TW201319248A - 切斷ｍＲＮＡ之ｐｏｌｙ（Ａ）鏈及／或３’端末端序列之一部分而抑制轉譯的技術 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種人為的基因表現抑制方法，其較先前方法(RNAi法．核酶(ribozyme)法．反義法)，設計簡便且效果之確認亦容易。係包含切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列的一部分之抑制標的基因的轉譯反應之方法。本發明亦提供：用於抑制轉譯反應之套組，其包含可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥；標的基因之轉譯反應被抑制之細胞，其導入有可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥；以及標的基因之轉譯反應被抑制之非人類生物，其導入有可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥。
Description
本發明係關於切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分，而抑制標的基因之轉譯反應之技術。
就人為限制基因表現之方法而言，有RNAi法(專利文獻1、非專利文獻1)、核酶(ribozyme)法(專利文獻2、3、非專利文獻2)及反義法(專利文獻4、5、非專利文獻3)。RNAi法及核酶法係藉由可與標的mRNA特異性結合之核酸等來誘導標的mRNA之特異性分解，而抑制基因表現之方法。反義法係藉由與標的mRNA特異性結合之核酸等與標的mRNA形成雙股，以誘導轉譯反應之阻礙或正常剪接(splicing)反應之阻礙而藉此抑制基因表現之方法。
RNAi法及核酶法，係依存於介由包含標的mRNA內之數十個鹼基的特異序列(標的序列)來誘導切斷mRNA之活性的方法。由於mRNA之長度普通為1000個鹼基以上，所以必須選擇可得到目標效果之標的序列。雖然有軟體等但並不實際，目前係將複數個位置作為標的進行預備實驗，從其中選擇有效果之標的序列。
另一方面，在反義法中，雖然標的序列被限定為轉譯開始密碼子(codon)周邊與剪接轉接頭部位，於前者，係由於無法在mRNA層級檢測出反義效果，確認效果之判定係為煩雜。又，於後者，雖然可在mRNA層級檢測出效果，但難以評價是否為喪失功能之蛋白質。
[專利文獻1]日本特開2009-291209
[專利文獻2]WO92/03456
[專利文獻3]日本專利第2708960號
[專利文獻4]WO88/04300A1
[專利文獻5]日本專利第2530906號
[非專利文獻1]Nature. 2009 Jan 22; 457(7228): 396-404. On the road to reading the RNA-interference code. Siomi H, Siomi MC.
[非專利文獻2]Chem Senses. 1998 Apr;23(2):249-55. Current status of antisense DNA methods in behavioral studies. Ogawa S, Pfaff DW.
[非專利文獻3]Trends Genet. 1996 Dec;12(12):510-5. Anti-gene therapy: the use of ribozymes to inhibit gene function. Couture LA, Stinchcomb DT.
本發明之目的為提供一種人為的基因表現抑制方法，係較先前方法(RNAi法．核酶(ribozyme)法．反義法)，設計簡便且效果之確認亦容易。
本發明人等發現藉由選擇性地削除mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分可阻礙轉譯反應，藉此可
達成抑制特異性基因表現之效果，而完成本發明。
本發明之要旨係如以下。
(1)一種抑制標的基因之轉譯反應之方法，其包切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分。
(2)如(1)記載之方法，其中使用可雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之核糖核酸，來切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分。
(3)如(2)記載之方法，其中該核糖核酸包含與從標的mRNA之poly(A)縫結合部位至上游40個核苷酸之區域之序列之全部或一部分互補的核苷酸序列。
(4)如(3)記載之方法，其中從標的mRNA之poly(A)鏈結合部位至上游40個核苷酸之區域之序列之全部或一部分，係包含聚A信號序列之全部或一部分。
(5)如(3)或(4)記載之方法，其中該核糖核酸為20~25 mer。
(6)如(2)~(5)中任一項記載之方法，其中該核糖核酸包含天然型之核苷酸。
(7)如(6)記載之方法，其中該核糖核酸為雙股RNA。
(8)如(2)~(5)中任一項記載之方法，其中該核糖核酸包含至少1個核苷酸類似物。
(9)如(8)記載之方法，其中該核糖核酸為單股。
(10)如(9)記載之方法，其中單股核糖核酸為反義啉基寡核苷酸。
(11)一種用於抑制標的基因之轉譯反應之套組，其
包含可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥。
(12)如(11)記載之套組，其中可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥為核糖核酸。
(13)一種標的基因之轉譯反應被抑制之細胞，其導入有可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥。
(14)一種標的基因之轉譯反應被抑制之非人類生物，其導入有可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥。
藉由本發明，可抑制基因之表現，且其標的序列決定係簡便。又，由於可以mRNA層級評價基因表現抑制效果，所以效果之評價變得容易。
再者，藉由本發明，可同時或選擇性地抑制從相同基因以選擇性剪接反應所製成之複數mRNA的轉譯反應。
本說明書包含本案優先權之基礎的日本專利申請案、專利申請案2011-160512之說明書及/或圖式中所記載之內容。
以下，更詳細地說明有關本發明之實施之形態。
本發明提供抑制標的基因之轉譯反應之方法，其包含切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分。
抑制轉譯反應之標的基因可為任何基因；可例示酵素基因、癌關連基因、免疫關連基因、分化關連基因、神經關連基因、DNA修復基因、疾病關連基因等，但不限於此等。又，亦可為不知功能之基因。
要切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分，可使用能夠雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的核糖核酸。
能夠雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的核糖核酸，若是包含與從標的mRNA之poly(A)鏈結合部位至上游45個核苷酸之區域的序列之全部或一部分互補的核苷酸序列即可，較佳為包含與從標的mRNA之poly(A)鏈結合部位至上游40個核苷酸之區域的序列之全部或一部分互補的核苷酸序列。
又，從標的mRNA之poly(A)鏈結合部位至上游40個核苷酸之區域的序列之全部或一部分，亦可包含聚A信號序列之全部或一部分。
能夠雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的核糖核酸，可為20~25mer。核糖核酸亦可為天然型之核苷酸(例如，雙股RNA)，也可為包含至少1個核苷酸類似物者。就天然型之核苷酸而言，可例示雙股RNA、DNA、DNA-RNA嵌合體(chimera)等。包含至少1個核苷酸類似物之核糖核酸，係可為單股、可例示反義啉基寡核苷酸、S Oligo、2’-O-甲基化RNA、2’-F-RNA、BNA(LNA)Oligo等。核糖核酸，可用基因工程的手法、化學合成法等周知方法來製作。
本發明之轉譯反應抑制方法，可在試管內(細胞、或非細胞系)或在活體內(生物)進行。
藉由本發明之轉譯反應抑制方法，可抑制細胞、人類及非人類生物中之基因表現。藉由利用本發明之轉譯反應抑制方法，例如可以藉由選擇性抑制致癌基因之表現而治療癌症、藉由特異性抑制參與免疫反應之基因之表現而緩和過敏反應、藉由特異性抑制參與細胞分化之基因之表現而控制分化、藉由特異性抑制神經興奮傳導相關基因之表現而開發精神治療藥。
又，本發明提供用於抑制標的基因之轉譯反應之套組，其包含可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥。可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥可為核糖核酸。核糖核酸，係可為能夠雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分者，關於如此等之核糖核酸已於上文敘述。本發明之套組，係可用於抑制細胞、人類及非人類生物中之基因表現。本發明之套組，亦可進一步包含轉染試藥、對照用試藥(例如，陰性對照之核糖核酸、陽性對照之核糖核酸)、用於檢測陽性對照之試藥(例如，針對以陽性對照為標的之蛋白質之抗體、可檢出該蛋白質之mRNA之表現的引子等)等之其他試藥、操作手冊等。
再者，本發明提供一種標的基因之轉譯反應被抑制之細胞，其導入有可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥。本發明之細胞，標的基因
之表現可被抑制。
可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥可為核糖核酸。核糖核酸，係可為能夠雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分者，關於如此等核糖核酸已於上文敘述。
要將能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥導入細胞，在該試藥為核糖核酸之情況，可使用磷酸鈣法、電穿孔(electroporation)法、脂質體轉染(lipofection)法、顯微注射(microinjection)法、藉由基因槍之方法、土壤桿菌(agrobacterium)法、病毒載體法等之任一種基因導入法。能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的核糖核酸，可被直接導入細胞內，也可利用周知之載體系使其在細胞內表現。
導入有能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥的細胞，只要具有標的基因者即可，不管分化．未分化，係體細胞，亦或生殖細胞皆可；亦可為經不死化者、經轉形者。可例示胚(來自人類或人類以外之生物)、癌細胞、免疫細胞、神經細胞、生殖細胞、幹細胞等。細胞，係可為來自魚類(斑馬魚等)、哺乳類(人類之外，小鼠、大鼠、倉鼠、猴、牛、山羊、豬、綿羊、犬等人類以外之哺乳類)、，鳥類(鷄等)、昆蟲類(果蠅等)、棘皮動物(海膽、海星、海參等)、線蟲、非洲爪蟾等青蛙等之動物；双子葉植物(白犬薺(Arabidosis thaliana)、菸草、棉等)、單子葉植物(稻、玉米、大麥、
小麥等)等之植物；大腸菌、枯草菌等之細菌；黴菌、酵母等之真菌等的任一種生物者。
再者，本發明提供轉譯反應被抑制之非人類生物，其係導入有能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥。本發明之非人類生物，標的基因之表現可被抑制。
能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥可為核糖核酸。核糖核酸可為能夠雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分者，關於此等核糖核酸，已敘述於上文。
要將能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥導入生物中，在該試藥為核糖核酸之情況，可使用磷酸鈣法、電穿孔(electroporation)法、脂質體轉染(lipofection)法、顯微注射(microinjection)法、藉由基因槍之方法、土壤桿菌(agrobacterium)法、病毒載體法等之任一種基因導入法。能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的核糖核酸，係可直接導入生物內，也可利用周知之載體系使其在生物內表現。
導入有能夠切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分之試藥的非人類生物，只要為具有標的基因者即可，亦可為魚類(斑馬魚等)、哺乳類(小鼠、大鼠、倉鼠、猴、牛、山羊、豬、綿羊、犬等人類以外之哺乳類)、鳥類(鷄等)、昆蟲類(果蠅等)、棘皮動物(海膽、海星、海參等)、線蟲、非洲爪蟾等青蛙等之動物；雙
子葉植物(白犬薺(Arabidosis thaliana)、菸草、棉等)、單子葉植物(稻、玉米、大麥、小麥等)等之植物；大腸菌、枯草菌等之細菌；黴菌、酵母等之真菌等的任一種生物。
以下，根據實施例詳細地說明本發明，但本發明不限於此等實施例。
以母性mRNA之poly(A)鏈連結部位上游為標的之反義啉基將poly(A)鏈除去並阻礙轉譯之證據
反義啉基寡核苷酸(MO)所造成之基因表現抑制，係使其與轉譯開始部位周邊雜交或使剪接供體部位(splice donor site)為標的而達成。在本實施例中，係介紹反義法，其係使用針對從母性mRNA之3’非轉譯區域(UTR)之poly(A)鏈結合部位至上游40個核苷酸的25mer之MO。本發明人等發現，MO係清除zcdk9 mRNA之poly(A)鏈並阻礙轉譯反應，此係顯示MO與miRNA之機能的類似點。在以PCR為基本之試驗法中，檢出斑馬魚cdk9或tbp、週期蛋白B1及週期蛋白B2之mRNA係受特異性的MO依存性poly(A)鏈伸長阻礙。因此，此處所介紹之反義法係表明MO在mRNA之控制上具有如miRNA之活性，同時顯示可應用於抑制動物之卵母細胞或初期胚中之母性mRNA之表現。
在用於抑制基因表現之典型的反義法中，單股(ss)DNA係利用通過藉由在活體內被誘導之標的mRNA之RNase H的切斷之活性，且該標的mRNA之RNase H係藉由通過互補之鹼基對形成DNA-RNA雙股而被誘導。然而，由於有效率地分解ssDNA之內切核酸酶(endonuclease)存在於活體內，所以藉由ssDNA之反義活性被減弱。為了迴避此問題點，因啉基寡核苷酸(MO)具有內切核酸酶(endonuclease)耐性，而被頻繁地使用。反義ssDNA藉由標的mRNA之分解而誘導基因表現抑制，但是並非MO仲介mRNA之RNase H依存性切斷。亦即，MO與mRNA間之雙股形成，係藉由MO雜交於mRNA之轉譯開始點近傍來阻礙轉譯，或者藉由與剪接供體部位(splice donor site)形成雙股來妨礙正確的剪接。在兩者中，反義MO，被使用作為抑制基因表現用之非常有效的手段，但是要簡單地確認對於基因表現之MO依存性的特異性阻礙之效果則有困難。
在此，記載了用於控制基因表現抑制之新穎方法。有效性及特異性，係以斑馬魚cdk9及tbp、週期蛋白B1以及週期蛋白B2之母性mRNA為標的來確認。成為此方法之關鍵的性質係：1)藉由MO與mRNA之3’UTR形成雙股，不僅阻礙poly(A)鏈伸長，而且發現削除poly(A)鏈之活性；2)該方法具有誘導mRNA之轉譯停止之活性。重點為，以3’UTR為標的之MO係如同時誘導poly(A)鏈之短小化及翻譯阻礙的miRNA而作用。。
DNA及啉基寡核苷酸係分別在Opelon及Gene Tools公司合成。
所有的斑馬魚及胚係於28℃飼育。
在野生型胚中，於1或2個細胞階段注入約2.5pmol之MO。於以下表示本研究所使用之MO。
cdk9 MO：GGAAATGTGAAGGATTTATAGGTGT(序列編號1)
cdk9 MO-2：ATTTATACTTATACAAGTAACAAAC(序列編號2)
cdk9 MO-3：ACCATGACCCCGAACACGTGATCTT(序列編號3)
cdk9 MO-4：ACAAATAAAAACATCTTTAAAAATA(序列編號4)
cdk9 MO-5：TGTGAAGGATTTATTGGTGTATTTA(序列編號5)
cdk9 MO-6：AGGATTTATTGGTGTATTTATACTT(序列編號6)
cdk9 MO-7：TTATTGGTGTATTTATACTTATACA(序列編號7)
cdk9 MO-8：GGTGTATTTATACTTATACAAGTAA(序列編號8)
cdk9m MO：GGTAATATGAACGATGTATAGGTGT(序列編號9)
探討2個MO之混合物之時，將各1.25pmol注入胚中。
10個回收之胚，係用液體氮冷凍之後、溶於200μl之RIPA緩衝液(150mM NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鹽，0.1%硫酸十二基酯鈉，50mM Tris-HCl[pH8.0])中。充分的超音波處理後，以1分鐘之離心(12,000g)回收100μl之上清液，在其中添加40μl之4×Laemmli樣本緩衝液。在西方墨點(Western blot)解析中，解析14μl之樣本(相當於1個胚之一半)。
全RNA係藉由Sepasol-RNA I super(Nacalai Tesque)從胚調製。
PAT試驗，雖加以微細的修正，基本上依照文獻10。全RNA(300ng)係於包含12-至18-mer之poly(dT)的磷酸化寡(dT)引子混合液存在下於65℃培養5分鐘。與T4 DNA連接酶(350U)(TAKARA Bio)於42℃培養1小時後，將樣本與200ng之(dT)12-錨定引子(5’-GCGAGCTCCGCGGCCGCGTTTTTTTTTTTT-3’(序列編號10))於12℃培養1小時，再與SuperScript III逆轉錄酵素(200U)(GE Healthcare)於42℃培養1小時，以得到PAT cDNA。最後，使用(dT)12-錨定引子及各個基因特異性引子進行PCR，PCR產物係藉
由2.2%之瓊脂糖凝膠電泳分離，將DNA譜帶用溴化乙錠可視化。於以下表示基因特異性引子。
zcdk9 PAT：GTGCTGCCCCAGTGCATTGT(序列編號11)
tbp PAT：TGTTGTGCAGTGCGAGAGATC(序列編號12)
週期蛋白B1 PAT：ATGTTGTGAGGGTCAACGAGG(序列編號13)
週期蛋白B2 PAT：AGCAGCAGACTCATGAAGATCA(序列編號14)
RT-PCR係使用SuperScript III轉錄酶(200U)來實施。使用隨機及寡(dT)引子(Invitrogen)作為逆轉錄反應用之引子。於以下表示RT-PCR用之基因特異性引子(正向及反向引子)。
肌動蛋白 正向：5’-CTGAATCCCAAAGCCAACAG-3’(序
列編號15)
肌動蛋白 反向：5’-TCACACCATCACCAGAGTCC-3’(序列編號16)
biklf正向：5’-ATGCTGACTCCACCATCCTC-3’(序列編號17)
biklf反向：5’-TGTCCGGTGTGTTTCCTGTA-3’(序列編號18)
zcdk9正向：5’-CAGCCAATCAGAGTTCGACA-3’(序列編號19)
zcdk9反向：5’-TAGTGCCACCGGTAAACTCC-3’(序列編號20)
tbp正向：5’-CTTGGGGTGCAAACTTGATT-3’(序列編號21)
tbp反向：5’-CATATTTCCTGGCTGCCAAT-3’(序列編號22)
週期蛋白B1正向：5’-CAGCTGCAACTTGTTGGTGT-3’(序列編號23)
週期蛋白B1反向：5’-GGTAGAGGCCTTCCAAAACC-3’(序列編號24)
週期蛋白B2正向：5’-CTCAAAGCATCTGACGGTGA-3’(序列編號25)
週期蛋白B2反向：5’-GCAGCAGTCCATCTCTCACA-3’(序列編號26)
為了製作抗zCdk9抗體，使重組zCdk9蛋白質在大腸桿菌(Escherichia coli)中表現備用，用盤式製備用電泳(disk preparative electrophoresis)進行分劃。使兔子(委託Takara Bio股份有限公司)對Cdk9蛋白質免疫，以Opelon之標準規程處理。多株抗Cdk9抗體係依照文獻11來精製。抗人類Cdk9抗體(H-169)及抗肌動蛋白抗體(clone C4)係分別自Santa Cruz及Chemicon購入。免疫墨點法(immunoblot)係依照文獻12來進行。探針係用ECL系統(GE Healthcare)來顯色。
使用些微變更小型RNA選殖套組(Takara)者。將300 ng之全RNA從胚單離後，用鹼性磷酸酶(BAP)處理後，將經生物素化之RNA/DNA 3’轉接頭(adaptor)連接於3’末端經BAP處理之RNA。以在表面附著有鏈黴抗生物素蛋白(streptoavidin)之磁性珠粒回收連接有轉接頭之RNA(adaptor-Logated RNA)。洗淨該珠粒後，於PCR-R & RT-引子存在下進行逆轉錄反應，使所合成之cDNA藉由鹼處理由珠粒遊離出來後，於zcdk9 PAT引子及PCR-R & RT-引子存在下進行PCR。之後，將PCR產物係進行瓊脂糖凝膠電泳，將DNA譜帶(band)以溴化乙錠染色可視化。將該譜帶從凝膠切出，回收DNA斷片後，選殖入pMD20-T載體(vector)中。在含有安比西林(ampicillin)之培養皿上，進行藉由青白判定之殖株(clone)分選，從各殖株回收質體(plasmid)。所插入之區域係以限制酵素處理來確認。從各個樣本抽出10殖株以上，決定DNA之鹼基序列。
．若在斑馬魚初期胚注入以zcdk9 mRNA之3’UTR末端為標的之MO，poly(A)鏈伸長會被阻礙，結果，轉譯反應被阻礙。
在解析中囊胚期轉換(Mid-blastula transition)中之斑馬魚激酶cdk9之mRNA的表現控制機構的過程中，本發明人等注意到poly(A)鏈伸長在轉譯反應之活性化上擔任重要的角色。而為了研究此，本發明人等思考出使用毒性低之核酸類似物即啉基寡核苷酸(MO)的反義實驗。本發明人等預測了mRNA之3’UTR與MO間之雙股形
成應係阻礙poly(A)鏈伸長。準備了包含與zcdk9 mRNA 3’UTR之末端序列完全互補之25個鹼基的cdk9 MO(第1圖A)。為了檢討MO對於3’UTR是否會影響poly(A)鏈伸長，實施了供給PCR產物之PAT試驗，該PCR產物係反映特定之mRNA之poly(A)鏈長。得知若在受精之胚中注入cdk9 MO，相較於未處理胚(WT)，緩慢地泳動之譜帶顯著減少c亦即此被認為係顯示藉由cdk9 MO之poly(A)鏈伸長阻礙(第1圖B)。cdk9 MO在對於tbp或週期蛋白B1之譜帶的產生不造成影響，僅使cdk9之譜帶顯著減少。重要的是，此係說對於cdk9 MO具特異性。亦即根據，在雜交之鹼基序列之中具有5鹼基錯配之cdk9m MO，對於注入該者之胚，與未處理胚係造成了無變化之結果(第1圖B)。此等之結果顯示cdk9 MO係特異性地對cdk9 mRNA造成影響。
接著，以蛋白質層級來驗證MO之基因表現抑制效果。以2種獨立的抗體(本發明人等所獨自製作之對於斑馬魚Cdk9者以及可購入之對於人類Cdk9之抗體H-169)實施西方墨點(Western blot)法。使用抗肌動蛋白抗體作為對照。cdk9 MO對受精後3小時之胚中之zCdk9蛋白質的蓄積不造成影響，但從第4小時開始使zCdk9蛋白質蓄積量之增加停止(第1圖C)。與cdk9 MO不同，cdk9m MO對於zcdk9 mRNA之轉譯反應未顯示可檢測出之顯著差異。接著，為了更鮮明地顯示此結果，再次使用第1圖C所使用之樣本進行西方墨點(Western blot)試驗。其結果係可顯示，cdk9 MO阻礙初期胚中之Cdk9蛋白質的蓄積之增加(
第1圖D)。綜上所述，此等之結果顯示，cdk9 MO之注入係在初期發生階段阻礙母性zcdk9 mRNA之轉譯反應。
由於藉由cdk9 MO之注入，在PAT試驗中cdk9產物減少，所以接著以RT-PCR法來驗證其效果。以隨機引子或寡-dT引子實施逆轉錄反應，之後，以PCR放大zcdk9之編碼區域。為了確認實驗之時間經過過程，解析了於受精後3小時可檢出，於4小時開始蓄積之mRNA的bilkf之表現(第1圖E、F)。此結果係顯示，於第10次卵裂週期開始的受精後3小時發生從體細胞基因之轉錄反應，已知此與已被報告之實驗事實一致。在使用隨機引子之RT-PCR中得知，不管是否注入cdk9 MO，從由實驗所用之全部胚抽出之mRNA得到同量之zcdk9產物(第1圖E)。因此，此結果顯示，將cdk9 MO注入胚並非使zcdk9 mRNA量減少的原因。另一方面，在使用寡-dT引子之實驗中，若以RT-PCR法解析注入有cdk9 MO之胚，zcdk9 mRNA之凝集降低係已明確(第1圖F)。由於寡-dT引子係與poly(A)鏈雜交，所以在包含少數A之短poly(A)鏈之情況，雜交的效率會降低。因此該結果可認為係擴增效率減少。所以此次所觀察到在RT-PCR試驗中之DNA斷片之放大量降低，可能是因為藉由poly(A)鏈之短小化而使短鏈之poly(A)產生(參照下文)。上述結果係顯示，若將cdk9 MO注入初期胚中可誘導mRNA之poly(A)鏈之短小化，而在另一方面不會發生mRNA分解之原因。
．zcdk9 3’UTR末端起40個核苷酸，係藉由MO之poly(A)鏈伸長阻礙的有活性之區域。
為了調查3’UTR末端對MO依存性抑制是否擔任重要的角色，準備MO-2(-26至-50)、MO-3(-51至-75)及MO-4(-76至-100)(第5圖)。藉由用PAT試驗及西方墨點(Western blot)法之解析，可知在5種MO之中只有cdk9 MO具有阻礙poly(A)鏈伸長及轉譯之活性，暗示了3’UTR之最末端部分對該阻礙係為重要。以確認此結果之目的，進一步探討4種MO。其結果確認了阻礙poly(A)鏈伸長及轉譯反應之MO-5(-6至-30)、MO-6(-11至-35)及MO-7(-16至40)。又，得知MO-8(-21至-45)具有弱活性(第2圖B、C)。此等之結果顯示，3’UTR末端的40個核苷酸係MO依存性阻礙中之活性部位。
如已記載之，MO與mRNA之3’UTR末端間之雙股阻礙適當的poly(A)鏈伸長。為了正確地決定添加MO後在poly(A)鏈部分殘留幾個殘基A，進行zcdk9 cDNA之3’末端區域之DNA的定序反應，其中該zcdk9 cDNA係以在第2圖中所得到之來自注入有MO之胚的mRNA來合成。當進行此定序反應時，採用小型RNA選殖套組(Takara)。於該套組，係將經生物素化之RNA/DNA 3’轉接頭附加於mRNA之3’端末端，其後，以鏈黴抗生物素蛋白(streptoavidin)磁性珠粒回收．精製。逆轉錄反應係在珠粒上實施，cDNA回收後，藉由使用zcdk9 PAT引子及PCR-R & RT-引子之PCR來擴大cDNA(第3圖A)。PCR產物係藉由瓊脂糖凝膠以電泳來解析，DNA譜帶係以溴化乙錠染色來可視化(第3圖B)。
此等PCR產物，在TA-選殖用載體pMD20-T(Takara)中被選殖後，該部分之DNA鹼基序列被決定。如在第3圖C中之，來自注入有MO-2之胚的zcdk9之cDNA，與來自未處理胚者同樣地具有完整的poly(A)鏈。另一方面，從來自注入有MO、MO-5、MO-6、MO-7、或MO-8之胚之cDNA的解析得知，在此等中poly(A)鏈完全地消失。由此可知將MO注入初期胚中，係誘導從MO所標定之mRNA中除去poly(A)鏈。再者，本發明人等注意到各個cDNA之3’端末端序列不同。而且得知隨著MO與mRNA形成雜交株之部分向上游移動，殘留之3’端末端序列亦向上游移動。亦即，從MO、依MO-5、MO-6、MO-7、然後MO-8之順序，3’端末端具有位於上游之傾向。此正暗示著，MO與mRNA間之雜交株之位置，係參與各mRNA之3’末端序列之決定。此可能是藉由poly(A)鏈短小化酵素與外切核酸酶(exonuclease)之共同作業者，或是藉由識別該雜交株之內切核酸酶(endonuclease)者(參照討論及第7圖)。
為了評價對於poly(A)鏈伸長之MO效果，準備除了cdk9 MO之外，加上週期蛋白B1 MO及週期蛋白B2 MO之3種基因特異性MO(第4圖)。為了簡單地決定MO之特異性，從受精後5小時之胚抽出全RNA，實施了使用此等之PAT試驗(第4圖B、C)。亦探討關於週期蛋白B1 MO及週期蛋白B2 MO(第4圖A、B)。此處應當提出的是，相當於斑馬魚週期蛋白B之同源基因(ortholog)的B1及B2，係分
別具有包含相當類似之鹼基序列的3’UTR(第4圖A)。實際上在週期蛋白B1 MO與週期蛋白B2 MO之間存在10個相同的鹼基(第4圖A)。實驗結果，週期蛋白B1 MO及週期蛋白B2 MO係各自特異性地僅對本身之mRNA顯示效果(第4圖B)。在使用cdk9 MO及tbp MO之情況，亦得到同樣地其分別具有特異性作用的效果之結果(第4圖C)。對於mRNA之poly(A)鏈伸長之MO效果，進一步在第6圖A及B中以來自受精後2小時至5小時之胚的mRNA被確認。此等結果係顯示，以3’UTR為標的之反義MO法在斑馬魚之發生初期胚中特異性地作用於poly(A)鏈伸長阻礙。
報告關於在斑馬魚初期胚中母性mRNA之表現阻礙。此係由poly(A)鏈伸長阻礙及轉譯阻礙所引起。關於poly(A)鏈伸長阻礙，在mRNA之poly(A)鏈連結部位上游所形成之MO與mRNA間的雙股構造係被認為對MO依存性poly(A)鏈伸長阻礙為必需者(第2圖及第5圖)。特別應該提到的是，若MO雜交於zcdk9 mRNA之3’UTR的末端起上游26個鹼基至50個鹼基之部分，則未觀察到對於poly(A)鏈之影響(第2及3圖)。此係暗示，3’UTR區域之末端部分25個鹼基為重要的順式作用因子(cis-element)。在zcdk9、週期蛋白B1及週期蛋白B2之mRNA之3’端末端的25個鹼基部分以及tbp之mRNA之3’端末端的30個鹼基部分存在典型的聚A信號(AAUAAA)，CPSF結合在該處，該CPSF係參與細胞質中所發生之poly(A)化的RNA-蛋白質複合體之一。在非洲爪蟾卵母細胞中，該RNA-蛋白
質複合體，係細胞質poly(A)鏈短小化酵素(PARN)及細胞質poly(A)鏈伸長酵素(Gld-2)含有CPSF或細胞質poly(A)鏈控制相關因子之CPEB、Pumilio以及Musashi。因此，認為MO雜交於poly(A)鏈連結部位阻礙CPSF結合於聚A信號或阻礙該RNA-蛋白質複合體之機能，應係恰當。此或許係暗示對Gld-2與PARN間之平衡造成變化，結果會發生poly(A)鏈之短小化的可能性。
本發明人等係發現，MO與mRNA之雜交將mRNA之3’端末端序列部分及poly(A)鏈除去。亦即，為了要使mRNA在雜交株之位置起向mRNA之3’側行進數個鹼基處被切斷，poly(A)鏈被去除(第3圖)。此被認為係在最初poly(A)鏈短小化酵素作用，接著外切核酸酶(exonuclease)作用之故(第7圖A)。或者可能是，雜交株之形成誘發某種內切核酸酶(endonuclease)活性，而其將mRNA上之雜交株位置起的下游部分切斷(第7圖B)。本發明人等對於哪一假說適用於本次之情況並無定案，但如果是後者之情形，則有需要提倡新的模型，該模型係顯示識別MO與mRNA之雜交株並與其結合之內切核酸酶(endonuclease)的參與。
關於miRNA及MO之作用存在3項類似點。亦即，mRNA之3’UTR為標的、poly(A)鏈短小化發生、更發生轉譯阻礙。因此，miRNA相關因子是否參與MO仲介之poly(A)鏈短小化係被認為是很有趣的課題。
在本實施例中介紹使用MO之新穎方法。該方法之優點，係相較於先前方法，由於以mRNA之3’UTR末端為標的，有所謂設計較為簡單之優點以及可有效率地確認MO
之作用之優點。由於保有對斑馬魚Cdk9之特異抗體，所以可確認藉由MO所誘導之兩蛋白質之量的減少。如果在手邊沒有適當的抗體之情形，可藉由以PCR為基本之PAT法來觀測poly(A)鏈之長度，而調查基因之表現阻礙。除了該RNA層級之驗證，加上藉由進行如在第4圖F中所實施之使用合成mRNA之回復實驗，亦可確認MO之對於標的基因之表現的效果。
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HeLa細胞係於含10%不活化FBS、100單位/mL青黴素(penicillin)、100mg/mL鏈黴素(streptomycin)之DMEM(Sigma-Aldrich)中，在37℃、5%CO2之條件下培養。
使細胞懸浮於含10%不活化FBS之DMEM培養基中，成為如約1x106/mL，而在12孔培養皿各散布1mL。在細胞為約40~50%之密集狀態時，添加在200μL OptiMEM(Ingitrogen)中混合了siRNA(最終濃度20nM)及2μL
Lipofectamine(Ingitrogen)者。視需要，亦添加PMA(最終濃度10nM或100nM)。於24小時後回收，進行全RNA之精製或西方墨點解析。
於以下表示該研究中所使用之siRNA。
RelA：5’-CUGAACUAAUAAAUCUGUU-3’(序列編號27)
Bcl-xL：5’-GUUCAGUAAUAAACUGUGU-3’(序列編號28)
凋亡抑制蛋白：5’-GAAUAGAAAUAAAGUGGGU-3’(序列編號29)
PLK1：5’-UAUGCACAUUAAACAGAUG-3’(序列編號30)
tPA：5’-CUGUACUUAAUAAAUUCAG-3’(序列編號31)
n/c：Universal negative control(Nippon EGT股份有限公司)
全RNA係藉由Sepasol-RNA I super(Nacalai Tesque)從細胞調製。
RT-PCR係使用SuperScript III轉錄酶(200U)來實施。使用隨機及寡(dT)引子(Invitrogen)作為逆轉錄反應用之引子。於以下表示RT-PCR用之基因特異性引子(正向及反向引子)。
RelA正向：5’-CCTGGAGCAGGCTATCAGTC-3’(序列編號32)
RelA反向：5’-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3’(序列編號33)
Bcl-xL正向：5’-GGTATTGGTGAGTCGGATCG-3’(序列編號34)
Bcl-xL反向：5’-AAGAGTGAGCCCAGCAGAAC-3’(序列編號35)
PLK1正向：5’-GGCAACCTTTTCCTGAATGA-3’(序列編號36)
PLK1反向：5’-AATGGACCACACATCCACCT-3’(序列編號37)
tPA正向：5’-CCCAGATCGAGACTCAAAGC-3’(序列編號38)
tPA反向：5’-TGGGGTTCTGTGCTGTGTAA-3’(序列編號39)
凋亡抑制蛋白正向：5’-CCTCTCTGCCTGTTCTGGAC-3’(序列編號40)
凋亡抑制蛋白反向：5’-CTCCAGGGAAAACCCACTTT-3’(序列編號41)
β肌動蛋白正向：5’-GATATCGCCGCGCTCGTCG-3’(序列編號42)
β肌動蛋白反向：5’-GGGAGGAGCTGGAAGCAG-3’(序列編號43)
回收之細胞係以1ml之PBS洗淨後，溶於125μL之RIPA緩衝液(150mM NaCl、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鹽
、0.1%硫酸十二基酯鈉、50mM Tris-HCl[pH8.0])中。以5分鐘之離心(15,000rpm)回收62.5μL之上清液，在其中添加62.5μL之2×Laemmli樣本緩衝液。在西方墨點(Western blot)解析中，解析5μL之樣本。使用抗Bcl-xL抗體(Santacruz,sc-8392)、抗PLK1抗體(Santacruz,sc-17783)、抗凋亡抑制蛋白抗體(Santacruz,sc-30161)、抗RelA抗體(Santacruz,sc-372)或抗肌動蛋白抗體(Millipore,clone C4)作為1次抗體。又，使用結合有HRP之抗-兔IgG抗體(HRP-conjugated anti-rabbit IgG)(GE Healthcare,NA9340OV)或結合有POD之抗-兔IgG之小鼠IgG(POD-conjugated mouse IgG to Rabbit IgG)(Dako,P0260)作為2次抗體。反應之蛋白質係以SuperSignal West Pico化學發光受質(Chemiluminescent Substrate)(Pierce)處理，以LAS4000 IR multi color(Fuji Film)可視化。
如包覆RelA、Bcl-xL、凋亡抑制蛋白及PLK1之各mRNA 3’UTR之聚A信號序列而設計siRNA(第12圖)。若在HeLa細胞中導入siRNA，可觀察到mRNA及蛋白質蓄積量特異性地減少(第8、9、10圖)。再者，關於藉由添加PMA而被誘導表現之tPA基因，同樣地如包覆tPA之mRNA 3’UTR之聚A信號序列而設計siRNA(第12圖)。在對HeLa細胞添加PMA之同時添加siRNA，於24小時後回收RNA。若藉由RT-PCR法解析，tPA之表現誘導係以mRNA層級被阻礙(第11圖)。
本實驗提供可比先前方法更簡便地設計之siRNA。
在本說明書中所引用之全部刊物、專利及專利申請案係以原樣引進本說明書中作為參考。
本發明可利用作為選擇性基因表現抑制法。
序列編號1表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO之核苷酸序列。
序列編號2表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO-2之核苷酸序列。
序列編號3表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO-3之核苷酸序列。
序列編號4表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO-4之核苷酸序列。
序列編號5表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO-5之核苷酸序列。
序列編號6表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO-6之核苷酸序列。
序列編號7表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO-7之核苷酸序列。
序列編號8表示反義啉基寡核苷酸cdk9 MO-8之核苷酸序列。
序列編號9表示反義啉基寡核苷酸cdk9m MO之核苷酸序列。
序列編號10表示(dT)12-錨定引子之核苷酸序列。
序列編號11表示PAT試驗用引子zcdk9 PAT之核苷酸序列。
序列編號12表示PAT試驗用引子tbp PAT之核苷酸序列。
序列編號13表示PAT試驗用引子週期蛋白B1 PAT之核苷酸序列。
序列編號14表示PAT試驗用引子週期蛋白B2 PAT之核苷酸序列。
序列編號15表示PCR用肌動蛋白特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號16表示PCR用肌動蛋白特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號17表示PCR用biklf特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號18表示PCR用biklf特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號19表示PCR用zcdk9特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號20表示PCR用zcdk9特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號21表示PCR用tbp特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號22表示PCR用tbp特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號23表示PCR用週期蛋白B1特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號24表示PCR用週期蛋白B1特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號25表示PCR用週期蛋白B2特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號26表示PCR用週期蛋白B2特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號27表示針對RelA之siRNA之核苷酸序列。
序列編號28表示針對Bcl-xL之siRNA之核苷酸序列。
序列編號29表示針對凋亡抑制蛋白之siRNA之核苷酸序列。
序列編號30表示針對PLK1之siRNA之核苷酸序列。
序列編號31表示針對tPA之siRNA之核苷酸序列。
序列編號32表示RelA特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號33表示RelA特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號34表示Bcl-xL特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號35表示Bcl-xL特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號36表示PLK1特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號37表示PLK1特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號38表示tPA特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號39表示tPA特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號40表示凋亡抑制蛋白特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號41表示凋亡抑制蛋白特異性引子(反向)之核苷酸序列。
序列編號42表示β肌動蛋白特異性引子(正向)之核苷酸序列。
序列編號43表示β肌動蛋白特異性引子(反向)之核苷酸序列。
[第1圖]雖然cdk9MO(啉基寡核苷酸)之注入，係使初期胚胎中之zcdk9 mRNA的poly(A)鏈伸長及轉譯受到阻礙，但是cdk9m MO之注入，係不發生此等。(A)MO所雜交之zcdk9 mRNA 3’UTR內之標的序列。(B)在注入有cdk9 MO的胚中之zcdk9 mRNA的poly(A)鏈伸長阻礙。胚係於所記載之各個時間回收。全RNA係從未處理胚(WT)、cdk9 MO注入胚及cdk9m MO注入胚中抽出。PAT試驗係用cdk9、tbp、週期蛋白B1、及週期蛋白B2之PAT用引子來進行。PCR產物係用2.2%之瓊脂糖凝膠電泳來解析。右側，以鹼基長度表示之長度之標記。(C)cdk9 MO所造成之zcdk9 mRNA的特異性轉譯阻礙。cdk9 MO係不發生。胚係於所記載之各個時間回收。西方墨點分析(Western blot)係在未處理胚(第1、4、7、10行)、cdk9 MO注入胚(第2、5、8、11行)及cdk9m MO注入胚(第3、6、9、12行)中，以圖中所示之抗體來實施。HeLa細胞之核抽出液(NE)(第13行)為陽性對照(positive control)。(D)注入有cdk9 MO及cdk9m MO之胚係於受精後3小時、4小時及5小時回收。此等之胚抽出液(在(C)中所用者)係以西方墨點(Western blot)法來解析。(E及F)使用隨機引子(E)及寡
o-dT引子(F)之逆轉錄，以及其後實施之使用cdk9、biklf、tbp及肌動蛋白(actin)之各個之引子的PCR。產物係用2.2%瓊脂糖凝膠來解析。胚於所記載之各個時間回收。全RNA係從未處理胚(WT，第1至3行)、cdk9 MO注入胚(cdk9 MO，第4至6行)及cdk9m MO注入胚(cdk9m MO，第7至9行)中抽出。
[第2圖]自zcdk9 3’UTR之末端的40個核苷酸在zcdk9 mRNA之表現抑制中係重要。(A)zcdk9 mRNA 3’UTR之末端序列與反義MO雜交之位置。本發明人等將poly(A)鏈所連結之鹼基定義為-1，而編號。全RNA係從未處理胚(WT)、cdk9 MO注入胚及cdk9m MO注入胚中抽出。(B)藉由cdk9 MO、MO-5、MO-6及MO-7之注入充分抑制zcdk9 mRNA之表現。注入有MO之胚(第2至8行)或未處理胚(第1行)，於受精後3小時回收並抽出全RNA，然後以cdk9及tbp之PAT引子實施PAT試驗。(C)由注入有各個記載之MO之受精後5小時起的胚的抽出液(第2至8行)及未處理胚抽出液(第1行)係以7.5%SDS-聚丙烯醯胺凝膠解析。墨點解析係使用抗zCdk9抗體、抗人類Cdk9抗體(H-169)及抗肌動蛋白抗體。使用HeLa細胞核抽出液(NE)作為陽性對照(positive control)(第9行)。
[第3圖]mRNA 3’UTR末端序列之決定。(A)圖解本研究中所採用之決定mRNA 3’UTR末端序列之方法。(B)PCR產物係以溴化乙錠染色而可視化。(C)來自各個MO注入胚之cDNA之DNA定序結果。選擇5殖株並記載其3’端末端序列。垂直線表示mRNA之poly(A)鏈連結部位。
其連結部位之資訊係從NCBI核苷酸資料庫(NM_212591.1.)取得。
[第4圖]MO所引起之poly(A)鏈伸長阻礙之特異性。(A)週期蛋白(cyclin)B1及週期蛋白B2 MO之序列。(B)全RNA係由注入有各個記載之MO之受精後5小時的胚(第2至4行)及未處理胚(第1行)中抽出。使用cdk9、週期蛋白B及週期蛋白B2之PAT引子實施PAT試驗。亦進行藉由肌動蛋白引子對之PAT試驗(肌動蛋白)。PCR產物係以2.2%瓊脂糖凝膠來解析。右側，以鹼基長度表示之長度的標記。(C)全RNA係由注入有各個記載之MO之受精後5小時的胚(第1至5行)及未處理胚(行6)中抽出。使用cdk9、tbp及週期蛋白B1之PAT引子實施PAT試驗。PCR產物係以2.2%瓊脂糖凝膠來解析。右側，以鹼基長度表示之長度之標記。
[第5圖]以zcdk9 3’UTR為標的之zcdk9 mRNA之表現抑制的探討。(A)zcdk9 mRNA之3’UTR末端序列與反義MO雜交結合之部分。本發明人等將poly(A)鏈所連結之鹼基定義為-1，並編號如圖所示。(B)只有cdk9 MO影響zcdk9 mRNA之poly(A)鏈伸長。注入有各個MO之胚(第1至5行)或未處理胚(第6行)係於受精後3小時回收。全RNA係從各個胚單離。藉由cdk9及tbp之PAT引子實施PAT試驗，以2.2%瓊脂糖凝膠解析PCR產物。右側，以鹼基長度表示之長度之標記。(C)只有cdk9 MO阻礙了zcdk9之mRNA的轉譯。胚係於受精後5小時回收。西方墨點(Western blot)解析係以各個之胚抽出液來實施。HeLa細
胞核抽出液(NE)係作為陽性對照(第7行)使用。使用抗zCdk9抗體及抗肌動蛋白抗體。
[第6圖]MO之對於poly(A)鏈短小化的特異性效果。(A)圖中所示之各個mRNA 3’UTR的序列資訊以及反義MO所雜交之位置。(B)以PAT試驗所檢出之MO所仲介的poly(A)鏈伸長阻礙。胚係於圖中所示之時間回收。全RNA係未處理胚(WT、第21至24行)、cdk9 MO注入胚(第1至4行)、cdk9m MO注入胚(第5至8行)、tbp MO注入胚(第9至12行)、週期蛋白B1 MO注入胚(第13至16行)、及週期蛋白B2 MO注入胚(第17至20行)。PAT試驗係使用cdk9、tbp、週期蛋白B1及週期蛋白B2之PAT引子進行。oligo dT係表示在逆轉錄反應中使用寡dT引子。tbp隨機及肌動蛋白隨機，係分別表示在逆轉錄反應使用隨機引子，在其後之PCR反應使用tbp或肌動蛋白之PCR用引子對。PCR產物係以2.2%瓊脂糖凝膠來解析。
[第7圖]於MO雜交後決定mRNA之3’UTR末端序列之假想模型。(A)藉由對於mRNA之3’UTR之對MO的雜交而poly(A)鏈短小化係被活化。可能是藉由poly(A)鏈短小化酵素去除poly(A)鏈後，外切核酸酶(exonuclease)將3’UTR之末端序列削除。在此模型中，MO-mRNA間之雜交株阻礙外切核酸酶進一步的侵入。(B)可識別MO與mRNA間之雜交株的內切核酸酶(endonuclease)係在由雜交株部分之下游處切斷mRNA。
[第8圖]在HeLa細胞中，藉由以mRNA之3’UTR為標的之siRNA，誘導標的基因mRNA之poly(A)鏈的切斷。使
用寡-dT引子之逆轉錄反應，以及其後所實施之使用各個RelA、Bcl-xL、凋亡抑制蛋白(Livin)、PLK1及肌動蛋白之引子的PCR。產物係以2.0%瓊脂糖凝膠來解析。全RNA係由siRNA導入起24小時後之細胞抽出。n/c係導入有陰，性對照siRNA者。
[第9圖]在HeLa細胞中，藉由以mRNA之3’UTR為標的之siRNA，誘導標的基因mRNA之分解。使用隨機引子之逆轉錄反應，以及其後所實施之使用各個RelA、Bcl-xL、凋亡抑制蛋白、PLK1及肌動蛋白之引子的PCR。產物係以2.0%瓊脂糖凝膠來解析。全RNA係由導入siRNA起24小時後之細胞抽出。n/c係導入有陰性對照siRNA者。
[第10圖]在HeLa細胞中，藉由以mRNA之3’UTR為標的之siRNA，特異性地誘導標的基因之轉譯阻礙。將各siRNA導入起24小時後之細胞的抽出液以圖中所示之抗體藉由西方墨點(Western blot)法來解析。n/c係導入有陰性對照siRNA者。
[第11圖]在HeLa細胞中，藉由以tPA mRNA之3’UTR為標的之siRNA，誘導tPA mRNA之poly(A)鏈之切斷及mRNA本身之分解。使用寡-dT引子(上段)或隨機引子(下段)之逆轉錄反應，以及其後所實施之使用各個tPA及肌動蛋白之引子的PCR。產物係以2.0%瓊脂糖凝膠來解析。細胞係以所記載之各濃度的PMA處理24小時。全RNA係由siRNA導入起24小時後之細胞抽出。n/c係導入陰性對照siRNA者。
[第12圖]各個RelA、Bcl-xL、凋亡抑制蛋白、PLK1
及tPA之mRNA 3’UTR的末端序列資訊及實驗中所使用之siRNA之標的序列(下線部分)。
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<220>
<223> tPA-特異性引子(正向)
<400> 38
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> tPA-特異性引子(反向)
<400> 39
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> Livin-特異性引子(正向)
<400> 40
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> Livin-特異性引子(反向)
<400> 41
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> β肌動蛋白-特異性引子(正向)
<400> 42
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> β肌動蛋白-特異性引子(反向)
<400> 43
Claims (14)
- 一種抑制標的基因之轉譯反應之方法，其包含切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其使用可雜交於標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的核糖核酸，來切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分。
- 如申請專利範圍第2項之方法，其中該核糖核酸包含與從標的mRNA之poly(A)鏈結合部位至上游40個核苷酸之區域的序列之全部或一部分互補的核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第3項之方法，其中從標的mRNA之poly(A)鏈結合部位至上游40個核苷酸之區域的序列之全部或一部分，係包含聚A信號序列之全部或一部分。
- 如申請專利範圍第3或4項之方法，其中該核糖核酸為20~25mer。
- 如申請專利範圍第2至5項中任一項之方法，其中該核糖核酸包含天然型之核苷酸。
- 如申請專利範圍第6項之方法，其中該核糖核酸為雙股RNA。
- 如申請專利範圍第2至5項中任一項之方法，其中該核糖核酸包含至少1個核苷酸類似物。
- 如申請專利範圍第8項之方法，其中該核糖核酸為單股。
- 如申請專利範圍第9項之方法，其中該單股核糖核酸為反義啉基寡核苷酸。
- 一種用於抑制標的基因之轉譯反應之套組，其包含可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥。
- 如申請專利範圍第11項之套組，其中該可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥為核糖核酸。
- 一種標的基因之轉譯反應被抑制之細胞，其導入有可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥。
- 一種標的基因之轉譯反應被抑制之非人類生物，其導入有可切斷標的mRNA之poly(A)鏈及/或3’端末端序列之一部分的試藥。
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