KR970005273B1 - 거대세포 바이러스 감염의 효과를 완화시키기 위한 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

거대세포 바이러스 감염의 효과를 완화시키기 위한 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
거대세포 바이러스 감염의 효과를 완화시키기 위한 올리고뉴클레오티드
[도면의 간단한 설명]
제1도는 거대세포 바이러스에 대한 올리고뉴클레오티드 2725 내지 2890의 항바이러스성 활성을 나타내는 막대그래프이다.
제2도는 거대세포 바이러스에 대한 올리고뉴클레오티드 2891 내지 3300의 항바이러스성 활성을 나타내는 막대그래프이다.
제3도는 0.01 내지 10μM의 복용량에서의 8가지 올리고뉴클레오티드의 항바이러스성 활성을 나타내는 선그래프이다.
제4도는 0.01 내지 10μM의 복용량에서의 3가지 올리고뉴클레오티드의 항바이러스성 활성을 나타내는 선그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 거대세포 바이러스(cytomegalovirus)의 복제를 저해하고 거대세포 바이러스 감염을 치료하기 위해 적용될 수 있는 항감각 올리고뉴클레오티드의 설계 및 합성에 관련된 것이다. 이들 화합물들은 거대세포 바이러스들에 의하여 일어나는 질병의 심각성을 완화시키기 위하여 예방적으로 또는 치료적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에는 RNA 목표들과 특이적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체들이 기술되어 있다.
[발명의 배경]
거대세포 바이러스(CMV's)는 광범위한 범위로 자연에 존재하며, 가장 일반적으로 자궁내 감염의 원인이다. 감염된 모(母)로부터 출생한 신생아에서 흔한 선천성 감염이다. 일부 모집단(母集團)에서 아이의 10%정도가 분만시의 감염을 나타낸다. 적은 백분율의 신상아에서는 상기 감염은 여러가지 기관들을 포함하여 치명적이다. 망피 및 중추 신경 시스템의 뚜렷한 병발(involvement)은 전형적인 것이며; 또한 그 감염은 정신적 지연의 주요 원인이다. 심각하게, 선천적으로 감염된 성인의 50% 정도가 신경정신적 질병 및 난청을 나타낸다. 신경외의 기관들은 대개 만성적인 발병률(發炳率)로 위해를 받지 않기는 하나, 상기 바이러스는 수년동안 신장에서 검출될 수 있다.
성인에서, 거대세포-촉진 단핵세포증가증(mononucleosis)은 명백한 발병율을 나타내는 만성적인 병이다. 만일 면역저하된 환자에게 발병하는 경우에는, 상기 질병은 보다 심각하며, 또한 치사에 이를 수 있는 다른 감염성 병원체에 의하여 복잡해질 수 있다. 거대세포 망막염은 면역저해된 환자들에게는 매우 심각한 문제이며, 종종 실명에 이를 수 있다. 면역저하된 환자들은 또한 거대세포 바이러스 폐염에 매우 감염되기 쉬우며, 이는 가장 치명적인 인간의 바이러스성 질병들 중의 하나이다. 변형되지 않은, 동시에 감염된 T 세포들내에서 HIV의 긴 말단 반복구조(LTR)의 전사를 자극하므로써 HIV 감염의 후천선면역결핍증(AIDS)으로 진행시키는 역할을 함에도 불구하고, 후천성면역결핍증 환자로부터의 부신 및 뇌의 역사학적 검사에서 부신염, 뇌염 및 말초신경병들이 거대세포 바이러스 감염에 의하여 일어난다는 것을 암시한다.
거대세포 바이러스는 종양원성(oncogenic) 바이러스인 것으로 여겨진다. 시험관내에서, 거대세포 바이러스는 세포들로 변형되고, 성장을 자극한다. 인간 및 비-인간의 세포들은 거대세포 바이러스와 함께 배양할때 변형을 수행할 수 있다. 변형된 세포들은 적절한 동물들내로 접종하는 경우 종양원성인 거대세포 바이러스 항원들을 포함한다. 더우기, 거대세포 바이러스의 특성의 단편들은 종양원성 잠재력과 관련되어 있다.
인간의 거대세포 바이러스는 그 게놈(genome)이 길이에서 대략 240,000 뉴클레오티드인 이중-나선의 DNA 분자로 구성된 커다란, 기낭(氣囊)으로 싸여진 포진바이러스이다. 이 게놈은 모든 DNA 바이러스들 중에서 가장 복잡하며, 단순포진 바이러스(HSV)의 게놈보다 대략 50% 더 크다. 상처가 없는 바이러스성 DNA는 인접한 긴(L) 및 짧은(S) 단편들로 구성되며, 그 각각은 반복적인 시퀀스 영역의 측면에 위치한 독특한 DNA 시퀀스의 영역들을 포함한다. 여러가지 거대세포 DNA 표분들의 제한 엔도뉴클레아제(endoneuclease)형태들에서의 변형들이 역학적으로 관련이 없는 스트레인들에엇 확인될 수 있음에도 불구하고, 군(群)으로서 인간의 거대세포 바이러스 분리물들은 적어도 80% 시퀀스 적어도 80% 시퀀스 상동(homology)을 공유하여 거대세포 바이러스들을 아군(亞群) 또는 아형(亞型)으로의 분류를 거의 불가능하게 한다. 거대세포 바이러스(AD 169)의 원형 스트레인의 DNA들이 순차분석되고, 또한 줄잡아 175개의 독특한 해독상의 오픈 리딩 프레임(ORFs)을 포함하는 것으로 보고되었다. 다수이 예측된 거대세포 바이러스 유전자 생성물들이 다른 인간의 포진 바이러스 유전자와 강동을 나타낸다. 적어도 42개의 ORFs들이 가상 글리코프로테인들을 부호화하고, 그리고 다수의 거대세포 바이러스 ORFs들이 가상적으로 아미노산 상동으로 인간의 옵신(opsin) 수용체 단백질들로 단백질을 부호화한다.
허용가능한 인간의 결합조직형성세포에서, 거대세포 바이러스 유전자 발현은 전사적 수준 및 해독성 수준 모두에게 작용하는 유전적 사건들의 단(段)에 의하여 조절된다. 거대세포 유전자 발현은 최초기(immediate early; IE), 초기 및 말기로 정의되는 바와 같이 정의되는 HSV의 발현과 유사한 삼단계로 구분될 수 있다. 상기 바이러스의 흡착, 투과 및 탈피(uncoating)에 이어서, 시클로헥스이미드(cycloheximide) 등과 같은 해독 저해제등의 존재에도 불구하고 1 내지 4시간내에 최초기의 전령 RNA(IC mRNA)들인, 일 군의 바이러스성 전사물들이 합성된다. 감염의 정규과정에서, 상기 IE mRNA들은 해독되고 그리고 그들의 단백질 생성물들은 최초기전사적 사건들의 개시기에서 유용하다. 적어도 4가지의 단백질들이 IE mRNA로부터 합성되고; 그들중의 하나가 글리코프로테인이다. IE1 및 IE2 단백질들이 다른 측 유전자들에 대한 전사적 활성화 인자이고 그리고 IE3 단백질은 시험관내에서 NIH 3T3 세포들로 변형될 수 있는 CMV 게놈의 영역을 포함한다. 초기 단백질들은 바이러스성 DNA 합성에 선행하여 합성될 수 있는 mDNA들에 의하여 부호화된다. 다수의 초기 단백질들은 감염된 세포내에서 뉴클레오티드 대사 및 DNA 합성에서 중요한 역할을 한다. 바이러스성 DNA 합성의 개시후에, 말기 mRNA들의 전사는 최대이며, 유사 HSV mRNA들에 대해 관측되는 것과 유사한 풍부한 필요량의 형(template)을 반영한다. 후기 CMV 단백질은 바이러스성 기낭의 글리코프로테인 구성성분들, 성숙 CMV 입자를 모으거나 또는 구조적을 통합하기 위하여 필요하거나 또는 상기 감염된 세포들로부터 모아진 비리온을 밀어내는데 필요한 바이러스성 캡시드(capsid) 단백질들 및 다른 단백질들을 포함한다. CMV 유전자 발현에 대하여 효력있는 전사적 조절에 대해, 사전-전사적 조절들의 예들이 몇몇 CMV 단백질들의 외양에 영향을 주는 것으로 알려졌다. mRNA들의 접합이 HSV 유전자 발현에서 관측되는 것보다 더욱 일반적이며, 또한 동족의 mRNA내의 5' 비해독영역의 뉴클레오티드 시퀀스 조성이 적어도 하나의 초기 CMV 단백질의 합성에 영향을 준다는 것이 보고되었다.
다수의 항바이러스제에 대한 연구에도 불구하고 CMV에 대한 유효한 치료법이 아직 개발되지 못하였다. 인터페론, 전이 인자(transfer factor), 아데닌 아라비노시드(Ara-A), 아시클로구아노신(Acyclovir, ACV) 및 이들 약품들의 특정의 조합들이 CMV 감염을 조절하는데 효과가 없다. 증상이 나타나기 전 및 임상적 자료들을 초기로 하면, 포스카네트(forcarnet; PFA) 및 간시클로비르(gancyclovir; DHPG)는 항바이러스제로서 제한된 효과를 나타낸다. PFA 처리는 다섯명의 후천성 면역결핍증 환자에게 CMV 망막염의 분리(分利; 염증이 경감되는 것)되는 결과를 낳는다. DHPG 연구들에서는 CMV 망막염 또는 대장염에 대하여 효과를 나타낸다. DHPG가 치료된 개인들에게 내용성(耐容性)인 것으로 보여지기는 하나, 가역적인 호중구감소(neutropenia)의 출현, 장기간의 복용에 대한 CMV의 내성 스트레인의 돌발, 그리고 CMV 폐염에 대한 효능의 결여가 이 화합물의 장기간 복용을 제한한다. 급성 및 만성용으로 보다 효과적이고 덜 독성인 치료화합물들 및 방법들의 개발에 필요하다.
고전적인 치료방법들은 대개 그들 질병원인 또는 질병강화기능들을 완화시키기 위한 단백질과의 상호작용에 중점을 두었다. 이러한 치료 접근방법은 거대세포 바이러스 감염에 대해서는 실패하였다. 본 발명은 이러한 감염의 치료에 대한 다른 접근방법 및, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들의 중개를 통하여 거대세포 바이러스 유전자 발현의 항감작 억제를 제공한다.
항감작 방법은 이들 세포간 핵산들의 필수적 기능들이 정지시키도록 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드의 단일-나선 mRNA 또는 단일-나선 DNA 또는 심지어 이중-나선 DNA에의 상보적으로 혼성하는 것이다.
혼성은 RNA 또는 단일-나선 DNA와 와트슨-크리크 염기쌍에의 시퀀스 특이적 수소 결합이다. 이러한 염기쌍들은 서로에 대해 상보적인 것이라고 할 수 있다.
핵산 기능을 정지시키는 상기 사실들은 Oligonucleotides : Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton FL, (1989)에서 코헨(Cohen)에 의하여 기술되었으며, 이 사람은 두가지 가능한 형태의 말단 사실들은 제안하였다. 첫째로 혼성 포획은 올리고뉴클레오티드 저해제의 목표 핵산에 결합하고, 그에 따라서 단순 입체장애에 의하여 필수의 단백질들, 대부분 리보조옴들의 핵산에의 결합을 방지하는 종료사실을 나타낸다. Methyl phosphonate oligonucleotides; P.S Miller P.O.P Ts'O, Anti-Cancer Drug Design, Vol. 2, pp. 117-128(1987) 및 α-anomer oligonucleotides, Cohen J.S. ed., Oligonucleotides : Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC. Press, Boca Raton FL(1989)들은 혼성 포획에 의한 핵산 기능의 파과라 여겨지는 항감작 제제들에 대한 가장 광범위한 연구들에 대한 것이다.
항감작 올리고뉴클레오티드들에 대한 종료사실의 두번째 형태는 세포내 RNase H에 의한 목표 RNA의 효소적 절단을 포함한다. 반드시 디옥시리보 형태인 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오디 유사체들은 목표 RNA들과 혼성하고, 이 이중물(duplex)은 상기 RNase H 효소를 활성화하여 상기 RNA 나선을 절단하고, 따라서 상기 RNA의 정상적인 기능을 파괴한다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들은 이 형태의 종료사실에 의하여 동작하는 항감작제제의 유명한 예이다.
항감작제제로서 올리고뉴클레오니드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들의 치료목적으로의 적용에 대하여 상당한 연구들이 진행되었다. 진단제, 연구용 시약 및 강력한 치료제로서의 올리고뉴클레오티드의 적용에 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들이 대량으로 합성되어야 하고, 세포막들을 통하여 이동하거나 또는 세포들에 의하여 섭취되고, 목표된 RNA 또는 DNA을 적절하게 혼성되고, 그리고 계속해서 핵산기능을 종료시키거나 또는 파괴되어야 한다는 것을 필요로 한다. 이들의 임계 기능들을 뉴클레아제 분해로의 올리고뉴클레오티드들의 초기 안정성에 의한다.
뉴클레아제에 대한 저항성을 나타내고, RNase H 종료사실을 활성화시키고 그리고 목표 RNA(또는 DNA)에 적절한 강도로 확실하게 혼성되도록 변형된 올리고뉴클레오티드들 및 유사체들이 거대세포 바이러스에 대한 항감작 올리고뉴클레오티드 진단제, 치료체 및 연구용으로 매우 필요하다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 거대세포 바이러스의 전령 RNA와 혼성하여 전령 RNA의 기능을 억제하는 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클에오티드 유사체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스의 전령 RNA와의 항감작 상호작용을 통하여 거대세포 바이러스의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 동물들에게 거대세포 바이러스를 진장하고 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 거대세포 바이러스를 포함한다고 여겨지는 샘플내에 거대세포 바이러스 존재 또는 부재를 검사하는 방법, 물질 및 킷트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 신규한 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적들 및 다른 목적들은 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위를 검토하므로써 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 명백하게 될 것이다.
[발명의 요약]
본 발명에 따라 거대세포 바이러스 감염의 영향을 조절하는 방법을 제공한다. 거대세포 바이러스 RNA의 선택적 시퀀스와 특이적으로 혼성할 수 있는 뉴클레오티드 염기들의 시퀀스를 갖는 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들을 제공한다. 1E1, 1E2 또는 DNA 폴리머라아제 단백질들을 부호화하는 목표 거대세포 바이러스 mRNA가 이들 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들로의 유효한 항감작요법의 열쇠이다. 거대세포 바이러스 감염을 갖는 것으로 여겨지는 동물들에 약제학적으로 수용 가능한 담체와 함께 올리고뉴클레오티드들 올리고뉴클레오티드 유사체들을 단독으로 또는 혼합하여 적용함으로써 질병상태를 치료하는 방법들을 제공한다.
이러한 관계를 대개 항감작이라고 언급한다. 상기 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 RNA의 기능 즉, 단백질내로의 해독이나 세포질내로의 전좌(轉座) 또는 전체 생물학적 기능에 필요한 어떠한 다른 활성을 저해할 수 있다. RNA의 그 기능의 전부 또는 일부를 수행의 실패는 상기 바이러스의 정상적인 생활 주기를 조절하는 게놈의 일부의 부전이라는 결과를 낳는다.
거대세포 바이러스 감염에 대하여 거대세포 바이러스 감염을 완화시키는데 유효한 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들을 설계하는 것이 가능하다. 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들이 대략 5 내지 50개의 핵산염기단위를 갖는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들이 CMV 1E1, 1E2 또는 DNA 폴리머라아제 단백질들을 부호화하는 mRNA와 특이적으로 혼성할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드 유사체는 뉴클레아제 내성이 감소되고 그리고 그들의 효율이 증가되도록 변형될 수 있다.
상기 바람직한 구체예에 따라, 상기 mRNA CMV 복제를 저해하기 충분한 정도로 상호작용될 수 있다. 따라서, CMV mRNA의 일부들과 상호작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들이 파악되었다. 상기 질병을 갖는 것으로 여겨지는 동물들을 본 발명에 따라 제조된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체와 접촉시킨다. 특히, 본 발명은 거대세포 바이러스 감염을 예방적으로 또는 치료적으로 처리하는데 유효한 것으로 여겨진다.
[바람직한 구체예의 상세한 설명]
항감작 올리고뉴클레오티드들이 많은 인간 질병들의 치료용의 치료제로서 커다란 잇점을 갖는다. 올리고뉴클레오티드들은 와트슨-크리크 염기쌍에 의해 한정된 바와 같이 전(前)-mRNA 또는 성숙 mRNA 두가지 모두의 보족 시퀀스에 특이적으로 결합하여 DNA으로부터 단백질로의 유전정보의 흐름을 저해한다. 목표 단백질을 연구하기 위한 생화학적 도구로서의 항감작 올리고뉴클레오티드들의 활용에 대하여 다수의 최근의 연구들의 기록이 있다. Rothenberg et. al., J. Natl. Cancer Inst. 81 : 1539-1544(1989); Zon, G. Pharmaceutical Res., 5 : 539-549(1987)을 참조하시오. 올리고뉴클레오티드 화학, 뉴클레아제-내성 올리고뉴클레오티드들의 합성 그리고 증가된 세포 섭취를 나타내는 올리고뉴클레오티드 유사체들의 형태의 획득 가능성 등에서의 최근의 진보로 인하여, 신규한 형태의 치료제로서 항감작 올리고뉴클레오티드들의 사용을 고려하는 것이 가능하게 되었다.
치료용으로, 거대세포 바이러스 감염을 갖는다고 여겨지는 동물을 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들로 처리한다. 당해 기술분야에서 통상적으로 숙련된 자는 적절한 복용량, 복용방법 및 반복횟수들을 쉽게 결정할 수 있다. 이러한 치료는 일반적으로 치료가 되거나 또는 질병상태의 저하가 달성될 때까지 계속된다.
다른 종들로부터의 거대세포 바이러스의 DNA와 동일한 종내에서의 다른 형태들로부터의 거대세포 바이러스의 DNA의 차이점이 존재한다고 여겨진다. 따라서, 예를 들어 다양한 거대세포 종들의 영역들이 각각의 종들에 대하여 동일한 기능을 제공하고, 또한 유전정보의 발현과의 상호작용이 여러가지 종들에서 유사한 결과들을 제공한다고 고려진다. 의심할 여지없는 종들간의 뉴클레오티드 시퀀스에서의 차이점이 존재함에도 불구하고 상기와 같다고 여겨진다.
따라서, 본 명세서에서 규정된 뉴클레오티드 시퀸들은 기술되는 특정의 종들에 대한 표현이라고 이해될 수 있다. 거대세포 바이러스의 다른 종들에 대한 동종의 또는 유사한 시퀀스들이 본 발명의 범위내에서 특별히 주의 깊게 관찰하였다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들을 거대세포 바이러스 RNA의 기능의 항감작 저해에 사용하였다. 본 발명의 명세서 중에서, 올리고뉴클에오티드라는 용어는 천연적으로 발생하는 염기들과 펜토푸라노실 그룹들이 천연의 포스포디에스테르 결합에 의하여 결합되어 형성된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 천연적으로 발생한 종들 또는 천연적으로 발생하는 서브유니트들 또는 그들과 밀접한 동족체들로부터 형성된 합성종들을 효과적으로 의미한다.
본 발명과 관련하여 사용된 용어로서의 올리고뉴클레오티드 유사체는 올리고뉴클레오티드들과 유사한 기능을 하나 비-천연적으로 발생하는 부분들을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 유사체들은 당 부분들 또는 당 사이의 결합들로 변경할 수 있다. 이들중의 예들에는 당해 기술분야에서 사용되는 것으로 알려진 포스포로티오에이트 및 다른 황-함유 종들이 있다. 몇몇 바람직한 구체예에 따르면, 그 활성을 조절할 RNA 또는 DNA가 위치하는 영역내로 투과하는 능력을 증가시키도록 기능하는 구조로 상기 조성물들이 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 결합들의 적어도 일부를 치환한다. 이러한 치환들에는 포스포로티오에이트 결합, 메티포스포네이트 결합, 또는 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 구조를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 포스포로티오에스테르 결합들은 실질적으로 비-이온성, 비-키랄성 또는 키랄이며 광학이성질적으로 특이한 구조로 치환된다. 당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게는 본 발명의 실용에 사용되는 다른 결합들을 선택할 수 있을 것이다.
올리고뉴클레오티드 유사체들은 또한 적어도 일부가 변형된 염기 형태들을 포함하는 종들을 포함한다. 따라서, 천연적으로 발견되는 것들과는 다른 푸린 및 피리미딘들이 사용될 수도 있다. 유사하게, 본 발명의 필수적인 요지들을 고수하는 한 상기 뉴클레오티드 서브유니트들의 펜토푸라노실 부분들상에 대한 변형들 또한 일어날 수 있다.
이러한 유사체들은 천연의 올리고뉴클레오티드(또는 천연의 계열을 따라 합성된 올리고뉴클레오티드)들과 교체할 수는 있으나, 천연의 구조와는 하나 또는 그 이상의 다른점들을 갖는 것으로 잘 설명될 수 있다. 모든 이러한 유사체들은 이들이 거대세포 바이러스와 효과적으로 혼성하도록 기능하는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 상기 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 바람직하게 대략 3 내지 대략 50개의 핵산염기단위들을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드들 및 유사체들이 대략 8 내지 대략 25개의 핵산염기단위들을 포함하는것이 더욱 바람직하며, 대략 12 내지 대략 25개의 핵산염기단위들을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 이해될 수 있는 바와 가이, 핵산염기단위는 포스포디에스테르 또는 다른 결합들을 통하여 인접한 핵산염기단위와 적절하게 결합된 염기-당 조합이다.
본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오티드들 및 유사체들은 솔리드 페이스 신디시즈(solid phase synthesis) 등의 가지의 기술을 통하여 편리하게 그리고 일정하게 제조할 수 있다. 이러한 합성용의 장치는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)를 포함한 여러 공급업자들에 의하여 판매되고 있다. 이러한 합성에 대하여 다른 수단들이 사용딜 수도 있으나, 올리고뉴클레오티드들의 실제의 합성은 판에 박힌 일을 하는 사람의 재능의 범위내에 속한다. 포스포로티오에이트들 및 알킬화 유도체 등과같은 다른 올리고뉴클레오티드 유사체들을 제조하는데 다른 기술들이 사용될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 당해 기술분야에서 통상의 기술을 갖는 사람들은 전령 RNA가 세개의 문자 유전코드를 사용하여 단백질을 부호화하는 정보 뿐만아니라 리보뉴클레오티드들과 연계하여 5'-비해독 영역, 3'-비해독 영역 및 인트론/액스 접합 리보뉴클레오티드들과 연계하여 5'-비해독 영역, 3'-비해독 영역 및 인트론/액슨 접합 리보뉴클레오티드들로 알려진 영역을 형성하는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 본 발명에 따라 구체화될 수 있으며, 이는 정보를 주는 리보뉴클레오티드들과 마찬가지로 이들 관련된 리보뉴클레오티드들을 전체적으로 또는 부분적으로 목표로 하고 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 유사체들은 전사개시자리, 해독개시자리, 인트론/액슨 접합 또는 5' 또는 3'-비해독 영역들과 특이적으로 혼성한다.
인간거대세포 바이러스 게놈은 그 게놈 구조의 견지에서 포진 바이러스 중 가장 복잡하다. 인간거대세포 바이러스의 복제-결함 돌연변이들은 단지 두개의 바이러스 유전자, 최초기 착물(1E1 또는 1E2) 및 DNA 폴리머라아제만이 단리되었다. 이들 유전자들은 인간거대세포 바이러스 유전자 발현에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 이들은 항감작 화합물 설계를 위한 일차 목표로서 선택되었다. 치료용의 항감작 올리고뉴클레오티드들 및 유사체들의 설계를 위한 2차 목표 유전자들은 단순포진 바이러스의 유전자들과 유사하게 선택되었다. 이러한 유전자들은 단순포진 바이러스 복제 및/또는 항감작 저해 감작용으로 필수적인 것으로 결정되었다. 항감작 저해에 감작인 것으로 최근 밝혀진 단순포진 바이러스 4가지 유전사 생성물들은 비리온 외피 단백질(UL48), 리보뉴클레오티드 환원효소를 구성하는 두개의 단백질(UL39, UL40) 및 비리온 포스포트랜스퍼라아제(UL13)들이다. 최근 연구되고 있는 다른 단순포진 바이러스 유전다들은 보족 DNA 복제 효소들(UL5,8,9,29,42 및 52)과 주 캡시드 단백질(UL36)들이다. 인간거대세포 바이러스는 기능면에서 이들 단순포진 바이러스 단백질들 각각에 잠재적으로 유사한 것으로 확인된 단백질들을 부호화하며; 이들 유전자들은 본 발명과 관련하여 이차 목표로서 사용되도록 선택되었다.
인간거대세포 바이러스에서 최초기 전사의 분자생물학은 성숙핵 세포내에서의 어떠한 전사적 유니트의 최초기 전사와 같은 것으로 밝혀졌다. 간단하게, 주요 최초기 전사물(1E1)의 합성은 다수의 mRNA 캡자리의 5' 반복단위에 의하여 조절된다. 이들 반복들은 세포-특이성 및 분화 특이 방법들에서 작동하는 것으로 알려진 다수의 전사적 대응 분자들에 대응하는 것이다. 상기 1E1 mRNA는 1.9kb의 길이의 풍부한 RNA이며, 또한 PAGE-SDS에 대한 72kDa의 분자량으로 이동하는 단백질을 부호화한다. 이 단백질은 비리온들에서 밝혀졌으며, 1E2 유전자 생성물의 발현과 마찬가지로 그 자체의 발현을 조절한다. 최초기의 개시상태에서, 단지 1E1 mRNA가 세포상 RNA 폴리머라아제에 의하여 합성된다. 소량의 1E2 mRNA는 감염의 초기 동안에의 1E1 mRNA의 처리에 의하여 제조될 수 있다. 상기 시간에 걸쳐, 1E1 단백질의 수준들은 축적되고 그리고 1E1 유전자의 프로모터의 영역을 결합하여 1E1 mRNA의 그 이상의 전사를 억제하고 그리고 1E2에 대한 프로모터의 보다 약한 다운스크림을 허용하여 1E2 mRNA의 그 이상의 합성을 조절한다. 1E1 유전자 생성물이 생산성 감염 동안의 바이러스성 전사를 촉진하고 그리고 다른 방법으로 잠복하고 있는 상태로부터의 바이러스성 유전자 발현을 활성화하도록 작용한다. 1E1 유전자의 프로모터의 세포-형 관측 및 분화 또는 호르몬성 응답요소들이 본 제안과 일치한다. 상기 1E2 단백질은 다른 기지의 세포상 및 바이러스성 발생(origin)의 단백질의 처리로 알려진 것과 유사한 방법으로 많은 인간거대세포 바이러스의 초기 및 말기 단백질들 전사적으로 활성화시킬 수 있다. 따라서, 상기 1E2 단백질은 인간거대세포 바이러스 유전자 발현의 중심 스위치의 하나라고 여겨진다. 거대세포 바이러스 유전자들의 다른 조절 스위치는 DNA 폴리머라아제 단백질이다. 말기 바이러스성 유전자들의 전사는 바이러스성 DNA 복제의 개시까지 매우 낮은 수준으로 작동하고, 그후에 말기 유전자들은 증가된 템플레이트 유용성에 의하여 활성화된다. 상기 증가된 템플레이트 유용성에서 유효한 정확한 분자 상태가 명백하지 않지만, 상기 바이러스성 DNA 폴리머라아제의 존재 및 상기 게놈의 복제는 관측된 효과에 필수적인 요건들이다.
상기 mRNA 시퀀스 내에서의 선택된 목표들은 mRNA 안정성, 처리 및/또는 전사적 효율을 조절하는 것으로 알려진 mRNA의 영역들을 포함한다. 이들 목표자리들은 5' 캡 영역들 및 전사개시조절영역들을 포함한다. 1E1, 1E2 및 DNA 폴리머라아제 유전자들에 대한 상기 목표 시퀀스를 표1에 규정하였다.
표1에서, 약자 I/E는 인트론/액슨 접합을 의미하는 한편 상기 AUG 영역은 전사가 1E2 특이적 프로모터 영역에 의하여 조절되는 1E2 mRNA의 전자개시영역이다. 약어 nuc sig는 상기 1E2 단백질의 핵 편재신호들을 의미한다.
본 발명에서 유용한 올리고뉴클레오티드들 또는 유사체들은 DNA(특히 인트론/액슨 접합들에는 향하는 올리고뉴클레오티드들에 대하여)에 또는 대응하는 전령 DNA(mRNA) 또는 전-전령 RNA(pre-messenger RNA)에 보족이다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 올리고뉴클레오티드들 및 유사체들은 바람직하게 앞서의 시퀀스들중의 하나 또는 그의 유효한 영역을 갖는다. 따라서, 상기에서 규정한 이들 올리고뉴클레오티드들(또는 그들의 유사체들) 또는 당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자가 상기 바이러스성 감염의 조절을 위한 바람직한 항감작 목표들에 대한 지식으로부터 제조할 수 있는 유사한 뉴클레오티드들중의 어느것이나 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 진단, 치료 및 연구용 시약들과 키드등으로 사용될 수 있다. 치료용으로는, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 거대세포 바이러스 감염으로부터 고통을 받는 동물들에 투여한다. 본 발명에 따른 치료제를 정맥내, 피내 또는 근육내 등과 같이 내측으로 적용시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 국소적 또는 아강(亞綱)내 등과 같은 다른 형태의 적용 또한 가능하다. 현재 좌약내의 봉입이 유용할 것이라 여겨진다. 예방의학에서의 본 발명의 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들의 사용 또한 유용한 것으로 여겨진다. 이는 예를 들명, 콘돔 등의 코팅용 약제를 제공함으로써 수행될 수 있다. 몇몇 구체예에 대하여는 약제학적으로 수용가능한 담체들의 사용이 또한 바람직하다.
본 발명의 또한 진단용 연구용으로 유용하다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드 유사체들이 거대세포 바이러스의 핵산과 혼성할 수 있기 때문에, 이러한 사실을 조사하기 위하여 샌드위치(sandwich) 분석기술 및 다른 분석기술들을 용이하게 확립할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 유사체들과 거대세포 바이러스를 포함하는 것으로 여겨지는 샘플내에 존재하는 거대세포 바이러스의 혼성을 검출하는 수단을 정형적으로 수행될 수 있다. 이러한 수단은 효소 공역(共役), 방사상 표지 또는 다른 어떠한 적절한 검출 시스템들을 포함한다. 거대세포 바이러스의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트 또한 준비될 수 있다.
구체예
구체예 1
세포 및 바이러스 : 사용된 인간 포피 결합조직형성세포(ATCC #CRL 1635)들은 미합중국모식균배양수집(American Tissue Culture Collection)으로부터 얻었다. 배양물은 10%의 어린 송아지의 혈청(FBS), 페니실린(100단위/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖) 및 L-글루타민(2mM)로 보충된 4.5g/L을 갖는 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Engle's Medium; 높은 농도의 글루코스 DMEM)에서 성장시켰다. 인간거대세포 바이러스(HCMV 스트레인 AD169 또는 타운(Towne))의 스톡(stock) 배양물은 낮은 다중 감염(감염의 다중도 [MOI]=0.02 반점형성단위 [PFU]/세포)을 사용하여 포피 세포상에서 성장시켰다.
거대세포 바이러스 감염을 저해하는 올리고뉴클레오티드들의 능력을 검증하기 위해서는, 감염성수율분석을 사용할 수 있다. 이 분석을 수행하기 위해서는, 휄콘 6웰 조직배양 플레이트(Falcon 6 well tissue culture plate)들 내에서 웰 당 5x105세포들의 농도로 포피 세포들을 파종하였다. 세포들을 2㎖이 배지(10% FBS를 갖는 농은 농도의 글루코스 DMEM)위에 덧칠하고, 37℃에서 18 내지 24시간동안 배양시켰다. 적절한 곳에서, 상기 플레이트들의 파종후에 24시간에서 1㎖의 매질에 올리고뉴클레오티드 제제물을 덧칠하였다. 18시간의 배양후에, 모든 웰들을 포스페이트로 완충된 식염수로 세척해내고, 감염의 다중도를 변화시키면서 0.5㎖의 무혈청의, 높은 농도의 글루코스 DMEM내에 현탁시킨 인간거대세포 바이러스로 감염시켰다. 교반 플랫폼(rocking platform)상에서 바이러스 및 세포들을 37℃에서 90분동안 배양시켰다. 바이러스 흡착후에, 미흡착된 바이러스를 포스페이트로 완충시킨 식염수로 세척해낸다. 적절한 곳에서, 10μM 농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1㎖의 배지(10% FBS를 갖는 높은 농도의 클루코스 DMEM)를 상기 웰에 가하고 그리고 상기 세포들을 37℃에서 4 내지 5일 동안 배양시켰다. 대조 웰에는 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는 1㎖의 배지를 수용한다.
바이러스를 상기 덧칠한 배지내로 수확하고 그리고 각 실험점들의 3벌의 웰들을 결합시켰다. 상기 현탁액을 -80℃에서 냉동시켰다. 인간 포피세포단층에 대한 반점분석에 의하여 각 샘플에 대하여 바이러스 역가(力價)를 결정하였다. 각 바이러스 제재의 희석물을 준비하고 그리고 교반하면서, 90분동안 각 희석물의 이중의 분취를 포피 세포상에 흡수시켰다. 흡착후에, 상기 플레이트들을 포스페이트로 완충시킨 식염수로 세척하므로써 미흡착된 바이러스 접종물을 제거하고, 그리고 상기 세포들을 5% FBS 및 0.75% 메틸셀룰로오스를 포함하는 2㎖의 높은 농도의 글루코스 DMEM에 덧칠하였다이 세포들을 37℃에서 12 내지 14일동안 배양시킨 후 반점들을 포르말린으로 고정시키고, 크리스탈자(crystal violet)으로 채색하고 계수하였다. 처리된 웰들로부터의 반점의 수를 대조 웰들과 비교하여 감염 바이러스 생산의 저해의 정도를 측정하였다.
CMV 1E1, 1E2 또는 DNA 폴리머라아제에 대해 시퀀스 보족성을 나타내는 10μM 농도의 포스포르티오에이트 올리고뉴클레오티드의 거대세포 바이러스 감염된 세포들의 처리는 바이러스의 감염 수득율을 90%로 감소시킬 수있음을 나타낸다.
구체예 2
활성 거대세포 바이러스 항감작 화합물들의 작용의 메카니즘 또한 평가되었다. 작용 연구의 어떠한 메카니즘의 분자성 속성은 올리고뉴클레오티드 저해의 목표인 거대세포 바이러스 유전자 시퀀스에 의하여 기술되었다. 가장 직접적인 분석방법은 상기 목표 거대세포 바이러스 유전자에 의하여 부호화된 단백질의 생물학적 작용의 잇점을 취한다. 효소적 단백질의 생물학적 활성은 종종 상기와 같은 분석의 최종 신호를 증폭하여 상기 분석방법이 바이러스성 단백질 수준에서의 작은 변화들에 조차 매우 민감하게 되도록 한다. 이들 분석방법들의 형태로 변형할 수 있는 거대세포 바이러스 유전자등의 예들에는 DNA 폴리머라아제 및 IE1 및 2자리들이 있다.
상기 DNA 폴리머라아제 단백질에 대하여는, 단순한 기계적 분석방법에는 세포상 DNA 폴리머라아제 활성보다 바이러스성 DNA 폴리머라아제 활성에 더 좋은 조건들하에서 바이러스성 DNA 내로의3H-티미딘의 개재를 저해하는 목표 특이성 올리고뉴클레오티드들의 능력을 평가하는 것이 포함한다. 일정한 거대세포 바이러스 유전자들의 RNA 합성을 처리하는 거대세포 바이러스 IE 단백질들의 능력은 일시적인 유전자 발현분석을 고안하는데 사용하였으며, 그 활성은 감염된 세포내의 생물학적 활성인 IE1 또는 IE2 단백질들의 존재에 따른다. 간단하게, IE1 또는 IE2 응답 프로모터 영역들은 플라스미드 벡터내의 5' 표시 유전자(예를 들어, 세균성 클로람페닐콜 아세틸 트랜스퍼라아제, CAT)를 복제한다. 상기 벡터는 인간 포피 세포들내로 도입되고, 이는 차례로 인간거대세포 바이러스로 감염된다. 클로람페니콜 아세틸 트랜스 퍼라아제에 대한 올리고뉴클레오티드들의 영향은 IE1 및 IE2 두가지 모두의 응답 제조물들과 비교될 수 있다.
명백한 생물학적 활성이 쉽게 증명되지 아니하는 경우에 있어서는, 단백질 수준내에서의 올리고뉴클레오티드-자극 변화들은 감염된 세포 단백질들의 면역침전(immunoprecipitation), SDS-아크릴아미드 매트릭스 내에서의 면역침전의 겔 전기영동 및 상기 겔의 방사산도에 의한 목표 단백질 수준의 검출에 의하여 결정될 수 있다. 분석가능한 생물학적 활성의 단백질들 또한 명역침전 및 겔 전기영동등 기술들에 의하여 정량화될 수 있다.
구체예 3
거대세포 바이러스 항감작 약제의 역가는 역으로 숙주세포 기능에 영향을 주지 않고 거대세포 바이러스 목표들과 특이적으로 상호작용할 수 있는 능력에 크게 의존한다. 따라서 비특이적 상호작용들 및 활성 화합물들의 독성들에 대한 잠재를 평가하는 것이 중요하다. 이들 역반응들에 대한 잠재는 다수의 급성 및 만성의 세포독성의 모델에서 접근하였다. 우선,3H-류신 및3H-티미닌을 사용하여 감염된 인간포피 세포들에서 활성 화합물들의 독성을 평가하여 단백질 및 DNA 합성 각각에 대한 영향을 측정하였다. 일차 및 이차 활성 분석에서 얻어진 이들 분석방법들에서 올리고뉴클레오티드 LD50 및 ID50 활성 역가들의 결정으로부터 각 활성 올리고뉴클레오티드 화합물에 대한 치료지표(therapeutic index; T.I.)를 결정하였다. 단지 100이상의 치료지표를 나타내는 이들 화합물들에 대하여만 후속되는 평가를 고려하였다.
구체예 4
올리고뉴클레오티드들 및 유사체들의 합성 및 특성화; 표준 포스포로아미다이트화학을 사용하여 요오드에 의한 산화시켜 자동화된 DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템즈 모델 380비(Applied Biosystems model 380B)상에서 합성하였다. β-시아노에틸디이소프로필포스포르아미다이트(-cyanothyldiisopropylphosphoramidite)는 플라이드 바이오시스템즈사(켈로포니아주 포스터 시 소재)로부터 구입하였다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들에 대하여는, 아세토니트릴내의 3H-1,2-벤조디티올-3-은 1,1-디옥사이드의 0.2M 용액을 표준 산화병 내에 위치시키고, 포스파이트 결합을 단계적으로 티아화(thiation)시켰다. 상기 티아화 사이클 정지 단계를 68초까지 증가시키고 계속해서 캡핑(capping) 단계를 수행하였다.
2'-O-메틸 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들은 테트라졸 및 염기의 간헐적 분배를 360초까지 증가시킨 후의 정지 단계를 제외하고는 2'-O-메틸 β-시아노에틸디이소프로필포스포르아미다이트(매사츄세츠주 니드햄 소재 켐젠스(Chemgenes))와 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드들에 대한 표준 사이클을 사용하여 합성하였다. 상기 합성의 개시에 사용된 상기 3'(?)-염기는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
조절된 다공성 유리관(어플라이드 바이오시스템즈)으로부터의 절단 및 55℃에서 18시간동안 진한 수산화암모늄내에서의 블로킹 해제후에, 상기 올리고뉴클레오티드들을 2.5용적 에탄올 내의 0.5M 염화나트륨에서 2회 침전시켜 정제하였다. 20% 아크릴아미드, 8M 요소, 45mM 트리스-보레이트 완충제, ph 7.0에서 분석적 겔 전기영동을 수행하였다. 전기영동으로부터 올리고뉴클레오티드데옥시뉴클레오티드들 및 그들의 포스포로티오에니트 유사체들이 전체 길이 물질에서 80%보다 더 큰 것으로 판정되었다.
구체예 5
항감작 올리고뉴클레오티드들에 의한 인간거대세포 바이러스 복제의 저해에 대한 엘리사(ELISA) 분석 : 인간거대세포 mRNA에 보족인 올리고뉴클레오티드들을 인간거대세포 바이러스 복제의 엘리사-염기 분석에서의 항바이러스성 활성에 대하여 시험하였다. 정상적인 인간 피부의 결합조직형성세포(캘포니아주산 디에고 소재 클로틱스)를 무혈청의 배지에서 성장시키고 96-웰 플레이트에 파종하는데 사용하였다. 대략 80%의 세포들이 융합하는 때에, 이들은 올리고뉴클레오티드들로 전처리하였다. 전처리후 대략 20시간후에 상기 배지(올리고뉴클레오티드들을 함유하는)를 조심스럽게 딸아내고 그리고 상기 세포들을 가열한 결합조직형성세포 기저의 배지(FBM : fibroblast basal medium : 클로틱스)로 2회 세척하였다. 그다음에 세포들을 FBM에 희석시킨 인간거대세포 바이러스 스톡으로 100㎕/웰로 감염시켰다. 상기 플레이트들을 37℃에서 배양시키고, 그 다음에 FBM에 희석시킨 올리고뉴클레오티드 5㎕를 각 웰내의 배지내로 재도입시켰다. 이틀후, 세포들을 다시 동일한 방법으로 전-처리하였다ㅣ 6일째, 상기 플레이트들을 엘리사 분석에 맞도록 준비하였다.
엘리사 분석에 대한 준비에서, 상기 배지를 상기 플레이트로 조심스럽게 딸아내고 그리고 세포들을 각 웰당 200㎕의 무수에탄올로 고정시켰다. 세포들을 실온에서 30분동안 고정시킨후, 그 다음에 에탄올을 제거하고 그리고 플레이트들을 공기-건조시켰다. 엘리사 분석에 앞서 2%의 BSA를 함유하는 PBS로 1시간동안 플레이트들을 블로킹시켯다. 블로킹 용액을 제거하고, 1%의 BSA를 함유하는 PBS에 1 : 2000으로 희석시킨 100μL의 항-거대세포 바이러스 항체를 가하였다. 항체내에서 세포들을 37℃에서 1시간동안 배양시키고 그리고 PBS로 3회 세척하였다. 이차 항체, 비오티닐화 고우트 안티-마우스 IgG(메릴랜드주 소재 배데스다 리서치 라보레토리즈)를 1%의 BSA를 함유하는 PBS에 1 : 1000으로 희석시키고, 그리소 상기 세포들과 함께 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 그다음에 세포들을 세척하고 그리고 37℃에서 1시간동안 스트렙타비딘-B-D-갈락토시다아제(streptavidin-B-D-galactosidase)내에서 배양시켰다. 20㎎의 클로로페놀 레드-B-D-갈락토시다아제(chlorophenolred-B-D-galactosidase)를 10㎖의 50mM 나트륨 포스페이트, 1.5mM MgCl2에 용해시킨 용액으로 색을 전개시키고 : 플레이트들을 10분동안 흔들어 준 후 575nm에서 그 흡광도를 측정하였다.
항바이러스성 활성에 대하여 인간거대세포 바이러스에 보족인 24개의 올리고뉴클레오티드들을 시험하였다.이들 올리고뉴클레오티드들에 대한 상기 시퀀스들 및 유전자 목표들을 표2에 나타내었다.
올리고뉴클레오티드들의 시험에서, 8개는 상기 인간거대세포 바이러스 DNA 폴리머라아제를 부호화하는 mRNA에 보족이며, 나머지들은 인간거대세포 바이러스의 최초기의 주요 프로모터로부터 전사된 RNA에 보족이다. 이들 유전 영역으로부터의 두가지 주요 단백질 생성물들이 공통 프로모터로부터 전사된 전력 RNA로부터 합성되기 때문에, 이들 화합물들 중 8개가 IE1 및 IE2 mRNA 두가지 모두에 보족이다. 3개의 화합물들이 단지 IE1 및 IE2 mRNA에 보족이다. 3개의 화합물들은 단지 IE1 mRNA에만 보족이며, 또한 나머지 5개가 IE2 mRNA에 특이적이다.
5μM의 스크리닝 농도에서 단지 하나만을 제외한 미처리된 세포들과 비교하여 바이러스성 복제의 어느정도의 감소를 나타낸다(제1도 및 제2도). 몇몇 화합물들은 대조 올리고뉴클레오티드들 보다 뚜렷하게 큰 바이러스성 복제의 저해를 나타내고 그리고 이들은 이들을 선택하여 더욱 특성화시켰다.
항감작 올리고뉴클레오티드들에 의한 인간거대세포 바이러스 복제의 비특이성 효과들 및 시퀀스-특이성 저해 사이의 복용량-의존 실험들을 차별화하였다. ISIS 2922(시퀀스 확인번호 : 22), ISIS 2882(시퀀스 확인번호 : 12), ISIS 2918(시퀀스 확인번호 : 18), ISIS 2919(시퀀스 확인번호 : 19) 및 ISIS 330(시퀀스 확인번호 : 24, P=S/2'-O-Me)화합물 모두는 인간거대세포 바이러스에 대하여 비보족성인 불규칙화된 올리고뉴클레오티드들 보다 낮은 복용량에서 인간거대세포 바이러스 복제의 저해를 나타낸다(제3도). ISIS 2818(시퀀스 확인번호 : 18), ISIS 2919(시퀀스 확인번호 : 19) 및 ISIS 2922(시퀀스 확인번호 : 22)는 IE2 RNA 시퀀스들에 대하여 보족이다. ISIS 2882(시퀀스 확인번호 : 12) 및 ISIS 3300(시퀀스 확인번호 : 24, P=S/2'-O-Me)는 IE1 및 IE2 전사물의 5' 캡 영역에 대하여 보족이다. 표 2에 나타낸 것을 제외하고는, 사용된 올리고뉴클레오티드들은 포스포로티오에이트들이며; ISIS 300은 포스포로티오에이트 결합들로 2'-O-메틸-변형시킨 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 이중 변형은 포스포로티오에이트(ISIS 3246, 중간정도의 활성) 또는 2'-O-메틸 변형(ISIS 3258, 약간의 활성) 단독으로보다 올리고뉴클레오티드에 대한 보다 강한 항바이러스성 활성을 수행하는 것으로 나타났다. 불규칙화된 대조 올리고뉴클레오티드와 비교한 ISIS 2919 및 ISIS 2922의 활성을 비의존성을 복용량-응답 실험에서 확인하였다(제4도).
시퀀스 리스팅
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인 : 케빈 피. 앤더슨
케네스 지. 드레퍼
(ⅱ) 발명의 명칭 : 거대세포 바이러스 감염의 효과를 완화시키기 위한 올리고뉴클레오티드
(ⅲ) 시퀀스의 수 : 27
(ⅳ) 주소 :
(a) 주소자 : 우드콕 워시번 커츠 매키비츠 앤드 노리스
(b) 거리 : 원 리버티 플레이스-46층
(c) 도시 : 필라델피아
(d) 국가 : 미합중국
(e) ZIP코드 : 19103
(ⅴ) 컴퓨터 가독형태
(a) 매개형 : 디스켓 3.5인치, 1.44Mb 용량
(b) 컴퓨터 기종 : IBM PS/2
(c) 운용체계 : PC-DOS
(d) 소프트웨어 : 워드퍼팩트 5.0
(ⅵ) 현 출원자료 :
(a) 출원번호 :
(b) 출원인 : 동시
(c) 분류 :
(ⅷ) 변리사/대리인 정보 :
(a) 성명 : 제인 엠. 리카타
(b) 등록 번호 : 32,257
(c) 참고 번호 : ISIS-0408
(ⅸ) 통신정보 :
(a) 전화 : (215) 568-3100
(b) 텔레팩스 : (215) 568-3439
(2) 시퀀스 검증번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 1 :
GTGTCAAGTG GCACCATACG 20
(2) 시퀀스 검증번호 2에 대한 정보
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 2 :
TGGAAAGTGT ACACAGGCGA A 21
(2) 시퀀스 검증번호 3에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 3 :
GGGTTGAAAA ACATAGCGGA C 21
(2) 시퀀스 검증번호 4에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 20 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 4 :
GACGGACTCCA TCGTGTCAAG 20
(2) 시퀀스 검증번호 5에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 5 :
GTGGGCCATG ATGATGGAAG G 21
(2) 시퀀스 검증번호 6에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 6 :
GTCCCGTAGA TGACCCGCGC C 21
(2) 시퀀스 검증번호 7에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 7 :
CGGCGCAGAT TGCAAGGGCG G 21
(2) 시퀀스 검증번호 8에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 8 :
GCCGGAGCCG GGTGAAACGC C 21
(2) 시퀀스 검증번호 9에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 9 :
CGCCGTCCGG ACACCGGGCG C 21
(2) 시퀀스 검증번호 10에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 10 :
ACCGGGAAAC CACGCCGGCG G 21
(2) 시퀀스 검증번호 11에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 11 :
CCGCGCCCTC TTCTTTGCCG G 22
(2) 시퀀스 검증번호 12에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 12 :
GGTACTTACG TCACTCTTGG C 21
(2) 시퀀스 검증번호 13에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 13 :
GACGGTGACT GCAGAAAAGA C 21
(2) 시퀀스 검증번호 14에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 14 :
GACACGTACC GTGGCACCTTG G 21
(2) 시퀀스 검증번호 15에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 20 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 15 :
GTCTCGGGCC TAAACACATG 20
(2) 시퀀스 검증번호 16에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 20 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 16 :
CAGACTTACC GACTTCTGCC 20
(2) 시퀀스 검증번호 17에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 20 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 17 :
CTGTTTGACT GTAGAGGAGG 20
(2) 시퀀스 검증번호 18에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 18 :
GGGTCCTTCA TCTGGGAGAG C 21
(2) 시퀀스 검증번호 19에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 19 :
CGGCTCAGGT CGTCAATCTT G 21
(2) 시퀀스 검증번호 20에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 20 :
GCGCACCATG ACCTGTTTGG G 21
(2) 시퀀스 검증번호 21에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 21 :
GTTTTGCGCG GTTTCTTACG C 21
(2) 시퀀스 검증번호 22에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 22 :
GCGTTTGCTC TTCTTCTTGC G 21
(2) 시퀀스 검증번호 23에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 23 :
CGTCTCCAGG CGATCTGACG C 21
(2) 시퀀스 검증번호 24에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 24 :
TGGCGTCTCC AGGCGATCTG A 21
(2) 시퀀스 검증번호 25에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 20 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 25 :
TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC 20
(2) 시퀀스 검증번호 26에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 26 :
CTCCACGCGA ATTTTAACAC A 21
(2) 시퀀스 검증번호 27에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(a) 길이 : 21 염기쌍
(b) 형 : 핵산
(c) 선형 : 단일
(d) 위상 : 선형
(ⅱ) 분자형 : DNA(유전자의)
(ⅲ) 가정적 이론 : 없음
(ⅳ) 항감작 : 있음
(xi) 시퀀스 기재 : 시퀀스 확인 번호 : 27 :
ACTCGGGCTG CCACTTGACA G 21

Claims (2)

  1. 표적 DNA 또는 그에 대응하는 mRNA 또는 전-전력 RNA 서열에 완전히 상보적이며 5 내지 50염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로서 상기 올리고뉴클레오티드 시퀀스 확인 번호 : 3∼24로 이루어진 군으로부터 선택되고 상기 올리고뉴클레오티드 유사체는 표 2에 기재된 변형된 시퀀스 확인 번호 : 3∼24로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 오리고뉴클레오티드 유사체.
  2. 표적 DNA 또는 그에 대응하는 mRNA 또는 전-전력 RNA 서열에 완전히 상보적이며, 시퀀스 확인 번호 : 3∼24로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 표 2에 변형된 시퀀스 확인 번호 : 3∼24로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 유사체와 측에 감염된 생체외(in vitro) 세포를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 거대세포 바이러스의 복제를 저해하는 방법.
KR1019930700439A 1990-08-16 1991-08-14 거대세포 바이러스 감염의 효과를 완화시키기 위한 올리고뉴클레오티드 KR970005273B1 (ko)

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US56836690A 1990-08-16 1990-08-16
US568,366 1990-08-16
PCT/US1991/005815 WO1992003456A1 (en) 1990-08-16 1991-08-14 Oligonucleotides for modulating the effects of cytomegalovirus infections

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CA (1) CA2089666C (ko)
DE (1) DE69126710T2 (ko)
DK (1) DK0544713T3 (ko)
ES (1) ES2104717T3 (ko)
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GR (1) GR3024873T3 (ko)
HU (1) HUT63430A (ko)
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