KR20140060290A

KR20140060290A - ｍＲＮＡ 의 ｐｏｌｙ（Ａ） 사슬 및/또는 3'' 말단 배열의 일부를 절단하여 번역 반응을 억제하는 기술

Info

Publication number: KR20140060290A
Application number: KR1020147003977A
Authority: KR
Inventors: 다다시 와다; 게이 다케다; 히로시 한다
Original assignee: 고리츠다이가쿠호진 요코하마시리츠다이가쿠; 가부시키가이샤 요신도; 고쿠리츠다이가쿠호진 토쿄고교 다이가꾸
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2014-05-19
Also published as: WO2013015152A1; CA2842580A1; TW201319248A; US20140189895A1; EP2735613A1; JP5953617B2; JPWO2013015152A1; CN103717735A

Abstract

종래법 (RNAi 법·리보자임법·안티센스법) 보다 설계가 간편하며 또한 효과의 확인도 용이한 인위적 유전자 발현 억제 방법을 제공한다.
표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 번역 반응을 억제하는 방법. 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약을 함유하는, 번역 반응을 억제하기 위한 키트 ; 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어, 표적 유전자의 번역 반응이 억제된 세포 ; 및 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어, 표적 유전자의 번역 반응이 억제된 비인간 생물도 제공된다.

Description

ｍＲＮＡ 의 ｐｏｌｙ（Ａ） 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하여 번역 반응을 억제하는 기술 {TECHNIQUE FOR CLEAVING OUT PART OF poly(A) CHAIN AND/OR 3'-TERMINAL SEQUENCE OF mRNA TO INHIBIT TRANSLATION REACTION}

본 발명은 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하여 표적 유전자의 번역 반응을 억제하는 기술에 관한 것이다.

유전자 발현을 인위적으로 제한하는 방법으로는, RNAi 법 (특허문헌 1, 비특허문헌 1), 리보자임법 (특허문헌 2, 3, 비특허문헌 2) 및 안티센스법 (특허문헌 4, 5, 비특허문헌 3) 이 있다. RNAi 법이나 리보자임법은 표적 mRNA 와 특이적으로 결합하는 핵산 등에 의해 표적 mRNA 의 특이적 분해를 유도함으로써 유전자 발현을 억제하는 방법이다. 안티센스법은, 표적 mRNA 와 특이적으로 결합하는 핵산 등에 의해 표적 mRNA 와 이중 사슬을 형성시킴으로써, 번역 반응 저해나 정상적인 스플라이싱 반응의 저해를 유도함으로써 유전자 발현을 억제하는 방법이다.

RNAi 법이나 리보자임법은 표적 mRNA 내의 수십 염기로 이루어지는 특이 배열 (표적 배열) 을 통하여 mRNA 의 절단을 유도하는 활성에 의존한 방법이다. mRNA 의 길이는 보통 1000 염기 이상이므로, 목적으로 하는 효과가 얻어지는 표적 배열을 선택해야 한다. 소프트웨어 등이 있지만 실질적이 아니라, 현 상황에서는, 복수 지점을 표적으로 하여 예비 실험하고, 그 중에서 효과가 있는 표적 배열을 선택하고 있다.

한편, 안티센스법에서는, 표적 배열은 번역 개시 코돈 주변과 스플라이싱 정션 부위로 한정되어 있지만, 전자에서는 안티센스 효과를 mRNA 레벨에서 검출할 수 없기 때문에 효과의 판정을 확인하는 것이 번잡하다. 또, 후자에서는 mRNA 레벨에서 효과를 검출할 수 있지만, 기능을 상실한 단백질인지 여부의 평가는 어렵다.

일본 공개특허 2009-291209 WO92/03456 일본 특허 제2708960호 WO88/04300A1 일본 특허 제2530906호

Nature. 2009 Jan 22 ; 457 (7228) : 396-404. On the road to reading the RNA-interference code, Siomi H, Siomi MC. Chem Senses. 1998 Apr ; 23 (2) : 249-55. Current status of antisense DNA methods in behavioral studies. Ogawa S, Pfaff DW. Trends Genet. 1996 Dec ; 12 (12) : 510-5. Anti-gene therapy : the use of ribozymes to inhibit gene function. Couture LA, Stinchcomb DT.

본 발명은 종래법 (RNAi 법·리보자임법·안티센스법) 보다 설계가 간편하며 또한 효과의 확인도 용이한 인위적 유전자 발현 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 선택적으로 삭제함으로써 번역 반응을 저해할 수 있고, 이로써 특이적인 유전자 발현 억제 효과를 달성할 수 있는 것을 알아내어 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

본 발명의 요지는 이하와 같다.

(1) 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하는 것을 포함하는 표적 유전자의 번역 반응을 억제하는 방법.

(2) 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부에 하이브리다이즈할 수 있는 리보 핵산을 사용하여, 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하는 (1) 에 기재된 방법.

(3) 리보 핵산이 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 40 뉴클레오티드까지의 영역의 배열의 전부 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 (2) 에 기재된 방법.

(4) 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 40 뉴클레오티드까지의 영역의 배열의 전부 또는 일부가 폴리 A 시그널 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 (3) 에 기재된 방법.

(5) 리보 핵산이 20 ∼ 25 mer 인 (3) 또는 (4) 에 기재된 방법.

(6) 리보 핵산이 천연형의 뉴클레오티드로 이루어지는 (2) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(7) 리보 핵산이 2 개 사슬 RNA 인 (6) 에 기재된 방법.

(8) 리보 핵산이 적어도 1 개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 (2) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(9) 리보 핵산이 1 개 사슬인 (8) 에 기재된 방법.

(10) 1 개 사슬 리보 핵산이 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드인 (9) 에 기재된 방법.

(11) 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약을 함유하는 표적 유전자의 번역 반응을 억제하기 위한 키트.

(12) 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 리보 핵산인 (11) 에 기재된 키트.

(13) 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어 표적 유전자의 번역 반응이 억제된 세포.

(14) 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어 표적 유전자의 번역 반응이 억제된 비인간 생물.

본 발명에 의해 표적 배열 결정이 간편한 유전자 발현 억제가 가능해졌다. 또, 유전자 발현 억제 효과의 평가를 mRNA 레벨에서 실시할 수 있기 때문에, 효과의 평가가 용이해졌다.

또한, 본 발명에 의해, 동일 유전자로부터 선택적 스플라이싱 반응에 의해 작성되는 복수의 mRNA 의 번역 반응을 동시 또는 선택적으로 억제하는 것이 가능해졌다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 특원 2011-160512호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

[도 1] cdk9 MO (모르폴리노 올리고뉴클레오티드) 의 주입에서는 초기 배 (胚) 에 있어서의 zcdk9 mRNA 의 poly(A) 사슬 신장과 번역은 저해되지만, cdk9m MO 의 주입에서는 그들은 발생하지 않는다. (A) MO 가 하이브리다이즈하는 zcdk9 mRNA 3'UTR 내의 표적 배열. (B) cdk9 MO 를 주입한 배에 있어서의 zcdk9 mRNA 의 poly(A) 사슬의 신장 저해. 배는 표기되어 있는 각각의 시간에 회수하였다. 전체 RNA 는 미처리 배 (WT), cdk9 MO 주입 배 및 cdk9m MO 주입 배로부터 추출하였다. PAT 어세이는 cdk9, tbp, cyclin B1, 및 cyclin B2 의 PAT 용 primer 를 사용하여 실시하였다. PCR 산물은 2.2 ％ 의 아가로오스 겔 전기 영동으로 해석하였다. 우측, 염기 길이로 나타낸 길이의 마커. (C) cdk9 MO 에 의한 zcdk9 mRNA 의 특이적 번역 저해. cdk9 MO 에서는 발생하지 않는다. 배는 표기되어 있는 각각의 시간에 회수하였다. 웨스턴 블롯은 미처리 배 (레인 1, 4, 7, 10), cdk9 MO 주입 배 (레인 2, 5, 8, 11) 및 cdk9m MO 주입 배 (레인 3, 6, 9, 12) 에 있어서 도면 중에 나타낸 항체로 실시하였다. HeLa 세포의 핵 추출액 (NE) (레인 13) 은 포지티브 컨트롤이다. (D) cdk9 MO 및 cdk9m MO 가 주입된 배는 수정 후 3 시간, 4 시간 및 5 시간에 회수되었다. 그들 배 추출액 ((C) 에서 사용한 것) 은 웨스턴 블롯법으로 해석되었다. (E 와 F) random primer (E) 와 oligo-dT primer (F) 를 사용한 역전사와, 그 후 실시한 cdk9, biklf, tbp, 및 actin 의 각각의 primer 를 사용한 PCR. 산물은 2.2 ％ 아가로오스 겔로 해석되었다. 배는 표기되어 있는 각각의 시간에 회수하였다. 전체 RNA 는 미처리 배 (WT, 레인 1 내지 3), cdk9 MO 주입 배 (cdk9 MO, 레인 4 내지 6) 및 cdk9m MO 주입 배 (cdk9m MO, 레인 7 내지 9) 로부터 추출하였다.
[도 2] zcdk9 3'UTR 의 말단으로부터 40 뉴클레오티드는 zcdk9 mRNA 의 발현 억제에 있어서 중요하다. (A) zcdk9 mRNA 3'UTR 의 말단 배열과 안티센스 MO 가 하이브리다이즈하는 위치. 본 발명자들은 poly(A) 사슬이 연결되어 있는 염 기를 -1 로 정의하고 번호를 달았다. 전체 RNA 는 미처리 배 (WT), cdk9 MO 주입 배 및 cdk9m MO 주입 배로부터 추출하였다. (B) cdk9 MO, MO-5, MO-6 및 MO-7 의 주입에 의한 zcdk9 mRNA 의 충분한 발현 억제. MO 가 주입된 배 (레인 2 내지 8) 혹은 미처리 배 (레인 1) 는 수정 후 3 시간에 회수되고 전체 RNA 가 추출되었다. 그리고, cdk9 와 tbp 의 PAT primer 로 PAT 어세이를 실시하였다. (C) 각각의 표기된 MO 가 주입된 수정 후 5 시간부터의 배로부터의 추출액 (레인 2 내지 8) 및 미처리 배 추출액 (레인 1) 은 7.5 ％ SDS-폴리아크릴아미드 겔로 해석되었다. 블롯에서는 항 zCdk9 항체, 항인간 Cdk9 항체 (H-169) 및 항 actin 항체를 사용하였다. HeLa 세포핵 추출액 (NE) 은 포지티브 컨트롤로서 사용하였다 (레인 9).
[도 3] mRNA 3'UTR 말단 배열의 결정. (A) 본 연구에서 채용한 mRNA 3'UTR 말단 배열을 결정하는 방법을 도해하였다. (B) PCR 산물은 에티듐브로마이드 염색으로 가시화하였다. (C) 각각의 MO 주입 배에서 유래하는 cDNA 의 DNA 시퀀스 결과. 5 클론을 선택하여 그 3' 말단 배열을 기재하였다. 수선은 mRNA 의 poly(A) 사슬 연결 부위를 나타내고 있다. 그 연결 부위의 정보는 NCBI nucleotide database (NM_212591.1.) 로부터 취득하였다.
[도 4] MO 에 의한 poly(A) 사슬 신장 저해의 특이성. (A) cyclin B1 과 cyclin B2 MO 의 배열. (B) 전체 RNA 는 각각의 표기된 MO 가 주입된 수정 후 5 시간의 배 (레인 2 내지 4) 및 미처리 배 (레인 1) 로부터 추출하였다. PAT 어세이를 cdk9, cyclin B 및 cyclin B2 의 PAT primer 를 사용하여 실시하였다. actin primer set 에 의한 PAT 어세이도 실시하였다 (actin). PCR 산물은 2.2 ％ 아가로오스 겔로 해석하였다. 우측, 염기 길이로 나타낸 길이의 마커. (C) 전체 RNA 는 각각의 표기된 MO 가 주입된 수정 후 5 시간의 배 (레인 1 내지 5) 및 미처리 배 (레인 6) 로부터 추출하였다. PAT 어세이를 cdk9, tbp 및 cyclin B1 의 PAT primer 를 사용하여 실시하였다. PCR 산물은 2.2 ％ 아가로오스 겔로 해석하였다. 우측, 염기 길이로 나타낸 길이의 마커.
[도 5] zcdk9 3'UTR 을 표적으로 하는 zcdk9 mRNA 의 발현 억제의 검토. (A) zcdk9 mRNA 의 3'UTR 말단 배열과 안티센스 MO 가 하이브리드 결합하는 부분. 본 발명자들은 poly(A) 사슬이 연결되어 있는 염기를 -1 로 정의하고, 도면에 나타낸 바와 같이 숫자를 달았다. (B) cdk9 MO 만이 zcdk9 mRNA 의 poly(A) 사슬 신장에 영향을 주었다. 각각의 MO 가 주입된 배 (레인 1 내지 5) 혹은 미처리 배 (레인 6) 는 수정 후 3 시간에 회수되었다. 전체 RNA 가 각각의 배로부터 단리되었다. cdk9 와 tbp 의 PAT primer 에 의해 PAT 어세이를 실시하고, PCR 산물을 2.2 ％ 아가로오스 겔로 해석하였다. 우측, 염기 길이로 나타낸 길이의 마커. (C) cdk9 MO 만 zcdk9 의 mRNA 의 번역을 저해하였다. 배는 수정 후 5 시간에 회수되었다. 웨스턴 블롯 해석이 각각의 배 추출액에서 실시되었다. HeLa 세포핵 추출액 (NE) 은 포지티브 컨트롤로서 취급되었다 (레인 7). 항 zCdk9 항체와 항 actin 항체를 사용하였다.
[도 6] MO 의 poly(A) 사슬 단소화 (短小化) 에 대한 특이적 효과. (A) 도면 중에 나타낸 각각의 mRNA 3'UTR 의 배열 정보와 안티센스 MO 가 하이브리다이즈하는 위치. (B) PAT 어세이에서 검출한 MO 가 중개하는 poly(A) 사슬 신장 저해. 배는 도면 중에 나타낸 시간에 회수하였다. 전체 RNA 는 미처리 배 (WT, 레인 21 내지 24), cdk9 MO 주입 배 (레인 1 내지 4), cdk9m MO 주입 배 (레인 5 내지 8), tbp MO 주입 배 (레인 9 내지 12), cyclin B1 MO 주입 배 (레인 13 내지 16), 및 cyclin B2 MO 주입 배 (레인 17 내지 20). PAT 어세이는 cdk9, tbp, cyclin B1 과 cyclin B2 의 PAT primer 를 사용하여 실시하였다. oligo dT 는 역전사 반응에서 oligo dT primer 를 사용한 것을 나타내고 있다. tbp random 과 actin random 은 각각, 역전사 반응에서 random primer 를 사용하고, 그 후의 PCR 반응에서 tbp 혹은 actin 의 PCR 용 primer 세트를 사용한 것을 나타내고 있다. PCR 산물은 2.2 ％ 아가로오스 겔로 해석되었다.
[도 7] MO 의 하이브리다이제이션 후에 mRNA 의 3'UTR 말단 배열이 결정되는 가상 모델. (A) mRNA 의 3'UTR 에 대한 MO 로의 하이브리다이제이션에 의해 poly(A) 사슬 단소화는 활성화된다. poly(A) 사슬 단소화 효소에 의해 poly(A) 사슬이 제거된 후, 엑소뉴클레아제가 3'UTR 의 말단 배열을 삭제하는 것일지도 모른다. 이 모델에서는, MO-mRNA 간의 하이브리드는 추가적인 엑소뉴클레아제의 침입을 저해한다. (B) MO 와 mRNA 간의 하이브리드를 인식하는 엔도뉴클레아제가 하이브리드 부분부터 하류 지점에서 mRNA 를 절단한다.
[도 8] HeLa 세포에 있어서, mRNA 의 3'UTR 을 표적으로 한 siRNA 에 의해, 표적 유전자 mRNA 의 poly(A) 사슬의 절단이 유도된다. oligo-dT primer 를 사용한 역전사 반응과, 그 후 실시한 RelA, Bcl-xL, Livin, PLK1 및 Actin 의 각각의 primer 를 사용한 PCR. 산물은 2.0 ％ 아가로오스 겔로 해석되었다. 전체 RNA 는 siRNA 도입으로부터 24 시간 후의 세포로부터 추출하였다. n/c 는 네거티브 컨트롤 siRNA 를 도입한 것이다.
[도 9] HeLa 세포에 있어서, mRNA 의 3'UTR 을 표적으로 한 siRNA 에 의해, 표적 유전자 mRNA 의 분해가 유도된다. random primer 를 사용한 역전사 반응과, 그 후 실시한 RelA, Bcl-xL, Livin, PLK1 및 Actin 의 각각의 primer 를 사용한 PCR. 산물은 2.0 ％ 아가로오스 겔로 해석되었다. 전체 RNA 는 siRNA 도입으로부터 24 시간 후의 세포로부터 추출하였다. n/c 는 네거티브 컨트롤 siRNA 를 도입한 것이다.
[도 10] HeLa 세포에 있어서, mRNA 의 3'UTR 을 표적으로 한 siRNA 에 의해, 표적 유전자의 번역 저해가 특이적으로 유도된다. 각 siRNA 도입으로부터 24 시간 후의 세포의 추출액을 도면 중에 나타낸 항체로 웨스턴 블롯법에 의해 해석하였다. n/c 는 네거티브 컨트롤 siRNA 를 도입한 것이다.
[도 11] HeLa 세포에 있어서, tPA mRNA 의 3'UTR 을 표적으로 한 siRNA 에 의해, tPA mRNA 의 poly(A) 사슬의 절단 및 mRNA 자신의 분해가 유도된다. oligo-dT primer (상단) 또는 random primer (하단) 를 사용한 역전사 반응과, 그 후 실시한 tPA 및 Actin 의 각각의 primer 를 사용한 PCR. 산물은 2.0 ％ 아가로오스 겔로 해석되었다. 세포는 표기되어 있는 각각의 농도의 PMA 로 24 시간 처리하였다. 전체 RNA 는 siRNA 도입으로부터 24 시간 후의 세포로부터 추출하였다. n/c 는 네거티브 컨트롤 siRNA 를 도입한 것이다.
[도 12] RelA, Bcl-xL, Livin, PLK1 및 tPA 각각의 mRNA 3'UTR 의 말단 배열 정보와 실험에서 사용한 siRNA 의 표적 배열 (하선 부분).

이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하는 것을 포함하는 표적 유전자의 번역 반응을 억제하는 방법을 제공한다.

번역 반응을 억제하는 표적 유전자는 어떠한 유전자이어도 되고, 효소 유전자, 암 관련 유전자, 면역 관련 유전자, 분화 관련 유전자, 신경 관련 유전자, DNA 수복 유전자, 질환 관련 유전자 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 경우는 없다. 또, 기능이 알려지지 않은 유전자이어도 된다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하려면, 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부에 하이브리다이즈할 수 있는 리보 핵산을 사용하면 된다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부에 하이브리다이즈할 수 있는 리보 핵산은 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 45 뉴클레오티드까지의 영역의 배열의 전부 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지면 되고, 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 40 뉴클레오티드까지의 영역의 배열의 전부 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.

또, 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 40 뉴클레오티드까지의 영역의 배열의 전부 또는 일부는 폴리 A 시그널 배열의 전부 또는 일부를 포함해도 된다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부에 하이브리다이즈할 수 있는 리보 핵산은 20 ∼ 25 mer 이면 된다. 리보 핵산이 천연형의 뉴클레오티드 (예를 들어, 2 개 사슬 RNA) 이어도 되고, 적어도 1 개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 것이어도 된다. 천연형의 뉴클레오티드로는, 2 개 사슬 RNA, DNA, DNA-RNA 키메라 등을 예시할 수 있다. 적어도 1 개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 리보 핵산은 1 개 사슬이면 되고, 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, S 올리고, 2'-O-methyl 화 RNA, 2'-F-RNA, BNA (LNA) 올리고 등을 예시할 수 있다. 리보 핵산은 유전자 공학적인 수법, 화학 합성법 등의 공지된 방법으로 제작할 수 있다.

본 발명의 번역 반응 억제 방법은 in vitro (세포, 혹은 비세포계) 또는 in vivo (생물) 에 있어서 실시할 수 있다.

본 발명의 번역 반응 억제 방법에 의해, 세포, 인간 및 비인간 생물에 있어서의 유전자 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 번역 반응 억제 방법을 이용함으로써, 예를 들어, 암 원인 유전자의 선택적 발현 억제에 의한 암 치료, 면역 반응에 관여하는 유전자의 특이적 발현 억제에 의한 알레르기 반응의 완화, 세포 분화에 관여하는 유전자의 특이적 발현 억제에 의한 분화 제어, 신경 흥분 전달에 관한 유전자의 특이적 발현 억제에 의한 향정신약의 개발이 가능해진다.

또, 본 발명은 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약을 함유하는, 표적 유전자의 번역 반응을 억제하기 위한 키트를 제공한다. 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약은 리보 핵산이면 된다. 리보 핵산은 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부에 하이브리다이즈할 수 있는 것이면 되고, 이와 같은 리보 핵산에 대해서는 상기에서 서술하였다. 본 발명의 키트는 세포, 인간 및 비인간 생물에 있어서의 유전자 발현 억제에 사용할 수 있다. 본 발명의 키트는 추가로 트랜스펙션 시약, 컨트롤용 시약 (예를 들어, 네거티브 컨트롤의 리보 핵산, 포지티브 컨트롤의 리보 핵산), 포지티브 컨트롤을 검출하기 위한 시약 (예를 들어, 포지티브 컨트롤이 표적으로 하는 단백질에 대한 항체, 그 단백질의 mRNA 발현을 검출할 수 있는 프라이머 등) 등의 다른 시약, 매뉴얼 등을 포함해도 된다.

또한 본 발명은, 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어, 표적 유전자의 번역 반응이 억제된 세포를 제공한다. 본 발명의 세포에서는 표적 유전자의 발현이 억제될 수 있다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약은 리보 핵산이면 된다. 리보 핵산은 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부에 하이브리다이즈할 수 있는 것이면 되고, 이와 같은 리보 핵산에 대해서는 상기에서 서술하였다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약을 세포에 도입하려면, 이 시약이 리보 핵산인 경우, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 유전자총에 의한 방법, 아그로박테리움법, 바이러스 벡터법 등의 어떠한 유전자 도입법을 사용해도 된다. 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 리보 핵산은 직접 세포 내에 도입해도 되고, 공지된 벡터계를 이용하여 세포 내에 발현시켜도 된다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되는 세포는 표적 유전자를 갖는 것이면 되고, 분화·미분화를 불문하고, 체세포이어도 되고, 생식 세포이어도 되며, 불사화된 것, 형질 전환된 것이어도 된다. 배 (인간 또는 인간 이외의 생물 유래), 암 세포, 면역 세포, 신경 세포, 생식 세포, 간 세포 등을 예시할 수 있다. 세포는 어류 (제브라피시 등), 포유류 (인간 외, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 소, 염소, 돼지, 양, 개 등 인간 이외의 포유류), 조류 (닭 등), 곤충류 (초파리 등), 극피 동물 (성게, 불가사리, 해삼 등), 선충, 아프리카발톱개구리 등의 개구리 등의 동물 ; 쌍자엽 식물 (애기장대, 담배, 목화 등), 단자엽 식물 (벼, 옥수수, 대맥, 밀 등) 등의 식물 ; 대장균, 고초균 등의 세균 ; 곰팡이, 효모 등의 진균 등의 어느 생물에서 유래하는 것이어도 된다.

그리고 또, 본 발명은 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어, 번역 반응이 억제된 비인간 생물을 제공한다. 본 발명의 비인간 생물에서는 표적 유전자의 발현이 억제될 수 있다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약을 생물에 도입하려면, 이 시약이 리보 핵산인 경우, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 유전자총에 의한 방법, 아그로박테리움법, 바이러스 벡터법 등의 어떠한 유전자 도입법을 사용해도 된다. 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 리보 핵산은 직접 생물 내에 도입해도 되고, 공지된 벡터계를 이용하여 생물 내에 발현시켜도 된다.

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되는 비인간 생물은 표적 유전자를 갖는 것이면 되고, 어류 (제브라피시 등), 포유류 (마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 소, 염소, 돼지, 양, 개 등 인간 이외의 포유류), 조류 (닭 등), 곤충류 (초파리 등), 극피 동물 (성게, 불가사리, 해삼 등), 선충, 아프리카발톱개구리 등의 개구리 등의 동물 ; 쌍자엽 식물 (애기장대, 담배, 목화 등), 단자엽 식물 (벼, 옥수수, 대맥, 밀 등) 등의 식물 ; 대장균, 고초균 등의 세균 ; 곰팡이, 효모 등의 진균 등의 어느 생물이어도 된다.

실시예

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

모성 mRNA 의 poly(A) 사슬 연결 부위 상류를 표적으로 한 안티센스 모르폴리노가 poly(A) 사슬을 제거하고 번역을 저해하는 증거

개략

안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (MO) 에 의한 유전자 발현 억제는 번역 개시 부위 주변과 하이브리다이제이션시키거나 스플라이스 도너 부위를 표적으로 하여 달성된다. 본 실시예에서는, 모성 mRNA 의 3' 비번역 영역 (UTR) 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 40 뉴클레오티드에 대한 25 mer 의 MO 를 사용하는 안티센스법을 소개한다. 본 발명자들은 MO 가 zcdk9 mRNA 의 poly(A) 사슬을 제거하고 번역 반응을 저해하는 것을 알아내었고, 이는 miRNA 와 MO 의 기능적 유사점을 나타내는 것이다. PCR 을 기본으로 한 어세이법으로, 제브라피시 cdk9 나 tbp, cyclin B1 과 cyclin B2 의 mRNA 가 특이적인 MO 의존적 poly(A) 사슬 신장 저해를 받는 것을 검출하였다. 따라서 여기서 소개한 안티센스법은, MO 가 mRNA 의 제어에 있어서 miRNA 양 (樣) 의 활성을 갖고 있음을 분명히 함과 함께, 동물의 난모 (卵母) 세포나 초기 배에 있어서의 모성 mRNA 의 발현 억제에 응용할 수 있는 것을 나타내고 있다.

서문

유전자 발현을 억제하기 위한 고전적인 안티센스법에서는, 1 개 사슬 (ss) DNA 가 상보적인 염기쌍을 개재한 DNA-RNA 의 2 중 사슬 형성에 의해 생체 내에서 유도되는 표적 mRNA 의 RNase H 에 의한 절단을 통한 활성을 이용한다. 그러나, ssDNA 를 효율적으로 분해하는 엔도뉴클레아제가 생체 내에 존재하는 점에서, ssDNA 에 의한 안티센스 활성은 감약되어 버린다. 이 문제점을 회피하기 위해서 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (MO) 는 엔도뉴클레아제 내성을 갖고 있으므로 빈번하게 사용되고 있다. 안티센스 ssDNA 가 표적 mRNA 의 분해에 의해 유전자 발현 억제를 유도하지만, MO 는 mRNA 의 RNase H 의존적 절단을 중개하는 것은 아니다. 즉, MO 와 mRNA 간의 2 중 사슬 형성은 mRNA 의 번역 개시점 근방에 대한 MO 의 하이브리다이제이션에 의해 번역을 저해하는 경우나, 스플라이스 도너 부위와 2 중 사슬을 형성함으로써 정확한 스플라이싱을 방해한다. 양자에 있어서, 안티센스 MO 는 유전자 발현 억제를 위한 매우 유효한 수단으로서 사용되지만, 유전자 발현에 대한 MO 의존적인 특이적 저해 효과를 간단하게 확인하는 것은 곤란하다.

여기에는 유전자 발현 억제 제어를 위한 신규 방법을 기재하였다. 유효성과 특이성은 제브라피시 cdk9 나 tbp, cyclin B1 과 cyclin B2 의 모성 mRNA 를 표적으로 하여 확인되었다. 이 방법의 열쇠가 되는 성질은 1) mRNA 의 3'UTR 과 MO 가 2 중 사슬을 형성함으로써 poly(A) 사슬 신장을 저해할 뿐만 아니라 poly(A) 사슬을 삭제하는 활성을 알아낸 것, 2) 이 방법은 mRNA 의 번역 정지를 유도하는 활성을 갖는 것이다. 중요한 포인트는 3'UTR 을 표적으로 한 MO 가 poly(A) 사슬 단소화와 번역 저해를 동시에 유도하는 miRNA 와 같이 행동하는 것일 것이다.

재료와 방법

·합성

DNA 와 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 오페론과 Gene Tools 사에서 각각 합성되었다.

·배

모든 제브라피시와 배는 28 ℃ 에서 사육되었다.

·MO 의 미량 주입

야생형 배에는 1 또는 2 세포 스테이지에서 약 2.5 pmol 의 MO 가 주입되었다. 이 연구에서 사용한 MO 를 이하에 나타낸다.

안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드

2 개의 MO 의 혼합물을 검토할 때에는, 각각의 1.25 pmol 을 배에 주입하였다.

·배 추출액의 조제

10 개의 회수한 배는, 액체 질소로 동결시킨 후, 200 ㎕ 의 RIPA buffer (150 mM NaCl, 1 ％ NP-40, 0.5 ％ deoxycholate, 0.1 ％ sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) 에 녹였다. 충분한 초음파 처리 후, 상청 100 ㎕ 는 1 분간의 원심 분리 (12,000 g) 에 의해 회수되었고, 그곳에 40 ㎕ 의 4×Laemmli 샘플 버퍼를 첨가하였다. 웨스턴 블롯 해석에 있어서는, 14 ㎕ 의 샘플 (1 개의 배의 절반에 상당) 을 해석하였다.

·배 유래의 전체 RNA 의 정제

전체 RNA 는 Sepasol-RNA I super (Nacalai Tesque) 에 의해 배로부터 조제되었다.

Poly(A) 테스트 어세이 (PAT)

PAT 어세이는 미세한 수정을 더하였지만 기본적으로는 문헌 10 에 따랐다. 전체 RNA (300 ng) 는 65 ℃ 에서 5 분간, 12- 내지 18-mer 의 poly (dT) 로 이루어지는 인산화 oligo (dT) 프라이머 혼합액 존재하에서 인큐베이션하였다. T4 DNA ligase (350 U) (TAKARA Bio) 와 1 시간 42 ℃ 에서 인큐베이션한 후, 샘플은 200 ng 의 (dT)₁₂-anchor primer (5'-GCGAGCTCCGCGGCCGCGTTTTTTTTTTTT-3' (배열 번호 10)) 로 12 ℃, 1 시간 인큐베이션하고, 추가로 1 시간 42 ℃ 에서 SuperScript III 역전사 효소 (200 U) (GE Healthcare) 와 인큐베이션함으로써 PAT cDNA 를 얻었다. 마지막으로, (dT)₁₂-anchor primer 와 각각의 유전자 특이적인 primer 로 PCR 을 실시하고, PCR 산물은 2.2 ％ 의 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, DNA 밴드를 에티듐브로마이드로 가시화하였다. 유전자 특이적 primer 를 이하에 나타낸다.

PAT 어세이용 primer

·역전사 반응-PCR (RT-PCR)

RT-PCR 은 SuperScript III transcriptase (200 U) 를 사용하여 실시하였다. Random 과 oligo (dT) primers (Invitrogen) 를 역전사 반응용의 primer 로서 사용하였다. RT-PCR 용의 유전자 특이적 primer (forward 와 reverse primers) 를 이하에 나타낸다.

PCR 용 primer

·웨스턴 블롯 해석

항 zCdk9 항체 제작을 위해 재조합 zCdk9 단백질을 Escherichia coli 에서 발현시켜 준비하고, disk preparative electrophoresis 로 분획하였다. 토끼 (타카라 바이오 주식회사에 위탁) 에게 Cdk9 단백질을 면역시키고, 오페론의 표준 프로토콜로 처리하였다. 폴리클로날 항 Cdk9 항체는 문헌 11 에 따라 정제하였다. 항인간 Cdk9 항체 (H-169) 와 항 actin 항체 (clone C4) 는 각각 Santa Cruz 와 Chemicon 으로부터 구입하였다. 이뮤노블롯은 문헌 12 에 따라 실시하였다. 블롯은 ECL system (GE Healthcare) 으로 발색시켰다.

·mRNA 의 3' 말단 배열의 결정

small RNA Cloning Kit (Takara) 를 경미한 변경하에 사용하였다. 300 ng 의 전체 RNA 를 배로부터 단리한 후, alkaline phosphatase (BAP) 로 처리 후, 비오틴화한 RNA/DNA 3' adaptor 를 3' 말단이 BAP 처리된 RNA 에 라이게이션하였다. 스트렙토아비딘이 표면에 부착되어 있는 자성 비즈로 adaptor-ligated RNA 를 회수하였다. 그 비즈를 세정 후, PCR-R & RT-primer 존재하에서 역전사 반응을 실시하고, 합성된 cDNA 는 알칼리 처리에 의해 비즈로부터 유리된 후에 zcdk9 PAT primer 와 PCR-R & RT-primer 의 존재하에서 PCR 을 실시하였다. 그리고, PCR 산물은 아가로오스 겔 전기 영동에 적용시키고, DNA 밴드를 에티듐브로마이드 염색으로 가시화하였다. 그 밴드는 겔로부터 잘라내어져 DNA 단편이 회수된 후에 pMD20-T 벡터로 클로닝되었다. 암피실린 함유의 플레이트 상에서 청백 판정에 의한 클론의 선별을 실시하고, 플라스미드는 각각의 클론으로부터 회수되었다. 삽입된 영역은 제한 효소 처리에 의해 확인되었다. 각각의 샘플로부터 10 클론 이상을 추출하여, DNA 의 염기 배열을 결정하였다.

결과

·zcdk9 mRNA 의 3'UTR 말단을 표적으로 한 MO 를 제브라피시 초기 배에 주입하면 poly(A) 사슬 신장이 저해되고, 그 결과 번역 반응이 저해되었다.

중기 포배 천이에 있어서의 제브라피시 키나아제 cdk9 의 mRNA 의 발현 제어 메커니즘을 해석하고 있는 도중에, 본 발명자들은 번역 반응의 활성화에 있어서 poly(A) 사슬 신장이 중요한 역할을 담당하고 있음을 깨달았다. 그래서 이것을 연구하기 위해, 본 발명자들은 독성이 낮은 핵산 유연체인 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (MO) 를 사용한 안티센스 실험을 고안하였다. 본 발명자들은, mRNA 의 3'UTR 과 MO 간의 2 중 사슬 형성이 poly(A) 사슬 신장을 저해시킬 것이라고 예상하였다. zcdk9 mRNA 3'UTR 의 말단 배열과 완전하게 상보적인 25 염기로 이루어지는 cdk9 MO 를 준비하였다 (도 1A). 3'UTR 에 대한 MO 가 poly(A) 사슬 신장에 영향이 있는지 검토하기 위해, 특정 mRNA 의 poly(A) 사슬 길이를 반영한 PCR 산물을 부여하는 PAT 어세이를 실시하였다. 수정한 배에 cdk9 MO 를 주입하면, 미처리 배 (WT) 와 비교하여 천천히 영동하는 밴드가 현저하게 저하됨을 알 수 있었다. 즉, 이것은 cdk9 MO 에 의한 poly(A) 사슬 신장 저해를 나타내고 있는 것으로 생각된다 (도 1B). cdk9 MO 는 tbp 나 cyclin B1 에 대한 밴드의 산생에는 영향을 주지 않고, cdk9 의 밴드만을 강하게 감소시켰다. 중요한 것은 이것은 cdk9 MO 에 특이적이라는 것이다. 즉, 하이브리다이즈하는 염기 배열 중에서 5 염기의 미스매치를 갖는 cdk9m MO 에서는, 그것을 주입한 배는 미처리 배와 변화없는 결과를 부여하는 것에서 유래한다 (도 1B). 이들 결과는 cdk9 MO 가 특이적으로 cdk9 mRNA 에 영향을 준다는 것을 나타내고 있다.

다음으로, MO 의 유전자 발현 억제 효과를 단백질 레벨에서 검증하였다. 2 종류의 독립된 항체 (본 발명자들이 독자적으로 제작한 제브라피시 Cdk9 에 대한 것과 인간 Cdk9 에 대한 구입 가능한 항체 H-169) 로 웨스턴 블롯법을 실시하였다. 항 actin 항체는 컨트롤로서 사용되었다. cdk9 MO 는 수정 후 3 시간의 배에 있어서의 zCdk9 단백질의 축적에는 영향을 주지 않았지만, 4 시간째부터 시작되는 zCdk9 단백질 축적량의 증가를 정지시켰다 (도 1C). cdk9 MO 와는 달리, cdk9m MO 는 zcdk9 mRNA 의 번역 반응에 검출 가능한 우위한 차를 나타내지 않았다. 그래서 이 결과를 보다 선명히 나타내기 위해, 도 1C 에서 사용한 샘플을 다시 사용하여 웨스턴 블롯 어세이를 실시하였다. 그 결과, cdk9 MO 는 초기 배에 있어서의 Cdk9 단백질 축적 증가를 저해하는 것을 나타낼 수 있었다 (도 1D). 이상을 정리하면, 이들 결과는 cdk9 MO 의 주입은 모성 zcdk9 mRNA 의 번역 반응을 초기의 발생 단계에서 저해시키는 것을 나타내고 있다.

cdk9 MO 의 주입에 의해 cdk9 산물이 PAT 어세이에 있어서 감소하고 있었으므로, 다음으로 RT-PCR 법으로 이 효과를 검증하였다. 역전사 반응은 random primer 혹은 oligo-dT primer 로 실시하고, 그 후, zcdk9 의 코딩 영역을 PCR 로 증폭시켰다. 실험의 시간 경과 과정을 확인하는 목적에서, 수정 후 3 시간에 검출 가능해지고 4 시간에 집적이 시작되는 mRNA 의 bilkf 의 발현을 해석하였다(도 1E, 1F). 이 결과는 10 회째의 난할 주기가 시작되는 수정 후 3 시간에 체세포 유전자로부터의 전사 반응이 발생하고 있음을 나타내고 있고, 이는 이미 보고되어 있는 실험 사실과 일치함을 알 수 있었다. random primer 를 사용한 RT-PCR 에서는, cdk9 MO 의 주입 유무에 관계없이 실험에서 사용한 모든 배로부터 추출한 mRNA 로부터 동량의 zcdk9 산물이 얻어짐을 알 수 있었다 (도 1E). 따라서, 이 결과는 cdk9 MO 의 배에 대한 주입이 zcdk9 mRNA 량을 감소시키는 것은 아님을 나타내고 있다. 한편, oligo-dT primer 를 사용한 실험에서는, cdk9 MO 를 주입한 배를 RT-PCR 법으로 해석하자 zcdk9 mRNA 의 응집이 저하되어 있음이 분명해졌다 (도 1F). oligo-dT primer 는 poly(A) 사슬과 하이브리다이즈하므로, 소수의 A 로 이루어지는 짧은 poly(A) 사슬의 경우에는 하이브리다이제이션의 효율이 저하되어 버린다. 따라서 그 결과 증폭 효율이 감소하는 것으로 생각된다. 그러므로, 이번에 관찰된 RT-PCR 어세이에 있어서의 DNA 단편의 증폭량 저하는 poly(A) 사슬의 단소화에 의해 단사슬의 poly(A) 가 산생되었기 때문일지도 모른다 (이하 참조). 이상, 상기의 결과는, cdk9 MO 를 초기 배에 주입하면 mRNA 의 poly(A) 사슬의 단소화가 유도되고, 한편 mRNA 분해가 발생하는 것은 아님을 나타내고 있다.

·zcdk9 3'UTR 말단으로부터 40 뉴클레오티드는 MO 에 의한 poly(A) 사슬 신장 저해에 있어서 활성이 있는 영역이다.

3'UTR 말단이 MO 의존적 억제에 중요한 역할을 하고 있는지 조사하기 위해, MO-2 (-26 to -50), MO-3 (-51 to -75) 과 MO-4 (-76 to -100) 를 준비하였다 (도 5). PAT 어세이와 웨스턴 블롯법에 의한 해석에 의해, 5 종류의 MO 중에서 cdk9 MO 만 poly(A) 사슬 신장과 번역 저해의 활성을 갖고 있음을 알 수 있었고, 3'UTR 의 최말단 부분이 그 저해에는 중요하다는 것이 시사되었다. 이 결과를 확인하는 목적에서 추가로 4 종류의 MO 를 검토하였다. 그 결과, poly(A) 사슬 신장과 번역 반응을 저해하는 MO-5 (-6 to -30), MO-6 (-11 to -35) 과 MO-7 (-16 to -40) 을 확인하였다. 또, MO-8 (-21 to -45) 은 약한 활성을 가짐을 알 수 있었다 (도 2B, 2C). 이들 결과는 3'UTR 말단의 40 뉴클레오티드가 MO 의존적 저해에 있어서 활성 부위인 것을 나타내고 있다.

·안티센스 MO 가 zcdk9 mRNA 로부터 poly(A) 사슬을 완전하게 제거하는 증거

이미 기재한 바와 같이, MO 와 mRNA 의 3'UTR 말단 간의 2 중 사슬은 적절한 poly(A) 사슬 신장을 저해한다. MO 첨가 후 poly(A) 사슬 부분에 몇 잔기의 A 가 남아 있는지 정확하게 결정하기 위해, 도 2 에서 얻어지고 있는 MO 가 주입된 배 유래의 mRNA 로부터 합성된 zcdk9 cDNA 의 3' 말단 영역의 DNA 의 시퀀스 반응을 실시하였다. 이것을 실시함에 있어서, small RNA Cloning Kit (Takara) 를 채용하였다. 그 키트에서는, 비오틴화된 RNA/DNA 3' adaptor 가 mRNA 의 3' 말단에 부가되고, 그 후, 스트렙토아비딘 자기 비즈에 의해 회수·정제된다. 역전사 반응은 비즈 상에서 실시되고, cDNA 회수 후, zcdk9 PAT primer 와 PCR-R & RT-primer 에 의한 PCR 에 의해 cDNA 가 증폭되었다 (도 3A). PCR 산물은 아가로오스 겔에 의한 전기 영동으로 해석되었고, DNA 밴드는 에티듐브로마이드 염색으로 가시화되었다 (도 3B).

이들 PCR 산물은, TA-클로닝용 벡터의 pMD20-T (Takara) 로 클론화된 후, 그 부분의 DNA 염기 배열이 결정되었다. 도 3C 에 있는 바와 같이, MO-2 가 주입된 배 유래의 zcdk9 의 cDNA 는 미처리 배 유래의 것과 마찬가지로 완전한 poly(A) 사슬을 갖고 있었다. 한편, MO, MO-5, MO-6, MO-7 과 MO-8 이 주입된 배 유래의 cDNA 의 해석으로부터, 그들에서는 poly(A) 사슬이 완전하게 소실되어 있음을 알 수 있었다. 이것으로부터, 초기 배에 대한 MO 주입은 MO 가 표적으로 하는 mRNA 로부터 poly(A) 사슬 제거를 유도함을 알 수 있다. 또한, 본 발명자들은 각각의 cDNA 의 3' 말단 배열이 상이함을 깨달았다. 그리고, MO 와 mRNA 가 하이브리드를 형성하는 부분이 상류로 이동함에 따라 남아 있는 3' 말단 배열도 상류로 이동하는 것을 알 수 있었다. 즉, MO 부터 MO-5, MO-6, MO-7, 그리고 MO-8 의 순으로 3' 말단이 상류에 위치하는 경향을 갖고 있다. 그것은 MO 와 mRNA 간의 하이브리드 위치가 각각의 mRNA 의 3' 말단 배열의 결정에 기여하고 있음을 시사하고 있다. 이것은, poly(A) 사슬 단소화 효소와 엑소뉴클레아제의 공동 작업에 의한 것이거나, 혹은 그 하이브리드를 인식하는 엔도뉴클레아제에 의한 것일지도 모른다 (디스커션 및 도 7 참조).

·4 종류의 모성 mRNA 에 있어서의 MO 효과의 해석

poly(A) 사슬 신장에 대한 MO 효과를 평가하기 위해, cdk9 MO 에 더하여 cyclin B1 MO 와 cyclin B2 MO 의 3 종류의 유전자 특이적 MO 를 준비하였다 (도 4). MO 의 특이성을 간단하게 결정하기 위해, 수정 후 5 시간의 배로부터 전체 RNA 를 추출하고, 이들을 사용한 PAT 어세이를 실시하였다 (도 4B, 4C). cyclin B1 MO 와 cyclin B2 MO 에 관해서도 검토하였다 (도 4A, 4B). 여기서 언급해야 할 것은 제브라피시 cyclin B 의 오솔로그에 상당하는 B1 과 B2 는 각각 매우 유사한 염기 배열로 이루어지는 3'UTR 을 갖고 있다는 것이다 (도 4A). 실제로 cyclin B1 MO 와 cyclin B2 MO 간에는 10 개의 상동인 염기가 존재하고 있다 (도 4A). 실험 결과는 cyclin B1 MO 와 cyclin B2 MO 는 각각 특이적으로 자신의 mRNA 에 있어서만 효과를 나타냈다는 것이다 (도 4B). cdk9 MO 와 tbp MO 를 사용한 경우에 있어서도 마찬가지로 각각이 특이적으로 작용하는 효과를 갖는 결과가 얻어졌다 (도 4C). mRNA 의 poly(A) 사슬 신장에 대한 MO 효과는 추가로 도 6A 나 6B 에 있어서 수정 후 2 시간 내지 5 시간의 배에서 유래하는 mRNA 에서 확인되었다. 이들 결과는 3'UTR 을 표적으로 한 안티센스 MO 법이 제브라피시 발생 초기 배에 있어서 특이적으로 poly(A) 사슬 신장 저해에 작용하는 것을 나타내는 것이다.

디스커션

제브라피시 초기 배에 관하여 모성 mRNA 의 발현 저해에 관해 보고한다. 이것은 poly(A) 사슬 신장 저해와 번역 저해에 의해 일어난다. poly(A) 사슬 신장 저해에 관해서는, mRNA 의 poly(A) 사슬 연결 부위 상류에 있어서 형성되는 MO 와 mRNA 간의 2 중 사슬 구조가 MO 에 의존한 poly(A) 사슬 신장 저해에 필요하다고 생각된다 (도 2 와 도 5). 특필해야 할 것은 zcdk9 mRNA 의 3'UTR 의 말단부터 상류로 26 염기 내지 50 염기의 부분에서 MO 가 하이브리다이즈하면 poly(A) 사슬에는 영향이 관찰되지 않는다는 것이다 (도 2 와 3). 이것은 3'UTR 영역의 말단 부분 25 염기가 중요한 시스엘리먼트인 것을 시사한다. zcdk9, cyclin B1, 및 cyclin B2 의 mRNAs 의 3' 말단의 25 염기 부분과 tbp 의 mRNA 에서는 30 염기 부분에는 전형적인 폴리 A 시그널 (AAUAAA) 이 존재하고, 그곳에는 세포질에서 발생하는 poly(A) 화에 관여하는 RNA-단백질 복합체의 1 개의 CPSF 가 결합된다. 아프리카발톱개구리알 모세포에서는, 그 RNA-단백질 복합체는 세포질 poly(A) 사슬 단소화 효소 (PARN) 와 세포질 poly(A) 사슬 신장 효소 (Gld-2) 가 CPSF 나 세포질 poly(A) 사슬 제어 관련 인자인 CPEB, Pumilio, 및 Musashi 를 포함하고 있다. 그러므로, poly(A) 사슬 연결 부위에 MO 가 하이브리다이즈하는 것이 폴리 A 시그널에 대한 CPSF 의 결합이나 그 RNA-단백질 복합체의 기능을 저해한다고 생각하는 것은 타당할 것이다. 이것은 Gld-2 와 PARN 의 밸런스에 변화를 주고, 그 결과, poly(A) 사슬의 단소화가 발생하고 있을 가능성을 시사하고 있는 것일지도 모른다.

본 발명자들은 MO 와 mRNA 의 하이브리다이제이션이 mRNA 의 3' 말단 배열 부분과 poly(A) 사슬을 제거하는 것을 발견하였다. 즉, 하이브리드 위치로부터 mRNA 의 3' 측으로 수 염기 간 지점에서 mRNA 가 끊어지기 때문에 poly(A) 사슬이 제거된다 (도 3). 이것은, 처음에 poly(A) 사슬 단소화 효소가 작용하고, 이어서 엑소뉴클레아제가 작용하기 때문이라고 생각된다 (도 7A). 혹은, 하이브리드 형성은 어떠한 종류의 엔도뉴클레아제 활성을 유도하고, 그것은 mRNA 상의 하이브리드 위치에서부터 하류 부분을 절단하는 것일지도 모른다 (도 7B). 본 발명자들은 이번 케이스에 어느 쪽의 가설이 맞는지 해답을 갖고 있지 않지만, 만약 후자인 경우에는, MO 와 mRNA 의 하이브리드를 인식하고 결합하는 엔도뉴클레아제의 관여를 나타내는 새로운 모델을 제창할 필요가 있다.

miRNA 와 MO 의 행동에 관하여 3 개의 유사점이 존재한다. 즉, mRNA 의 3'UTR 이 표적인 것, poly(A) 사슬 단소화가 발생하는 것, 나아가 번역 저해가 발생하는 것이다. 그러므로, MO 가 중개하는 poly(A) 사슬 단소화에 miRNA 관련 인자가 관여하는지 여부는 매우 흥미로운 과제라고 생각된다.

MO 를 사용한 신규 방법을 본 실시예에서 소개하였다. 이 방법의 장점은 종래법과 비교하여 mRNA 의 3'UTR 말단을 표적으로 하는 점에서 설계가 간단하다는 점과 MO 의 작용을 효율적으로 확인할 수 있다는 점이다. 제브라피시 Cdk9 에 대한 특이 항체를 보유하고 있었으므로 MO 에 의해 유도되는 양 단백질의 양적 감소를 확인할 수 있었다. 만약 적절한 항체가 수중에 없는 경우에는, PCR 을 기본으로 한 PAT 법으로 poly(A) 사슬의 길이를 모니터함으로써 유전자의 발현 저해를 조사할 수 있다. 그 RNA 레벨에서의 검증에 더하여, 도 4F 에서 실시한 바와 같이 합성 mRNA 를 사용한 회복 실험을 실시함으로써 MO 의 표적 유전자 발현에 대한 효과를 확인할 수도 있다.

[실시예 2]

재료와 방법

·세포 배양

HeLa 세포는 10 ％ 비동화 FBS, 100 units/㎖ penicillin, 100 ㎎/㎖ streptomycin 의 DMEM (Sigma-Aldrich) 으로 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 배양하였다.

·유전자 도입

약 1 × 10⁶/㎖ 가 되도록, 세포를 10 ％ 비동화 FBS 를 포함하는 DMEM 배지에 현탁시키고, 1 ㎖ 씩 12 웰 플레이트에 뿌린다. 세포가 40 ∼ 50 ％ 정도의 집밀 상태일 때에, siRNA (최종 농도 20 nM) 및 2 ㎕ Lipofectamine (Ingitrogen) 을 200 ㎕ OptiMEM (Ingitrogen) 에 혼합한 것을 첨가하였다. 필요에 따라, PMA (최종 농도 10 nM 또는 100 nM) 도 첨가한다. 24 시간 후에 회수하여, 전체 RNA 의 정제 또는 웨스턴 블롯 해석을 실시하였다.

이 연구에서 사용한 siRNA 를 이하에 나타낸다.

siRNA

n/c : Universal negative control (주식회사 닛폰 EGT)

·세포의 전체 RNA 의 정제

전체 RNA 는 Sepasol-RNA I super (Nacalai Tesque) 에 의해 세포로부터 조제되었다.

·역전사 반응-PCR (RT-PCR)

PCR 용 primer

웨스턴 블롯 해석

회수한 세포는 PBS 1 ㎖ 에 의한 세정 후, 125 ㎕ 의 RIPA buffer (150 mM NaCl, 1 ％ NP-40, 0.5 ％ deoxycholate, 0.1 ％ sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) 에 녹였다. 상청 62.5 ㎕ 는 5 분간의 원심 분리 (15,000 rpm) 에 의해 회수되었고, 그곳에 62.5 ㎕ 의 2×Laemmli 샘플 버퍼를 첨가하였다. 웨스턴 블롯 해석에 있어서는, 5 ㎕ 의 샘플을 해석하였다. 1 차 항체로서 항Bcl-xL 항체 (Santacruz, sc-8392), 항 PLK1 항체 (Santacruz, sc-17783), 항 Livin 항체 (Santacruz, sc-30161), 항 RelA 항체 (Santacruz, sc-372) 또는 항 Actin 항체 (Millipore, clone C4) 를 사용하였다. 또, 2 차 항체로서 HRP-conjugated anti-rabbit IgG (GE Healthcare, NA9340OV) 또는 POD-conjugated mouse IgG to Rabbit IgG (Dako, P0260) 를 사용하였다. 반응한 단백질은 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) 로 처리하고, LAS4000 IR multi color (Fuji Film) 로 가시화하였다.

결과

RelA, Bcl-xL, Livin 및 PLK1 각각의 mRNA 3'UTR 의 폴리 A 시그널 배열을 덮도록 siRNA 를 설계하였다 (도 12). HeLa 세포에 siRNA 를 도입하자 특이적으로 mRNA 및 단백질 축적량의 감소가 관찰되었다 (도 8, 9, 10). 또한, PMA 첨가에 의해 발현 유도되는 tPA 유전자에 관해, 마찬가지로 tPA 의 mRNA 3'UTR 의 폴리 A 시그널 배열을 덮는 siRNA 를 설계하였다 (도 12). HeLa 세포에 대한 PMA 첨가와 동시에 siRNA 를 첨가하고, 24 시간 후에 RNA 를 회수하였다. RT-PCR 법에 의해 해석하자 tPA 의 발현 유도가 mRNA 레벨로 저해된 것을 알 수 있었다 (도 11).

디스커션

본 실험은 종래법보다 간편하게 설계가 가능한 siRNA 를 제공한다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 있어서 도입하는 것으로 한다.

산업상 이용가능성

본 발명은 선택적 유전자 발현 억제법으로서 이용 가능하다.

배열표 프리 텍스트

＜배열 번호 1＞

배열 번호 1 은 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 2＞

배열 번호 2 는 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO-2 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 3＞

배열 번호 3 은 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO-3 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 4＞

배열 번호 4 는 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO-4 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 5＞

배열 번호 5 는 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO-5 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 6＞

배열 번호 6 은 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO-6 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 7＞

배열 번호 7 은 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO-7 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 8＞

배열 번호 8 은 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9 MO-8 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 9＞

배열 번호 9 는 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 cdk9m MO 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 10＞

배열 번호 10 은 (dT)₁₂-anchor primer 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 11＞

배열 번호 11 은 PAT 어세이용 primer zcdk9 PAT 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 12＞

배열 번호 12 는 PAT 어세이용 primer tbp PAT 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 13＞

배열 번호 13 은 PAT 어세이용 primer cyclin B1 PAT 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 14＞

배열 번호 14 는 PAT 어세이용 primer cyclin B2 PAT 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 15＞

배열 번호 15 는 PCR 용 actin 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 16＞

배열 번호 16 은 PCR 용 actin 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 17＞

배열 번호 17 은 PCR 용 biklf 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 18＞

배열 번호 18 은 PCR 용 biklf 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 19＞

배열 번호 19 는 PCR 용 zcdk9 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 20＞

배열 번호 20 은 PCR 용 zcdk9 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 21＞

배열 번호 21 은 PCR 용 tbp 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 22＞

배열 번호 22 는 PCR 용 tbp 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 23＞

배열 번호 23 은 PCR 용 cyclin B1 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 24＞

배열 번호 24 는 PCR 용 cyclin B1 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 25＞

배열 번호 25 는 PCR 용 cyclin B2 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 26＞

배열 번호 26 은 PCR 용 cyclin B2 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 27＞

배열 번호 27 은 RelA 에 대한 siRNA 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 28＞

배열 번호 28 은 Bcl-xL 에 대한 siRNA 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 29＞

배열 번호 29 는 Livin 에 대한 siRNA 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 30＞

배열 번호 30 은 PLK1 에 대한 siRNA 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 31＞

배열 번호 31 은 tPA 에 대한 siRNA 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 32＞

배열 번호 32 는 RelA 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 33＞

배열 번호 33 은 RelA 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 34＞

배열 번호 34 는 Bcl-xL 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 35＞

배열 번호 35 는 Bcl-xL 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 36＞

배열 번호 36 은 PLK1 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 37＞

배열 번호 37 은 PLK1 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 38＞

배열 번호 38 은 tPA 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 39＞

배열 번호 39 는 tPA 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 40＞

배열 번호 40 은 Livin 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 41＞

배열 번호 41 은 Livin 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 42＞

배열 번호 42 는 βActin 특이적 primer (forward) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

＜배열 번호 43＞

배열 번호 43 은 βActin 특이적 primer (reverse) 의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Public University Corporation Yokohama City University Yoshindo Inc. Tokyo Institute of Technology <120> Technique for inhibiting translation by cleaving a part of polyA tail and/or 3' end sequence of mRNA <130> FP-172PCT <150> JP P2011-160512 <151> 2011-07-22 <160> 43 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO <400> 1 ggaaatgtga aggatttata ggtgt 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO-2 <400> 2 atttatactt atacaagtaa caaac 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO-3 <400> 3 accatgaccc cgaacacgtg atctt 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO-4 <400> 4 acaaataaaa acatctttaa aaata 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO-5 <400> 5 tgtgaaggat ttattggtgt attta 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO-6 <400> 6 aggatttatt ggtgtattta tactt 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO-7 <400> 7 ttattggtgt atttatactt ataca 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9 MO-8 <400> 8 ggtgtattta tacttataca agtaa 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cdk9m MO <400> 9 ggtaatatga acgatgtata ggtgt 25 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> (dT)12-anchor primer <400> 10 gcgagctccg cggccgcgtt tttttttttt 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> zcdk9 PAT primer <400> 11 gtgctgcccc agtgcattgt 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tbp PAT primer <400> 12 tgttgtgcag tgcgagagat c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cyclin B1 PAT primer <400> 13 atgttgtgag ggtcaacgag g 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cyclin B2 PAT primer <400> 14 agcagcagac tcatgaagat ca 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> actin-specific primer (forward) <400> 15 ctgaatccca aagccaacag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> actin-specific primer (reverse) <400> 16 tcacaccatc accagagtcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> biklf-specific primer (forward) <400> 17 atgctgactc caccatcctc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> biklf-specific primer (reverse) <400> 18 tgtccggtgt gtttcctgta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> zcdk9-specific primer (forward) <400> 19 cagccaatca gagttcgaca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> zcdk9-specific primer (reverse) <400> 20 tagtgccacc ggtaaactcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tbp-specific primer (forward) <400> 21 cttggggtgc aaacttgatt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tbp-specific primer (reverse) <400> 22 catatttcct ggctgccaat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cyclin B1-specific primer (forward) <400> 23 cagctgcaac ttgttggtgt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cyclin B1-specific primer (reverse) <400> 24 ggtagaggcc ttccaaaacc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cyclin B2-specific primer (forward) <400> 25 ctcaaagcat ctgacggtga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cyclin B2-specific primer (reverse) <400> 26 gcagcagtcc atctctcaca 20 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA to RelA <400> 27 cugaacuaau aaaucuguu 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA to Bcl-xL <400> 28 guucaguaau aaacugugu 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA to Livin <400> 29 gaauagaaau aaagugggu 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA to PLK1 <400> 30 uaugcacauu aaacagaug 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA to tPA <400> 31 cuguacuuaa uaaauucag 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RelA-specific primer (forward) <400> 32 cctggagcag gctatcagtc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RelA-specific primer (reverse) <400> 33 atcttgagct cggcagtgtt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bcl-xL-specific primer (forward) <400> 34 ggtattggtg agtcggatcg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bcl-xL-specific primer (reverse) <400> 35 aagagtgagc ccagcagaac 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLK1-specific primer (forward) <400> 36 ggcaaccttt tcctgaatga 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLK1-specific primer (reverse) <400> 37 aatggaccac acatccacct 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tPA-specific primer (forward) <400> 38 cccagatcga gactcaaagc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tPA-specific primer (reverse) <400> 39 tggggttctg tgctgtgtaa 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Livin-specific primer (forward) <400> 40 cctctctgcc tgttctggac 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Livin-specific primer (reverse) <400> 41 ctccagggaa aacccacttt 20 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> bActin-specific primer (forward) <400> 42 gatatcgccg cgctcgtcg 19 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> bActin-specific primer (reverse) <400> 43 gggaggagct ggaagcag 18

Claims

표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하는 것을 포함하는 표적 유전자의 번역 반응을 억제하는 방법.
제 1 항에 있어서,
표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부에 하이브리다이즈할 수 있는 리보 핵산을 사용하여, 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단하는 방법.
제 2 항에 있어서,
리보 핵산이 표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 40 뉴클레오티드까지의 영역의 배열의 전부 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 방법.
제 3 항에 있어서,
표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 결합 부위부터 상류 40 뉴클레오티드까지의 영역의 배열의 전부 또는 일부가 폴리 A 시그널 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
리보 핵산이 20 ∼ 25 mer 인 방법.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
리보 핵산이 천연형의 뉴클레오티드로 이루어지는 방법.
제 6 항에 있어서,
리보 핵산이 2 개 사슬 RNA 인 방법.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
리보 핵산이 적어도 1 개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 방법.
제 8 항에 있어서,
리보 핵산이 1 개 사슬인 방법.
제 9 항에 있어서,
1 개 사슬 리보 핵산이 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드인 방법.
표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약을 함유하는 표적 유전자의 번역 반응을 억제하기 위한 키트.
제 11 항에 있어서,
표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 리보 핵산인 키트.
표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어, 표적 유전자의 번역 반응이 억제된 세포.
표적 mRNA 의 poly(A) 사슬 및/또는 3' 말단 배열의 일부를 절단할 수 있는 시약이 도입되어, 표적 유전자의 번역 반응이 억제된 비인간 생물.