HUT63430A - Process for producing oligonucleotides influencing the effect of cytomegalovirus infection - Google Patents

Process for producing oligonucleotides influencing the effect of cytomegalovirus infection Download PDF

Info

Publication number
HUT63430A
HUT63430A HU93398A HU39893A HUT63430A HU T63430 A HUT63430 A HU T63430A HU 93398 A HU93398 A HU 93398A HU 39893 A HU39893 A HU 39893A HU T63430 A HUT63430 A HU T63430A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
analog
gcg
ccg
ccc
Prior art date
Application number
HU93398A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9300398D0 (en
Inventor
Kevin P Anderson
Kenneth G Draper
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of HU9300398D0 publication Critical patent/HU9300398D0/hu
Publication of HUT63430A publication Critical patent/HUT63430A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

A találmány olyan antiszenz oligonukleotid kialakítására és előállítására vonatkozik, amely felhasználható a citomegalovirus szaporodásának gátlására, és igy a citomegalovirus fertőzés kezelésére. Ezek a vegyületek alkalmazhatók profilaktikus vagy terápiás célból a citomegalovirus által okozott betegség súlyosságának csökkentésére. A találmány szerinti oligonukleotid és oligonukleotid analóg jellemző vonása, hogy különböző RNS célmolekulákkal specifikusan hibridizálódik.
A citomegalovirus (CMV) a természetben általánosan előfordul, és a méhen belüli fertőzések leggyakoribb kórokozója. A fertőzött anyáktól született újszülötteknél gyakori az öröklött fertőzés. Egyes populációknál a gyerekek 10 %-ánál vele született fertőzés mutatható ki. Az újszülöttek kis százalékánál a fertőzés virulens, és több szervre kiterjed. A fertőzés elsősorban a retikuló-endotéliás és a központi idegrendszert támadja meg, ezenkívül károsan befolyásolja a szellemi fejlődést. Az átfogó vizsgálatok szerint a súlyos, születés előtt szerzett fertőzésben szenvedő felnőttek 50 %-ánál neuro-pszichiátriai betegségek vagy süketség fejlődik ki. Bár az extraneurális szerveket általában megkíméli a krónikus betegség, a virus a vesében éveken keresztül kimutatható .
Felnőtteknél a citomegalovirus által kiváltott mononukleózis egy hosszadalmas betegség, amely jelentős károkat okoz. Legyengült immunrendszerrel rendelkező betegeknél a betegség még súlyosabb, és kon£)likáci óként további patejjéa.
• »
- 3 fertőzés léphet be, ami halált okozhat. A citomegalovirus recehártyagyulladás a legyengült immunrendszerrel rendelkező betegeknél gyakran okoz vakságot. A legyengült immunrendszerrel rendelkező betegek nagyon érzékenyek továbbá a CMV helyi tüdőgyulladásra, ami egyike a halált okozó humán vírus betegségeknek. Bár a citomegalovirus részt vesz abban a folyamatban, amikor a HÍV fertőzés AIDS betegséggé alakul, amikoris stimulálja a HÍV hosszú terminális ismétlődő egység (LTR) átírását nem-transzformált fertőzött T-sejtekké, az AIDS betegek mellékveséjének és agyának szövettani vizsgálata kimutatta, hogy a mellékvesegyulladást, agyvelőgyu 11adást és perifériális neurózist CMV fertőzés okozza.
A CMV-t onkogén vírusnak tekintik. In vitro körülmények között a CMV sejteket transzformál, és stimulálja azok növekedését. A transzformáció CMV-vel történő inkubálás során mind humán, mind nem-humán sejteknél bekövetkezik. A transzformált sejtek CMV antigéneket tartalmaznak, amelyek megfelelő állatba inokulálva onkogének. Emellett, az onkogén potenciál a CMV genom speciális szegmenséhez kötődik.
A humán CMV egy nagyméretű, burkolt herpesz virus, amelynek genomja mintegy 240 000 nukleotid hosszúságú, kétszálu DNS molekulát tartalmaz. Ez a genom valamennyi DNS virus közül a legkomplexebb, és mintegy 50 %-kal nagyobb, mint a herpesz szimplex virus (HSV) genomja. Az ép virus DNS egymással összefüggő, hosszú (L) és rövid (S) szegmensekből áll, amelyek mindegyike az ismétlődő szekvencia homológ szakaszaival farkazott egyetlen DNS szekvencia szakaszait tar- tiiií • 44
- 4 talmazza. Csoportként a humán CMV izolátumok legalább 80 %-os szekvencia homológiát mutatnak, ami gyakorlatilag lehetetlenné teszi a citomegalovirusok alcsoportokba vagy altípusokba történő osztályozását, bár különböző CMV DNS preparátumok restrikciós endonukleáz térképeinek változásai azonosíthatók az epitémiológiailag független törzsekben. A CMV prototípus törzs (AD 169) DNS-ét szekvenálták, és az óvatos becslések szerint 175 egyedi transzlációs nyilt leolvasó keretet (ORF) tartalmaz. A feltételezett CMV gén termékek nagy része homológiát mutat más humán herpesz vírus gén termékekkel. Feltételezhető, hogy legalább 42 ORF glikoproteint kódol, és ezen belül több CMV ORF olyan fehérjét kódol, amelynek aminosav szekvenciája homológiát mutat a humán opszin receptor fehérjékkel.
A permissziv humán fibroblasztokban a CMV gén kifejeződését különböző genetikai folyamatok sorozata szabályozza, amelyek transzkripcionális és transzlációs szinten hatnak. A CMV gén kifejeződése három fázisra osztható, amelyek a HSV esetében definiált fázisokhoz hasonlítanak, ezek az azonnali korai (ΙΕ) , a korai és a késői fázis. A megtapadás, a vírus behatolása és a burkolat elvesztése után különböző vírusos transzkriptumok azonnali korai messenger RNS-sek (IE mRNS) szintetizálódnak 1-4 órán belül, ami transzlációs inhibitorok, igy cikloheximid jelenlétében is bekövetkezik. A fertőzés szokásos menete szerint az IE mRNS lefordítódik, és fehérje termékei megjelennek a korai transzkripciós fázis kezdetén. Az IEv3?NS_ből legalább négy fehérje szintetizát * · • •9
- 5 lódik, amelyek közül egy valamely glikoprotein. Az IE1 és IE2 fehérjék más CMV gének vonatkozásában transzkripciós aktiváló faktorként működnek, mig az IE3 fehérje körülzárja a CMV genom azon szakaszát, amely in vitro NIH 3T3 sejteket transzformál. A korai fehérjéket olyan mRNS kódolja, amely a virus DNS szintézise előtt szintetizálódik. A korai fehérjék részt vesznek a fertőzött sejt nukleotid metabolizmusában és DNS szintézisében. A virus DNS szintézisének megkezdése után maximális szintet ér el a késői mRNS transzkripciója, és feltehetően az analóg HSV mRNS-hez hasonlóan nagy mennyiségű templátot igényel. A késői CMV fehérjék között található például olyan glikoprotein, amely részt vesz a virus burokjának kialakításában, valamint virus burok fehérjék és más fehérjék, amelyek szükségesek az érett CMV kialakításához és szerkezeti egységéhez, és/vagy a virionból a fertőzött sejtbe hatolnak. A CMV gén kifejezését befolyásoló transzkripciós kontrolion kívül léteznek olyan poszt-transzkripcionális kontrollok is, amelyek befolyásolják néhány CMV fehérje megjelenését. Az mRNS hasítása általánosabb, mint a HSV gén kifejeződésekor, és a rokon mRNS 5’ le-nem-fordított szakaszában lévő nukleotid szekvencia legalább egy korai CMV fehérje szintézisét befolyásolja.
Nagyszámú antivirális szer tanulmányozása ellenére hatékony terápia a CMV ellen még nem ismert. Az interferon, transzfer faktor, adenin-arabinozid (Ara-A), acikloguanozid (Acyclovir, ACV) és ezek különböző kombinációi hatástalanok a CMV^. fertőzés ellen. A preh.Vríikai és klinikai adatok ·«· ·♦
- 6 szerint a foszkárnet (PFA) és ganciklovir (DHPG) korlátozott potenciálú antivirális szerek. A PFA kezelés öt AIDS betegnél csökkentette a CMV recehártya gyulladást. A DHPG vizsgálatok bizonyos eredményeket mutatnak a CMV recehártyagyulladás vagy vastagbélgyulladás kezelésében. A DHPG-t a kezelt betegek viszonylag jól elviselik, de a hatóanyag hosszantartó alkalmazását korlátozza a reverzibilis neutropénia megjelenése, a rezisztens CMV törzsek kialakulása, és a CMV helyi tüdőgyulladás elleni hatástalanság. Szükség van tehát olyan hatékony és kevésbé toxikus terápiás szerek kidolgozására, amelyek akut és krónikus esetekben alkalmazhatók.
A klasszikus terápiában a fehérjék különböző reakcióira koncentrálnak, amelyek lehetővé teszik a betegség kialakulásához vehető folyamatok módosítását. Ez a megközelítés nem alkalmazható a citomegalovirus fertőzés esetén. A jelen találmány egy alternatív megoldást kínál az ilyen fertőzések kezelésére, amikoris a citomegalovirus gén kifejezését antiszenz értelemben gátoljuk oligonúkleotidok vagy oligonukelotid analógok közvetítésével.
Az antiszenz módszer viszonylag rövid oligonukleotidoknak egyszálu mRNS-hez vagy egyszálu DNS-hez vagy akár kétszálu DNS-hez történő komplementer hibridizálását jelenti, ami megakadályozza az ilyen intracelluláris nukleinsavak normális és lényeges funkcióit.
A hibridizálás során a szekvenciára nézve specifikus hidrogén kötések alakulnak ki az oligonukl és az RNS · ·
- 7 vagy egyszálu DNS Watson-Crick bázispárjai között. Ezek a bázispárok egymáshoz képest komplementerek.
Azok a folyamatok, amelyek megakadályozzák a nukleinsav funkcióit, ismertek Cohen: Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton FL (1989) műből, amely szerint két különböző terminációs folyamat lehetséges. Az egyik a hibridizációs gátlás, ami olyan terminációs folyamat, amelyben az oligonukleotid inhibitor a célnukleinsavhoz kötődik, és igy egyszerű sztérikus okok miatt megakadályozza, hogy az esszenciális fehérjék, gyakran riboszómák, a nukleinsavhoz kötődjenek. A leggyakrabban tanulmányozott antiszenz szerek a metil-foszfonát oligonukleotidok (P.S. Miller és P.O.P. Ts'O: Anti-Cancer Drug Design, 2. kötet, 117-128 (1987)) és az α-anomer oligonukleotidok (Cohen J.S.: Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton FL (1989)), amelyek a nukleinsav funkcióját hibridizációs gátlással akadályozzák.
Az antiszenz oligonukleotidok által kiváltott terminációs folyamatok másik típusában a cél-RNS-t intracelluláris Rnáz-H enzimatikusan hasítja. Az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely valamely dezoxiribo-tipus, hibridizál a cél-RNS-sel, és ez a duplex aktiválja az Rnáz-H enzimet, amely hasítja az RNS szálat, és igy megakadályozza az RNS normális működését. Az ilyen tipusu terminációs folyamatokat kiváltó antiszenz szerek tipikus példája a foszforo-tioát oligonukleotidok.
Széles körben kutatják az oligonukleotidok és oligV^ Jíi • * · * · · • «·« ··· ··· · · · · · *·· ·«· ··· · · ··
- 8 nukleotid analógok antiszenz szerként történő terápiás alkalmazását. Az oligonukleotidok diagnosztikumként, kutatási szerként, és potenciális terápiás szerként történő alkalmazásának feltétele, hogy az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg nagy mennyiségben szintetizálható legyen, transzportálódjon a sejtmembránon keresztül, vagy más módon bekerüljön a sejtbe, megfelelő módon hibridizáljón a cél-RNS-sel vagy DNS-sel, és ezután megakadályozza a nukleinsav funkcióját. A fenti feltételek teljesítése függ az oligonukleotidnak a nukleáz lebontással szemben mutatott kezdeti stabilitásától.
A citomegalovirussal összefüggő antiszenz oligonukleotid diagnosztikához, terápiához és kutatáshoz tehát olyan oligonukleotidokra és analógokra van szükség, amelyek rezisztensek a nukleázokkal szemben, aktiválják az Rnáz-H terminációs folyamatát, és megfelelő szigorúsággal hibridizálnak a cél-RNS-sel (vagy DNS-sel).
A találmány feladata olyan oligonukleotid és oligonukleotid analógok kidolgozása, amelyek hibridizálnak a citomegalovirus messenger RNS-ével, és igy gátolják annak működését.
A találmány feladata továbbá olyan oligonukleotidok és analógok kidolgozása, amelyek a virus messenger RNS-ével kialakított antiszenz kölcsönhatás alapján módosítják a citomegalovirus kifejeződését.
A találmány feladata továbbá olyan eljárás kidolgozása, ams. 1 Lehetővé teszi a citomegalovirus diagnosztizálását és ··· ··· terápiáját.
A találmány feladata továbbá olyan eljárások, anyagok és készletek kidolgozása, amelyek lehetővé teszik a citomegalovirus mintában történő kimutatását.
A találmány feladata továbbá uj oligonukleotidok és oligonukleotid analógok kidolgozása.
A fenti feladatokat a találmány értelmében a következő leírásban és a csatolt igénypontokban tárgyalt módon oldjuk meg.
A találmány tárgya tehát eljárás citomegalovirus fertőzés hatásának módosítására. A találmány tárgya továbbá oligonukleotid és oligonukleotid analóg, amelynek nukleotid bázis szekvenciája specifikusan hibridizál egy citomegalovirus RNS kiválasztott szekvenciájával. Azt találtuk, hogy célszekvenciaként az IE1, IE2 vagy DNS polimeráz fehérjéket kódoló citomegalovirus mRNS-t választva a fenti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg lehetővé teszi a hatékony antiszenz terápiát. A találmány tárgya továbbá eljárás betegség kezelésére, amelynek során a citomegalovirus fertőzött beteget oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal kezeljük önmagában vagy farmakológiailag alkalmazható hordozóval kombinálva.
Ezt az összefüggést általában az antiszenz jelöléssel látják el. Az oligonukleotid és oligonukleotid analóg gátolja az RNS funkcióját, közelebbről a fehérjévé történő transzlációját, a citoplazmában történő transzlokációját vagy az általános ;Ü©16giai funkciója kiváltásához szükségéé
• ·♦·
- 10 bármely más aktivitását. Az RNS funkciójának vagy annak egy részének kimaradása következtében a genom megfelelő szakasza képtelenné válik arra, hogy szabályozza a vírus normális életciklusát.
Azt találtuk, hogy a citomegalovirus fertőzés vonatkozásában olyan specifikus oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok dolgozhatók ki, amelyek hatékonyan csökkentik a fertőzést. Előnyösen alkalmazhatók a mintegy 5-50 nukleinsav bázis egységből álló oligonukleotidok és analógok. Előnyös továbbá, ha az oligonukleotid vagy analóg specifikusan hibridizál a CMV IE1, IE2 vagy DNS polimeráz fehérjét kódoló mRNS-sel. Az oligonukleotid analóg olyan módosított változat, ahol kisebb a nukleáz rezisztencia és nagyobb a hatékonyság.
A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módjában az mRNS funkcióját olyan mértékben befolyásoljuk, amellyel gátoljuk a CMV szaporodását. Ennek értelmében előnyösek azok az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok, amelyek kölcsönhatásba lépnek a CMV mRNS szakaszaival. A betegség kezelése érdekében a betegnek találmány szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot adagolunk. Tapasztalataink szerint a találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható a citomegalovirus fertőzés kezelésére akár profilaktikus, akár terápiás célból.
Az 1. ábra a 2725-2890 oligonukleotidok antivirális hatékonyságát mutatja citomegalovirus ellen.
A 2‘. ábra a 2891-3300 oli^cfeukileotidok antivirális ·«· ♦·<
* k t
- 11 hatékonyságát mutatja citomegalovirus ellen.
A 3. ábra nyolc oligonukleotid antivirális hatékonyságát mutatja 0,01-10 μιηόΐ/l dózisban.
A 4. ábra három oligonukleotid antivirális hatékonyságát mutatja 0,1-10 Mmól/1 dózisban.
Az antiszenz oligonukleotidok általában előnyösen alkalmazhatók terápiás szerként különböző humán betegségek kezelésére. A Watson-Crick bázis párosodás alapján definiált pre-mRNS vagy érett mRNS valamely komplementer szekvenciájához specifikusan kötődő oligonukleotidok gátolják a genetikai információ áramlását a DNS-ből a fehérje irányába. Számos vizsgálat igazolja, hogy az antiszenz oligonukleotidok biokémiai eszközként alkalmazhatók a célfehérjék tanulmányozására (Rothenberg és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 81, 1539-1544 (1989); Zon G.: Pharmaceutical Rés. 5, 539-549 (1987)). Az oligonukleotid kémia fejlődése, ezen belül a nukleáz rezisztens oligonukleotidok szintézise és olyan oligonukleotid analógok kidolgozása, amelyek előnyös sejtfelvételt biztosítanak, lehetővé teszi az antiszenz oligonukleotidoknak terápiás célból történő felhasználását.
A terápiás kezeléshez a citomegalovirus fertőzött beteget találmány szerinti oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal kezeljük. Az optimális dózis, az adagolási módszer és az ismétlési arány meghatározása szakember feladata. A kezelést általában a kúra hatékony befejezéséig, vagy a betegség csökkenéséig folytatjuk.
Feltételezhető, hogy: a különböző fajhő: (irtózó cito• 4 • · · · * »····· »·· ·· **
- 12 megalovirusok, illetve az azonos fajon belüli különböző tipusu vírusok DNS-e különbséget mutat. Ezért elképzelhető például, hogy a különböző citomegalovirus fajok egyes szakaszai a fajra jellemzően ugyanazt a funkciót töltik be, és a genetikai információ kifejeződésébe történő beavatkozás a különböző fajoknál hasonló eredménnyel fog járni. Ez annak ellenére feltételezhető, hogy a különböző fajok nukleotid szekvenciái kétségtelenül különbséget mutatnak.
Ennek megfelelően, a leírás keretein belül ismertetett nukleotid szekvenciák az adott fajtákat illusztrálják. Az oltalmi körbe tartoznak ezért a különböző citomegalovirus fajokhoz tartozó homológ és analóg szekvenciák.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok felhasználhatók a citomegalovirus RNS funkciójának antiszenz gátlására. A találmány keretein belül az oligonukleotid kifejezés természetes foszfodiészter kötésekkel összekapcsolt, természetben előforduló bázisokból és pentofuranozil csoportokból felépített polinukleotidot jelent. Az értelmezésbe beletartoznak tehát a természetes eredetű változatok vagy szintetikus molekulák, amelyeket természetes eredetű alegységekből vagy ezek közeli homológjából állítunk elő.
Az oligonukleotid analóg kifejezés olyan molekulákra utal, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonló módon funkcionálnak, de nem természetes eredetű részeket is tartalmaznak. Ennek megfelelően az oligonukleotid tartalmazhat módosított cukor-részeket vagy a cukor-részek közötti kötéseket. Ezc?l· ··· ···
- 13 példaként említhetők az ismert foszforo-tioát vagy más, kéntartalmú változatok. Előnyösek azok az analógok, amelyekben az oligonukleotid foszfodiészter kötéseit legalább részben olyan szerkezettel helyettesítjük, amely elősegíti a molekulának a sejt azon részébe történő behatolását, ahol megtalálhatók a hatásukban módosítandó RNS vagy DNS molekulák. A foszfodiészter kötések helyettesítésére előnyösen alkalmazhatók a foszfor-tioát kötések, a metil-foszfonát kötések vagy rövidszénláncu alkil- vagy cikloalkilcsoportok. Előnyös továbbá, ha a foszfodiészter kötést olyan szerkezettel helyettesítjük, amely lényegében nem-ionos és nem-királis, vagy amely királis és enantiomer specifikus. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány kereteink belül az említett kötés helyettesítésére más kötések is alkalmazhatók.
Az oligonukleotid analógok közé tartoznak azok a molekulák is, amelyek legalább néhány módosított bázist tartalmaznak. Ilyenként alkalmazhatók a természetestől eltérő purin és pirimidin bázisok. Hasonlóképpen, módosíthatók a nukleotid alegységek pentofuranozil részei, amikoris a találmány szerinti megoldás keretein belül maradunk.
Az analógok leginkább úgy definiálhatók, hogy funkciójukban felcserélhetők a természetes oligonukleotidokkal (vagy természetes utón szintetizált oligonukleotidokkal) , de a természetes szerkezethez képest egy vagy több különbséggel rendelkeznek. Minden lehetséges analóg az oltalmi körhöz tartozik^amennyiben funkciójában hatékonyan hibridizál a ♦ · · citomegalovirus RNS-sel. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok előnyösen mintegy 3-50 nukleinsav bázis egységet tartalmaznak. Különösen előnyösek azok az oligonukleotidok és analógok, amelyek mintegy 8-25 nukleinsav bázis egységet, ezen belül elsősorban mintegy 12-25 nukleinsav bázis egységet tartalmaznak. A nukleinsav bázis egység olyan bázis-cukor kombináció, amely foszfodiészter kötésen vagy más kötésen keresztül szomszédos nukleinsav bázishoz kapcsolódik.
A találmány szerinti oligonukleotidok és analógok a szilárd fázisú szintézis közismert technikájával egyszerűen és rutinszerűen előállíthatok. A szintézis megvalósításához szükséges készüléket több cég, köztük az Applied Biosystems forgalmazza. A szintézishez természetesen bármely más módszer felhasználható, amikoris az oligonukleotid előállításához alkalmazott gyakorlati módszer szakember köteles tudásához tartozik. Ugyancsak közismertek az oligonukleotid analógok, igy a foszfor-tioát és alkilezett származékok előállításához alkalmazható hasonló technikák.
A találmány szerinti megoldás során a messenger RNS alatt nemcsak a fehérjét kódoló, és a hárombetűs genetikai kódot alkalmazó információt értjük, hanem a kapcsolódó ribonukleotidokat is, amelyek a szakember számára 5' le-nem-fordított szakasz, 3’ le-nem-fordított szakasz, és intron/exon csatlakozó szakasz néven ismert szakaszokat képezik. A találmány életeimében olyan oligonukleotidokat és oligonukleotid ana?4w^at állítunk elő, amelyek célmole15 kulaként a fent említett társult ribonukleotidokat, valamint az információs ribonukleotidokat vagy ezek egy részét alkalmazzák. Előnyösek azok az oligonukleotidok vagy analógok, amelyek specifikusan hibridizálnak valamely transzkripciós iniciátor hellyel, transzlációs iniciátor hellyel, intron/exon csatlakozással vagy az 5' vagy 3' le-nem-forditott szakaszban található szekvenciával.
A HCMV genom szerkezetét tekintve a legösszetettebb a herpesz vírusok között. A replikáció hibájából eredő HCMV mutánsokat csak két vírusgén esetében, az azonnal korai komplex (IE1 vagy IE2) és a DNS polimeráz esetében izoláltak. A génekről közismert, hogy fontos szerepet játszanak a HCMV gén kifejeződésében. Az antiszenz molekulák kidolgozása során ezeket választottuk elsődleges célmolekulaként. A terápiás antiszenz oligonukleotidok vagy analógok kidolgozása során másodlagos célgénként a herpesz szimplex vírussal analóg géneket választottuk. Ezek a gének lényegesek a herpesz szimplex vírus szaporodása vonatkozásában, illetve érzékenyek az antiszenz gátlásra. Vizsgálataink szerint a herpesz szimplex vírus esetében a következő négy géntermék érzékeny az antiszenz gátlásra:
a virusburok fehérje (UL48), a ribonukleotid reduktáz enzimet képező két fehérje (UL 39, 40), és a vírus foszfotranszferáz (UL13).
A herpesz szimplex vírus gének közül tanulmányoztuk továbbá a kiegészítő DNS replikációs enz’ wl?^t (UL5, 8, 9, 29, 42 és
52), és a fő burokfehérjét (UL 36). A HCMV által kódolt fehérjék vizsgálataink szerint potenciálisan analógok a fent említett herpesz szimplex vírus fehérjékkel, ezért a találmány vonatkozásában másodlagos célmolekulaként ezeket a géneket választottuk.
A HCMV-ben lejátszódó azonnali korai transzkripciós molekuláris biológiáját az eukarióta sejtek bármely transzkripciós egységéhez hasonlóan közelről megvizsgálták. Röviden, a fő azonnali korai transzkriptum (IE1) szintézisét egy sor 5’ ismétlődő egység szabályozza az mRNS cap helyén. Ezek az ismétlődő egységek több transzkripciós válaszmolekuláért flelősek, amelyek sejtspecifikus és diferencia specifikus módon működnek. Az IE1 mRNS egy nagy mennyiségben jelenlévő,
1,9 kb hosszúságú RNS, és az általa kódolt fehérje PAGE-SDS vizsgálatnál 72 kDa látszólagos móltömegnél migrál. Ez a fehérje vírusokban megtalálható, és saját maga, valamint az IE2 géntermék kifejeződését szabályozza. Az azonnali korai transzkripció kezdeti fázisában a celluláris RNS polimeráz csak az IE1 mRNS-t szintetizálja. Kis mennyiségű IE2 mRNS csak az IE1 mRNS feldolgozása során a fertőzés korai szakaszában képződik. Idővel az IE1 fehérje szintje felhalmozódik, és az IE1 gén promoter szakaszához kötődik, ami elnyomja az IE1 mRNS további transzkripcióját, és lehetővé teszi, hogy a lefelé található gyengébb IE2 gén promoter szabályozza az IE2 mRNS további szintézisét. Feltételezhető volt, hogy az IE1 géntermék feladata, hogy fellendítse a vírus transzkripcióját a produktív fertőzés és akti-
Ja ·· ··*· ······ • · · · « >♦· ······ · « · · · · »»· ··· ··· ···· válja a vírus gén kifejeződést a látens állapotból. A sejttípus és a differenciálódás, valamint az IE1 gén promoterben található hormonális válasz elemek tanulmányozása alátámasztja ezt a feltételezést. Az IE2 fehérje aktiválja egy sor HCMV korai és késői gén transzkripcióját, amely más celluláris és vírusos transzaktiváló fehérjével hasonló módon játszódik le. így az IE2 fehérjéről feltételezhető, hogy egyikev a HCMV gén kifejeződés fő irányítóinak. A CMV gének egy másik szabályozó eleme a DNS polimeráz fehérje. A késői virális gének transzkripciója alacsony szinten játszódik le a virális DNS replikáció megkezdéséig, amelynek után a késői géneket a templát fokozódó hozzáférhetősége aktiválja. A növekvő templát mennyiség által kiváltott szabályozó mechanizmus pontos molekuláris feltételei még nem ismertek, de a megfigyelt hatás vonatkozásában lényegi feltétel a vírus DNS polimeráz jelenléte, és a genom replikációja.
Az mRNS szekvencia kiválasztott cél szakaszai közé tartoznak az mRNS stabilitását, feldolgozását és/vagy transzlációjának hatékonyságát szabályozó szakaszok. Ezekre a célszakaszokra példaként említhetők az 5' cap szakaszok és a transzlációs iniciációs kontroll szakaszok. Az IE1, IE2 és DNS polimeráz génekre vonatkozó célszekvenciák példáit az 1. táblázatban adjuk meg.
1. táblázat
A citomegalovirus cél szekvenciái
Cél gén Cél szakasz Cél DNS szekvencia
DNS polimeráz mRNS CAP hely GGACCGGGACCACCGTCGTC
DNS polimeráz AUG szakasz GTCCGCTATGTTTTTCAACCC
DNS polimeráz konzervált AA (717-732) CCTTCCATCATCATGGCCCAC
DNS polimeráz konzervált AA (905-914) GGCGCGGGTCATCTACGGGAC
DNS polimeráz CMV inszert (608-697) CCGCTGTGCCCGGCGACGCGG CCGCCCTTGCAATCTGCGCCG GGCGTTTCACCCGGCTCCGGC
DNS polimeráz (1109-1159) GCGCCCGGTGTCCGGACGGCG CCGCCGGCGTGGTTTCCCGGT CCGGCAAAGAAGAGGGCGCGG
IE1 mRNS CAP hely GTGAACCGTCAGATCGCCTGG
IE1 AUG szakasz CTTGACACGATGGAGTCCTC
IE1 I/E-l GCCAAGAGTGACGTAAGTACC
IE1 I/E-2 GTCTTTTCTGCAGTCACCGTC
IE1 I/E-3 CAAGGTGCCACGGTACGTGTC
IE1 I/E-4 CATGTGTTTAGGCCCGAGAC
IE1 I/E-5 GGCAGAACTCGGTAAGTCTG
IE1 I/E-6 CCTCCTCTACAGTCAAACAG
IE2 AUG/CAP hely GCGCCTATCATGCTGCCCCTC
IE2 AUG szakasz GCTCTCCCAGATGAACCACCC
IE2 I/E-l CAAGATTGACGAGGTGAGCCG
IE2 I/E-2 CCCAAACAGGTCATGGTGCGC
IE2 NUC SIG-1 GCGTAAGAAACCGCGCAAAAC
IE2 NUC SIG-2 CGCAAGAAGAAGAGCAAACGC
·· · · w * « ··· ··· ··· · • · · · · ·*· ··* ··· ·· ··
- 19 Az 1. táblázatban az I/E rövidítés az intron/exon csatlakozásra utal, míg az AUG szakasz az IE2 mRNS transzlációs iniciátor szakasza, amelynek átírását az IE2 specifikus promoter szakasz szabályozza. Az nuc sig rövidítés az IE2 fehérje nukleáris lokalizációs szignálját jelöli.
A találmány szerinti oligonukleotidok és analógok komplementerek a DNS-sel (elsősorban az intron/exon csatlakozásra irányuló oligonukleotidok esetében) vagy a megfelelő messenger RNS-sel (mRNS) vagy pre-messenger RNS-sel. A találmány szerinti oligonukleotidok és analógok ezért előnyösen a fent említett szekvenciák valamelyikét vagy ezek valamely hatékony szakaszát tartalmazzák. Előnyösen alkalmazható tehát bármely fenti oligonukleotid (vagy annak analógja) vagy bármely más hasonló nukleotid, amelyet szakember a módosítandó virus fertőzés szempontjából előnyös antiszenz célszakasz ismeretében elő tud állítani.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok felhasználhatók a diagnosztikában, terápiában, valamint a kutatásban reagens vagy készlet formájában. A terápiás alkalmazás esetében az oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot citomegalovirus fertőzésben szenvedő betegnek vagy állatnak adagoljuk. A terápiás szert a találmány értelmében előnyösen intravénásán, transzdermálisan vagy intramuszkulárisan adagoljuk. Alkalmazhatók egyéb adagolási formák is, igy a helyi vagy a sérülésbe történő adagolás. Előnyös továbbá a szuppozitórium formájában történő alkalmazás. A találmány ^ssrjjnti oligonukleotidok és oligonukelo- • ··· ·· · ··· · ······ ··· ·· ··
- 20 tid analógok a terápiás alkalmazáson belül felhasználhatók a megelőzés céljából is. Ebből a célból a hatóanyag különböző hordozóba, például kondomba építhető. A hatóanyagot előnyösen készítmény formájában alkalmazzuk, amelyhez a szokásos farmakológiai hordozóanyagokat használjuk.
A találmány szerinti megoldás felhasználható továbbá a diagnosztikában és a kutatásban. Mivel a találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok a citomegalovirusból származó nukleinsavakkal hibridizálnak, szendvics és más vizsgálatok könnyen elvégezhetők a fenti tény ellenőrzésére. Az oligonukleotid vagy analógja és a mintában jelenlévő citomegalovirus közötti sikeres hibridizálás detektálására a közismert rutineljárások alkalmazhatók. Példaként említhető az enzim konjugációs módszer, a radiojelölés, vagy bármilyen más megfelelő detekktáló rendszer. A találmány szerinti oligonukleotidok és analógjai a citomegalovirus kimutatására alkalmas készlet formájában is kiszere lhetők.
A találmány szerinti megoldást közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
1. példa
Sejtek és vírus:
Humán fityma fibroblaszt sejteket (ATCC CRL 1635) 4,5 g/1 glükózt tartalmazó Dulbecco Eagle közegben • ··· ··· ··« · * · · · * ······ ··· ·· · ·
- 21 (magas glükóz tartalmú DMEM) tenyésztünk, amelyhez a közeget 10 % magzati borjú szérummal (FBS), 100 egység/ml penicilinnel, 100 μg/ml sztreoptomicinnel és 2 mmól/1 L-glutaminnal egészítjük ki. Humán citomegalovirus törzs tenyészetét (AD169 vagy Towne HCMV törzs) fityma sejteken növesztjük kis értékű fertőzés (a fertőzés értéke MOI = 0,02 plakk képző egység [PFU] sejtenként) alkalmazásával.
Az oligonukleotidok CMV replikációt gátló hatásának méréséhez mérjük a fertőzés kitermelését. A vizsgálat elvégzéséhez a fityma sejteket 5 X 10^ sejt/mérőhely mennyiségben Falcon-féle 6 mérőhelyes szövettenyésztő lemezre visszük. A sejteket 2 ml közeggel (magas glükóztartalmú DMEM + 10 % FBS) fedjük, és 37 °C hőmérsékleten 18-24 órán keresztül inkubáljuk. A megfelelő szint elérésekor a sejteket 1 ml tápközegben felvett oligonukleotid készítménnyel fedjük a lemezre történő felviteltől eltelt 24 óra után. Ezután 18 órán keresztül inkubáljuk, majd a mérőhelyeket foszfát pufferolt sóoldattal átöblitjük, és különböző MOI értékek mellett 0,5 ml szérum-mentes, magas glükóztartalmú DMEM közegben szuszpendált HCMV-vel fertőzzük. A vírust és a sejteket 37 °C hőmérsékleten 90 percen keresztül inkubáljuk forgó lemezen. A vírus adszorpciója után a meg nem kötött vírust foszfát-pufferőit sóoldattal leöblítjük. Ezután 1 ml közegben (10 % FBS-sel kiegészített magas glükóztartalmu DMEM) 10 Mmól/1 koncentrációjú oligonukleotidot adunk a mérőhelyhez, és a sejteket 4-5 napon keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kontroll mérőhelyekhez oligonukleotid Nélküli 1 ml • · · • · · • · * · · « • ··· ··· ··« · ♦ · · a · ······ ··· · · · «
- 22 közeget adunk.
A vírust a felső rétegből begyüjtjük, és minden mérési ponthoz három mérőhelyet egyesítünk. A szuszpenziót -80 °C hőmérsékleten megfagyasztjuk. A vírus titerét mintánként humán figymasejt monorétegen végzett plakk vizsgálattal határozzuk meg. Az egyes viruskészítményeket hígítjuk, és minden higitásból két alikvot részt fitymasejten adszorbeálunk 90 percen keresztül rázatás mellett. A meg nem kötött vírus inokulumot foszfát pufferolt sóoldattal leöblítjük, és a sejteket 2 ml magas glükóztartalmu DMEM közeggel fedjük, amely 5 % FBS-t és 0,75 % metil-cellulózt tartalmaz. A sejteket 12-14 napon keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a plakkokat formaiinnal fixáljuk, kristály viola festékkel megszinezzük, és számoljuk. A kezelt mérőhelyeknél kapott plakk számot a kontroll mérőhelyeknél kapott eredményhez viszonyítjuk, és igy meghatározzuk a fertőzött virustermelés gátlásának mértékét.
A CMV IE1, IE2 vagy DNS polimeráz mRNS-sel komplementer szekvenciát tartalmazó foszforo-tioát oligonukleotiddal 10 /xmól/l koncentrációban kezelt CMV fertőzött sejteknél a fertőzés 90 %-ban csökken.
2. példa
Vizsgálatainkkal ellenőriztük az aktív CMV antiszenz vegyület hatásának mechanizmusát. A hatásmechanizmus mo lekuláris természetét az oligonukleotid gátlással megcélzottx • · · • ·
- 23 CMV gén szekvenciája határozza meg. A legközvetlenebb vizsgálatban a cél CMV gén által kódolt fehérje biológiai funkcióját vesszük figyelembe. Egy enzimatikus fehérje biológiai aktivitása gyakran a vizsgálat befejező szignálját alkalmazza, igy a vizsgálat igen érzékeny a vírus fehérje szintjének kismértékű változására is. A CMV gének közül ilyen vizsgálathoz alkalmazhatók például a DNS polimeráz, az IE1 és IE2 helyek.
A DNS polimeráz fehérje esetében az egyszerű mechanikai vizsgálatban azt mérjük, hogy a cél-specifikus oligonukleotid milyen mértékben gátolja a 3H-timidinnek a vírus DNS-be történő beépülését. A vizsgálatot olyan körülmények között végezzük, amelyekben a virális DNS polimeráz könnyebben kifejti aktivitását, mint a celluláris DNS polimeráz. A CMV IE fehérjéknek egyes CMV gének RNS szintézisének transzaktiválására gyakorolt hatását használjuk az átmeneti gén kifejeződés vizsgálathoz, amelynek aktivitása a biológiailag aktív IE1 vagy IE2 fehérjéknek a fertőzött sejtben történő jelenlététől függ. Röviden, az IE1 vagy IE2 felelős promoter szakaszok egy plazmid vektorban az indikátor géntől (például bakteriális klór-amfenikol acetil-transzferáz (CAT)) nézve 5' irányba vannak klónozva. A vektort humán fitymasejtekbe visszük, amelyeket HCMV-vel fertőzünk. A CAT aktivitás kimutatható roncsolt sejtekből, és ennek szintje közvetett módon felhasználható az IE1 vagy IE2 fehérjeszint meghatározásához. Az oligonukleotidnak a CAT hatékonyságra kifejtett hatását az IE1 és IE2 vonatkozásában felelős szerke•·· ··· • · · • · * · « » • ·*· ··· ··· · • · · · β • · · *«· ··· ·· ··
- 24 zetekhez hasonlítjuk.
Olyan esetekben, amikor a nyilvánvaló biológiai hatékonyság nem mutatható ki könnyen, a fehérjeszint oligonukleotidok által kiváltott megváltozása detektálható a fertőzött sejt fehérjék immunoprecipitativ vizsgálatával, a kapott csapadék SDS akrilamid mátrixon végzett gélelektroforézisével, és a cél fehérje szint gélen történő autoradiográfiás detektálásával. A kimutatható biológiai aktivitással rendelkező fehérjék is meghatározhatók az immunoprecipitativ és gélelektroforézis technikával.
3. példa
A CMV antiszenz hatóanyag értéke jelentős mértékben függ attól, hogy mennyire képes specifikus kölcsönhatásra a CMV RNS célszakasszal anélkül, hogy károsan befolyásolná a gazdasejt funkcióit. Ebből a célból meg kell határozni a nem-specifikus kölcsönhatásokra vonatkozó potenciált, és a hatóanyag toxicitását. A káros mellékhatások potenciája különböző modellekben az akut és krónikus sejt toxicitáshoz párosul. Először a hatóanyag toxicitását fertőzött humán fitymasejten vizsgáljuk 3H-leucin és 3H-timidin alkalmazásával, amelynek során a fehérje és DNS szintézisre gyakorolt hatást mérjük. Ebből a vizsgálatból az oligonukleotid esetében meghatározzuk az LD50 értéket, mig a primer és szekunder aktivitás vizsgálatából az ID50 értéket, amelypől minden hatékonyioligonukleotid vegyületre kiszá--------τ--------1------»--····«· ··· · · ·· • · · · ♦ » • »·· ·· ··· . ······ · ·4 « * * .
- 25 móljuk a terápiás indexet (T.I.). A további vizsgálathoz csak azokat a vegyületeket alkalmazzuk, amelyek T.I. értéke legalább 100.
4. példa
Az oligonukleotid és oligonukleotid analóg szintézise és jellemzése:
A módosítatlan DNS oligonukleotidokat automatizált DNS szintetizátorban (Applied Biosystems 380B model) állítjuk elő a szokásos foszfor-amidit kémiával, amelynek során az oxidálást jóddal végezzük. A szintézishez B-ciano-etil-diizopropil-foszfor-amiditet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) alkalmazzuk. A foszfor-tioát oligonukleotidokhoz a szokásos oxidációs palackot 0,2 mól/1 3H-1,2-benzol-ditiol-3-on-l,1-dioxid acetonitrilben felvett oldatával helyettesítjük a foszfit kötések lépésenként történő átalakításához. Az átalakítási ciklus várakozó lépését 68 másodpercre növeljük, majd lezáró lépés követi.
A 2'-O-metil-foszfor-tioát oligonukleotidokat 2’-0-metil-B-ciano-etil-diizopropil-foszfor-amidit (Chemgenes, Needham, MA, USA) alkalmazásával a módosítatlan oligonukleotidoknál alkalmazott standard ciklussal állítjuk elő azzal a különbséggel, hogy a tetrazol és bázis váltakozó szállítását követő várakozó lépést 360 másodpercre növeljük. A szintézis megindításához 3' bázisként egy 2'-dezoxi-ribonukleotidőt alkalmazunk. al • · · ·· · 9 ♦ « • »·· *·· · ·· ·
- 26 A szabályozott zsugorított üvegoszlopról (Applied Biosystems) történő lehasitás és a védőcsoport koncentrált ammónium-hidroxiddal 55 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül végzett eltávolítása után az oligonukleotidot tisztítás céljából 0,5 mól/1 nátrium-kloridból 2,5 térfogatrész etanollal kétszer kicsapjuk. Az analitikai gélelektroforézis vizsgálatot 20 % akril-amid gélen 8 mól/1 karbamiddal, 45 mmól/1 trisz-borát pufferrel pH = 7,0 értéken végezzük. A kapott oligonukleotid dezoxinukleotid és ennek foszfor-tioát analógja az elektroforézis vizsgálat szerint több, mint 80 %-ban a kívánt hosszúságú anyagból áll.
5. példa
ELISA vizsgálat a HCMV replikáció antiszenz oligonukleotiddal történő gátlása meghatározásához:
A humán citomegalovirus mRNS-sel komplementer oligonukleotidok antivirális hatékonyságát a HCMV replikációján alapuló ELISA vizsgálatban ellenőrizzük. Normál humán bőr fibroblasztot (Clonetics Corp., San Diego, CA, USA) szérummentes közegen (Clonetics) növesztünk, és 96 mérőhelyes lemezre visszük. Amikor a sejtek mintegy 80 %-ban összefolynak, oligonukleotidos előkezelést végzünk. Mintegy 20 órával az előkezelés után a közeget (oligonukleotidot tartalmaz) óvatosan leöntjük, és a sejteket kétszer meleg fibroblaszt alapközeggel (FBM, Clonetics) átöblitjük. A sejteket ezután mérőhelyenként/100 μΐ CMV törzs oldattal fertőz• ♦ ·
- 27 zük, amit FBM közegben hígítunk. A lemezeket 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A lemezeket (vírust tartalmaz) ezután óvatosan leöntjük, és friss, előmelegített FBM közeggel helyettesítjük mérőhelyenként 100 μΐ mennyiségben. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten rövid időn keresztül inkubáljuk, majd 5 μΐ, FBM közeggel hígított oligonukleotidot adagolunk az egyes mérőhelyeken lévő közeghez. Két nap elteltével a sejteket ismét oligonukleotiddal ugyanolyan módon utókezeljük. A hatodik napon a lemezeket előkészítjük az ELISA vizsgálathoz.
Ennek során a közeget óvatosan leöntjük a lemezről, a sejteket mérőhelyenként 200 μΐ abszolút etanollal fixáljuk, 30 percen keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd az etanolt eltávolítjuk, és a lemezeket levegőn szárítjuk. A lemezeket az ELISA vizsgálat előtt 1 órával 2 % BSA-t tartalmazó PBS-sel blokkoljuk. A blokkolt oldatot eltávolítjuk, és 100 μΐ anti-CMV antitest oldatot adunk hozzá, amit 1:2000 arányban 1 % BSA-t tartalmazó PBS-ben vettünk fel. A sejteket az antitesttel 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd PBS-sel háromszor mossuk. A szekunder antitestet, a biotinilezett kecske-antiegér IgG-t (Bethesda Research Labs. MD, USA) 1 % BSA-t tartalmazó PBS-ben 1:1000 arányban hígítjuk, és a sejtekkel 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejteket ezután mossuk, 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten streptavidin-B-D-galaktozidázzal inkubáljuk. A szint klór-fenol vörös-B-D-galaktopiranoziddal fejlesztjük ki, amelyhez 20 μς színezéket 10 ml
- 28 50 mmól/1 nátrium-foszfát és 1,5 mmól/1 magnézium-klorid elegyében oldjuk. A lemezeket 10 percen keresztül rázzuk, majd az abszorpciót 575 nm hullámhosszon mérjük.
Huszonnégy olyan oligonukleotid antivirális hatását mérjük, amely komplementer a HCMV-vel. A vizsgált oligonukleotidok szekvenciáját és gén célszakaszát a 2. táblázatban adjuk meg.
• « • <
W CO CO ΙΛ V> cn CO co V» w CO co CO (O
1 | | 1 1 1 1 1 1 1 | | I
CM CM CM CM CM CM Cm Cm CM Λ CM CM CM
ra N
< Q ρ ο ρ ο ο ρ b (3 Q
o < u ρ ο υ ρ ο ο ο Ο < c
u ο υ < < ο υ υ ο υ ο υ o P H
< υ ο < < υ ο υ υ ο Ü (Μ u <
H υ ο ο ο υ υ υ ο C3 ρ Q Q
< ο ο Η υ ο ο < υ υ Α b < < <
o < .< ρ Η ο < < υ Ρ {-< Α < u Q
CJ υ Η Η < ο < ρ υ ü Ρ b 3 u <
< < < b Ρ < ο Η < υ U < < ü
υ ϋ Ο υ Η ρ ο υ U < Η (3 o H <
υ < < Η < Η Η υ < Ο ρ Α o b
ο Η < < Ο < Ρ ο ο υ b b H Q o
ro b υ Η Ρ < Ο U <> Η υ Q u o
Ή b Η υ < < ρ ω υ ο < < < ü
y < b < Η ϋ Η < υ υ < U Η O H ü
< < Ρ υ Ρ Ο υ < Η Ρ υ Α H Q o
> υ < Η < ο U ο ρ b υ> 13 b b o Q
• Η < Μ ο υ υ U ο υ ρ Ο < o < H
CD; N g υ υ ρ ο υ ο ο υ υ C3 fi u o u
f r\1 Η ο ο < Η Η ο ο υ υ Ο b < < H
UQj Ο H ο υ <3 b ο ο υ < <3 Ρ o δ b
χυ ι—Η JD kro
C.0 o
IN C ω IN c r-l o 3
CO O
1 X C. US
έ M
(D cn
c z
c Q.
cn o
rM CM m
c C C c
o o o o
X X X X
V « Φ V
\ X» \
u 4J 4J u
c e c c
wl •w •ΐ
il 94
M U3 U) M
►1 H4 t-l M
CM V© r*. CM
r* CM ©* o ©t
o* r»* σ* i© \© \© *© r* h* IA
cn CM \D CM o t** CM rx r*> en CM CM CM
«ο r** σ\ r* s© CO CM r* h* r%
O CO r* co co r*· h* h* eM
co • r>. r*. h* r*. r* t • • •
• m • 1 4 • 1 • • ^4 iA *© CM
00 ja <n m CO <n lA O iA o r**> 00 r*.
4-< r* st o co *n O lA IA *© *© IA
\O CM Oi V© i© m CM cn CM CM C4
o tx CO co co h* r* r* r* r* r* r*»
co ^4 rx r* r** r* r*. r% rM fM rM
iA «© co a IA «0 ©\ O V© r* CM tA «0 o
CM CM CM CM <A IA S© r* r*. r** r** 00 00 CO ©v
r** A* f** CO 00 CO co co co co co CO co co
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
2891 172387-172407 ΙΕ1 lnt/exon 5 CAG ACT TAC CGA CTT CTG CC P-S
w to ΚΛ co CO CO CO
cL CU et 1 cL CU CU
U o o ü o u < < u
e o F u o ü o P u υ <
o < H u o o υ F H < <J>
< u O F < F < ü U u <
o < H F F F o H o e
o o < F F b H < < < H
< u < u u F ü ü o F H
o ü o F F F H u g g o F b
< H H b F b < o s K < F * <
U q o F F ü ' q o H o
b H o < b F < < < t>
< t-> u u b O o o ü
o U o u H ü Q u o fi
< H q < o o < F < o b
Q f < υ u ü u b H u u
H o o o P F u F ü o ü
F u H < F F F b g g < < g o
F H b o F F b υ * s u> o * u
P O e o L. o F ü F u
H ü u> o F o u o b H b
o o u b u υ H H b <
φ rH CN CN CL
E C c <0
O o o eo 60 u
X X X wU Ή
4> V Φ tt cri lA
\ \ X
4J u 4J 4J u u CN
c 9 c c □ 3 Id
•H < wd •H c G M
il CN CN CN CN CN rH
M M ld Id Id Id Id
►1 ►1 ·-< M ♦1 •H
G. M z-\
ς> :□
<1 μ
m (D ω
S N N
CN tn ω
Id e c e £ E
M g g o (U o Ö5« 0
\ •ö ΗΌ ι-H Ό
c -H E H G
Cd « 0) « 0J 4
ex i—i oí <—< Ού
XD OJ
> >
(véletlenszerű)
00 1H s© <n r4
m σ» CN m rx ** ΓΪ m
CN m O m t© rH r* rx
CN O o σ» O o m cn
r* fx rx \© rx rx r-» r* e
•M
• i I « 1 i • •
00 m IA CN o m o
rx m m CN
CN in 5© rx r*
CN O σ* o o r> m
rx rx rx 5© r* rx rx
r-i rN •M vM
00 00 et o r«4 CN
o CN CN CN
Cv O\ o ©\ σ* 9x
CN CN CN CN CN CN
,.T
Φ rx 00 & o ÍN
^4 CN CN CN
m 4© 00 O • W 00
*3 *0· m o CN CN t© cn
CN CN CN cn CN CN CN CN
cn cn cn cn cn cn cn
m «σ ιΛ Φ rx
CN CN « CN CN CN
A vizsgált oligonukleotidok közül nyolc komplementer a HCMV DNS polimerázt kódoló mRNS-sel, a többi a HCMV fő azonnali korai promoteréből átirt RNS-sel komplementer. Mivel a fenti genom szakasz két fő fehérje terméke (IE1 és IE2) olyan messenger RNS-ből szintetizálódik, ami egy közös promoterből Íródik át, a vegyületek közül nyolc mind az IE1, mind az IE2 RNS-sel komplementer. Három vegyület csak az IE1 és IE2 mRNS egyikével komplementer. Három vegyület az IE1 mRNS-sel és a fennmaradó öt specifikusan az IE2 mRNS-sel komplementer.
A vizsgált 5 Mmól/1 koncentrációban egy kivételével mindegyik vegyület bizonyos mértékben csökkenti a vírus replikációját a kezeletlen sejtekhez viszonyítva (1. és 2. ábra). Néhány vegyület lényegesen nagyobb gátlást vált ki a virus replikációra, mint a kontroll oligonukleotid, a további vizsgálathoz ezeket a vegyületeket alkalmazzuk.
A dózis-függő kísérlet különbséget tesz az antiszenz oligonukleotidok nem-specifikus hatása és a HCMV replikáció szekvencia specifikus gátlása között. Az ISIS 2922 jelű vegyület (szekvenciaszám 22) , az ISIS 2882 jelű vegyület (szekvenciaszám 12), az ISIS 2918 jelű vegyület (szekvenciaszám 18), az ISI 2919 jelű vegyület (szekvenciaszám 19) és az ISIS 3300 jelű vegyület (szekvenciaszám 24) P=S/2'-0-Me) kisebb dózisban gátolják a HCMV replikációt, mint a HCMV-hez nem komplementer véletlenszerű oligonukleotidok (3. ábra) . Az ISIS 2918 jelű vegyület (szekvenciaszám 18), az . 2 ISIS 2919 jelű vegyület (szekvenciaszám 19) és az ISIC ♦·· ·♦· ··»
- 32 jelű vegyület (szekvenciaszám 22) az IE2 RNS szekvenciával komplementerek. Az ISIS 2882 jelű vegyület (szekvenciaszám 12) és az ISIS 3300 jelű vegyület (szekvenciaszám 24, P=S/2'-O-Me) az IE1 és IE2 transzkriptumok 5' cap szakaszával komplementerek. A kivételeket a 2. táblázat jelöli, az oligonukleotidok foszfor-tioátok, az ISIS 3300 jelű vegyület 2'-O-metil-módositott nukleozidokat tartalmaz foszfor-tioát kötéssel. Ez a kettős módosítás sokkal erősebb antivirális hatást kölcsönöz az oligonukleotidnak, mint akár a foszfor-tioát módosítás (ISIS 3246 jelű vegyület), amely közepes aktivitást mutat, vagy a 2’-O-metil módosítás (ISIS 3258 jelű vegyület, amely enyhe aktivitást mutat) önmagában. Az ISIS 2919 és ISIS 2922 jelű vegyületek hatékonyságát a véletlenszerű kontroll oligonukleotidokhoz viszonyítva dózistól független vizsgálatban (4. ábra) ellenőrizzük.
Szekvencia lista (2) Információ az 1. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem i 'ívj antiszenz: igen ··* ··♦ ·♦·
- 33 (xi) a szekvencia ismertetése: az 1. számú szekvencia: GTGTCAAGTG GCACCATACG 20 (2) Információ a 2. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 2. számú szekvencia: TGGAAAGTGT ACACAGGCGA A 21 (2) Információ a 3. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 3. számú szekvencia:
GGGTTGAAAA ACATAGCGGA C 21 •a· ··· • ·«
- 34 (2) Információ a 4. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 4. számú szekvencia: GAGGACTCCA TCGTGTCAAG 20 (2) Információ az 5. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: az 5. számú szekvencia: GTGGGCCATG ATGATGGAAG G 21 (2) Információ a 6. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A)> hosszúság: 21 báz’ 1 pár ·· · · · · • ··· · 4 · ··· » • · · · · ······ *·· ·· ·« (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 6. számú szekvencia:
GTCCCGTAGA TGACCCGCGC C 21 (2) Információ a 7. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 7. számú szekvencia:
CGGCGCAGAT TGCAAGGGCG G 21 (2) Információ a 8. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris ♦ · · · (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 8. számú szekvencia: GCCGGAGCCG GGTGAAACGC C 21 (2) Információ a 9. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 9. számú szekvencia: CGCCGTCCGG ACACCGGGCG C 21 (2) Információ a 10. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus; nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen *«
(xi) a szekvencia ismertetése: a 10. számú szekvencia: ACCGGGAAAC CACGCCGGCG G 21 (2) Információ a 11. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 11. számú szekvencia: CCGCGCCCTC TTCTTTGCCG G 21 (2) Információ a 12. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 12. számú szekvencia:
GGTACTTACG TCACTCTTGG C 21 ··
- 38 (2) Információ a 13. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 13. számú szekvencia: GACGGTGACT GCAGAAAAGA C 21 (2) Információ a 14. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 14. számú szekvencia: GACACGTACC GTGGCACCTT G 21 (2) Információ a 15. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 15. számú
GTCTCGGGCC TAAACACATG (2) Információ a 16. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 16. számú
CAGACTTACC GACTTCTGCC (2) Információ a 17. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu <D) topológia: lineáris szekvencia:
szekvencia:
« *-♦ · * • · ·9 ···· *«·* ·· · · · V • ·«· ··· * • · · « · ♦····· ··· « * · · (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (ív) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 17. számú szekvencia:
CTGTTTGACT GTAGAGGAGG 2 0 (2) Információ a 18. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 18. számú szekvencia:
GGGTCCTTCA TCTGGGAGAG C 21 (2) Információ a 19. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen ·»· ···
(xi) a szekvencia ismertetése: a 19. számú szekvencia:
CGGCTCAGGT CGTCAATCTT G (2) Információ a 20. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 20. számú szekvencia:
GCGCACCATG ACCTGTTTGG G (2) Információ a 21. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 21. számú szekvencia:
GTTTTGCGCG GTTTCTTACG C ««« «*· ♦ ·-· ·· ♦· (2) Információ a 22. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 22. számú szekvencia: GCGTTTGCTC TTCTTCTTGCG 21 (2) Információ a 23. számú szekvenciáról (1) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 23. számú szekvencia: CGTCTCCAGG CGATCTGACG C 21 (2) Információ a 24. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
hosszúság: 21 bázis pár ··· ··· ♦·· ·· • 9 ·· • ·· ···· • · • · ··· 999
(B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 24. számú szekvencia:
TGGCGTCTCC AGGCGATCTG A (2) Információ a 25. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 25. számú szekvencia:
TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC (2) Információ a 26. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia lineáris
4·· ··· ··* • ·υ ··· • ··· ···· ·« »··· *· W ····«·· • · ·····
Φ ·· (ii) a molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 26. számú szekvencia: CTCCACGCGA ATTTTAACAC A 21 (2) Információ a 27. számú szekvenciáról (i) a szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 bázis pár (B) tipus: nukleinsav (C) szál: egyszálu (D) topológia: lineáris (ii) a molekula tipusa: DNS (genomiális) (iii) feltételezett: nem (iv) antiszenz: igen (xi) a szekvencia ismertetése: a 27. számú szekvencia:
ACTCGGGCTG CCACTTGACA G 21 ·· * $ · * • ··· ··· ··.
• · · · · ··« ··· ··· .· ·.

Claims (40)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy egy citometalovirus IE1, IE2 vagy DNS polimeráz génjéből származó RNS vagy DNS legalább egy szakaszával specifikusan hibridizál.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a DNS polimeráz génből származó mRNS cap hely, AUG szakasz, konzervált aminosav szakasz vagy a 608-697 vagy 1109-1159 bázisok közötti CMV inszerciós szakaszok legalább egy részével specifikusan hibridizál.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az IE1 génből származó mRNS cap hely, AUG szakasz vagy intron/exon csatlakozó szakasz legalább egy részével specifikusan hibridizál .
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az IE2 génből származó AUG/CAP hely, AUG szakasz, IE2 specifikus intron/exon csatlakozó szakasz vagy nukleáris lokációs szignál szakasz legalább egy részével specifikusan hibridizál.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag alkalmazható hordozóanyagba van beépítve.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy minte?. 5 50 nukleinsav bázis egységből áll.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 8-25 nukleinsav bázis egységből áll.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 12-25 nukleinsav bázis egységből áll.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotid egységei közötti kapcsolócsoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoportot tartalmaz.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotid egységei közötti kapcsolócsoportok közül legalább néhány foszfor-tioát részt tartalmazó csoportot tartalmaz.
  11. 11. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák egyikének legalább egy részének megfelelő DNS-sel vagy megfelelő RNS-sel vagy premessenger RNS-sel komplementer:
    GGA CCG GGA CCA CCG TCG TC, GTC CGC TAT GTT TTT CAA CCC CCT TCC ATC ATC ATG GCC CAC GGC GCG GGT CAT CTA CGG GAC
    CCG CTG TGC CCG GCG ACG CGG CCG CCC TTG CAA TCT GCG CCG GGC GTT TCA CCC GGC TCC GGC, GCG CCC GGT GTC CGG ACG GCG CCG CCG GCG TGG TTT CCC GGT CCG GCA AAG AAG AGG GCG CGG, GTG AAC CGT CAG ATC GCC TGG, CTT GAC ACG ATG GAG TCC TC, GCC AAG AGT GAC GTA AGT ACC, GTC TTT TCT GCA GTC ACC GTC, CAA GGT GCC ACG GTA CGT GTC, CAT GTG TTT AGG CCC GAG AC, GGC AGA ACT CGG TAA GTC TG, CCT CCT CTA CAG TCA AAC AG, GCG CCT ATC ATG CTG CCC CTC, GCT CCA GAT GAA CCA CCC,
    • ·
    CAA GAT TGA CGA GGT GAG CCG, CCC AAA CAG GTC ATG GTG CGC, GCG TAA GAA ACC GCG CAA AAC, vagy CGC AAG AAG AAG ACG AAA CGC. 12. A 11. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligo-
    nukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag alkalmazható hordozóba van beépítve.
  12. 13. A 11. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotid egységei közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoportot tartalmaz.
  13. 14. A 11. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotid egységei közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszfor-tioát részt tartalmazó csoportot tartalmaz.
  14. 15. Eljárás citomegalovirus fertőzés aktivitásának módosítására, azzal jellemezve, hogy a CMV fertőzött állatot olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal kezeljük, amely a citomegalovirus IE1, IE2 vagy DNS polimeráz génjéből származó RNS vagy DNS legalább egy részével specifikusan hibridizál.
  15. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán citomegalovirus fertőzés kezelésére alkalmazzuk.
  16. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve.
    • · ·
    - 49 hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely a DNS polimeráz génből származó mRNS cap hely, AUG szakasz, konzervált aminosav szakasz vagy a 608-697 vagy 1109-1159 bázisok közötti CMV inszerciós szakasz legalább egy részével specifikusan hibridizál.
  17. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely az IE1 génből származó mRNS cap hely, AUG szakasz vagy intron/exon csatlakozó szakasz legalább egy részével specifikusan hibridizál.
  18. 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely az IE2 génből származó AUG/CAP hely, AUG szakasz, IE2 specifikus intron/exon csatlakozó szakasz vagy nukleáris lokációs szignál szakasz legalább egy részével specifikusan hibridizál.
  19. 20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag alkalmazható hordozóanyagba beépített oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk.
  20. 21. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan 1. igénypont szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely mintegy 5-50 nukleinsav bázis egységet tartalmaz.
  21. 22. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan 1. igénypont szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely mintegy 8-25 nukleinsav bázis egységből áll.
    ♦ < ·
  22. 23. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan 1. igénypont szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely mintegy 12-25 nukleinsav bázis egységből áll.
  23. 24. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynek nukleotid egységei közötti kapcsolócsoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoportot tartalmaz.
  24. 25. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynek nukleotid egységei közötti kapcsolócsoportok közül legalább néhány foszfor-tioát részt tartalmazó csoportot tartalmaz.
  25. 26. Eljárás citomegalovirus fertőzés akvitásának módosítására, azzal jellemezve, hogy a CMV fertőzött állatot olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal kezeljük, amely az alábbi szekvenciák egyikének legalább részben megfelelő DNS-sel vagy megfelelő RNS-sel vagy premessenger
    RNS-sel GGA komplementer: CCG GGA CCA CCG TCG TC, GTC CGC TAT GTT TTT CAA CCC CCT TCC ATC ATC ATG GCC CAC GGC GCG GGT CAT CTA CGG GAC
    CCG CTG TGC CCG GCG ACG CGG
    CCG CCC TTG CAA TCT GCG CCG GGC GTT TCA CCC GGC TCC GGC, GCG CCC GGT GTC CGG ACG GCG CCG CCG GCG TGG TTT CCC GGT CCG GCA AAG AAG AGG GCG CGG, GTG AAC CGT CAG ATC GCC TGG, CTT GAC ACG ATG GAG TCC TC, GCC AAG AGT GAC GTA AGT ACC, GTC TTT TCT GCA GTC ACC GTC, CAA GGT GCC ACG GTA CGT GTC, CAT GTG TTT AGG CCC GAG AC, GGC AGA ACT CGG TAA GTC TG, CCT CCT CTA CAG TCA AAC AG, GCG CCT ATC ATG CTG CCC CTC, GCT CTC CCA GAT GAA CCA CCC,
    CAA GAT TGA CGA GGT GAG CCG,
    CCC AAA CAG GTC ATG GTG CGC,
    GCG TAA GAA ACC GCG CAA AAC, vagy
    CGC AAG AAG AAG ACG AAA CGC.
  26. 27. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a 2. táblázatban megadott szekvenciák egyikét legalább részben tartalmazó citomegalovirus DNS-ével vagy megfelelő mRNS-ével vagy pre-mRNS-ével specifikusan hibridizál.
  27. 28. A 27. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag alkalmazható hordozóanyagba van beépítve.
  28. 29. A 27. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotid egységei közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoportot tartalmaz.
  29. 30. A 27. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotid egységei közötti kapcsoló csoportok közül néhány foszfor-tioát részt tartalmazó csoportot tartalmaz.
  30. 31. A 27. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a nukleotid bázisok közül legalább néhány 2'-0-alkil módosítást hordoz.
  31. 32. A 5?. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligo··«· • · ·
    - 53 nukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a nukleotid bázisok közül legalább néhány 2'-0-metil módosítást hordoz.
  32. 33. Eljárás citomegalovirus fertőzés aktivitásának módosítására, azzal jellemezve, hogy a citomegalovirus fertőzött állatot terápiásán hatékony mennyiségben olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal kezeljük, amely a 2. táblázatban megadott szekvenciák egyikét legalább részben tartalmazó citomegalovirus DNS-ével vagy megfelelő mRNS-ével vagy pre-mRNS-ével specifikusan hibridizál.
  33. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag alkalmazható hordozóanyagba beépített oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk.
  34. 35. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynek nukleotid egységei közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú csoportot tartalmaz.
  35. 36. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynek nukleotid egységei közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszfor-tioát részt tartalmazó csoportot tartalmaz.
  36. 37. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynek nukleotid bázisai legalább részben 2'-O-alkil módosítást hordoznak.
  37. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynek nukleotid bázisai legalább részben 2’-0-metil módosítást hordoznak.
  38. 39. A 27. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligo- nukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy foszfor-tioát ♦
    csoporttal kapcsolódó 2'-0-metil módosított nukleozidokat tartalmaz.
  39. 40. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amely foszfor-tioát csoporttal kapcsolódó 2'-0-metil módosított nukleozidokat tartalmaz.
  40. 41. Oligonukleotid, amely a 22. számú szekvenciát tartalmazza.
HU93398A 1990-08-16 1991-08-14 Process for producing oligonucleotides influencing the effect of cytomegalovirus infection HUT63430A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56836690A 1990-08-16 1990-08-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9300398D0 HU9300398D0 (en) 1993-05-28
HUT63430A true HUT63430A (en) 1993-08-30

Family

ID=24270996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU93398A HUT63430A (en) 1990-08-16 1991-08-14 Process for producing oligonucleotides influencing the effect of cytomegalovirus infection

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5591720A (hu)
EP (1) EP0544713B1 (hu)
JP (1) JP2708960B2 (hu)
KR (1) KR970005273B1 (hu)
AT (1) ATE154947T1 (hu)
AU (1) AU649717B2 (hu)
BR (2) BR9106751A (hu)
CA (1) CA2089666C (hu)
DE (1) DE69126710T2 (hu)
DK (1) DK0544713T3 (hu)
ES (1) ES2104717T3 (hu)
FI (1) FI930658A0 (hu)
GR (1) GR3024873T3 (hu)
HU (1) HUT63430A (hu)
NO (1) NO930515L (hu)
WO (1) WO1992003456A1 (hu)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US5789573A (en) * 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
US5595978A (en) * 1990-08-16 1997-01-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composition and method for treatment of CMV retinites
US6153595A (en) * 1990-08-16 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Composition and method for treatment of CMV infections
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US7119184B2 (en) 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
CA2159639A1 (en) * 1993-04-02 1994-10-13 Vincent J. Miles Method for selective inactivation of viral replication
US6824976B1 (en) 1993-04-02 2004-11-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method for selective inactivation of viral replication
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5801235A (en) * 1994-05-25 1998-09-01 Hybridon, Inc. Oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
WO1997033992A1 (en) * 1996-03-14 1997-09-18 Hybridon, Inc. Selected oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity
AU3309697A (en) * 1996-06-18 1998-01-07 Hybridon, Inc. Compositions and methods for treating specific gene expression-related diseases and disorders in humans
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6127533A (en) * 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
WO1998037919A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO1998046740A1 (en) * 1997-04-17 1998-10-22 Antivirals, Inc. Method of treating restenosis by antisense targeting of cmv
EP1003531B1 (en) 1997-05-20 2007-08-22 Ottawa Health Research Institute Processes for preparing nucleic acid constructs
US5877309A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
US20070149472A1 (en) * 1997-08-13 2007-06-28 Mckay Robert Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of jnk proteins
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
AU760549B2 (en) 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
US6841539B1 (en) * 1998-05-21 2005-01-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6867294B1 (en) * 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6335194B1 (en) 1998-09-29 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of survivin expression
NZ513402A (en) 1999-02-12 2003-06-30 Sankyo Co Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
JP4151751B2 (ja) * 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
PT1446162E (pt) 2001-08-17 2009-01-27 Coley Pharm Gmbh Agrupamentos imunoestimuladores oligonucléotidos com actividade melhorada
KR20040008342A (ko) * 2002-07-18 2004-01-31 한국전력공사 산업용 보일러의 화학세정시 발생하는 폐액 재활용 방법
EP1537208A1 (en) * 2002-09-13 2005-06-08 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
EP1556077A2 (en) 2002-10-29 2005-07-27 Coley Pharmaceutical Group, Ltd Use of cpg oligonucleotides in the treatment of hepatitis c virus infection
US7683036B2 (en) * 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
EP2735613A1 (en) 2011-07-22 2014-05-28 Public University Corporation Yokohama City University TECHNIQUE FOR CLEAVING OUT PART OF poly(A) CHAIN AND/OR 3'-TERMINAL SEQUENCE OF mRNA TO INHIBIT TRANSLATION REACTION
RU2723032C2 (ru) 2014-12-29 2020-06-08 Бонак Корпорейшн Композиция, стабильно содержащая молекулу нуклеиновой кислоты
US10688164B2 (en) * 2015-11-20 2020-06-23 Oregon Health & Science University CMV vectors comprising microRNA recognition elements
US20210395746A1 (en) * 2018-06-12 2021-12-23 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads Compositions for herpesvirus transcriptional feedback circuit disruption and uses thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5248670A (en) * 1990-02-26 1993-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses

Also Published As

Publication number Publication date
EP0544713A1 (en) 1993-06-09
WO1992003456A1 (en) 1992-03-05
JPH06501841A (ja) 1994-03-03
CA2089666A1 (en) 1992-02-17
AU649717B2 (en) 1994-06-02
FI930658A (fi) 1993-02-15
NO930515D0 (no) 1993-02-12
ATE154947T1 (de) 1997-07-15
HU9300398D0 (en) 1993-05-28
DE69126710T2 (de) 1998-01-15
FI930658A0 (fi) 1993-02-15
EP0544713B1 (en) 1997-07-02
US5591720A (en) 1997-01-07
NO930515L (no) 1993-03-31
CA2089666C (en) 2003-01-07
BR9106751A (pt) 1993-08-17
AU8439391A (en) 1992-03-17
DE69126710D1 (de) 1997-08-07
KR930701465A (ko) 1993-06-11
GR3024873T3 (en) 1998-01-30
DK0544713T3 (da) 1997-09-29
EP0544713A4 (en) 1994-05-18
JP2708960B2 (ja) 1998-02-04
KR970005273B1 (ko) 1997-04-15
BR1100909A (pt) 2000-06-06
ES2104717T3 (es) 1997-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT63430A (en) Process for producing oligonucleotides influencing the effect of cytomegalovirus infection
US5442049A (en) Oligonucleotides for modulating the effects of cytomegalovirus infections
US6310044B1 (en) Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpesviruses
Anderson et al. Inhibition of human cytomegalovirus immediate-early gene expression by an antisense oligonucleotide complementary to immediate-early RNA
Boldogh et al. Transcriptional activation of cellular oncogenes fos, jun, and myc by human cytomegalovirus
US5885834A (en) Antisense oligodeoxynucleotide against phosphodiesterase
US5242906A (en) Antisense oligonucleotides against Epstein-Barr virus
Pari et al. Potent antiviral activity of an antisense oligonucleotide complementary to the intron-exon boundary of human cytomegalovirus genes UL36 and UL37
JPH08503959A (ja) ヘルペスウイルスの効果を変調するオリゴヌクレオチド治療法
US5849900A (en) Inhibition of viruses by antisense oligomers capable of binding to polypurine rich tract of single-stranded RNA or RNA-DNA hybrids
JPH08500481A (ja) ウイルスの複製を阻害するための方法および薬剤
WO1992003454A1 (en) Inhibition of influenza virus type a, ann arbor strain h2n2 by antisense oligonucleotides
Peyman et al. Inhibition of viral growth by antisense oligonucleotides directed against the IE110 and the UL30 mRNA of herpes simplex virus type-1
WO1994007367A9 (en) Anti-viral oligomers that bind polypurine tracts of single-stranded rna or rna-dna hybrids
AU725047B2 (en) Composition and method for treatment of CMV infections
WO1993007882A1 (en) Compositions and methods for treatment of epstein-barr virus-associated diseases
JPH05508998A (ja) 細胞接着のオリゴヌクレオチド変調
JPH10500851A (ja) 抗サイトメガロウイルス作用を有するオリゴヌクレオチド
US5550047A (en) Oligonucleotides with anti-Epstein-Barr virus activity
CA2158834C (en) Antisense oligos which interfere with mrna cap activity and inhibit translation
Abe et al. Inhibition of influenza virus replication by phosphorothioate and liposomally endocapsulated oligonucleotides
CA2211877A1 (en) Human immunodeficiency virus transcription inhibitors and methods of their use
Jacob et al. Inhibition of viral growth by an α‐oligonucleotide directed to the splice junction of Herpes simplex virus type‐1 immediate‐early pre‐mRNA species 22 and 47
Kmetz et al. Vmw65 phosphorothioate oligonucleotides inhibit HSV KOS replication and Vmw65 protein synthesis
Temsamani et al. Antisense oligonucleotides as antiviral agents

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee