E+08 |
| HSV-1 | 0.5 | 35 | 1.7E+07 | 2.0E+07 | 1.85E+07 |
| HSV-1 | 0.5 | 37 | 3.5E+07 | 4.7E+07 | 4.10E+07 |
| HSV-1 | 0.5 | 38 | 5.7E+06 | 7.1E+06 | 6.40E+06 |
| HSV-1 | 0.5 | 40 | 1.7E+09 | 2.1E+09 | 1.86E+09 |
| HSV-1 | 0.05 | nőne | 2.8E+08 | 3.3E+08 | 3.05E+08 |
| HSV-1 | 0.05 | 03 | 3.5E+08 | 4.7E+08 | 4.10E+08 |
| HSV-1 | 0.05 | 07 | 2.6E+08 | 3.2E+08 | 2.90E+08 |
| HSV-1 | 0.05 | 08 | 3.0E+08 | 4.3E+08 | 3.65E+08 |
| HSV-1 | 0.05 | 09 | 3.5E+08 | 3.7E+08 | 3.60E+08 |
| HSV-1 | 0.05 | 35 | 4.2E+05 | 6.0E+05 | 5.10E+05 |
| HSV-1 | 0.05 | 37 | 2.9E+06 | 3.2E+06 | 3.05E+06 |
| HSV-1 | 0.05 | 38 | 2.5E+05 | 3.9E+05 | 3.20E+05 |
| HSV-1 | 2.5 | nőne | 1.5E+08 | 2.5E+08 | 2.00E+08 |
| HSV-1 | 2.5 | 01 | 4.0E+08 | 7.1E+08 | 5.55E+08 |
| HSV-1 | 2.5 | 02 | 6.2E+08 | 7.6E+08 | 6.90E+08 |
| HSV-1 | 2.5 | 03 | 4.0E+08 | 4.3E+08 | 4.15E+08 |
| HSV-1 | 2.5 | 04 | 5.0E+08 | 6.1E+08 | 5.55E+08 |
| HSV-1 | 2.5 | 06 | 5.4E+08 | 6.1E+08 | 5.75E+08 |
| HSV-1 | 2.5 | 07 | 2.9E+08 | 4.1E+08 | 3.50E+08 |
• i ·
- 38 • · · « · · ♦ ··· *· ·· ·« ««·
2. Táblázat (folytatás)
Vírus típusa MOI
| HSV-1 HSV-1 | 0.25 0.25 |
| HSV-1 | 0.25 |
| HSV-1 | 0.25 |
| HSV-1 | 0.25 |
| HSV-1 | 0.25 |
| HSV-1 | 0.25 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 1.5 |
| HSV-2 | 0.15 |
| HSV-2 | 0.15 |
| HSV-2 | 0.15 |
| HSV-2 | 0.15 |
| HSV-2 | 0.15 |
| HSV-2 | 0.15 |
| HSV-2 | 0.15 |
| HSV-2 | 0.15 |
| Oligomer | Hozam 1 |
| nőne | 7.7E+07 |
| 01 | 6.5E+07 |
| 02 | 5.9E+07 |
| 03 | 5.4E+07 |
| 04 | 5.2E+07 |
| 06 | 6.7E+07 |
| 07 | 2.1E+07 |
| nőne | 1.3E+08 |
| 01 | 5.9E+07 |
| 02 | 5.3E+07 |
| 03 | 1.1E+08 |
| 04 | 1.3E+08 |
| 06 | 1.1E+08 |
| 07 | 5.0E+07 |
| 08 | 8.7E+07 |
| nőne | 8.0E+07 |
| 01 | 2.8E+07 |
| 02 | 7.3E+07 |
| 03 | 4.4E+07 |
| 04 | 6.7E+07 |
| 06 | 4.4E+07 |
| 07 | 5.0E+07 |
| 08 | 4.0E+07 |
| Hozam 2 | Átlag |
| 8.4E+07 | 8.05E+07 |
| 7.0E+07 | 6.75E+07 |
| 7.0E+07 | 6.45E+07 |
| 6.4E+07 | 5.90E+07 |
| 7.1E+07 | 6.15E+07 |
| 7.2E+07 | 6.95E+07 |
| 4.3E+07 | 3.20E+07 |
| 1.7E+08 | 1.48E+08 |
| 5.8E+07 | 5.85E+07 |
| 6.4E+07 | 5.85E+07 |
| 1.2E+08 | 1.15E+08 |
| 1.3E+08 | 1.28E+08 |
| 1.2E+08 | 1.12E+08 |
| 5.4E+07 | 5.20E+07 8.70E+07 |
| 8.4E+07 | 8.20E+07 |
| 3.1E+07 | 2.95E+07 |
| 8.5E+07 | 7.90E+07 |
| 5.0E+07 | 4.70E+07 |
| 7.2E+07 | 6.95E+07 |
| 4.8E+07 | 4.60E+07 |
| 5.4E+07 | 5.20E+07 |
| 4.1E+07 | 4.05E+07 |
a táblázatban nőne jelentése: nincs ·· · - w · • ··· V·· ♦····· • · « * · · * ·*· ·· ·♦ ·····
A következő táblázatban összefoglalt adatokat hasonlóképpen nyertük, kivéve hogy a sejteket előzőleg nem 18 órán át, hanem 5 órán át kezeltük az oligonukleotiddal. Bizonyos esetekben, ahol külön jelöljük, nagyobb oligonukleotid koncentrációkat alkalmaztunk.
3. Táblázat
| Vírus típusa | MOI | Oligomer | Hozam 1 | Hozam 2 | Átlag | ||
| HSV-1 | 0.5 | nőne | 6.1E+08 | 6.8E+08 | 6.45E+08 | ||
| HSV-1 | 0.5 | 01 | 6.4E+08 | 7.4E+08 | 6.90E+08 | ||
| HSV-1 | 0.5 | 02 | 6.2E+08 | 6.5E+08 | 6.35E+08 | 8 | μΜ |
| HSV-1 | 0.5 | 03 | 7.9E+08 | 9.0E+08 | 8.45E+08 | 11 | μΜ |
| HSV-1 | 0.5 | 06 | 5.7E+08 | 7.0E+08 | 6.35E+08 | ||
| HSV-1 | 0.5 | 07 | 7.0E+08 | 8.0E+08 | 7.50E+08 | ||
| HSV-1 | 0.5 | 08 | 6.9E+08 | 8.9E+08 | 7.90E+08 | 15 | μΜ |
| HSV-1 | 0.5 | 09 | 6.6E+08 | 8.1E+08 | 7.35E+08 | ||
| HSV-1 | 0.5 | 35 | 4.0E+05 | 5.0E+05 | 4.50E+05 | ||
| HSV-1 | 0.5 | 37 | 1.8E+06 | 1.8E+06 | |||
| HSV-1 | 0.5 | 38 | 3.2E+06 | 3.8E+06 | 3.50E+06 | ||
| HSV-1 | 0.05 | nőne | 6.7E+08 | 8.6E+08 | 7.65E+08 | ||
| HSV-1 | 0.05 | 03 | 7.8E+07 | 9.0E+07 | 8.40E+07 | 11 | μΜ |
| HSV-1 | 0.05 | 06 | 7.6E+07 | 7.7E+07 | 7.65E+07 | ||
| HSV-1 | 0.05 | 07 | 8.4E+07 | 8.4E+07 | 8.40E+07 | ||
| HSV-1 | 0.05 | 08 | 6.5E+07 | 8.3E+07 | 7.40E+07 | 15 | μΜ |
| HSV-1 | 0.05 | 09 | 3.8E+07 | 4.5E+07 | 4.15E+07 | ||
| HSV-1 | 0.05 | 35 | 4.5E+04 | 4.8E+04 | 4.65E+04 | ||
| HSV-1 | 0.05 | 37 | 9.5E+04 | 1.0E+05 | 9.95E+04 | ||
| HSV-1 | 0.05 | 38 | 2.3E+04 | 2.7E+04 | 2.50E+04 | ||
| HSV-2 | 0.5 | nőne | 5.3E+07 | 6.3E+07 | 5.80E+07 | ||
| HSV-2 | 0.5 | 07 | 2.8E+07 | 3.0E+07 | 2.90E+07 | ||
| HSV-2 | 0.5 | 38 | 6.5E+06 | 7.1E+06 | 6.80E+06 | ||
| HSV-2 | 0.05 | nőne | 4.3E+07 | 4.3E+07 | 4.30E+07 | ||
| HSV-2 | 0.05 | 07 | 1.6E+07 | 1.8E+07 | 1.70E+07 | ||
| HSV-2 | 0.05 | 38 | 6.7E+04 | 8.0E+04 | 7.35E+04 |
• · ♦ * 4 Λ9 • ··· ··♦ ·····» • 4 · · · · * ··· *· ·· ····♦
Az előző adatokból látható, hogy a találmány szerinti oligonukleotidok alkalmazásával a vírus replikáció jelentős csökkenése érhető el.
2. Példa
A következő kísérletnél az antiszenz oligonukleotid hatásosságát vizsgáltuk egér modellen okuláris HSV fertőzés esetén, amely oligonukleotid komplementer a HSV-1 UL13 génnel.
Kezelési módszer
Az anti-UL13 oligonukleotidot, amelynek szekvenciája a következő: GCCGAGGTCCATGTCGTACGC (ISIS 1082; SEQ ID NO.: 7), 50 mmól nátrium-acetátot (pH = 5,8) és 0,15 mól NaCl-t tartalmazó pufferban oldottuk, és 4-5 hetes nőstény BALB/c egereknek adagoltuk. Három különböző ISIS 1082 koncentrációt vizsgáltunk, és a kezelést 4 órával a fertőzést követően (pi) végeztük, a fertőzéshez HSV-1 laboratóriumi törzset alkalmaztunk, amely komoly okuláris fertőzést vált ki. A kísérleteknél felhasznált HSV-1 KOS törzset [Grau és munkatársai, Invest. Ophthalmol. vis. Sci., 30:2474-2480 (1989)] 1 x 105 plakk képző egység (pfu) inokulum mennyiségben alkalmaztuk.
A vizsgálandó vegyületek adagolásához az egereket halothane (2,5 %) inhalációval elaltattuk. 10 μΐ mennyiségű oldatot helyeztünk minden szaruhártyára, és a szemet 15 percen át nyitva tartottuk. Az egereket ezután visszahelyeztük a ketrecekbe. A felesleges hatóanyagot nem távolítottuk el. A kezelést 16 órán át minden 2 órában elvégeztük naponta (8 dózis összesen naponta) az első 7 napon át, majd a kezelés második hetében minden 4 órában végeztük a kezelést naponta 16 órán át (4 dózis naponta) .
Az egereket a fertőzés után 30 napon át tartottuk, ekkor a trigeminális gangliát (TG) aszeptikusán eltávolítottuk. A minták felét homogenizáltuk, fagyasztottuk és szárítottuk, ezt háromszor ismételtük, majd meghatároztuk a fertőzött vírusok mennyiségét [Brandt és Grau módszere szerint, Invest. Ophthal mól. Vis. Sci., 31:2214-2223 (1990)]. Minden mintát 600 μΐ mennyiségű sejt tápközegbe helyeztünk a vizsgálat elvégzését megelőzően. Minden vizsgálati ponthoz három egeret alkalmaztunk. A mennyiségeket átlagosan totál log10 pfu per szövet értékben adtuk meg.
A megmaradt mintákat összevagdaltuk, és tenyésztő csészékbe tettük, amelyek Verő sejt monorétegeket tartalmaztak 2 % szérumot tartalmazó tápközegben. A ko-tenyésztést minden második nap figyeltük 2 héten át a citopatikus hatás bizonyítására.
A kezelés hatása az okulárig betegségre
Három különböző dózisú ISIS 1082-t, puffért és kereskedelmi forgalomban beszerezhető trifluor-timidin oldatot (TFT), 1 %, Viroptic, Burroughs-Wellcome) vizsgáltunk. A különböző kezelési csoportokat a 4. táblázatban foglaljuk össze.
4. Táblázat
| Csoport | Állatok száma | Kezelés |
| A | 10 | csak puffer |
| B | 10 | 0,1 % ISIS 1082 |
| C | 10 | 0,3% ISIS 1082 |
| D | 9 | 1,0 % ISIS 1082 |
| E | 9 | Viroptic (1,0 %) |
| F | 10 | Látszat-fertőzés |
| G | 10 | Nincs kezelés |
A 7. ábrán bemutatjuk a kapott eredményeket blepharitis, a szaruhártya vaszkularizációja és stromális keretitisz esetén. A blepharitis először a fertőzést követő 3. napon volt látható az A, B, C, D és G csoportnál, a komolysága növekedett, a csúcsot a 7. napon érte el, majd egy javulás indult meg. A blepharitis mértéke a 7. napon az A, B, C, D és G esetében nem különbözött egymástól szignifikánsan (p > 0,05), jelezve, hogy az ISIS 1082 kis hatással van, vagy egyáltalán nincs hatásai a blepharitis komolyságának kifejlődésére. A blepharitis teljesen a 15. napon gyógyult meg a C és D csoportnál, 28 napig tartott a gyógyulás a B és G csoportnál, míg teljes gyógyulás nem volt kimutatható a D csoportnál. A betegség jelei szignifikáns mértékben különböztek a 15. napon (p > 0,05), az A, B, C, D és G csoportok esetében, jelezve, hogy az ISIS 1082-vel végzett kezelés csökkenti a gyógyulási időt. A TFT esetén (E csoport) szignifikáns blepharitis kialakulása akadályozva volt.
Az ISIS 1082 által okozott gyulladások meghatározására 10 egér esetében 1 %-os ISIS 1082 oldattal látszat-fertőzést végeztünk. A hatóanyagot 7 napon át naponta minden második órában adagoltuk (8 dózis naponta), és a blepharitist naponta értékeltük. Egyik egér esetében sem volt látható blepharitis vagy gyulladás kialakulása. Tehát az ISIS 1082 esetében kimutatható blepharitist (7. ábra) nem a hatóanyag okozta.
A szaruhártya vaszkularizációját először az 5. és 7. nap között figyeltük meg megnövekedett mértékben az A, B, C, D és G csoportnál. A vaszkularizáció legnagyobb értéke a 11. napon volt kimutatható a kezeletlen, fertőzött egereknél (G csoport), kismértékben csökkent a 13. napon, de még mindig elegendően magas értékű volt a fertőzést követő 28. napon (pontérték 1,2). A vaszkularizáció a 13. napon volt a legnagyobb (pontérték 1,7), és magas értékű maradt a csak pufferral kezelt egerek esetében. Az ISIS 1082-vel kezelt egerek esetében a kifejlődött vaszkularizáció a 13. napon volt a legnagyobb, és konstans értékű maradt a 28. napig, függetlenül a dózistól. Azonban az ISIS 1082-vel kezelt egerek esetében a vaszkularizáció mértéke kisebb volt, mint a kezeletlen vagy pufferral kezelt egereknél (0,8 -
1,2 pont, szemben az 1,7 ponttal a 13. napon), jelezve, hogy bár az ISIS 1082 nem akadályozza meg a vaszkularizációt, mégis csökkenti a betegség komolyságát. Enyhe vaszkularációt figyeltünk meg a 15. napon a TFT-vel kezelt egerek esetében (F csoport), de ez is gyorsan kitisztult.
Az A, B, C, D és G csoportok mindegyikénél stromális keratitisz fejlődött ki. A stromális keratitiszt először a 7. és 8.
napon figyeltük meg megnövekedett mértékben, és az A és G csoportok esetében a 11. és 15. napon volt a legnagyobb. Az ISIS 1082-vel kezelt egerek esetében a stromális keratitisz nem ért el maximumot a 15. vagy 21. napig, és kevésbé volt komoly a
11., 13. és 15. napon a kezeletlen vagy pufferral kezelt egerekhez viszonyítva. A TFT-vel kezelt egerek esetében enyhe stromális keratitisz kifejlődését állapítottuk meg a 15. napon, ez a 21. napon kitisztult.
A 11., 13. és 15. napokon kapott adatok időbeli lefutását statisztikus szignifikáns differenciákra vonatkozóan ANOVA teszttel vizsgáltuk a 95, 90 és 85 %-os bizonyossági szinteknél. A kapott eredményeket a következő 5. táblázatban foglaljuk össze.
• · • · ·
- 45 5. Táblázat
Stromális keratitisz
Vaszkularizáció
| 11. | nap | 11. | nap |
| A B C D E F G§ | ABCDEFG | ||
| A | - 0 + + * * 0 | A | - 0 0 0 **0 |
| B | -00** + | B | -00** + |
| C | - 0 # # * | C | -0**0 |
| D | - # + * | D | - * * 0 |
| E | - 0 * | E | - 0 * |
| F | - * | F | - * |
| G | G | — | |
| 13. | nap | 13. | nap |
| ABCDEFG | ABCDEFG | ||
| A | - 0 + 0 * * 0 | A | - 0 + # * * 0 |
| B | - 0 0 * * 0 | B | - 0 # * * 0 |
| C | - 0 0 0 * | C | - 0 # + * |
| D | - 0 # * | D | - + * + |
| E | - 0 * | E | - 0 * |
| F | - * | F | - * |
| G | - | G | - |
| 15. | nap | 15. | nap |
| ABCDEFG | ABCDEFG | ||
| A | - 0 * 0 * * 0 | A | - 0 * 0 * * 0 |
| B | - # 0 * * 0 | B | - 0 0 * * 0 |
| C | - 0 0 0 * | C | -00#* |
| D | - + * 0 | D | - # * 0 |
| E | - 0 * | E | - 0 * |
| F | - A | F | - * |
| G | - | G |
* = 95 % bizonyság + = 90 % bizonyság # = 85 % bizonyság
Blepharitis
11. nap
A B C D E F G A -000**0 B - 0 0 # + 0
C - 0 0 0 +
D - + * 0
E - 0 *
F - *
G
13. nap
A B C D E F G A - 0 # + * * 0 B - 0 0 + * 0 C - 0 0 0 # D -00 + E - 0 * F - * G
15. nap
ABCDEFG
A - 0 * * * *0
B - * * * *o
C - 0 0 0+
D“00#
E- 0 #
F- + • ·· ·* · · · ·· • · · · · · * • ··· · · · · · · ··· • · · · · ·
- 46 Ezzel a vizsgálattal kimutattuk, hogy a 0,3 %-os és 1,0 %os ISIS 1082 oldattal végzett kezelés szignifikánsan csökkenti a stromális keratitisz és a szaruhártya vaszkularizációjának mértékét a 11., 13. és 15. napon a kezeletlen vagy pufferral kezelt egerekhez viszonyítva. Bizonyos esetekben a betegség szignifikánsan különbözik az egyik napon, de nem különbözik a másik napon. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy csoportok, amelyek között szignifikáns differencia kellett volna hogy legyen, nem volt található. így például a stromális keratitisz a 0,3 %-os ISIS 1082 oldattal kezelt egereknél szignifikánsan különbözött a pufferral kezelt egerektől a 15. napon, de az 1 %-os ISIS 1082 oldattal kezelt egerek esetében nem volt ilyen szignifikáns differencia, bár a két csoportnál a betegség előfordulás hasonló volt. Ezen nehézségeket, amelyek az adatok statisztikus értelmezésével kapcsolatban léptek fel, a betegség előfordulás variációs tulajdonságai okozták, amely ilyen típusú tanulmányozásoknál általában előfordul, továbbá a minta nagysága.
A kezelés hatása az in vivő replikációra
Egereket 1 x 105 pfu mennyiségű HSV-1 KOS törzssel megfertőztünk, és a fertőzést követő 1., 2., 3., 6., 8. és 10. napon eltávolítottuk a szemet, a TG-t és a szemhéjat, és meghatároztuk a fentiekben leírtak szerint a fertőzés mértékét. A kapott eredményeket a következő 6. táblázatban foglaljuk össze.
Szem titerek+
Csop. Kezelés Nap
| Zx | Z—X | Z“^ | z·^ | |||
| CM | CM | CM | CM | CM | CM | |
| X | X | X | X | X | X | |
| o | O | o | o | O | O | |
| Kz4 | o | K_Z | o | |||
| o | o | o | o | o | o | |
| 4·^ | ||||||
| n | CM | n | CM | n | « | |
| X | X | X | X | X | X | |
| o | CM | o | H | o | o | |
| X»z | xz | *Z* | x—z | |||
| o | CO | o | Cl | o | o | |
| Cl | tn | |||||
| • | • | |||||
| rH | CM | |||||
| Γ) | (*) | n | γί | γί | r> | |
| X | X | X | X | X | X | |
| n | CM | CM | CM | γί | ||
| Ke* | kZ | N-/ | o | »kZ | ||
| in | CO | CO | rM | o | ||
| v> | tn | rH | VD | |||
| • | • | « | • | • | + | |
| CM | CM | CM | Γ) | CM | ||
| Φ | ||||||
| 4—S | 4-¼ | <—» | /—A | 4—X | 4“X | Φ |
| ΓΊ | cn | γί | CM | γί | cn | 4J |
| X | • | X | X | X | X | |
| n | CM | n | rH | o | CM | «μ |
| %-z | s_4 | ^-4 | ||||
| in | t' | ΓΊ | o | xy | •o 'Φ | |
| XT | Cl | γί • | ’T | 10 | ||
| CM | D | n | CM | n | Λ e φ | |
| N | ||||||
| Z»» | z·*. | z*. | Z^k | zs | ω | |
| n | r> | γί | r> | r> | γί | |
| X | X | X | X | X | X | |
| r> | n | ΓΊ | CM | γί | ||
| *—4 | \z | x—z | ^z | X«4 | ||
| Γ' | r· | Cl | CO | |||
| *3· | o | CM | rH | Cl | CM | |
| -M* | r> | CM | ||||
| « | ||||||
| z·^ | ZX | z·^ | 4-^ | |||
| r> | cn | n | CM | γί | cn | |
| X | X | X | X | X | X | |
| r> | cn | <n | CM | n | γί | |
| X.Z | SeZ | XkZ* | X—4 | S-4 | ||
| vo | n | CO | 10 | ** | 10 | |
| cn | n | ΓΊ | o | o | ||
| n | ΓΊ | ’T | ||||
| CM | CM | CM | ||||
| io | CO | CO | ||||
| o | O | o | ||||
| H | rM | rM | ||||
| 1 | « | 1 | H | |||
| w | w | ω | u< | |||
| L | H | H | H | cn | ||
| V | ||||||
| <u | Z | 44 | 44 | 44 | ω | |
| H | n | O | O | c | ||
| J5 | • | • | • | • | •r~< | |
| Q_ | o | o | H | t-4 | z | |
| <c | ® | U | Q | u | ü |
| CM X ο ^4 ο | CM X ο ο | CM X ο ο | ζ—. CM X ο ο | CM X ο ^ζ* ο | ζ^ CM X ο ο |
| ζ^ | |||||
| η | ο | η | <Μ | CM | CM |
| X | X | X | X | X | X |
| rH | •Η | CM | ο | Ο | ο |
| νζ | χ-ζ | Χζ» | *ζ* | ||
| \ο | C0 | Ο | ο | ο | ο |
| rM | r* | CM | |||
| • | • | • | |||
| CM | ο | CM | |||
| η | η | ΓΊ | η | η | η |
| X | X | X | X | X | X |
| CM | ο | CM | γΜ | Ο | rH |
| Χ-4» | %ΙΖ* | χζ | •^ζ | ||
| \0 | Ο | CM | Ο | ο | Ο |
| Ο | Γ* | 10 | |||
| • | • | • | • | ||
| rM | ΓΊ | CM | ο | ||
| ζ-^ | |||||
| γί | ΓΊ | CM | η | CM | CM |
| X | X | X | X | X | X |
| •Η | rH | ΓΜ | γΜ | Ο | r-1 |
| *—* | ΧΖ | ΧζΖ | ^ζ» | *~ζ | SzZ |
| \0 | ΓΊ | CM | ιη | ο | C0 |
| ιη | ω | σ\ | τΤ | ||
| • | • | • | • | • | |
| η | γΗ | η | η | ο | |
| ζ—. | *—> | ζ^ | |||
| γί | η | η | η | η | CM |
| X | X | X | X | X | X |
| 1-Η | Ο | Ο | CM | Ο | rH |
| %-ζ | χζ· | ^ζ | ^ζ | ^4 | |
| χο | Ο | Ο | η | ο | ΓΊ |
| ο | Η | ||||
| « | • | • | |||
| CM | CM | CM | |||
| Z-fc | ζ^. | ζ^ | |||
| η | η | η | η | η | η |
| X | X | X | X | X | X |
| ιΗ | ο | ο | ο | ο | Ο |
| χζ | 'Χ-Ζ | ν-ζ | Χζ* | ||
| Η | Ο | Ο | ο | ο | Ο |
| Γ* | |||||
| • | |||||
| CM | |||||
| CM | CM | CM | |||
| C0 | C0 | C0 | |||
| ο | ο | ο | |||
| r—< | rH | γΜ | |||
| 1 | 1 | 1 | F· | ||
| W | ω | ω | u< | ||
| U | Η | Η | Η | Η | |
| φ | ω | ||||
| <Μ | 44 | 44 | 44 | 44 | ο |
| ΜΜ | <1 | η | ο | Ο | c |
| J5 | • | • | • | • | C—< |
| Q- | Ο | Ο | rH | Η | |
| < | m | υ | ο | Μ | 0 |
| rM | Ν | η | Οί | Γ4 | Ν |
| X | X | X | X | X | X |
| ο | ο | ο | ο | ο | Ο |
| Χ-Ζ | ΧΖ | Χ-* | Χ-* | ||
| Ο | ο | Ο | ο | ο | ο |
| ζχ | ^χ | χχ | ΖΧ | XX | |
| η | Μ | η | <Ν | η | Μ |
| X | X | X | X | X | X |
| Ν | η | CS | ο | ο | ο |
| χ^ | XX | ^χ | χ-* | χχ | |
| ιη | 10 | ts | ο | ο | ω |
| r* | 10 | η | |||
| • | • | • | • | ||
| π | <Ν | Ν |
Trigeminális ganglia titerek
| *-χ | ζχ | ζ·χ | |||
| η | η | ΓΊ | η | η | η |
| \ | X | \ | X | X | X |
| Γ> | r> | rH | Μ | «Η | η |
| χ^* | S—ζ | χ«ζ | χ-ζ | Χ»Ζ | |
| σι | Ο | Φ | ο | σι | |
| Γ* | η | η | Φ | η | α> |
| • | • | • | • | • | • |
| Μ | η | ο | Οί | ο | η |
<N X a H
N
| η | OJ | Γ> | η | η |
| X | X | X | X | X |
| Ο | rH | Ο | Ο | rH |
| ΧχΖ | χ·* | XX | χ-* | |
| ο | φ | ο | ο | ω |
| na | ιη | |||
| • | • | |||
| Γϊ | CM |
| <*» | ζ-χ | χχ | Ζ»Χ | ||
| <Ν | η | η | η | Γ» | η |
| X | X | X | X | X | X |
| ο | ο | ο | Ο | ο | ο |
| χ-ζ | χζ | X.>* | Χ-* | χ-* | Χ-Ζ |
| ο | ο | Ο | Ο | ο | ο |
| ζ*χ | ζΧ | ζ«χ | ζ-χ | ||
| η | Γ) | η | Γ> | Γ> | η |
| X | X | X | X | X | X |
| ο | ο | ο | ο | ο | ο |
| χ»χ | Χζ | χ-ζ | X—* | ΧμΖ | χ-ζ |
| ο | ο | ο | ο | Ο | ο |
| (Μ | <Μ | (Ν | ||
| 0 | 0 | 0 | ||
| Ο | Ο | Ο | ||
| <—< | Η | «Η | ||
| 1 | 1 | 1 | Α | |
| 0 | 0 | ω | Ε | |
| ti | Μ | Η | Η | & |
| CD ςμ_| | <* | Ζ> | <* | * 2 |
| Ψ-Ι | r-{ • | Π • | ο • | °. C. |
| □ 0_ | ο | ο | Η | |
| < | 0 | υ | ο | Μ Ο |
rO C
C (U Λ νβ σ>
Π5 γΗ Ρ '<0
Ρ r—i
L. νθ 'Φ σ> σ> ω Φ Ν •Η cn >
χ · οο rd C ο > pH \Η Ρ b ·Η Μ Ν Λ Ο Λ
Ν
Φ · ω ο :Ο X + * • ·
- 49 Dózis válasz az ISIS 1082-re
A 7. ábrán bemutatott eredmények mutatják, hogy a hatóanyag dózisa bizonyos befolyással van az okuláris betegségre. A 8. ábrán látható a hatóanyag dózisa a betegség előfordulásának függvényében blepharitis, vaszkularizáció és stromális keratitisz esetében a 11., 13. és a 15. napon a fertőzés után. Általában a betegség komolysága csökkent 0,3 és 1,0 % ISIS 1082 dózis esetén. A magasabb dózisú ISIS 1082 (1 %) nem tűnt hatásosabbnak, mint az alacsonyabb dózis (0,3 %). Az 5 % ISIS 1082 tartalmú oldat antivirális hatását az alacsonyabb koncentrációkhoz viszonyítva HSV-1, KOS törzs esetén egér okuláris modellnél stromális keratitiszre vonatkozóan a 9. ábrán mutatjuk be. Mint látható, az 5 %-os ISIS 1082 oldat jelentős mértékben növeli a betegség átlagos jeleit stromális keratitisz esetében a 11. pi napon. A betegség csökkenése 5 %-os oldat esetében nagyobb volt, mint a 0,3 %-os oldat esetében, aminél viszont nagyobb csökkenés mutatkozott, mint a 0,1 %-os oldat esetében. EZ a dózisfüggő hatásosság hasonló a korábbi kísérletek eredményeihez, amit a 7. és 8. ábrákon foglaltunk össze.
Lappangási idő meghatározása
A hatóanyaggal való kezelés hatását a lappangási időre szintén visgáltuk. A TG-t a 28. napon a fertőzés után eltávolítottuk. A szövet felét vizsgáltuk közvetlenül a fertőző vírusra, és a megmaradó mintát ko-tenyésztettük verő sejteken a reaktiválható latens fertőzés meghatározására. A szövetek egyike sem volt pozitív, ha közvetlenül vírusra vizsgáltuk. Mint az a ·«·
7. táblázatból látható, az 1 % TFT-vel kezelt egerekből származó
TG egyike sem volt pozitív a reaktiválható vírus szempontjából. A
TG-ben reaktiválható vírust mutattunk ki minden egyéb kezelt csoport esetében. A ko-tenyésztés 14. napján a minták 60-100 %-a volt pozitív.
7. Táblázat
| Csoport | Vírus | Kezelés | Reaktiválás | |
| 7. nap | 14. nap | |||
| A | + | puffér | 3/5# (60)§ | 3/5 (60) |
| C | + | 0,3% IS-1082 | 3/5 (60) | 5/5 (100) |
| D | + | 1,0 %IS-1082 | 3/5 (60) | 4/5 (80) |
| E | + | TFT | 0/5 (0) | 0/5 (0) |
| F | - | nincs | ND* - | ND* - |
| G | + | nincs | 3/5 (60) | 4/5 (80) |
Napok száma a ko-tenyésztés után # No. pozitív/No. vizsgált * nincs vizsgálat § a pozitív minták %-a
3. Példa
A különböző oligonukleotidok hatása a HSV fertőzésre
Különböző oligonukleotidok hatását vizsgáltuk a HSV replikációra fertőzési vizsgálat alkalmazásával, amit általánosságban az 1. példában írtunk le.
A HSV-1 PAAr^ és Dm.2.1. törzseket a Burroughs Wellcome
Company-tól szereztük be.
A HSV-1 és HSV-2 UL13 RNS-sek in vitro szintéziséhez felhasználásra kerülő plazmidokat a HSV gének megfelelő részeinek a pSP72 transzkripciós vektor (Promaga Corporation) polilinker szakaszának KpnI és BamHI restrikciós endonukleáz helyeire való klónozásával állítottuk elő. A pIP-1 plazmidba való inszertált rész a HSV-1 DNS 3245 nukleotid KpnI-BglII fragmenséből áll, amelyet a plBOl plazmidból vettünk (ezt a plazmidot S. Weller, University of Connecticut Health Center, Farmington, CN bocsájtotta rendelkezésünkre), amely plazmid a DNS HSV-1 BglII fragmensét tartalmazta. A KpnI-BglII fragmens kódoló szekvenciákat tartalmaz, amelyek a +68 nukleotidnál az 5' részen belül és a HSV-1 UL13 mRNS nem-transzIáit részével kezdődnek, keresztezik az UL13 proteint kódoló teljes nyitott leolasási keretet, és az UL13 mRNS-en belül a +3313 nukleotidnál végződnek. A pIP-2 plazmid inszertuma a HSV-2 DNS 1684 nukleotid KpnI-Bam Hl fragmenséből áll, amelyet a BEDJ plazmidból vettünk, amelyet E. Wagner (University of California, Irvine, CA) bocsátott rendelkezésünkre, és amely az UL13 génnel homológ HSV-2 kódoló szakaszát tartalmazza. A KpnI-BamHI fragmens kódoló szakaszokat tartalmaz, amelyek az 5' részen belül a +68 nukletoiddal és a HSV-2 mRNS nem-transzIáit részével kezdődnek, keresztezik az UL13 proteint kódoló teljes nyitott leolvasási keretet, és az UL13 mRNS-én belül a +1752 nukleotidnál végződnek. A pIP-1 és pIP-2 plazmidokba inszertált HSV DNS inszertumok úgy vannak orientálva, hogy a plazmidokon belüli T7 promoterről induló transzkripció virális szenz-szál transzkriptumokat
- 52 biztosít.
A transzkripciós reagenseket a Promega Corporation-től szereztük be, és a gyártó cég előírásai szerint jártunk el. A pIP-1 és pIP-2 RNS-ek előállításánál, amelyek a HSV-1 és HSV-2 UL13 leolvasási kereteket kódolják, a pIP-1 és pIP-2 plazmidokat linearizáltuk Xbal enzimmel végzett emésztéssel, amely a DNS szekvenciák egyedülálló 3' helyénél hasítanak, és amely szekvenciákat a pSP72 plazmidba klónoztuk. Ezeket a linearizált plazmidokat alkalmaztuk templátként a T7 RNS polimerázzal való in vitro transzkripcióhoz. Az in vitro transzkriptumokat a templát DNS RQ1 DNS-ázzal való emésztéssel tisztítottuk (20 perc, 37 °C), kétszer extraháltuk fenol/kloroform/izoamil-alkohol = 25:24:1 eleggyel, egyszer kloroform/izoamil-alkohol = 24:1 eleggyel, majd 3,75 mólos ammónium-acetát és 70 %-os etanol eleggyel kicsaptuk, majd dietil-pirokarbonáttal (DEPC)-kezelt vízben reszuszpendáltuk. Az RNS készítmények integritását és tisztaságát egy alikvot rész denaturált formaldehid agaróz gélen végzett elektroforézissel igazoltuk standard eljárások szerint.
Az in vitro transzlációs reagenseket a Promega Corporationtől szereztük be. A transzlációs reakcióban a következő reagenseket alkalmaztuk: 120 ng megfelelő RNS minta, 4 μΐ nyúl reticulocyta lizátum, 1 μΐ metionin-mentes aminosav keverék, 1 μΐ [35S] metionin (5 μϋί > 1000 Ci/mmól, New England Nuclear), ez összesen 12 μΐ. A transzlációs keveréket 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A transzláció után 12 μΐ transzlációs keveréket elkevertünk 12 μΐ 2x Laemmli Loading Pufferral (lx = ·«· ··· · • · · ·
- 53 88 trisz-HCl, pH = 6,8; 2 % nátrium-dodecil-szulfát [SDS]; 5,0 % β-merkapto-etanol; 10 % glicerin; 0,001 % bróm-fenol-kék); a keveréket forró vízfürdőn 10 percen át melegítettük, majd az in vitro transzlációs terméket elektroforézissel 10 % poliakrilamid-SDS (Laemmli) gélen elektroforizáltuk. A kapott gélt vákuumban szárítottuk, majd autoradiográfiát végeztünk Kodak XRP-5 filmmel. Az in vitro transzlációhoz alkalmazott RNS mintákat 1 órán át 37 °C hőmérsékleten előinkubáltuk oligonukleotiddal és oligonukleotid nélkül, közvetlen a transzlációs keverékhez való adagolás előtt.
Az oligonukleotidokat automatizált DNS szintetizátoron (Applied Biosystems model 380B) szintetizáltuk foszforamidit kémiával az 1. példában leírtak szerint. A foszforotioát oligonukleotidok előállításához a kénezést minden kapcsolás után végeztük 0,2 mól 3H-1,2-benzoditiol-3-on-l,1-dioxid acetonitriles oldatával Beaucage és munkatársai szerint [Ann. N.Y., Acad. Se. (1989)]. A teljes kénezés biztosítására a növekvő oligonukleotid molekulákat minden kénezési lépés után semlegesítés céljából kezeltük. A metil-foszfonát oligonukleotidok előállításához szükséges metil-foszforamidit bázisokat a Glen Research Corporation-től szereztük be. Minden oligonukleotidot liofilizálással tisztítottunk, és két etanolos kicsapást végeztünk a felhasználás előtt. Az oligonukleotid készítmények tisztaságát és integritását akrilamid gél elektroforézissel határoztuk meg.
A klonogén vizsgálatoknál minden kísérleti ponthoz Hela sejteket (2000 sejt 5 ml DMEM-10 % FCS-ben) oltottunk három « · *
- 54 párhuzamossal 60 mm2 nagyságú szövettenyésztő lemezekre, és 18 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Egy éjszakán át végzett inkubálás után a sejtekre 1,5 ml friss tápközeget rétegeztünk, amely vagy ISIS 1082-t vagy Acyclovir-t tartalmazott, és 3 napon át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A hatóanyaggal való kezelés után a sejtekre friss tápközeget rétegeztünk, és 6 napon át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk a fixálás és a kristály-violettel való festést megelőzően. A vegyületek Hela sejtekre kifejtett toxikus hatás meghatározásához a festett sejteket számláltuk, majd összehasonlítottuk a sejtszámokat a kezeletlen Hela sejteket tartalmazó párhuzamos tenyészetekkel.
A különböző nukleotid szekvenciákat és váz kompozíciókat tartalmazó különböző oligonukleotid készítmények antivirális aktivitását az ISIS 1043 tartalmú készítmény inhibiciós hatásával hasonlítottuk össze, amelyről kimutattuk, hogy in vitro anti-HSV akivitása van. Az oligo-dezoxi-ribonukleotid szekvenciákat, ezek célzott mRNS szakaszait és a vizsgált oligonukleotidok váz összetételét a 8. táblázatban foglaljuk össze.
• · ·· ·· ···· • * · · ♦ ··· ··· ··· ··· » « * « · · « ·· ·· ·* «·
- 55 r>
>4 (0 X Ό
| x> | •rH | ||||||||||||||
| >1 | H | N | rH | N | <H | Cí | H | Oí | N ü | ||||||
| r—( | c | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | >41 MŰ | |||||
| φ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | r-H | |
| a | x | x | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | • M | |
| < | < | < | < | < | < | < | < | < | < | < | < | C U) | |||
| Φ c | |||||||||||||||
| c | co | r> | o\ | o | r> | r> | n | M | O\ | o | r> | n | r> | Λ kJ | |
| \φ | T? | <H | n | Ti | rH | rH | rH | rH | r> | Ti | rH | rH | rH | 1 P | |
| 0 | P) | A | »4 | .4 | ►3 | .4 | |4 | ►4 | >4 | t4 | X | CO -P | |||
| X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X E C · | ||
| 0 rH | |||||||||||||||
| cn W mű HOC | |||||||||||||||
| rH | i4 | r4 | rH | rH | o | Oi | rH | rH | rH | rH | CH | η | i4 <0 /4 | ||
| r—( \φ | 1 > | 1 > | > | > | 1 > | 1 > | 1 > | 1 > | > | 1 > | 1 > | l > | > | X Η '0 (0 «rH | |
| U | co | co | <0 | co | co | CO | CO | co | co | w | ω | W | w | ΟΝ Ο cn kJ ><mö | |
| X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | x . | |||
| Ο frlrH | |||||||||||||||
| • · | H c Φ N | ||||||||||||||
| • | — ο ω | ||||||||||||||
| o | Ό >H X | ||||||||||||||
| a | 4· 0 Η (Ű ιο Φ μ | ||||||||||||||
| Q | Ή Ε -Ρ | ||||||||||||||
| P | H | N | in | Φ | 1 (0 Φ | ||||||||||
| kJ | rH | r> | *r | Γ' | M | n | in | Φ | t | ΗΟ 0 | |||||
| N | & | m ·η - ρ | |||||||||||||
| 'KJ | a | η υ c -Ρ | |||||||||||||
| rH | ω | MQ 0 -Η | |||||||||||||
| A | —· | ••Η Ό > | |||||||||||||
| MŰ | η υ Ο | ||||||||||||||
| H | η·η λ; c | ||||||||||||||
| C ·Η | |||||||||||||||
| • | •·Η W | ||||||||||||||
| co | 0 | < | 0 | υ | 0 | o | 0 | < | 0 | 0 | 0 | 0 | U) Ό Ν | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | o | Ο | 0 | 0 | Φ W -<η kJ | |||
| 0 | 0 | < | Jí | υ | 0 | 0 | 0 | < | O | 0 | 0 | «Ό 0 | |||
| 0 | U | 0 | < | 0 | < | 0 | 0 | 0 | < | 0 | < | •Η MŰ rH | |||
| ο | O | «§ | O | Eh | 0 | Eh | 0 | < | 0 | Eh | 0 | Eh | rH 0 -rHO | ||
| o | Eh | < 0 | < | 0 | Eh | 0 | Eh | < | < | 0 | EH | 0 | (0 MŰ 0 Q | ||
| u | H | u | 0 | 0 | 0 | Eh | 0 | 0 | 0 | 0 | Ο | Ρ Η ·Η | •Η Ν C C0 > V) ·Η Ζ | |||
| Eh | 0 | Eh | 0 | Eh | U | Eh | 0 | Eh | 0 | Eh | 0 | Eh | |||
| 0 | 0 | Eh | 0 | 0 | U | 0 | 0 | Eh | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| KJ | H | H | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | ||
| < | < | < | < | < | < | < | < | < | < | < | < | •rH C Ρ5 | |||
| •H | 0 | U | 0 | 0 | 0 | 0 | U | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | -Ρ <0 ω Ε | |
| O | 0 | 0 | 0 | U | 0 | U | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | G Ρ '0 | |
| C | H | Eh | 0 | Eh | Eh | Eh | Eh | Eh | 0 | Eh | Eh | Eh | Eh | < ρ ·γ| Μ | |
| Φ | U | < | 0 | < | 0 | < | 0 | 0 | < | 0 | < | 0 | 0 ΓΗ | ||
| > | U | 0 | A | < | 0 | 0 | 0 | 0 | Eh | 2 | 0 | 0 | 0 | - ρ Μθ μ4 | |
| * | Ο | Eh | 0 | 0 | < | Eh | < | Eh | 0 | o | < | Eh | < | •Η φ Η Ρ | |
| Φ | U | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | KJ Ε Ν | |
| N | 0 | < | 0 | 0 | 0 | < | 0 | < | 0 | 0 | 0 | < | 0 | 10 ·Η (Λ Ν | |
| CO | Eh | 0 | 0 | 0 | U | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Ρ Ρ C (Ö | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | < | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | < | 0 | 0 | MŰ (X Φ -Ρ Ρ Ρ» | ||
| Φ Φ -Ρ Ή X C Η Λί C 5 1 Η κί Ε 0 Ό Ρ | |||||||||||||||
| N | O | O | O | O | O | O | O | W | CO | W | CO | CO | CO | 0 0-rH | |
| vű | II | II | II | II | II | II | II | II | II | II | II | II | II | w < ω | |
| > | X | X | Λ | x | 0« | X | X | x | X | X | X | X | X | 'Φ mű .ρ | |
| η g ίο | |||||||||||||||
| PH Μβ Φ >4 Φ -Ρ | |||||||||||||||
| ÍXX ·Η | |||||||||||||||
| O | Φ <Ν > | ||||||||||||||
| tn e | r> | in | 10 | cn | 0 | Ρ Ν 1 -Ρ | |||||||||
| •H MŰ | r~ | co | co | o | rH | n | Q < 0 -Ρ | ||||||||
| rH N | Ti | Tf | TÍ | Ti | ΤΪ | TT | nr | r-' | 0 | 0 | 0 | X Λ4 Φ Λ < Φ | |||
| O 10 | o rH | o fH | O rH | o rH | O rH | o rH | o rH | o rH | o rH | o rH | o rH | O rH | o rH |
• I» · · 4
444 ··· *·· ··· « « 4 · · · «« 4· ·* ···
Ezen aktivitás meghatározásokhoz 0,5 pfu/sejt virális koncentrációt alkalmaztunk. A HSV-1 és HSV-2 antivirális aktivitásának összehasonlítását a 10. ábrán mutatjuk be. A P=0 vázakat tartalmazó oligonukleotidok antivirális hatásának összehasonlítása azt mutatja, hogy a HSV fertőzések csökkenése függ mind az alkalmazott HSV altípustól, mind az oligonukleotid szekvenciától. A legszélesebb antivirális aktivitást az ISIS 1049 esetében mutattunk ki. Meglepetésszerűen az ISIS 1047, amelynek nukleotid szekvenciája az ISIS 1049 szekvenciájától csak az 5' terminális bázisban különbözik, nem volt olyan hatásos, mint az ISIS 1049 a fertőzés mértékének gátlásában. Bár a P=0 oligonukleotidok esetében megfigyelt inhibiciós trend konzisztens volt minden kísérletnél, az inhibiciós aktivitás tényleges mértéke jelentős mértékben különbözött (például az ISIS 1049 volt mindig a legjobb inhibitor a HSV replikációnál, de az inhibició mértéke a 18 % alacsony értéktől a 63 % magas értékig terjedt az öt kísérlet során). Azt tapasztaltuk, hogy ez az eltérőség elsősorban azon hőmérséklet különbségeknek tudható be, amelynél a magzati borjúszérumot (SCS) hőkezeltük. Az 1. ábrán bemutatott inhibiciós szinteket olyan SCS mellett kaptuk, amelyet 65 °C hőmérsékleten hőkezeltünk. A szérumnak ezt a kezelését standardizáltuk minden következő kísérlet számára.
A P=0 oligonukleotid vázszerkezet P=S szerkezetté való átalakítása nagymértékű anti-HSV aktivitás növekedést eredményezett minden új, vizsgált oligonukleotid esetében (10. ábra). A P=O oligonukleotidoknál megfigyelt szérum hatással ellentétben és a P=S oligonukleotidoknak a szérum nukleázzal való emésztés- 57 sel szembeni megnövekedett ellenállásával egyezően, azt találtuk, hogy a P=S oligonukleotidok inhibiciós aktivitása független az FCS hőkezelésénél mutatkozó különbségektől.
A virális koncentráció hatása a HSV-1 replikációra ISIS 1082 esetén
A kezdeti virális koncentráció vagy terhelés hatását az
ISIS 1082 antivirális aktivitására fertozéses vizsgálattal határoztuk meg. A sejteket 0,05, 0,1, 0,25, 1 vagy 2,5 pfu/sejt koncentrációval fertőztük 4 μιηόΐ mennyiségű ISIS 1082 jelenlétében, vagy ISIS 1082 nélkül. Az ISIS 1082-t azért választottuk ehhez a kísérlethez, mivel analógjának az ISIS 1049-nek igen széles anti-HSV aktivitása van, valamint megnövekedett nukleázrezisztenciával rendelkezik a P=S oligonukleotidoknak megfelelően. A HeLa sejtek HSV-1 fertőzésével, amelyekhez a fenti koncentrációkat alkalmaztuk, csupán háromszoros fertőző vírustermelést kaptunk a legalacsonyabb (0,05 pfu/sejt) és a legmagasabb (2,5 pfu/sejt) koncentrációk között annak ellenére, hogy a fertőzés mértéke 50-szeres volt (lásd 9. táblázat).
9. táblázat
| Bevitt fertőzés (pfu/sejt) | ISIS 1082 | Kapott vírus mennyisége (pfu/ml) | % Kontroll Kihozatal |
| 2.5 | - | 58.5 + 5.5 x 107 | |
| + | 56.5 + 6.0 X 106 | 9.7 | |
| 1.0 | - | 46.0 + 4.0 x 107 | |
| + | 44.5 + 0.5 X 106 | 9.7 | |
| 0.5 | - | 42.0 ± 7.0 x 107 | |
| + | 71.0 + 3.0 X 105 | 1.7 | |
| 0.25 | - | 35.0 + 3.0 X 107 | |
| + | 11.1 ± 0.5 X 10® | 3.2 | |
| 0.1 | - | 35.0 + 1.0 X 107 | |
| + | 18.5 + 3.5 x 105 | 0.5 | |
| 0.05 | - | 19.5 + 0.5 X 107 | |
| + | 15.5 ± 3.5 X 10s | 0.8 |
a A kísérleteknél HSV-1 (KOS törzs) vírust alkalmaztunk.
Ugyanezen koncentráció-tartományban az ISIS 1082 antivirális hatása az alacsony 90,3 %-os gátlási értéktől, amelyet 1,0 pfu/sejt-nél mutatott, a magas inhibiciós szintig (99,5 %) terjedt, amelyet 0,1 pfu/sejt esetében mutatott. így ha a vírus koncentráció 0,1 és 1,0 pfu/sejt közötti érték, a termelt fertőző vírusok mennyisége nem mutat egyszerű matematikai összefüggést a bevitt vírusok számával. Az ISIS 1082 antivirális hatása azonban fordítottan arányos a bevitt vírus mennyiségével, az egész koncentráció tartományban.
A vázösszetétel hatása az oligonukleotidok antivirális aktivitására
A vázösszetétel hatását az oligonukleotidok antivirális aktivitására három oligonukleotid szekvencia különböző analógjainak összehasonlításával vizsgáltuk. Az ISIS 1047 nukleotid szekvenciáját és ezen szekvencia rövidített változatát, amely az ISIS 1301-ben található, P=0, P=S és MeP vázakkal szintetizáltuk. Ezen oligonukleotidok antivirális aktivitását fertőzéses vizsgálatban vizsgáltuk, és összehasonlítottuk Kulka és munkatársai által ismertetett MeP oligonukleotidok hatásával [Kulka et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6868-6872] (lásd 10. táblázat).
σΡ Λ CM I > w (SEQ ID NO.:) Szekvencia Oligo Váz- Kontroll kihozatal· <e
i > cn
X (U cn 'Φ P :o
X t—<
| rí in in rí σι σι | rH 0 ρ | Ρ | Ρ Ό •d | X 'φ Ρ | |||||
| t' v ro in | ν ο ο ιη | Ρ | 'Φ | υ | Ρ | ||||
| o <n σ> | η Η >» ο | α | Λ | •d | φ | ||||
| 0 | Ρ | ||||||||
| X | X | •Η | Ρ | ||||||
| φ | Ρ | (1) | |||||||
| X | β | β | ε | • | |||||
| Ό> | •d | •d | φ | β | |||||
| rH | 'φ | •d | 'Φ | ||||||
| φ | Ρ | Ρ | |||||||
| Μ | C | C | 0 | ||||||
| χΦ | •d | σχ | φ | ω | |||||
| » ·ν· Η | ® Η | Η | ε | σ* | Ρ | ||||
| φ | Λ | Ρ | Ρ | ||||||
| tn σι ο η Ο CM νο | Ο Η ιη Μ ιη η ο | Ρ Ρ φ | *Η χφ | χφ d 0 | Φ r—1 χφ | ||||
| ·—1 | «Η | • | Ρ | fi | X | θ' | |||
| X | xd | Ό | φ | ||||||
| 3 | Φ | •d | cd | Ν | |||||
| Ρ | Φ | Ρ | Ό | •d | |||||
| Ν | Ν | 0 | Ρ | > | |||||
| Φ | Φ | φ | 'Φ | ||||||
| Ρ | ε | Φ | rH | •ΓΊ | φ | ||||
| ocutnocLwtLw ιι α> ιι ιι βι ιι φ ιι CLSCLCLSQcSCU | Ρ •r> Φ ω | •m Φ 0) | rH Φ ,Μ γ-I | :0 Ρ Φ | X 3 fi 0 | Ο Ό rd Φ | '0 •d ο Λ! | ||
| 3 | Φ | r-1 | σ> | β | 3 | ||||
| 3 | Μ-ί | Ρ | •d | φ | Ό | ||||
| Μ-Ι | CU | C | 'φ | r—I | Φ | ||||
| CL | φ | 0) | 0 | Ρ | d | ||||
| ιη | Λ | xd | 'Φ | ||||||
| Γ' Γ' Ο r-( | r* γμ χο ιη | ιη | ·* | Ό | X | c | β | X | |
| ν η μ ο Ο (Μ ο η | > ο η η (Μ ΓΊ (Μ (Μ | ο | ο || | •Η υ | ε ο | φ Τ5 c | 0 Μ-Ι | Λί Φ | |
| Η Η Η Η | γΗ rd «Η Η | II | Ρ | Ρ | •d | φ | Λ | ||
| Ό | Ρ | 'φ | X | 0 | |||||
| Ό | •Η | β | Ρ | χρ | φ | ||||
| •Η | Ο | φ | I | t | 1 | ||||
| υ | ο | χφ | υ | Ρ | X | rd | X | ||
| 0 | χΦ | Μ | C | 'φ | 3 | • | •Η | ‘d | |
| ο | Μ | Ρ | 0 | X | Ρ | c | Ρ | ||
| Ρ | C | X | Ν | 'Φ | φ | φ | |||
| 3 | φ | Ν | Φ | Ρ | ε | X | |||
| Η | α> | ο | <d | 0 | ε | φ | ι~4 | ||
| υ | ο | fi | Ό | X | «Η | Μ | Φ | Φ | |
| ο < | fi | 0 | ε | χφ | Φ | φ | •Η | Ό | |
| Ε-ι Ε-ι | 0 | X | 3. | η | X | ο | β | ||
| ϋ 0 | X | «0 | ι—I | Ό | β | φ | |||
| Ε-< U < Μ Ο ο | ο ο ο | «Ρ Ρ | Ρ Ρ •Ή | -ί Ρ | Ν 0 Ρ | Φ Ρ | •d υ 'Φ | φ > X | d rH |
| •d | > | ο | 'φ | χφ | $4 | φ | Φ | ||
| 0 Η | 0 | > | φ | Ό | Ρ | Ο | Ρ | Μ | ω |
| Η < | Εη | φ | Ρ | •Η | φ | φ | C | ω | ω |
| ο υ | ο | η | Ρ | Ρ | ί-1 | φ | 'Φ | ||
| υ υ | ο | «. | 0 | σ> | Ρ | υ | η | Ρ | |
| < Η | Η | α> | φ | Χφ | C | •d | •Η | ||
| υ ο | υ | *-* | Φ | ·—I | ε | 0 | Ρ | > | |
| υ ϋ y < < ο | ο | φ Ν Ρ | Ν Ρ :0 | 3 α | X φ | X φ C | X ι-Η | 0 φ | •d Ρ X |
| Ε« | :θ | Ρ | 0 | X | •d | ο | X | φ | |
| Ρ | σ | ιφ | φ | ε | 3 | ||||
| (Μ | ♦d | Ρ | X | 4. | β | > | |||
| CQ | ιη | rH | Ρ | Ό) | ο | V) | |||
| ο | 0 | 0 | Ό | Ρ | ο | σ | X | ||
| X | X | Ρ | ο | •d | 1 | ||||
| ,—I | ιφ | r-1 | Γ—ί | •Η | |||||
| α | Φ | 0 | Ρ | ||||||
| rH | (Μ | φ | Ρ | φ | X | β | |||
| I | I | Ό | φ | 0 | C | α | φ | ||
| > | > | C | Ν | ε | 3 | φ | |||
| W | W | •Ρ | 0 | Φ | Ρ | Ν | s | ||
| ο | X | X | X | Ρ | bJ | & | Μ | cn | |
| ιη σι | <8 | •d | 3 | φ | 0 | ||||
| Ρ | 0 | X | Ρ | X | Ό | Ρ |
A HSV-1 vírus szaporulat gátlásának mértéke 4 μιηόΐ vagy
100 μπιόΐ oligonukleotid koncentrációnál durván azonos volt minden metil-foszfonát oligonukleotid esetében (ISIS 1237, 1277 és 1236) . 4 μιηόΐ oligonukleotid koncentrációnál, az MeP oligonukleotidok esetében az anti-HSV aktivitás azonos volt minden vizsgált HSV altípus esetében. Az ISIS 1237 és 1277 esetében az MeP analógok antivirális aktivitása jobb volt, mint a megfelelő P=0 analógok esetében, azaz az ISIS 1047 és 1301 esetében. A 21és 15-nukleotid szekvenciák foszforotioát analógjai (ISIS 1080 és ISIS 1302) nagymértékben megnövekedett antivirális aktivitást mutatnak az ISIS 1237 vagy ISIS 1277 oligonukleotidokhoz viszonyítva. Meglepetésszerűen sem a HSV-1, sem a HSV-2 replikációt nem gátolta az ISIS 1235, ami az ISIS 1236 P-S analógja. Az antivirális aktivitást sokkal jelentősebben befolyásolta az oligonukleotid vázban vagy a nukleotid szekvenciában bekövetkezett változás, mint az oligonukleotid hosszában mutatkozó változás.
ISIS 1049 és 1082 hatása az UL13RNS in vitro transzlációjára
Az ISIS 1049 és 1082 oligonukleotidok azon képességét, hogy specifikusan kötődnek a célzott UL13 RNS-hez (pIP-1 vagy pIP-2 transzkriptum) és gátolják a transzlációt, in vitro transzlációval vizsgáltuk, amelyhez nyúl retikulocita lizátumot alkalmaztunk. A nem specifikus foszforotioát oligonukleotidoknak a transzlációs aktivitásra kifejtett hatásának vizsgá0 latánál kontrollként ISIS 1238-at alkalmaztunk, amely az ISIS
1080 nukleotid szekvencia kevert változata. A humán 5-lipoxigenáz transzkriptum RNS szekvenciáját tartalmazó in vitro szintetizált transzkriptumot (5L0) alkalmaztuk az ISIS nukleotidoknak a heterológ RNS transzlációjára kifejtett hatás megállapítására.
A pIP-1 RNS transzlációja (11a. ábra) egy fő polipeptid termék, amely kb. 61 kD tömegű, és több kisebb termék szintézisét eredményezte, amely utóbbiak közül a legfontosabb a 33 kD tömegű polipeptid, amely az ISIS 1080 (1082) és 1047 (1049) oligonukleotidokkal komplementer szekunder AUG kodon szakasznál kezdődik. Számszerűen, az ISIS 1049 jobb inhibiciós hatással volt a pIP-1 RNS transzlációjára, mint az ISIS 1082, amely viszont jobb inhibitor volt, mint az ISIS 1238. Minőségileg az ISIS 1049 és 1082-vel végzett inhibició a pIP-1 RNS transzlációjára látszólagosan valamivel különböző molekula mechanizmuson alapul. Mind az ISIS 1082 és 1049 esetében az oligonukleotidok adagolása a pIP-1 RNS-ből szintetizált polipeptid teljes hosszának redukcióját eredményezi. Továbbá az ISIS 1049-cél végzett inhibició észrevehető növekedést eredményez mind a három kisebb polipeptid termék esetén, amelyek molekulatömeges, 28 illetve 26 kD. A 33 kD polipeptid ugyanaz a polipeptid, amely kis mennyiségben a nem kezelt mintákban is szintetizálódik. A 28 kD polipeptid feltehetően a 61 kD csonkított változata, és a 26 kD polipeptidről pedig úgy gondoljuk, hogy egy másik AUG kodonnal indul, amely az ISIS 1049 cél szakaszhoz a 3' helyen helyezkedik el. Hasonló inhibiciós eredményeket figyeltünk meg ha a pIP-2 plazmidból nyert homológ in vitro • ·
- 63 transzkriptumot (11b. ábra) pIP-1 RNS-sel helyettesítettük a hibridizációs keverékben, és ha a transzlációt búzacsíra lizátummal végeztük.
Az oligonukleotidoknak az RNS transzlációjára kifejtett nem specifikus inhibiciós hatása minimális volt. Az ISIS 1238 enyhe, de kimutatható inhibiciós hatással van a pIP-1 RNS transzlációjára, míg egyik nukleotid sem volt inhibiciós hatással a heterológ 5L0 RNS transzlációjára.
Az Acyclovir és az ISIS oligonukleotidok antivirális hatásának összehasonlítása HSV-2 replikációjára
Fertőzéses vizsgálattal meghatároztuk a dózis válasz görbéket Acyclovir (ACV), ISIS 1302, ISIS 1080 és ISIS 1082 esetében HSV-2, HG52 törzzsel kapcsolatban. Mivel az ACV törzsoldatot (4 mmól) dimetil-szulfoxiddal (DMSO) készítettük, az ACV-kezelt mintákban a vírus mennyiségét olyan fertőzött kontrollokhoz viszonyítottuk, amelyet 0,025 % DMSO-val kezeltünk. A kontroll vírus kihozatal a DMSO-kezelt minták esetében kb. 30 %-kal nagyobb volt, mint a kezeletlen minták esetében. A dózis válasz görbéket a 13. ábrán mutatjuk be. Mind a négy vegyület a HSV-2 replikációt dózis-függő módon befolyásolta. A 12. ábra adatai alapján számoltuk ezen vegyületek IC5Q értékeit, és azok 600 mmól, 2 μιηόΐ, 430 nmól és 250 nmól értékűek voltak ACV, illetve ISIS 1302, ISIS 1082 és ISIS 1080 esetében. A dózis válasz görbék meredeksége az ISIS 1080 és 1082 esetében megváltozott, ha a HSV-1 vagy HSV-2 vírusok más törzseit alkalmaztuk a fertőzéshez (lásd például 12. ábra).
• ·
- 64 Az ISIS 1082 dózisfüggő hatása két HSV-1 törzs replikációjára
Az ISIS 1082 antivirális hatását két HSV-1 törzs (KOS és F) esetében összehasonlítottuk ismert anti-HSV vegyület, az ACV, valamint egy nem komplementer foszforotioát oligonukleotid, az ISIS 1238 antivirális hatásával. Ez utóbbi nukleotid az ISIS 1080 kevert változata, és kontrollként szolgál a nem specifikus oligonukleotid transzlációs aktivitásra kifejtett hatásra. Az ISIS 1238-nak sokkal kisebb inhibiciós hatása volt, mint akár az ISIS 1042-nek vagy az ACV-nek. Az ISIS 1082 és az ACV gátló hatású volt a KOS törzsekkel szemben, itt az ICg0 érték 2,73, illetve 2,57 Mmól volt (lásd 13. ábra). Az ICgQ értékek az ACV és az ISIS 1082 esetében extrapolálva lettek a vírus F törzsére vonatkozóan, ezek az értékek 3,6, illetve 5,8 Mmól (lásd 14. ábra). Bár az ACV és ISIS 1082 esetében meghatározott ICqq értékek hasonlóak voltak minden vírus törzs esetében, a dózis válasz görbék azt mutatták, hogy a HSV törzsek között ezen vegyületekkel való kezelésnél törzs-specifikus inhibició van.
ISIS 1082 dózisfüggő hatása a HSV-1 ACV-rezisztens törzseinek replikációjára
Vizsgáltuk az ISIS 1082 antivirális hatásosságát két HSV-1 ACVr törzs, a DM2.1 törzs (ez nem tartalmaz virális timidin-kináz gént) és a PAAr5 törzs esetében, amely a virális DNS polimerázban egy megváltozott nukleotid kötési helyet expresszál. Mindegyik vírus törzset 400 nmól, 800 nmól vagy 4 Mmól ISIS 1082-vel kezeltünk. Összehasonlításképpen párhuzamos • ···
- 65 fertőzésekben minden törzset azonos koncentrációjú ACV-vel kezeltünk. A vizsgált koncentráció értékeknél az ACV egyik törzs esetében sem hatott dózis-függő módon, míg az ISIS 1082vel végzett kezelés mindegyik törzs esetében dózisfüggő módon gátolta a vírus kihozatalt (lásd 15. ábra). Az ISIS 1082 esetében az ICsq értékeket 300 nmól, illetve 600 nmól-ra becsültük a HSV-1 DM2.1 és PAAr5 törzsek esetében. Az a tény, hogy a DM2.1 törzs esetében a kihozatal csökkenésének mértéke hasonló volt ahhoz, mint amikor más HSV-1 (13., 14. ábra) vagy HSV-2 törzseket (12. ábra) kezeltünk, azt mutatja, hogy az ISIS 1082 antivirális hatásához nem szükséges az oligonukleotid virális timidin-kináz enzimmel való foszforilezése.
Az ISIS 1082 és az ACV celluláris toxicitásának összehasonlítása
Az ISIS 1082 és az ACV celluláris toxicitását hasonlítottuk össze a HeLa sejtekben végzett klonogén vizsgálattal, amely kimutatta a vegyületnek való kitétel idejét a fertőzéses vizsgálatnál. 100 Mmól vegyület koncentráció értéknél sem az ISIS 1082, sem az ACV nem okozott 50 %-os csökkenést a HeLa sejtek klonogén kapacitásában. A 275 nmól, illetve 300 nmól IC5Q értékeket, amelyeket az ISIS 1082, illetve ACV esetében határoztunk meg, a HSV-2 esetében (12. ábra) számoltuk a gyógyhatású indexeket (Therapeutic Indices (TIs, Ti = LC50/IC50), és a számítás szerint ez >360 ISIS 1082 és >334 ACV esetében. Ily módon a várható TI érték ISIS 1082 esetében összemérhető az ACV TI értékével.
* ·
- 66 Szekvenciák ismertetése (1) Általános információk:
(i) Bejelentő: Draper et al.
(ii) Találmányunk címe: Oligonukleotid terápiák herpesz vírusok hatásának módosítására (iii) Szekvenciák száma: 12 (iv) Megfelelő cím:
(A) Címzett: Woodcock Washburn Kurtz
Mackiewich & Norris (B) Utca: One Liberty Piacé - 46th Floor (C) Város: Philadelphia (D) Állam: PA (E) Ország: USA (F) Irányítószám: 19103 (v) Komputer adatok:
(A) Médium típus: Diskette, 3,5 Inch, 1,44 Mb storage (B) Komputer: IBM PS/2 (C) Rendszer: PC-DOS (D) Software: Wordperfect 5.0 (vi) A jelen bejelentés adatai (a) Bejelentési szám: n/a (b) Bejelentési nap:
(c) Klasszifikáció:
(vii) Elsőbbségi bejelentés adatai:
(A) Bejelentés száma: 485,297 (B) Bejelentés napja: 1990. 02. 26.
- 67 (viii) Szabadalmi ügyvivő adatai:
(A) Név: Jane Massey Licata (B) Regisztrálási szám: 32 257 (C) Aktaszám: ISIS-0085 (ix) Telekommunikációs adatok:
(A) Telefon: (215) 568-3100 (B) Telefax: (215) 568-3439 (2) Információ az SEQ ID No: 1 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 1:
GTCCGCGTCC ATGTCGGC 18 (2) Információ az SEQ ID No: 2 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 2:
GGACTCATCC ATCCTTCGGC C • ·
- 68 (2) Információ az SEQ ID No: 3 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 3:
GCGGCTGGCC ATTTCAACAG A 21 (2) Információ az SEQ ID No: 4 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 4:
CGCGGAATCC ATGGCAGCAG G 21 (2) Információ az SEQ ID No: 5 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 5:
ACCGAGGTCC ATGTCGTACG C 21
- 69 (2) Információ az SEQ ID No: 6 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 6:
GGACTCATCC ATCCGTCCGC C 21 (2) Információ az SEQ ID No: 7 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 7:
GCCGAGGTCC ATGTCGTACG C 21 (2) Információ az SEQ ID No: 8 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (iv) Anti-szenz: Y (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 8:
GCGGTTGGCC ATTGGAACCA A
- 70 (2) Információ az SEQ ID No: 9 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 9:
GAGGTCCATG TCGTA 15 (2) Információ az SEQ ID No: 10 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 10:
TTCCTCCTGC GG 12 (2) Információ az SEQ ID No: 11 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 11:
ATGGATGAGT CCCGCAGACA GCGACCTGCT GGTCATGTGG CAGCTAAC CAGCCCCCAA GGTGCACGCC AACGGTCCTT CAAGGATTGG CTCGCATC ACGTACACTC CAACCCCCAC GGGGCCTCCG GGCGCCCCAG CGGCCCCT • ·
| CTCCAGGACG | CCGCCGTCTC | CCGCTCCTCC | CACGGGTCCC | GCCACCGATC | 200 |
| CGGCCTCCGC | GAGCGGCTTC | GCGCGGGACT | ATCCCGATGG | CGAATGAGCC | 250 |
| GCTCGTCTCA | TCGCCGCGCG | TCCCCCGAGA | CGCCCGGTAC | GGCGGCCAAA | 300 |
| CTGAACCGCC | CGCCCCTGCG | CAGATCCCAG | GCGGCGTTAA | CCGCACCCCC | 350 |
| CTCGTCCCCC | TCGCACATCC | TCACCCTCAC | GCGCATCCGC | AAGCTATGCA | 400 |
| GCCCCGTGTT | CGCCATCAAC | CCCGCCCTAC | ACTACACGAC | CCTCGAGATC | 450 |
| CCCGGGGCCC | GAAGCTTCGG | GGGGTCTGGG | GGATACGGTG | ACGTCCAACT | 500 |
| GATTCGCGAA | CATAAGCTTG | CCGTTAAGAC | CATAAAGGAA | AAGGAGTGGT | 550 |
| TTGCCGTTGA | GCTCATCGCG | ACCCTGTTGG | TCGGGGAGTG | CGTTCTACGC | 600 |
| GCCGGCCGCA | CCCACAACAT | CCGCGGCTTC | ATCGCGCCCC | TCGGGTTCTC | 650 |
| GCTGCAACAA | CGACAGATAG | TGTTCCCCGC | GTACGACATG | GACCTCGGTA | 700 |
| AGTATATCGG | CCAACTGGCG | TCCCTGCGCA | CAACAAACCC | CTCGGTCTCG | 750 |
| ACGGCCCTCC | ACCAGTGCTT | CACGGAGCTG | GCCCGCGCCG | TTGTGTTTTT | 800 |
| AAACACCACC | TGCGGGATCA | GCCACCTGGA | TATCAAGTGC | GCCAACATCC | 850 |
| TCGTCATGCT | GCGGTCGGAC | GCCGTCTCGC | TCCGGCGGGC | CGTCCTCGCC | 900 |
| GACTTTAGCC | TCGTCACCCT | CAACTCCAAC | TCCACGATCG | CCCGGGGGCA | 950 |
| GTTTTGCCTC | CAGGAGCCGG | ACCTCAAGTC | CCCCCGGATG | TTTGGCATGC | 1000 |
| CCACCGCCCT | AACCACAGCC | AACTTTCACA | CCCTGGTGGG | TCACGGGTAT | 1050 |
| AACCAGCCCC | CGGAGCTGTT | GGTGAAATAC | CTTAACAACG | AACGGGCCGA | 1100 |
| ATTTACCAAC | CACCGCCTGA | AGCACGACGT | CGGGTTAGCG | GTTGACCTGT | 1150 |
| ACGCCCTGGG | CCAGACGCTG | CTGGAGTTGG | TGGTTAGCGT | GTACGTCGCC | 1200 |
| CCGAGCCTGG | GCGTACCCGT | GACCCGGTTT | CCCGGTTACC | AGTATTTTAA | 1250 |
| CAACCAGCTG | TCGCCGGACT | TCGCCCTGGC | CCTGCTCGCC | TATCGCTGCG | 1300 |
| TGCTGCACCC | AGCCCTGTTT | GTCAACTCGG | CCGAGACCAA | CACCCACGGC | 1350 |
| CTGGCGTATG | ACGTCCCAGA | GGGCATCCGG | CGCCACCTCC | GCAATCCCAA | 1400 |
| GATTCGGCGC | GCGTTTACGG | ATCGGTGTAT | AAATTACCAG | CACACACACA | 1450 |
| AGGCGATACT | GTCGTCGGTG | GCGCTGCCTC | CCGAGCTTAA | GCCTCTCCTG | 1500 |
»*·♦
- 72 GTGCTGGTGT CCCGCCTGTG TCACACCAAC CCGTGCGCGC GGCACGCGCT 1550
GTCGTGA
1557 (2) Információ az SEQ ID No: 12 szekvenciával kapcsolatban:
(i) Szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 (B) Típus: nukleinsav (C) Szerkezet: egyszálú (D) Topológia: nem ismert (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 12:
| ATGGATGAGT | CCGGGCGACA | GCGACCTGCT | GGTCGTGTGG | CAGCTGACAT | 50 |
| CAGCCCCCAA | GGTGCACACC | GACGCTCCTT | CAAGGCCTGG | CTCGCGTCCT | 100 |
| ACATACACTC | CCTCAGCCGC | CGGGCGTCCG | GACGCCCAAG | CGGCCCCTCC | 150 |
| CCCCGAGACG | GCGCCGTCTC | CGGAGCCCGC | CCCGGGTCCC | GCCGCCGATC | 200 |
| CAGCTTCCGG | GAGCGGCTTC | GCGCGGGACT | GTCCCGATGG | CGAGTGAGCC | 250 |
| GCTCGTCTCG | TCGCCGCTCG | TCCCCCGAGG | CCCCCGGCCC | TGCGGCCAAG | 300 |
| CTAAGGCGCC | CGCCCCTGCG | CAGGTCCGAG | ACGGCCATGA | CCTCGCCCCC | 350 |
| GTCGCCCCCC | TCGCACATCC | TGTCCCTCGC | GCGCATCCAC | AAGCTATGCA | 400 |
| TCCCCGTATT | CGCCGTCAAC | CCCGCCCTCC | GCTACACGAC | CTCGGAGATC | 450 |
| CCCGGGGCCC | GCAGCTTCGG | GGGCTCGGGG | GGGTACGGCG | AGGTGCAGTT | 500 |
| GATTCGCGAA | CACAAACTCG | CCGTGAAGAC | CATCCGGGAA | AAAGAGTGGT | 550 |
| TTGCCGTGGA | GCTCGTCGCG | ACCCTGCTCG | TGGGGGAGTG | CGCTCTTCGC | 600 |
| GGCGGCCGCA | CCCACGACAT | CCGCGGCTTT | ATCACCCCGC | TCGGGTTCTC | 650 |
| GCTGCAGCAG | CGCCAGATCG | TGTTCCCCGC | GTACGÁCATG | GACCTCGGCA | 700 |
| AGTACATCGG | CCAGCTGGCG | TCCCTGCGCG | CGACCACCCC | CTCCGTCGCG | 750 |
| ACGGCCCTCC | ACCACTGCTT | CACAGACCTG | GCGCGCGCCG | TGGTGTTCCT | 800 |
| GAACACCAGG | TGCGGGATCA | GCCACCTGGA | CATCAAGTGC | GCCAACGTCC | 850 |
| TCGTGATGCT | GCGATCGGAC | GCGGTGTCGC | TCCGGCGGGC | CGTCCTGGCC | 900 |
| GACTTTAGCC | TGGTGACCCT | GAACTCCAAC | TCCACGATAT | CCCGGGGCCA | 950 |
| gttttgcctc | CAGGAGCCGG | ACCTCGAGTC | CCCCCGGGGG | TTTGGGATGC | 1000 |
| CCGCCGCCCT | GACCACGGCC | AACTTTCACA | CTCTGGTGGG | GCACGGGTAC | 1050 |
| AACCAGCCAC | CGGAGCTCTC | GGTAAAGTAC | CTCAACAACG | AGCGGGCCGA | 1100 |
| GTTTAACAAC | CGCCCCCTGA | AGCACGACGT | CGGGCTGGCG | GTCGATCTCT | 1150 |
| ACGCCCTGGG | GCAGACGCTG | CTGGAGCTGC | TGGTTAGCGT | GTACGTGGCC | 1200 |
| CCGAGCCTGG | GCGTCCCCGT | GACCCGCGTC | CCGGGCTACC | AGTACTTTAA | 1250 |
| CAACCAGCTC | TCGCCGGACT | TTGCCGTGGC | CCTCCTCGCC | TATCGCCGCG | 1300 |
| TTCTGCACCC | CGCCCTCTTT | GTCAACTCGG | CCGAGACCAA | CACCCACGGC | 1350 |
| CTGGCGTATG | ACGTGCCGGA | GGGCATCCGG | CGCCACCTTC | GCAATCCCAA | 1400 |
| GATTCGGCGC | GCGTTCACGG | AGCAGTGTAT | AAATTACCAG | CGCACGCACA | 1450 |
| AGGCCGTCCT | GTCGTCGGTG | TCGCTGCCGC | CCGAGCTGAG | GCCGCTGCTG | 1500 |
| GTGCTGGTCT | CCCGCCTCTG | TCACGCCAAC | CCGGCCGCGC | GCCACTCTCT | 1550 |
GTCGTGA
Claims (26)
- Szabadalmi igénypontok1. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely specifikusan hibridizálható a herpesz vírus génjéből származó RNS-sel vagy DNS-sel, amely gén megfelel a herpesz simplex vírus 1 típus valamely következő nyitott leolvasási keretének: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52, amely oligonukleotid annyi nukleotid egységet tartalmaz, amely azonosságában és számában elegendő az említett specifikus hibridizáció létrehozásához.
- 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely a transzlációs iniciációs helyen specifikusan hibridizálható.
- 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely CAT szekvenciát tartalmaz.
- 4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a gén valamely következő vírusból származik: herpesz szimplex vírus típus 1, herpesz szimplex vírus típus 2, cytomegalovirus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus vagy varicella zoster vírus.
- 5. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal elkeverve.
- 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább néhánya kéntarttalmú csoport.
- 7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok legalább néhánya foszforotioát csoportot tartalmaz.
- 8. Oligonukleotid, amely valamely következő szekvenciák ·«- 75 közül egyet tartalmaz:5.- -3'
GGA CTC ATC CAT CCT TCG GCC, SEQ ID NO. : 2, GCG GCT GGC CAT TTC AAC AGA, SEQ ID NO. : 3, CGC GGA ATC CAT GGC AGC AGG, SEQ ID NO.: 4, ACC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO. : 5, GGA CTC ATC CAT CCG TCC GCC, SEQ ID NO. : 6, GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 7, GCG GTT GGC CAT TGG AAC CAA, SEQ ID NO.: 8. - 9. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal elkeverve.
- 10. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoport.
- 11. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszforotioát csoportot tartalmaz.
- 12. Eljárás herpesz vírus aktivitásának módosítására, azzal jellemezve, hogy a vírust vagy a vírussal fertőzött állatot egy oligonukleotiddal érintkeztetjük, amely oligonukleotid specifikusan hibridizálható egy herpesz vírus génről származó RNS-sel, vagy DNS-sel, amely gén a herpesz szimplex vírus 1 típus valamely következő nyitott leolvasási keretének felel meg: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52, és amely oligonukleotid annyi nukleotid egységet tartalmaz, hogy az azonosságában és számában biztosítani tudja az említett specifikus hibridizációt.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, ♦4 · ··4·» ··«···4 · · ·♦ •4·· :- • 44 • •4 hogy az oligonukleotid specifikusan hibridizálható a transzlációs iniciációs hellyel.
- 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid CAT szekvenciát tartalmaz.
- 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a herpesz vírus valamely következő vírus: herpesz szimplex vírus típus 1, herpesz szimplex vírus típus 2, cytómegalovirus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus vagy varicella zoster vírus.
- 16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid valamely következő szekvenciát tartalmazza:
5'- -3' GGA CTC ATC CAT CCT TCG GCC, SEQ ID NO.: 2, GCG GCT GGC CAT TTC AAC AGA, SEQ ID NO.: 3, CGC GGA ATC CAT GGC AGC AGG, SEQ ID NO.: 4» ACC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 5, GGA CTC ATC CAT CCG TCC GCC, SEQ ID NO.: 6, GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: Ί, GCG GTT GGC CAT TGG AAC CAA, SEQ ID NO.: 8. - 17. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidban lévő nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok legalább néhánya kéntartalmú csoport.
- 18. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidban lévő nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszforotioát csoportot tartalmaz.
- 19. Eljárás állatok kezelésére, amelyek feltehetően herpesz vírussal fertőzöttek, azzal jellemezve, hogy az állatot egy oligonukleotiddal érintkeztetjük, amely oligonukleotid • «· ·· 4····· ·· · · 4 ·<• ··· 4·· *···♦· • · · · · *φ ··· ·· ·· ····· specifikusan hibridizálható egy herpesz vírus génből származó RNS-vel vagy DNS-sel, amely gén megfelel a herpesz szimplex vírus típus 1 valamely következő nyitott leolvasási keretének: UL5, UL8, UL9, UL13, UL29, UL30, UL39, UL40, UL42 és UL52, és amely oligonukleotid annyi és olyan nukleotid egységet tartalmaz, amely elegendő az említett specifikus hibridizáció létrehozásához.
- 20. A 19. igénypont szerinti eljárás amelynél az oligonukleotid specifikusan hibridizálható a transzlációs iniciációs hellyel.
- 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynél az oligonukleotid CAT szekvenciát tartalmaz.
- 22. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelyben a herpesz vírus valamely következő vírus: herpesz szimplex vírus típus 1, herpesz szimplex vírus típus 2, cytomegalovirus, humán herpesz vírus 6, Epstein Barr vírus vagy varicella zoster vírus.
- 23. A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid gyógyászatilag hordozóanyaggal van elkeverve.
- 24. A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid valamely követekző szekvenciát tartalmazza:5‘- -3'
GGA CTC ATC CAT CCT TCG GCC, SEQ ID NO. : 2, GCG GCT GGC CAT TTC AAC AGA, SEQ ID NO. : 3, CGC GGA ATC CAT GGC AGC AGG, SEQ ID NO. : 4, ACC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 5, GGA CTC ATC CAT CCG TCC GCC, SEQ ID NO.: 6, GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC, SEQ ID NO.: 7, GCG GTT GGC CAT TGG AAC CAA, SEQ ID NO.: 8. ·· ·· ·· 2·»· • · · · á ··« ··· ··· ♦·· • * · · · * - 25. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynél az oligonukleotidban a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoport.
- 26. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynél az oligonukleotidban lévő nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszforotioát-csoportot tartalmaz.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/485,297 US5248670A (en) | 1990-02-26 | 1990-02-26 | Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT64474A true HUT64474A (en) | 1994-01-28 |
Family
ID=23927618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202746A HUT64474A (en) | 1990-02-26 | 1991-02-25 | Process for producing pharmaceutical compositions containing oligonukleotides for treating and diagnostising herpes virus invections |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5248670A (hu) |
| EP (1) | EP0517859B1 (hu) |
| JP (1) | JP2795538B2 (hu) |
| AT (1) | ATE168561T1 (hu) |
| AU (1) | AU652152B2 (hu) |
| BR (1) | BR9106087A (hu) |
| CA (1) | CA2074523A1 (hu) |
| DE (1) | DE69129848T2 (hu) |
| DK (1) | DK0517859T3 (hu) |
| ES (1) | ES2118082T3 (hu) |
| FI (1) | FI923707A7 (hu) |
| HU (1) | HUT64474A (hu) |
| NO (1) | NO923321D0 (hu) |
| WO (1) | WO1991012811A1 (hu) |
Families Citing this family (88)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5635488A (en) * | 1991-10-15 | 1997-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds having phosphorodithioate linkages of high chiral purity |
| US6339066B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-01-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C |
| US5587361A (en) * | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5620963A (en) * | 1991-10-15 | 1997-04-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating protein kinase C having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5514577A (en) * | 1990-02-26 | 1996-05-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses |
| US5248670A (en) * | 1990-02-26 | 1993-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses |
| WO1992003051A1 (en) * | 1990-08-15 | 1992-03-05 | Genta Incorporated | Inhibition of herpesviridae infection by antisense oligonucleotides |
| CA2089666C (en) * | 1990-08-16 | 2003-01-07 | Kevin P. Anderson | Oligonucleotides for modulating the effects of cytomegalovirus infections |
| US5646267A (en) * | 1991-08-05 | 1997-07-08 | Polish Academy Of Sciences | Method of making oligonucleotides and oligonucleotide analogs using phospholanes and enantiomerically resolved phospholane analogues |
| US5359052A (en) * | 1991-08-05 | 1994-10-25 | Polish Academy Of Sciences | Chalcophospholanes useful in the synthesis of oligonucleoside phosphorothioates, phosphorodithioates and related selenates |
| US6369209B1 (en) | 1999-05-03 | 2002-04-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| US7119184B2 (en) | 1991-08-12 | 2006-10-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| US5661134A (en) * | 1991-10-15 | 1997-08-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5607923A (en) * | 1991-10-15 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating cytomegalovirus having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5599797A (en) * | 1991-10-15 | 1997-02-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5576302A (en) * | 1991-10-15 | 1996-11-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5654284A (en) * | 1991-10-15 | 1997-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating RAF kinase having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| AU3129993A (en) * | 1991-11-08 | 1993-06-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Localized oligonucleotide therapy |
| GB9125891D0 (en) * | 1991-12-05 | 1992-02-05 | Inst Of Cancer The Research | Antiviral agent |
| US6537973B1 (en) | 1992-03-16 | 2003-03-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide inhibition of protein kinase C |
| EP0683668A4 (en) * | 1993-01-27 | 1997-12-29 | Affymax Tech Nv | PREPARATIONS AND METHODS FOR TRANSDERMAL DRUG ADMINISTRATION. |
| US6824976B1 (en) * | 1993-04-02 | 2004-11-30 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Method for selective inactivation of viral replication |
| DE4331670A1 (de) * | 1993-09-17 | 1995-03-23 | Hoechst Ag | Neue Antisense-Oligonucleotide gegen HSV-1 sowie deren Herstellung |
| US5550047A (en) * | 1994-02-18 | 1996-08-27 | University Of Massachusetts | Oligonucleotides with anti-Epstein-Barr virus activity |
| US6727230B1 (en) | 1994-03-25 | 2004-04-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
| WO1995026204A1 (en) * | 1994-03-25 | 1995-10-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
| US5801235A (en) * | 1994-05-25 | 1998-09-01 | Hybridon, Inc. | Oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity |
| AU2963195A (en) * | 1994-07-05 | 1996-01-25 | Baltech, Inc. | Prevention and treatment of human herpesvirus-6 infection with quaternary ammonium compounds and/or ganglionic blocking agents |
| US20030026782A1 (en) * | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
| US6239116B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| US7935675B1 (en) * | 1994-07-15 | 2011-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| ATE509102T1 (de) | 1994-07-15 | 2011-05-15 | Univ Iowa Res Found | Immunomodulatorische oligonukleotide |
| US6429199B1 (en) | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
| WO1996003500A1 (en) * | 1994-07-26 | 1996-02-08 | Ltt Institute Co., Ltd. | Sustance with antiviral activity |
| US5591721A (en) * | 1994-10-25 | 1997-01-07 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
| US6645943B1 (en) | 1994-10-25 | 2003-11-11 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
| US6608035B1 (en) * | 1994-10-25 | 2003-08-19 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
| US6667293B1 (en) | 1995-09-12 | 2003-12-23 | Hybridon, Inc. | Use of cyclodextrins to modulate gene expression with reduced immunostimulatory response |
| US5837854A (en) * | 1996-04-05 | 1998-11-17 | University Of Massachusetts | Oligonucleotides with anti-Epstein-Barr virus activity |
| US6111085A (en) * | 1996-09-13 | 2000-08-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
| EP0855184A1 (en) | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
| US6576752B1 (en) | 1997-02-14 | 2003-06-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy functionalized oligomers |
| US6127533A (en) | 1997-02-14 | 2000-10-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides |
| US6172209B1 (en) | 1997-02-14 | 2001-01-09 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same |
| WO1998037919A1 (en) | 1997-02-28 | 1998-09-03 | University Of Iowa Research Foundation | USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS |
| US6406705B1 (en) | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
| AU7690898A (en) | 1997-05-20 | 1998-12-11 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute | Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols |
| US6610539B1 (en) * | 1997-07-10 | 2003-08-26 | Genesense Technologies, Inc. | Antisense oligonucleotide sequences as inhibitors of microorganisms |
| ATE356630T1 (de) * | 1998-04-03 | 2007-04-15 | Univ Iowa Res Found | Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine |
| ATE305507T1 (de) * | 1998-05-14 | 2005-10-15 | Coley Pharm Gmbh | Verfahren zur regulierung der hematopoiese mit hilfe von cpg oligonukleotide |
| JP2002515514A (ja) | 1998-05-21 | 2002-05-28 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチドの局所送逹のための組成物及び方法 |
| PT1077722E (pt) | 1998-05-22 | 2006-12-29 | Coley Pharm Group Inc | Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal |
| US20030022854A1 (en) | 1998-06-25 | 2003-01-30 | Dow Steven W. | Vaccines using nucleic acid-lipid complexes |
| US6867294B1 (en) | 1998-07-14 | 2005-03-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages |
| US6242589B1 (en) | 1998-07-14 | 2001-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages |
| US6277967B1 (en) | 1998-07-14 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages |
| US6335194B1 (en) | 1998-09-29 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of survivin expression |
| US6077709A (en) | 1998-09-29 | 2000-06-20 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of Survivin expression |
| US6492111B1 (en) * | 1998-11-25 | 2002-12-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | In situ binary synthesis of biologically effective molecules |
| CZ296576B6 (cs) | 1999-02-12 | 2006-04-12 | Sankyo Company Limited | Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem |
| US6977245B2 (en) | 1999-04-12 | 2005-12-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
| JP4151751B2 (ja) * | 1999-07-22 | 2008-09-17 | 第一三共株式会社 | 新規ビシクロヌクレオシド類縁体 |
| US6147200A (en) * | 1999-08-19 | 2000-11-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers |
| US6949520B1 (en) | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
| EP1322655B1 (en) * | 2000-01-14 | 2007-11-14 | The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
| US7585847B2 (en) | 2000-02-03 | 2009-09-08 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy |
| AU2001270134B2 (en) | 2000-06-22 | 2006-06-15 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer |
| AU2001276691A1 (en) * | 2000-08-03 | 2002-02-18 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Brushless motor and method of manufacturing the brushless motor |
| US6818787B2 (en) * | 2001-06-11 | 2004-11-16 | Xenoport, Inc. | Prodrugs of GABA analogs, compositions and uses thereof |
| US7666674B2 (en) | 2001-07-27 | 2010-02-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo |
| WO2003020884A2 (en) | 2001-08-14 | 2003-03-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Method for rapid generation of mature dendritic cells |
| IL160157A0 (en) | 2001-08-17 | 2004-07-25 | Coley Pharm Group Inc | Combination motif immune stimulation oligonucleotides with improved activity |
| AU2002366710A1 (en) | 2001-12-20 | 2003-07-09 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of | USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS |
| US8466116B2 (en) | 2001-12-20 | 2013-06-18 | The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth |
| US20050196382A1 (en) * | 2002-09-13 | 2005-09-08 | Replicor, Inc. | Antiviral oligonucleotides targeting viral families |
| EP2330194A3 (en) * | 2002-09-13 | 2011-10-12 | Replicor, Inc. | Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides |
| US8263091B2 (en) | 2002-09-18 | 2012-09-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides |
| PT2241325E (pt) | 2002-10-29 | 2012-04-12 | Coley Pharm Gmbh | Utilização de oligonucleótidos cpg no tratamento de infecção com vírus da hepatite c |
| EP1578954A4 (en) | 2002-12-11 | 2010-08-11 | Coley Pharm Group Inc | 5'-CPG NUCLEIC ACIDS AND USE METHOD |
| US7713738B2 (en) * | 2003-02-10 | 2010-05-11 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression |
| PT1592793E (pt) † | 2003-02-10 | 2009-09-30 | Santaris Pharma As | Compostos oligoméricos para a modulação da expressão de survivina |
| WO2006085942A2 (en) * | 2004-06-17 | 2006-08-17 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for regulating gene transcription |
| KR20070095882A (ko) * | 2004-11-09 | 2007-10-01 | 산타리스 팔마 에이/에스 | Ｌｎａ 올리고뉴클레오티드 및 암의 치료 |
| EP1913141A2 (en) * | 2005-06-03 | 2008-04-23 | The CBR Institute for Biomedical Research, Inc. | Sirna microbicides for preventing and treating viral diseases |
| US20070141559A1 (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-21 | Quest Diagnostics Inc | Methods for detecting and typing herpes simplex virus |
| AU2016215155A1 (en) * | 2015-02-04 | 2017-08-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tau antisense oligomers and uses thereof |
| EP3254104B1 (en) | 2015-02-04 | 2021-08-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of selecting therapeutic molecules |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4757055A (en) * | 1980-11-12 | 1988-07-12 | The Johns Hopkins University | Method for selectively controlling unwanted expression or function of foreign nucleic acids in animal or mammalian cells |
| NZ209840A (en) * | 1983-10-17 | 1988-11-29 | Kaji Akira | A method of inhibiting viral propagation by hybridising dna with the viral rna thus blocking its action |
| US4806463A (en) * | 1986-05-23 | 1989-02-21 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides |
| US5110802A (en) * | 1987-07-14 | 1992-05-05 | City Of Hope | Oligonucleotide phosphonates and method of inhibiting a human immunodeficiency virus in vitro utilizing said oligonucleotide phosphonates |
| US5004810A (en) * | 1988-09-30 | 1991-04-02 | Schering Corporation | Antiviral oligomers |
| US5248670A (en) * | 1990-02-26 | 1993-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses |
| US5166195A (en) * | 1990-05-11 | 1992-11-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides |
-
1990
- 1990-02-26 US US07/485,297 patent/US5248670A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-02-25 AT AT91908334T patent/ATE168561T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-25 DK DK91908334T patent/DK0517859T3/da active
- 1991-02-25 DE DE69129848T patent/DE69129848T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-25 JP JP3507979A patent/JP2795538B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-25 US US07/852,132 patent/US6310044B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-25 ES ES91908334T patent/ES2118082T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-25 EP EP91908334A patent/EP0517859B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-25 AU AU77470/91A patent/AU652152B2/en not_active Ceased
- 1991-02-25 HU HU9202746A patent/HUT64474A/hu unknown
- 1991-02-25 BR BR919106087A patent/BR9106087A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-02-25 WO PCT/US1991/001327 patent/WO1991012811A1/en not_active Ceased
- 1991-02-25 CA CA002074523A patent/CA2074523A1/en not_active Abandoned
-
1992
- 1992-08-18 FI FI923707A patent/FI923707A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1992-08-25 NO NO923321A patent/NO923321D0/no unknown
-
1994
- 1994-10-26 US US08/329,212 patent/US5658891A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9106087A (pt) | 1993-02-02 |
| US5248670A (en) | 1993-09-28 |
| DE69129848T2 (de) | 1999-04-29 |
| JP2795538B2 (ja) | 1998-09-10 |
| JPH05503016A (ja) | 1993-05-27 |
| US6310044B1 (en) | 2001-10-30 |
| FI923707A0 (fi) | 1992-08-18 |
| DE69129848D1 (de) | 1998-08-27 |
| US5658891A (en) | 1997-08-19 |
| ES2118082T3 (es) | 1998-09-16 |
| NO923321L (no) | 1992-08-25 |
| FI923707A7 (fi) | 1992-08-18 |
| CA2074523A1 (en) | 1991-08-27 |
| NO923321D0 (no) | 1992-08-25 |
| WO1991012811A1 (en) | 1991-09-05 |
| AU7747091A (en) | 1991-09-18 |
| EP0517859A4 (en) | 1993-08-04 |
| EP0517859A1 (en) | 1992-12-16 |
| AU652152B2 (en) | 1994-08-18 |
| EP0517859B1 (en) | 1998-07-22 |
| ATE168561T1 (de) | 1998-08-15 |
| DK0517859T3 (da) | 1998-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT64474A (en) | Process for producing pharmaceutical compositions containing oligonukleotides for treating and diagnostising herpes virus invections | |
| US5514577A (en) | Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses | |
| EP0544713B1 (en) | Oligonucleotides for modulating the effects of cytomegalovirus infections | |
| Pari et al. | Potent antiviral activity of an antisense oligonucleotide complementary to the intron-exon boundary of human cytomegalovirus genes UL36 and UL37 | |
| US5442049A (en) | Oligonucleotides for modulating the effects of cytomegalovirus infections | |
| US5767102A (en) | Antisense composition and method for treatment of CMV infection | |
| KR100353924B1 (ko) | 사이토메갈로바이러스 감염 치료용 조성물 및 방법 | |
| Rong et al. | Detection of herpes simplex virus thymidine kinase and latency-associated transcript gene sequences in human herpetic corneas by polymerase chain reaction amplification. | |
| NZ244820A (en) | Oligonucleotide inhibitor of epstein-barr virus. | |
| AU698089B2 (en) | Oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity | |
| Merville-Louis et al. | Varicella-zoster virus infection of adult rat sensory neurons in vitro | |
| Levina et al. | Therapeutic nucleic acids against Herpes simplex viruses (a review) | |
| Jarman et al. | LAT expression during an acute HSV infection in the mouse | |
| WO1997033992A1 (en) | Selected oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity | |
| Feng et al. | Herpes simplex virus-mediated activation of human immunodeficiency virus is inhibited by oligonucleoside methylphosphonates that target immediate-early mRNAs 1 and 3 | |
| US20250188469A1 (en) | Antiviral antisense oligomer | |
| Chiba et al. | Herpesvirus alkaline deoxyribonuclease; a possible candidate as a novel target for anti-herpesvirus therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |