CN103717735A

CN103717735A - 切断mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分而抑制翻译反应的技术

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Publication number: CN103717735A
Application number: CN201280036289.1A
Authority: CN
Inventors: 和田忠士; 竹田圭; 半田宏
Original assignee: YOSHINDO Inc; PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: YOSHINDO Inc; PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Tokyo Institute of Technology NUC; Yokohama City University
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2014-04-09
Also published as: WO2013015152A1; KR20140060290A; US20140189895A1; JP5953617B2; TW201319248A; EP2735613A1; CA2842580A1; JPWO2013015152A1

Abstract

本发明提供相比以往方法（RNAi法－核酶法－反义法）设计更简便，并且效果的确认也容易的人为的基因表达抑制方法。包括切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分来抑制目标基因的翻译反应的方法。也提供含可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、用于抑制翻译反应的试剂盒；导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、而使目标基因的翻译反应被抑制的细胞；及导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、目标基因的翻译反应进而被抑制的非人生物。

Description

切断mRNA的多聚(A)链和/或3’末端序列的一部分而抑制翻译反应的技术

【技术领域】

本发明涉及切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分，进而抑制目标基因的翻译反应的技术。

【背景技术】

作为人为地限制基因表达的方法，有RNAi法（专利文献1、非专利文献1）、核酶法（专利文献2、3、非专利文献2）及反义法（专利文献4、5、非专利文献3）。RNAi法或核酶法是通过由与目标mRNA特异性地结合的核酸等诱导目标mRNA的特异性分解来抑制基因表达的方法。反义法是通过由与目标mRNA特异性地结合的核酸等使目标mRNA形成双链来诱导抑制翻译反应或抑制正常的剪接反应而抑制基因表达的方法。

RNAi法或核酶法是依赖于经目标mRNA内的由数十碱基组成的特异序列（目标序列）诱导切断mRNA的活性的方法。由于mRNA的长度一般是1000个碱基以上，必需要对可能得到目的效果的目标序列进行选择。虽然有软件等的，但没实质的内容，现状是，对于多个位点作为目标进行预实验，从中选择有效果的目标序列。

另一方面，在反义法中，虽然目标序列限定于翻译起始密码子周边和剪接接头部位，但前者由于无法在mRNA水平检测反义效果，从而确认效果的判断是烦琐的。另外，后者虽然可在mRNA水平检测效果，难以评价是否是丧失了功能的蛋白质。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1:特开2009-291209

专利文献2:WO92/03456

专利文献3:专利第2708960号

专利文献4:WO88/04300A1

专利文献5:专利第2530906号

【非专利文献】

非专利文献1：Nature.2009Jan22;457(7228):396-404.On theroad to reading the RNA-interference code.Siomi H,Siomi MC.

非专利文献2：Chem Senses.1998Apr;23(2):249-55.Currentstatus of antisense DNA methods in behavioral studies.Ogawa S,PfaffDW.

非专利文献3：Trends Genet.1996Dec;12(12):510-5.Anti-genetherapy:the use of ribozymes to inhibit gene function.Couture LA,Stinchcomb DT.

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明旨在提供相比以往方法（RNAi法－核酶法－反义法）设计更为简便，并且效果的确认也更容易的人为的基因表达抑制方法。

【解决课题的技术方案】

本发明人发现，通过选择性地删除mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分可抑制翻译反应，由此可达到特异性的基因表达抑制效果，从而完成本发明。

本发明的要点如下。

（1）抑制目标基因的翻译反应的方法，其包括切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分。

（2）（1）所述的方法，其中使用可与目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分杂交的核糖核酸切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分。

（3）（2）所述的方法，其中核糖核酸由与从目标mRNA的多聚（A）链结合部位开始直至上游40位核苷酸的区域的序列的全部或一部分互补的核苷酸序列组成。

（4）（3）所述的方法，其中从目标mRNA的多聚（A）链结合部位开始直至上游40位核苷酸的区域的序列的全部或一部分含聚A信号序列的全部或一部分。

（5）（3）或（4）所述的方法，其中核糖核酸是20～25聚体。

（6）（2）～（5）中任一项所述的方法，其中核糖核酸由天然型的核苷酸组成。

（7）（6）所述的方法，其中核糖核酸是双链RNA。

（8）（2）～（5）中任一项所述的方法，其中核糖核酸含至少1个的核苷酸类似物。

（9）（8）所述的方法，其中核糖核酸是单链。

（10）（9）所述的方法，其中单链核糖核酸是反义吗啉代寡核苷酸。

（11）用于抑制目标基因的翻译反应的试剂盒，其含可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂。

（12）（11）所述的试剂盒，其中可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂是核糖核酸。

（13）细胞，其是导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的目标基因的翻译反应被抑制的细胞。

（14）非人生物，其是导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、目标基因的翻译反应被抑制的非人生物。

【发明效果】

由本发明，使目标序列测序简便地抑制基因表达成为可能。另外，由于是在mRNA水平上进行基因表达抑制效果的评价，效果的评价变得容易。

再者，由本发明，使同时或选择性地抑制从相同基因通过选择性剪接反应制成的多个mRNA的翻译反应成为可能。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请、特愿2011-160512的说明书和/或附图中记载的内容。

【附图说明】

【图1】通过cdk9MO（吗啉代寡核苷酸）的注入使初期胚中的zcdk9mRNA的多聚（A）链延伸和翻译得到抑制，但注入cdk9m MO时不发生此现象。（A）MO所杂交的zcdk9mRNA3'UTR内的目标序列。（B）注入了cdk9MO的胚中的zcdk9mRNA的多聚（A）链的延伸抑制。胚在所示的各时间回收。从未处理胚（WT）、cdk9MO注入胚及cdk9m MO注入胚提取总RNA。使用cdk9、tbp、细胞周期蛋白B1、及细胞周期蛋白B2的PAT用引物进行的PAT测定。PCR产物用2.2%的琼脂糖凝胶电泳解析。右侧为碱基长所示的长度的标志物。（C）由cdk9MO的zcdk9mRNA的特异性翻译抑制。用cdk9MO不发生此现象。在所示的各时间回收的胚。在未处理胚（泳道1、4、7、10）、cdk9MO注入胚（泳道2、5、8、11）及cdk9m MO注入胚（泳道3、6、9、12）中用图中所示的抗体实施的蛋白印迹。HeLa细胞的核提取液（NE）（泳道13）是阳性对照。（D）在受精后3小时、4小时及5小时回收的注入cdk9MO及cdk9m MO的胚。它们的胚提取液（（C）中使用的）用蛋白印迹法解析。（E和F）使用随机引物（E）和寡-dT引物（F）的逆转录，及其后实施的使用cdk9、biklf、tbp、及肌动蛋白的各自的引物的PCR。产物用2.2%琼脂糖凝胶解析。胚在所示的各时间回收。从未处理胚（WT、泳道1～3）、cdk9MO注入胚（cdk9MO、泳道4～6）及cdk9m MO注入胚（cdk9m MO、泳道7～9）提取总RNA。

【图2】从zcdk93'UTR的末端开始的40个核苷酸在zcdk9mRNA的表达抑制中很重要。（A）zcdk9mRNA3'UTR的末端序列与反义MO杂交的位置。本发明人将连结多聚（A）链的碱基定义为-1，分配编号。从未处理胚（WT）、cdk9MO注入胚及cdk9m MO注入胚提取总RNA。（B）由cdk9MO、MO-5、MO-6及MO-7的注入导致充分抑制zcdk9mRNA的表达。注入了MO的胚（泳道2～8）或未处理胚（泳道1）在受精后3小时回收而提取总RNA。然后，用cdk9和tbp的PAT引物实施PAT测定。（C）被注入各自所表示的MO的自受精后5小时的自胚的提取液（泳道2～8）及未处理胚提取液（泳道1）用7.5%SDS-聚丙烯酸类树脂酰胺凝胶解析。在印迹中使用抗zCdk9抗体、抗人Cdk9抗体（H-169）及抗肌动蛋白抗体。将HeLa细胞核提取液（NE）作为阳性对照使用（泳道9）。

【图3】mRNA3’UTR末端序列的确定。（A）图解了确定本研究中采用的mRNA3’UTR末端序列的方法。（B）PCR产物用溴化乙锭染色进行可视化。（C）各MO注入胚来源的cDNA的DNA测序结果。选择5个克隆，记录其3’末端序列。垂线表示mRNA的多聚（A）链连结部位。其连结部位的信息由NCBI核苷酸数据库（NM_212591.1.）取得。

【图4】MO导致的多聚（A）链抑制延伸的特异性。（A）细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白B2MO的序列。（B）从注入各所示的MO的受精后5小时的胚（泳道2～4）及未处理胚（泳道1）提取总RNA。使用cdk9、细胞周期蛋白B及细胞周期蛋白B2的PAT引物实施PAT测定。也进行由肌动蛋白引物组的PAT测定（肌动蛋白）。PCR产物用2.2%琼脂糖凝胶解析。右侧为碱基长所示的长度的标志物。（C）从注入各所示的MO的受精后5小时的胚（泳道1～5）及未处理胚（泳道6）提取总RNA。使用cdk9、tbp及细胞周期蛋白B1的PAT引物实施PAT测定。PCR产物用2.2%琼脂糖凝胶解析。右侧为碱基长所示的长度的标志物。

【图5】以zcdk93'UTR为目标对zcdk9mRNA的表达抑制进行探讨。（A）zcdk9mRNA的3'UTR末端序列和反义MO杂交结合的部分。本发明人将连结多聚（A）链的碱基定义为-1，如图所示分配数字。（B）仅cdk9MO影响zcdk9mRNA的多聚（A）链延伸。注入各MO的胚（泳道1～5）或未处理胚（泳道6）在受精后3小时回收。从各自的胚分离总RNA。由cdk9和tbp的PAT引物实施PAT测定，PCR产物用2.2%琼脂糖凝胶解析。右侧为碱基长所示的长度的标志物。（C）仅cdk9MO抑制zcdk9的mRNA的翻译。胚在受精后5小时回收。用各自的胚提取液实施蛋白印迹解析。HeLa细胞核提取液（NE）作为阳性对照对待（泳道7）。使用抗zCdk9抗体和抗肌动蛋白抗体。

【图6】对MO的多聚（A）链短小化的特异性效果。（A）图中所示的各自的mRNA3'UTR的序列信息和反义MO杂交的位置。（B）用PAT测定检测的MO介导的多聚（A）链延伸抑制。胚在图中所示的时间回收。总RNA来自未处理胚（WT、泳道21～24）、cdk9MO注入胚（泳道1～4）、cdk9m MO注入胚（泳道5～8）、tbp MO注入胚（泳道9～12）、细胞周期蛋白B1MO注入胚（泳道13～16）、及细胞周期蛋白B2MO注入胚（泳道17～20）。PAT测定使用cdk9、tbp、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白B2的PAT引物进行。显示寡dT在逆转录反应中使用寡dT引物。显示tbp随机和肌动蛋白随机各自在逆转录反应中使用随机引物，在其后的PCR反应中使用tbp或肌动蛋白的PCR用引物组。PCR产物用2.2%琼脂糖凝胶解析。

【图7】MO的杂交后，mRNA的3’UTR末端序列确定的假想模型。（A）通过MO向mRNA的3’UTR的杂交而多聚（A）链短小化被活化。说不定是由多聚（A）链短小化酶去除多聚（A）链之后，外切核酸酶切除3’UTR的末端序列。在此模型中，MO-mRNA间的杂交体抑制其他外切核酸酶的侵入。（B）识别MO和mRNA间的杂交体的内切核酸酶在从杂交体部分至下游切断mRNA。

【图8】在HeLa细胞中，由以mRNA的3’UTR作为目标的siRNA，诱导目标基因mRNA的多聚（A）链的切断。使用寡-dT引物的逆转录反应和其后实施的使用RelA、Bcl-xL、Livin、PLK1及肌动蛋白的各自的引物的PCR。产物用2.0%琼脂糖凝胶解析。全从自siRNA导入24小时后的细胞提取RNA。n/c是导入了阴性对照siRNA的。

【图9】在HeLa细胞中，由以mRNA的3’UTR作为目标的siRNA诱导目标基因mRNA的分解。使用随机引物的逆转录反应和其后实施的使用RelA、Bcl-xL、Livin、PLK1及肌动蛋白的各自的引物的PCR。产物用2.0%琼脂糖凝胶解析。从自siRNA导入24小时后的细胞提取总RNA。n/c是导入了阴性对照siRNA的。

【图10】在HeLa细胞中，由以mRNA的3’UTR作为目标的siRNA特异性地诱导目标基因的翻译抑制。将自各siRNA导入24小时后的细胞的提取液用图中所示的抗体由蛋白印迹法解析。n/c是导入了阴性对照siRNA的。

【图11】在HeLa细胞中，由以tPA mRNA的3’UTR作为目标的siRNA诱导tPA mRNA的多聚（A）链的切断及mRNA自身的分解。使用寡-dT引物（上段）或随机引物（下段）的逆转录反应和其后实施的使用tPA及肌动蛋白的各自的引物的PCR。产物用2.0%琼脂糖凝胶解析。细胞用所示的各自的浓度的PMA处理24小时。从自siRNA导入24小时后的细胞提取总RNA。n/c是导入了阴性对照siRNA的。

【图12】RelA、Bcl-xL、Livin、PLK1及tPA的各自的mRNA3'UTR的末端序列信息和实验中使用的siRNA的目标序列（加下划线部分）。

【实施方式】

以下，更详细地说明本发明的实施方式。

本发明提供抑制目标基因的翻译反应的方法，其包括切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分。

抑制翻译反应的目标基因可以是任何基因，可例示为酶基因、癌相关基因、免疫相关基因、分化相关基因、神经相关基因、DNA修复基因、疾病相关基因等，但不限于这些。另外，也可为未知功能的基因。

为了切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分，可使用可与目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分杂交的核糖核酸。

可与目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分杂交的核糖核酸由与从目标mRNA的多聚（A）链结合部位开始直至上游45位核苷酸的区域的序列的全部或一部分互补的核苷酸序列组成即可，优选由与从目标mRNA的多聚（A）链结合部位开始直至上游40位核苷酸的区域的序列的全部或一部分互补的核苷酸序列组成。

另外，从目标mRNA的多聚（A）链结合部位开始直至上游40位核苷酸的区域的序列的全部或一部分也可含聚A信号序列的全部或一部分。

可与目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分杂交的核糖核酸可以是20～25聚体。核糖核酸可为天然型的核苷酸（例如，双链RNA），也可含至少1个核苷酸类似物。作为天然型的核苷酸，可例示双链RNA、DNA、DNA-RNA嵌合体等。含至少1个核苷酸类似物的核糖核酸是单链即可，可例示反义吗啉代寡核苷酸、S寡体、2'-O-甲基化RNA、2'-F-RNA、BNA（LNA）寡体等。核糖核酸可用基因工程学的方法、化学合成法等的公知的方法制作。

本发明的翻译反应抑制方法可在体外（细胞、或者非细胞系）或体内（生物）进行。

由本发明的翻译反应抑制方法，可抑制细胞、人及非人生物中的基因表达。通过利用本发明的翻译反应抑制方法，使例如，由致癌基因的选择性表达抑制的癌治疗、由与免疫反应相关的基因的表达特异性的抑制的过敏反应的缓和、由与细胞分化相关的基因的表达特异性的抑制的分化控制、由与神经兴奋传递相关的基因的表达特异性的抑制的向精神药的开发变得可能。

另外，本发明提供用于抑制目标基因的翻译反应的试剂盒，其含可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂。可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂可以是核糖核酸。核糖核酸只要是可与目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分杂交的即可，以上阐述了这样的核糖核酸。本发明的试剂盒可在抑制细胞、人及非人生物中的基因表达中使用。本发明的试剂盒也可再含转染试剂、对照用试剂（例如，阴性对照的核糖核酸、阳性对照的核糖核酸）、用于检测阳性对照的试剂（例如，针对阳性对照所靶标的蛋白质的抗体、可检测其蛋白质的mRNA的表达的引物等）等的其他试剂、手册等。

再者，本发明提供其中导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、目标基因的翻译反应被抑制的细胞。在本发明的细胞中，目标基因的表达可被抑制。

可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂是核糖核酸即可。核糖核酸只要是可与目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分杂交的即可，这样的核糖核酸如前所述。

为了将可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂导入细胞，当此试剂是核糖核酸时，可使用磷酸钙法、电穿孔法、脂转染法、微注射法、由基因枪的方法、土壤杆菌（Agrobacterium）法、病毒载体法等任何的基因导入法。可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的核糖核酸可直接导入细胞内，也可利用公知的载体系统在细胞内表达。

导入可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的细胞只要有目标基因即可，无关于分化－未分化，可为体细胞，也可为生殖细胞，永生化的细胞，转化的细胞。可例示胚（人或人以外的生物来源）、癌细胞、免疫细胞、神经细胞、生殖细胞、干细胞等。细胞可源于鱼类（斑马鱼等）、哺乳类（人之外、小鼠、大鼠、仓鼠、猴、牛、山羊、猪、羊、狗等人以外的哺乳类）、鸟类（鸡等）、昆虫类（猩猩蝇等）、棘皮动物（海胆、海星、海参等）、线虫、非洲爪蟾等的蛙等的动物；双子叶植物（拟南芥、烟草、棉等）、单子叶植物（稻、玉米、大麦、小麦等）等的植物；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等的细菌；真菌、酵母等的真菌等任何来源的生物。

再另外，本发明提供其中导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、翻译反应被抑制的非人生物。在本发明的非人生物中，目标基因的表达可被抑制。

为了将可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂导入生物，当此试剂是核糖核酸时，可使用磷酸钙法、电穿孔法、脂转染法、微注射法、由基因枪的方法、土壤杆菌（Agrobacterium）法、病毒载体法等任何基因导入法。可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的核糖核酸可直接导入生物内，也可利用公知的载体系统在生物内表达。

导入可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的非人生物只要有目标基因即可，可为鱼类（斑马鱼等）、哺乳类（小鼠、大鼠、仓鼠、猴、牛、山羊、猪、羊、狗等人以外的哺乳类）、鸟类（鸡等）、昆虫类（猩猩蝇等）、棘皮动物（海胆、海星、海参等）、线虫、非洲爪蟾等的蛙等的动物；双子叶植物（拟南芥、烟草、棉等）、单子叶植物（稻、玉米、大麦、小麦等）等的植物；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等的细菌；真菌、酵母等的真菌等之任何生物。

【实施例】

以下，基于实施例详细地说明本发明，本发明不限于这些实施例。

【实施例1】

【以母体mRNA(maternal mRNA)的多聚（A）链连结部位上游作为目标的反义吗啉代去除多聚（A）链而抑制翻译的证据】

【概要】

或是通过与翻译开始部位周边杂交，或以剪接供体部位作为目标而实现了由反义吗啉代寡核苷酸（MO）导致基因表达抑制。在本实施例中，介绍使用针对自母体mRNA的3’非翻译区域（UTR）的多聚（A）链结合部位上游40位核苷酸的25聚体的MO的反义法。本发明人发现，MO去除zcdk9mRNA的多聚（A）链而抑制翻译反应，这表示miRNA和MO的功能的类似点。通过基于PCR的测定法检测到，斑马鱼cdk9或tbp、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白B2的mRNA受特异性的MO依赖的多聚（A）链延伸抑制。从而，此处介绍的反义法显示，MO在mRNA的控制中有miRNA样的活性，同时可应用于动物的卵母细胞或初期胚中的母体mRNA的表达抑制。

【序文】

在用于抑制基因表达的经典的的反义法中，利用的是：单链（ss）DNA通过与互补的碱基对形成DNA-RNA双链而在活体内由该形成诱导的目标mRNA的RNA酶H切断的活性。但是，由于在活体内存在有效分解ssDNA的内切核酸酶，ssDNA导致的反义活性减弱了。为了避免这一问题，由于吗啉代寡核苷酸（MO）有内切核酸酶抗性而被频繁使用。反义ssDNA通过目标mRNA的分解而诱导基因表达抑制，但MO并不介导mRNA的RNA酶H依赖性切断。即，MO和mRNA之间形成双链进而通过MO杂交于在mRNA的翻译启始点附近而抑制翻译，或通过与剪接供体部位形成双链而妨碍正确的剪接。在两者中，可将反义MO作为用于基因表达抑制的非常有效的手段使用，但难以简单地确认对基因表达的MO依赖性的特异性抑制效果。

此处记载用于基因表达抑制控制的新方法。其有效性和特异性以斑马鱼cdk9或tbp、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白B2的母体mRNA作为目标进行确认。该方法的关键的性质是，（1）mRNA的3’UTR和MO通过形成双链不仅抑制多聚（A）链延伸，还发现其可切除多聚（A）链的活性，（2）此方法有诱导mRNA的翻译停止的活性。重要的一点是，以3’UTR作为目标的MO象能同时诱导多聚（A）链短小化和翻译抑制的miRNA一样发挥作用。

【材料和方法】

·合成

DNA和吗啉代寡核苷酸分别由OPERON和Gene Tools公司合成。

·胚

全部的斑马鱼和胚于28℃饲育。

·MO的微量注入

在野生型胚中在1或2细胞期注入约2.5pmol的MO。此研究中使用的MO如下所示。

【反义吗啉代寡核苷酸】

cdk9MO:GGAAATGTGAAGGATTTATAGGTGT（SEQ ID NO:1）

cdk9MO-2:ATTTATACTTATACAAGTAACAAAC（SEQ ID NO:2）

cdk9MO-3:ACCATGACCCCGAACACGTGATCTT（SEQ ID NO:3）

cdk9MO-4:ACAAATAAAAACATCTTTAAAAATA（SEQ ID NO:4）

cdk9MO-5:TGTGAAGGATTTATTGGTGTATTTA（SEQ ID NO:5）

cdk9MO-6:AGGATTTATTGGTGTATTTATACTT（SEQ ID NO:6）

cdk9MO-7:TTATTGGTGTATTTATACTTATACA（SEQ ID NO:7）

cdk9MO-8:GGTGTATTTATACTTATACAAGTAA（SEQ ID NO:8）

cdk9m MO:GGTAATATGAACGATGTATAGGTGT（SEQ ID NO:9）

在研究2种MO的混合物时，向胚内注入各MO分别为1.25pmol。

·胚提取液的制备

回收的10个胚用液氮冷冻之后，溶解于200μl的RIPA缓冲液（150mM NaCl，1%NP-40,0.5%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠，50mM Tris-HCl［pH8.0］）。充分的超声波处理后，通过1分钟的离心分离（12,000g）回收上清100μl，向其中添加40μl的4×Laemmli样品缓冲液。在蛋白印迹解析中，解析14μl的样品（相当于1个胚的一半）。

·胚来源的总RNA的纯化

用Sepasol-RNA I超级（Nacalai Tesque）从胚制备总RNA。

多聚（A）测试分析（PAT）

PAT分析除了加分析微细的修正之外，基本上根据文献10进行。将总RNA（300ng）于65℃、在由12-至18-聚体的多聚（dT）组成的磷酸化寡（dT）引物混合液存在下温育5分钟。与T4DNA连接酶（350U）（TAKARA Bio）于42℃温育1小时之后，将样品与200ng的（dT）₁₂-锚定引物（5'-GCGAGCTCCGCGGCCGCGTTTTTTTTTTTT-3'（SEQ ID NO:10））于12℃温育1小时，再于42℃与SuperScript III逆转录酶（200U）（GE Healthcare）温育1小时而得到PAT cDNA。最后，用（dT）₁₂-锚定引物和各自的基因特异性的引物进行PCR，将PCR产物由2.2%的琼脂糖凝胶电泳分离，将DNA条带用溴化乙锭可视化。基因特异性引物如下所示。

【PAT测定用引物】

zcdk9PAT GTGCTGCCCCAGTGCATTGT（SEQ ID NO:11）

tbp PAT TGTTGTGCAGTGCGAGAGATC（SEQ ID NO:12）

细胞周期蛋白B1PATATGTTGTGAGGGTCAACGAGG（SEQ ID NO:13）

细胞周期蛋白B2PAT AGCAGCAGACTCATGAAGATCA（SEQ ID NO:14）

·逆转录反应-PCR（RT-PCR）

使用SuperScript III转录酶（200U）实施RT-PCR。将随机的和寡（dT）引物（Invitrogen）作为逆转录反应用的引物使用。RT-PCR用的基因特异性引物（正向和反向引物）如下所示。

【PCR用引物】

肌动蛋白正向：5’-CTGAATCCCAAAGCCAACAG-3’（SEQ ID NO:15）

肌动蛋白反向：5’-TCACACCATCACCAGAGTCC-3’（SEQ ID NO:16）

biklf正向：5’-ATGCTGACTCCACCATCCTC-3’（SEQ ID NO:17）

biklf反向：5’-TGTCCGGTGTGTTTCCTGTA-3’（SEQ ID NO:18）

zcdk9正向：5’-CAGCCAATCAGAGTTCGACA-3’（SEQ ID NO:19）

zcdk9反向：5’-TAGTGCCACCGGTAAACTCC-3’（SEQ ID NO:20）

tbp正向：5’-CTTGGGGTGCAAACTTGATT-3’（SEQ ID NO:21）

tbp反向：5’-CATATTTCCTGGCTGCCAAT-3’（SEQ ID NO:22）

细胞周期蛋白B1正向：5’-CAGCTGCAACTTGTTGGTGT-3’（SEQ ID NO:23）

细胞周期蛋白B1反向：5’-GGTAGAGGCCTTCCAAAACC-3’（SEQ ID NO:24）

细胞周期蛋白B2正向：5’-CTCAAAGCATCTGACGGTGA-3’（SEQ ID NO:25）

细胞周期蛋白B2反向：5’-GCAGCAGTCCATCTCTCACA-3’（SEQ ID NO:26）

·蛋白印迹解析

为了抗zCdk9抗体制作，将重组zCdk9蛋白质在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达而准备，用盘型制备电泳分级分离。向兔（委托宝生物株式会社）免疫Cdk9蛋白质，用OPERON的标准流程处理。将多克隆抗Cdk9抗体根据文献11纯化。抗人Cdk9抗体（H-169）和抗肌动蛋白抗体（克隆C4）各购自Santa Cruz和Chemicon。免疫印迹根据文献12进行。印迹用ECL system（GE Healthcare）显色。

·mRNA的3’末端序列的确定

使用进行稍许变更的小RNA克隆试剂盒（Takara）。从胚单离300ng的总RNA之后，用碱性磷酸酶（BAP）处理后，将生物素化的RNA/DNA3’适配体连接到3’末端经BAP处理的RNA。用表面带链霉亲和素的磁性珠回收适配体-连接的RNA。将该珠清洗后，在PCR-R&RT-引物存在下进行逆转录反应，将合成的cDNA通过碱处理从珠游离之后，在zcdk9PAT引物和PCR-R&RT-引物的存在下进行PCR。使PCR产物经历琼脂糖凝胶电泳，将DNA条带用溴化乙锭染色可视化。将条带从凝胶切出，回收DNA片段之后克隆到pMD20-T载体。在含有氨苄西林的板上进行由蓝白判断的克隆的筛选，从各自的克隆回收质粒。通过限制性内切酶处理来确认插入的区域。从各自的样品提取10克隆以上，确定DNA的碱基序列。

【结果】

·将以zcdk9mRNA的3’UTR末端作为目标的MO注入斑马鱼初期胚，则多聚（A）链延伸被抑制，结果，翻译反应被抑制。

在解析中囊胚期转换中的斑马鱼激酶cdk9的mRNA的表达控制机制的过程中，本发明人注意到在翻译反应的活化中多聚（A）链延伸起到重要的作用。从而为了对其进行研究，本发明人想出使用作为毒性低的核酸类似物的吗啉代寡核苷酸（MO）的反义实验。本发明人预计，mRNA的3’UTR和MO间的双链形成可能会抑制多聚（A）链延伸。准备与zcdk9mRNA3'UTR的末端序列完全地互补的由25个碱基组成的cdk9MO（图1A）。为了研究对3’UTR的MO是否对多聚（A）链延伸有影响的，实施给出反映特定的mRNA的多聚（A）链长的PCR产物的PAT测定。向受精的胚注入cdk9MO，则知相比未处理胚（WT），缓慢地电泳的条带显著地降低。即这被认为显示由cdk9MO的多聚（A）链延伸抑制（图1B）。cdk9MO对tbp或细胞周期蛋白B1的条带的产生无影响，仅强力减少cdk9的条带。重要的是，这特异于cdk9MO。即由于，在杂交的碱基序列之中有5个碱基的错配的cdk9m MO中，给出注入其的胚相比未处理胚无变化的结果（图1B）。这些的结果表示cdk9MO特异性地影响cdk9mRNA。

接下来，在蛋白质水平验证MO的基因表达抑制效果。用2种独立的抗体（本发明人独自制作的针对斑马鱼Cdk9的抗体和针对人Cdk9的可商购的抗体H-169）实施蛋白印迹法。将抗肌动蛋白抗体作为对照使用。cdk9MO不影响在受精后3小时的胚中的zCdk9蛋白质的蓄积，但使自第4小时开始的zCdk9蛋白质蓄积量的增加停止（图1C）。与cdk9MO不同，cdk9m MO对于zcdk9mRNA的翻译反应不显示可检测的显著的差。从而，为了更明确显示此结果，再使用图1C中使用的样品进行蛋白印迹测定。结果显示，cdk9MO可抑制初期胚中的Cdk9蛋白质的蓄积的增加（图1D）。综上，这些的结果表示cdk9MO的注入在初期的发生阶段抑制母体zcdk9mRNA的翻译反应。

由于由cdk9MO的注入而cdk9产物在PAT测定中减少，接下来，用RT-PCR法验证此效果。用随机引物或寡-dT引物实施逆转录反应，其后，用PCR扩增zcdk9的编码区域。以确认实验的时间经过过程为目的，解析受精后3小时变得可检测，4小时开始蓄积的mRNA的bilkf的表达（图1E、F）。结果显示，第10次的卵裂周期开始的受精后3小时从体细胞发生基因的转录反应，这与已经报告的实验事实一致。在使用随机引物的RT-PCR中知，无关于是否注入cdk9MO，从实验中使用的全部的胚提取的mRNA得到同量的zcdk9产物（图1E）。从而，结果表示cdk9MO的向胚的注入并非减少zcdk9mRNA量。另一方面，通过使用寡-dT引物的实验可知，将注入cdk9MO的胚用RT-PCR法解析的话，zcdk9mRNA的凝集被降低（图1F）。由于寡-dT引物与多聚（A）链杂交，在由少数的A组成的短的多聚（A）链的情况下，杂交的效率降低了。从而认为其结果是扩增效率减少。所以，本次观察到的RT-PCR测定中的DNA片段的扩增量降低，或许是因为多聚（A）链的短小化而产生短链的多聚（A）的原因（参照以下）。至此，上述的结果表明若将cdk9MO注入初期胚则会诱导mRNA的多聚（A）链的短小化，另一方面，并不发生mRNA分解。

·从zcdk93'UTR末端开始的40个核苷酸是在由MO的多聚（A）链延伸抑制中有活性的区域。

为了研究3’UTR末端是否在MO依赖的抑制中起到重要的作用，准备MO-2（-26～-50）、MO-3（-51～-75）或MO-4（-76～-100）（图5）。通过由PAT测定和蛋白印迹法的解析可知，在5种MO之中仅cdk9MO有多聚（A）链延伸和翻译抑制的活性，提示3’UTR的最末端部分对于该抑制重要。以确认结果的目的，再检查了4种MO。结果确认，抑制多聚（A）链延伸和翻译反应的MO-5（-6～-30）、MO-6（-11～-35）和MO-7（-16～-40）。另外得知，MO-8（-21～-45）有弱的活性（图2B,C）。这些的结果表示，3’UTR末端的40个核苷酸在MO依赖的抑制中是活性部位。

·反义MO从zcdk9mRNA完全地去除多聚（A）链的证据

如上所述，MO和mRNA的3’UTR末端间的双链抑制适宜的多聚（A）链延伸。为了正确地确定MO添加后多聚（A）链部分残留几个残基的A，用图2中得到的注入MO的胚来源的mRNA进行合成的zcdk9cDNA的3’末区域的DNA的测序反应。此过程中采用小RNA克隆试剂盒（Takara）。用该试剂盒，生物素化的RNA/DNA3’适配体附加到mRNA的3’末端，其后，用链霉亲和素磁珠回收－纯化。在珠上实施逆转录反应，cDNA回收后，用由zcdk9PAT引物和PCR-R&RT-引物的PCR扩增cDNA（图3A）。PCR产物用由琼脂糖凝胶的电泳解析，将DNA条带用溴化乙锭染色可视化（图3B）。

将这些PCR产物克隆化到TA-克隆用载体的pMD20-T（Takara)之后，确定该部分的DNA碱基序列。如图3C所示，注入MO-2的胚来源的zcdk9的cDNA与未处理胚来源同样地有完全的多聚（A）链。另一方面，从注入MO、MO-5、MO-6、MO-7、或MO-8的胚来源的cDNA的解析得知，它们使多聚（A）链完全地消失。因此得知，向初期胚的MO注入诱导从MO所靶标的mRNA的多聚（A）链除去。再者，本发明人注意到各自的cDNA的3’末端序列不同。然后得知，随MO和mRNA形成杂交体的部分向上游移动而残留的3’末端序列也向上游移动。即，3’末端有以从MO至MO-5、MO-6、MO-7、然后MO-8的顺序位于上游的倾向。这提示，MO和mRNA间的杂交体的位置恭献于各自的mRNA的3’末端序列的确定。这或许是由于多聚（A）链短小化酶和外切核酸酶的共同作业，或者由于识别该杂交体的内切核酸酶（参照讨论及图7）。

·4种母体mRNA中的MO效果的解析

为了评价对多聚（A）链延伸的MO效果，除了cdk9MO之外，准备细胞周期蛋白B1MO和细胞周期蛋白B2MO的3种基因特异性MO（图4）。为了简单地确定MO的特异性，从受精后5小时的胚提取总RNA，实施使用这些的PAT测定（图4B、C）。也关于细胞周期蛋白B1MO和细胞周期蛋白B2MO进行检查（图4A、B）。其中应言及的是，与斑马鱼细胞周期蛋白B的直系同原物相当的B1或B2各自有由非常类似的碱基序列组成的3’UTR（图4A）。实际上，在细胞周期蛋白B1MO和细胞周期蛋白B2MO间存在10个的相同的碱基（图4A）。实验结果表明，细胞周期蛋白B1MO和细胞周期蛋白B2MO仅对各自特异性地自身的mRNA显示效果（图4B）。使用cdk9MO和tbp MO的时也同样地得到各自有特异性地作用的效果的结果（图4C）。对mRNA的多聚（A）链延伸的MO效果，再用在图6A或B中，从受精后2小时至5小时的胚来源的mRNA确认。这些的结果显示，以3’UTR作为目标的反义MO法在斑马鱼发生初期胚中特异性地作用于多聚（A）链延伸抑制。

【讨论】

就斑马鱼初期胚关于母体mRNA的表达抑制进行报告。这是由多聚（A）链延伸抑制和翻译抑制引起的。关于多聚（A）链延伸抑制，认为在mRNA的多聚（A）链连结部位上游形成的、MO和mRNA间的双链结构对于MO依赖的多聚（A）链延伸抑制是必要的（图2和图5）。需要特别说明的是，MO在从zcdk9mRNA的3'UTR的末端上游从26碱基至50碱基的部分杂交，则观察不到对多聚（A）链有影响（图2和3）。这提示，3'UTR区域的末端部分25碱基是重要的顺式元件。在zcdk9、细胞周期蛋白B1、及细胞周期蛋白B2的mRNAs的3’末端的25碱基部分和在tbp的mRNA中30碱基部分存在典型聚A信号（AAUAAA），在该处结合与在细胞质发生的多聚（A）化相关的RNA-蛋白质复合物之一的CPSF。在非洲爪蟾卵母细胞中，该RNA-蛋白质复合物含细胞质多聚（A）链短小化酶（PARN）和细胞质多聚（A）链延伸酶（Gld-2）是CPSF或细胞质多聚（A）链控制关联因子的CPEB、Pumilio、及Musashi。所以，认为MO杂交于多聚（A）链连结部位抑制向聚A信号的CPSF的结合或该RNA-蛋白质复合物的功能是妥当的。这给Gld-2和PARN的平衡带来变化，结果，或许提示多聚（A）链的短小化发生的可能性。

本发明人发现，MO和mRNA的杂交除去mRNA的3’末端序列部分和多聚（A）链。即，由于从杂交体的位置向mRNA的3’侧移行数碱基的过程中mRNA被切，从而多聚（A）链被去除（图3）。这被认为是因为，起初多聚（A）链短小化酶发挥作用，接下来外切核酸酶发挥作用（图7A）。或者，或许杂交体形成诱导某种内切核酸酶活性，其切断自mRNA上的杂交体位置下游的部分（图7B）。本发明人虽答不上本例适用何种假说，但如果是后者的情况，有必要提出显示识别MO和mRNA的杂交体而结合的内切核酸酶的相关的新的模型。

关于miRNA和MO发挥作用存在3个类似点。即，mRNA的3’UTR是目标，发生多聚（A）链短小化，再者发生翻译抑制。所以认为，是否miRNA关联因子与MO介导的多聚（A）链短小化相关是非常有趣的课题。

本实施例介绍了使用MO的新的方法。此方法的长处是，与以往方法比较，由于以mRNA的3’UTR末端作为目标，从而具有设计简单的优点和可有效确认MO的作用的优点。由于保有对斑马鱼Cdk9的特异抗体，可确认由MO诱导的两蛋白质的量的减少。如果手头无适宜的抗体时，可通过用基于PCR的PAT法监测多聚（A）链的长度来研究基因的表达抑制。除了该RNA水平的验证之外，如在图4F中实施，还可通进行使用合成mRNA的恢复实验来确认对MO的目标基因的表达的效果。

【参考文献】

1.Minshull,J.and Hunt,T.(1986)The use of single-strandedDNA and RNase H to promote quantitative`hybrid arrest oftranslation'of mRNA/DNA hybrids in reticulocyte lysate cell freetranslations.Nucleic Acids Res.,14,6433-651.

2.Cerritelli,S.M.and Crouch,R.J.(2009)Ribonuclease H:theenzymes in eukaryotes.FEBS J.,276,1494-1505.

3.Summerton,J.(1999)Morpholino antisense oligomers:thecase for an RNase H-independent structural type.Biochim.Biophys.Acta.,1489,141-158.

4.Eisen,J.S.and Smith,J.C.(2008)Controlling morpholinoexperiments:don’t stop making antisense.Development,135,1735-1743.

5.Bill,B.R.,Petzold,A.M.,Clark,K.J.,Schimmenti,L.A.andEkker,S.C.(2009)A primer for morpholino use in zebrafish.ZEBRAFISH,6,69-77.

6.Richter,J.D.(2007)CPEB:a life in translation.TRENDSBiochem.Sciences,32,279-285.

7.Radford,H.E.,Meijer,H.A.and de Moor,C.H.(2008)Translational control by cytoplasmic polyadenylation in Xenopusoocytes.Biochim.Biophys.Acta.,1779,217-229.

8.Filipowicz,W.,Bhattacharyya,S.N.and Sonenberg,N.(2008)Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs:are theanswers in sight?Nat.Rev.Genet.,9,102-114.

9.Westerfield,M.(1995)The Zebrafish Book:A guide to theLaboratory Use of Zebrafish(Danio rerio),3Edition.:Eugene:University of Oregon Press.

10.Salles,F.J.and Strickland,S.(1995)Rapid and sensitiveanalysis of mRNA polyadenylation states by PCR.PCR MethodsAppl.,4,317-321.

11.Harlow,E.and Lane,D.(1988)Antibodies:A laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.

12.Wada,T.,Takagi,T.,Yamaguchi,Y.,Ferdous,A.,Imai,T.,Hirose,S.,Sugimoto,S.,Yano,K.,Hartzog,G.A.,Winston,F.,Buratowski,S.and Handa,H.(1998)DSIF,a novel transcriptionelongation factor that regulates RNA polymerase II processivity,iscomposed of human Spt4and Spt5homologs.Genes Dev.,12,343-356.

13.Okano-Uchida,T.,Sekiai,T.,Lee,K.,Okumura,E.,Tachibana,K.and Kishimoto,T.(1998)In vivo regulation of cyclinA/Cdc2and cyclin B/Cdc2through meiotic and early cleavage cyclesin starfish.Dev.Biol.,197,39-53.

14.Okano-Uchida,T.,Okumura,E.,Iwashita,M.,Yoshida,H.,Tachibana,K.and Kishimoto,T.(2003)Distinct regulators for Plk1activation in starfish meiotic and early embryonic cycles.EMBO J.,22,5633-5642.

15.Kishimoto T.(1986)Microinjection and cytoplasmic transferin starfish oocytes.Methods Cell Biol.,27,379-394.

16.Tachibana,K.,Ishiura,M.,Uchida,T.,and Kishimoto,T.(1990)The starfish egg mRNA responsible for meiosis reinitiationencodes cyclin.Dev.Biol.,140,241-252

17.Kane D.A.and Kimmel C.B.(1993)The zebrafish midblastulatransition.Development,119,447-456.

18.O’Boyle,S.,Bree,R.T.,McLoughlin,S.,Grealy,M.andByrnes,L.(2007)Identification of zygotic genes expressed at themidblastula transition in zebrafish.Biochem.Biophys.Res.Comm.,358,462-468.

19.Mathavan,S.,Lee,S.G.P.,Mak,A.,Miller,L.D.,Murthy,K.R.K.,Govindarajan,K.R.,Tong,Y.,Wu,Y.L.,Lam,S.H.,Yang,H.,Ruan,Y.,Korzh,V.,Gong,Z.,Liu,E.T.and Lufkin,T.(2005)Transcriptome analysis of zebrafish embryogenesis using microarrays.PLoS Genet.,1,260-276.

20.Hara,M.,Mori,M.,Wada,T.,Tachibana,K.and Kishimoto,T.(2009)Start of the embryonic cell cycle is dually locked inunfertilized starfish eggs.Development,136,1687-1696.

21.Tachibana,K.,Machida,T.,Nomura,Y.and Kishimoto,T.(1997)MAP kinase links the fertilization signal transduction pathwayto the G1/S-phase transition in starfish eggs.EMBO J.,16,4333-4339.

22.Kim,J.H.and Richter,J.D.(2006)Opposingpolymerase-deadenylase activities regulate cytoplasmicpolyadenylation.Mol.Cell,24,173-183.

【实施例2】

【材料和方法】

·细胞培养

将HeLa细胞用10%灭活FBS、100单位/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM（Sigma-Aldrich）在37℃、5%CO₂的条件下培养。

·基因导入

使细胞悬浮于含10%灭活FBS的DMEM培养基中至达到约1x10⁶/mL，12孔板各接种1mL。当细胞处于40～50%左右的集密状态之时，添加将siRNA（最终浓度20nM）及2μL脂质体（Ingitrogen）与200μL OptiMEM（Ingitrogen）混合的物质。也根据需要添加PMA（最终浓度10nM或100nM）。24小时后，回收，进行总RNA的纯化或蛋白印迹解析。

此研究中使用的siRNA如下所示。

【siRNA】

RelA:5’-CUGAACUAAUAAAUCUGUU-3’（SEQ ID NO:27）

Bcl-xL:5’-GUUCAGUAAUAAACUGUGU-3’（SEQ ID NO:28）

Livin:5’-GAAUAGAAAUAAAGUGGGU-3’（SEQ ID NO:29）

PLK1:5’-UAUGCACAUUAAACAGAUG-3’（SEQ ID NO:30）

tPA:5’-CUGUACUUAAUAAAUUCAG-3’（SEQ ID NO:31）

n/c:通用阴性对照（株式会社日本EGT）

·细胞的总RNA的纯化

由Sepasol-RNA I超级（Nacalai Tesque）从细胞制备总RNA。

·逆转录反应-PCR（RT-PCR）

RT-PCR使用SuperScript III转录酶（200U）实施。将随机和寡（dT）引物（Invitrogen）作为逆转录反应用的引物使用。RT-PCR用的基因特异性引物（正向和反向引物）如下所示。

【PCR用引物】

RelA正向：5’-CCTGGAGCAGGCTATCAGTC-3’（SEQ ID NO:32）

RelA反向：5’-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3’（SEQ ID NO:33）

Bcl-xL正向：5’-GGTATTGGTGAGTCGGATCG-3’（SEQ ID NO:34）

Bcl-xL反向：5’-AAGAGTGAGCCCAGCAGAAC-3’（SEQ ID NO:35）

PLK1正向：5’-GGCAACCTTTTCCTGAATGA-3’（SEQ ID NO:36）

PLK1反向：5’-AATGGACCACACATCCACCT-3’（SEQ ID NO:37）

tPA正向：5’-CCCAGATCGAGACTCAAAGC-3’（SEQ ID NO:38）

tPA反向：5’-TGGGGTTCTGTGCTGTGTAA-3’（SEQ ID NO:39）

Livin正向：5’-CCTCTCTGCCTGTTCTGGAC-3’（SEQ ID NO:40）

Livin反向：5’-CTCCAGGGAAAACCCACTTT-3’（SEQ ID NO:41）

β肌动蛋白正向：5’-GATATCGCCGCGCTCGTCG-3’（SEQ ID NO:42）

β肌动蛋白反向：5’-GGGAGGAGCTGGAAGCAG-3’（SEQ ID NO:43）

【蛋白印迹解析】

回收的细胞在PBS1mL的清洗之后，溶解于125μL的RIPA缓冲液（150mM NaCl，1%NP-40,0.5%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠，50mM Tris-HCl［pH8.0］）。用5分钟的离心分离（15,000rpm）回收上清62.5μL，向其中添加62.5μL的2×Laemmli样品缓冲液。在蛋白印迹解析中，解析5μL的样品。作为第1抗体使用抗Bcl-xL抗体（Santacruz，sc-8392）、抗PLK1抗体（Santacruz，sc-17783）、抗Livin抗体（Santacruz，sc-30161）、抗RelA抗体（Santacruz，sc-372）或抗肌动蛋白抗体（Millipore，克隆C4）。另外，作为第2抗体使用HRP-缀合的抗-兔IgG（GE Healthcare，NA9340OV）或POD-缀合的小鼠IgG to兔IgG（Dako，P0260）。反应的蛋白质用SuperSignalWest Pico化学发光底物（Pierce）处理，用LAS4000IR多彩色（富士胶卷）可视化。

【结果】

设计siRNA至可覆盖RelA、Bcl-xL、Livin及PLK1的各自的mRNA3'UTR的聚A信号序列（图12）。向HeLa细胞导入siRNA，则观察到mRNA及蛋白质蓄积量特异性地减少（图8，9，10）。再者，关于由PMA添加表达诱导的tPA基因，同样地设计覆盖tPA的mRNA3'UTR的聚A信号序列的siRNA（图12）。与向HeLa细胞的PMA添加同时添加siRNA，24小时后，回收RNA。由RT-PCR法解析得知，则tPA的表达衍生在mRNA水平被抑制（图11）。

【讨论】

本实验提供可相比以往方法更简便地设计的siRNA。

将本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请作为直接参考并入本说明书。

【工业实用性】

本发明可作为选择性基因表达抑制法利用。

SEQ ID NO:1表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO-3的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO-4的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO-5的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO-6的核苷酸序列。

SEQ ID NO:7表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO-7的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9MO-8的核苷酸序列。

SEQ ID NO:9表示反义吗啉代寡核苷酸cdk9m MO的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10表示（dT）₁₂-锚定引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11表示PAT测定用引物zcdk9PAT的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12表示PAT测定用引物tbp PAT的核苷酸序列。

SEQ ID NO:13表示PAT测定用引物细胞周期蛋白B1PAT的核苷酸序列。

SEQ ID NO:14表示PAT测定用引物细胞周期蛋白B2PAT的核苷酸序列。

SEQ ID NO:15表示PCR用肌动蛋白特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16表示PCR用肌动蛋白特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:17表示PCR用biklf特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:18表示PCR用biklf特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:19表示PCR用zcdk9特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:20表示PCR用zcdk9特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:21表示PCR用tbp特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:22表示PCR用tbp特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:23表示PCR用细胞周期蛋白B1特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:24表示PCR用细胞周期蛋白B1特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:25表示PCR用细胞周期蛋白B2特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:26表示PCR用细胞周期蛋白B2特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:27表示针对RelA的siRNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO:28表示针对Bcl-xL的siRNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO:29表示针对Livin的siRNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO:30表示针对PLK1的siRNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO:31表示针对tPA的siRNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO:32表示RelA特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:33表示RelA特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:34表示Bcl-xL特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:35表示Bcl-xL特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:36表示PLK1特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:37表示PLK1特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:38表示tPA特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:39表示tPA特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:40表示Livin特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:41表示Livin特异性引物（反向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:42表示β肌动蛋白特异性引物（正向）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:43表示β肌动蛋白特异性引物（反向）的核苷酸序列。

Claims

1.抑制目标基因的翻译反应的方法，其包括切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分。

2.权利要求1所述的方法，其中使用可与目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分杂交的核糖核酸切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分。

3.权利要求2所述的方法，其中核糖核酸由与从目标mRNA的多聚（A）链结合部位开始直至上游40位核苷酸的区域的序列的全部或一部分互补的核苷酸序列组成。

4.权利要求3所述的方法，其中从目标mRNA的多聚（A）链结合部位开始直至上游40位核苷酸的区域的序列的全部或一部分含聚A信号序列的全部或一部分。

5.权利要求3或4所述的方法，其中核糖核酸是20～25聚体。

6.权利要求2～5中任一项所述的方法，其中核糖核酸由天然型的核苷酸组成。

7.权利要求6所述的方法，其中核糖核酸是双链RNA。

8.权利要求2～5中任一项所述的方法，其中核糖核酸含至少1个核苷酸类似物。

9.权利要求8所述的方法，其中核糖核酸是单链。

10.权利要求9所述的方法，其中单链核糖核酸是反义吗啉代寡核苷酸。

11.用于抑制目标基因的翻译反应的试剂盒，其含可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂。

12.权利要求11所述的试剂盒，其中可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂是核糖核酸。

13.细胞，其是导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、目标基因的翻译反应被抑制的细胞。

14.非人生物，其是导入了可切断目标mRNA的多聚（A）链和/或3’末端序列的一部分的试剂的、目标基因的翻译反应被抑制的非人生物。