JP7406228B2 - 変異型CeR-2a RNAホモログ及び該RNAホモログの利用 - Google Patents
変異型CeR-2a RNAホモログ及び該RNAホモログの利用 Download PDFInfo
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Description
[1]線虫が有する野生型CeR-2a RNAホモログにおいて、26S rRNAの塩基配列の5’末端側の塩基配列と高度に相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、変異型CeR-2a RNAホモログ。
[2]前記線虫は、カエノラブディティス属(Caenorhabditis)線虫、ヘモンカス属(Haemonchus)線虫又はシファシア属(Syphacia)線虫である、[1]に記載の変異型CeR-2a RNAホモログ。
[3]野生型CeR-2a RNAホモログの塩基配列において、5’末端側の1位~8位の塩基からなる塩基配列が、26S rRNAの塩基配列における5’末端側の21位~28位の塩基からなる塩基配列と、6個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、[1]~[2]のいずれか1項に記載の変異型CeR-2a RNAホモログ。
[4]更に野生型CeR-2a RNAホモログの塩基配列において、5’末端側の9位~18位の塩基からなる塩基配列が、26S rRNAの塩基配列における5’末端側の4位~13位の塩基からなる塩基配列と、9個以上の相補的塩基対を形成するように改変された変異を有する、[3]に記載の変異型CeR-2a RNAホモログ。
[5]更に野生型CeR-2a RNAホモログの塩基配列において、5’末端側の8位の塩基と9位の塩基との間に、26S rRNAの塩基配列における5’末端側の14位~20位の塩基からなる塩基配列の一部又は全部と相補的である塩基配列を挿入するように改変された変異を有する、[3]~[4]のいずれか1項に記載の変異型CeR-2a RNAホモログ。
[6]配列表の配列番号3、配列番号7又は配列番号23に記載の塩基配列から本質的になる、変異型CeR-2a RNAホモログ。
[7][1]~[6]のいずれか1項に記載の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物又は線虫の産卵抑制用組成物。
[8][1]~[6]のいずれか1項に記載の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫のrRNA前駆体蓄積促進用組成物又は線虫のリボソーム合成抑制用組成物。
[9][1]~[6]のいずれか1項に記載の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫用農薬。
[10]生物体のrRNA前駆体の5’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成して結合する核小体低分子RNAを取得する工程と、
前記核小体低分子RNAの5’末端側の塩基配列を、前記rRNA前駆体の5’末端側の塩基配列と相補性が高くなるように改変することにより、変異型核小体低分子RNAを得る工程と
を含む、変異型核小体低分子RNAの製造方法。
[11]前記生物体は、線虫である、[10]に記載の製造方法。
「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、2種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の2種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の1種以上と固形担体又は溶媒の1種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。
「及び/又は」は、列記した複数の関連項目のいずれか1つ、又は2つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、100%を超えることはない。
数値範囲の「~」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「0質量%~100質量%」は、0質量%以上であり、かつ、100質量%以下である範囲を意味する。
「塩基配列から本質的になる」は、該塩基配列からなるか、又は該塩基配列を有し、さらに該塩基配列によって表される核酸分子が有する構造及び/又は機能を損なわない範囲内で該塩基配列の5’末端側又は3’末端側に塩基が付加された塩基配列からなることを意味する。
「RNAホモログ」とは、同一又は近似する構造及び/又は機能を有し、かつ同一又は近似する塩基配列を有するRNAの群を意味する。CeR-2a RNAホモログは、CeR-2a RNA及び各生物におけるCeR-2a RNAに相当するRNAを意味する。CeR-2a RNAホモログは、26S rRNAの塩基配列の5’末端側の塩基配列と相補的塩基対を形成し、かつCeR-2a RNAと同一又は近似する塩基配列を有する。
変異型CeR-2a RNAホモログは、CeR-2a RNAホモログ(以下、野生型CeR-2a RNAホモログともよぶ。)の塩基配列において、塩基の置換を有する塩基配列、又は塩基の置換と付加及び/若しくは欠失とを有する塩基配列を有するRNA分子である。ここで、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味し、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味する。本明細書では、塩基を置換、付加及び/又は欠失することにより、塩基配列に変更を加えることを「変異」とよぶ。
本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物である。本発明の別の一態様は、本発明の一態様の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫の産卵抑制用組成物である。
本発明の別の一態様は、変異型核小体低分子RNAの製造方法である。本発明の一態様の製造方法は、生物体の26S rRNA、28S rRNAなどのrRNA前駆体の5’末端側の塩基配列の情報を基に、該塩基配列と比較的高度に相補的塩基対を形成するような核小体低分子RNAをデザインすることを基本構成とする。
線虫としては、Caenorhabditis elegansを用いた。
食料源として濃縮されたE.coli W3110株を用意するために、LB培地によりW3110を一晩前培養したもの(50ml)を、LB培地(3L)に添加し、37℃で125rpm/minで振とうしながら8時間培養した。W3110は4,500rpmで5分間、4℃で遠心分離によって回収した。回収したW3110ペレットを50mlの蒸留水中に再懸濁して、W3110の再懸濁液を得た。
線虫株HUJ0003及びHUJ0004は、Frokjar-Jensenらの文献(Frokjar-Jensen et al., Single-copy insertion of transgene in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40:1375-1383, 2008;Improved Mos1-mediated transgenesis in C. elegans. Nat Methods, 9:117-118, 2012)に記載のMosSCI法によって作製した。
線虫から、トータルRNA 1μg中におけるCeR-2a及びCeR-2b RNAの絶対コピー数を、下記手順に従って検量線法を使用して計測した。
線虫のトータルRNA(1μg)を、ホルムアルデヒドを含む1.0%変性アガロースゲル上で分離し、キャピラリーブロッティングによってBiodyne Plus membrane(Pall Corporation)上にブロットした。オリゴヌクレオチドNB1及びNB2を、DIG Oligonucleotide Tailing Kit 2nd generation(Roche)を使用してDIG-ddUTPを用いてラベルして、ハイブリダイゼーション用のプローブとして使用した。
リボソーム沈降プロファイルは、下記手順に従い、Kirstein-Milesらの文献(Kirstein-Miles,J.,et al., The nascent polypeptide-associated complex is a key regulator of proteostasis. EMBO J. 32: 1451-1468, 2013)及びSaijouらの文献(Saijou,E.,et al., RBD-1, a nucleolar RNA-binding protein, is essential for Caenorhabditis elegans early development through 18S ribosomal RNA processing. Nucleic Acids Res. 32: 1028-1036., 2004)に記載のショ糖密度勾配遠心法に軽微な修正を加えた方法によって分析した。
20体のL1期線虫を、E.coli OP50を播種したNGMプレート上に配置した。配置直後を時間0(t=0)として設定した。L1期線虫を播種したNGMプレートを20℃、25℃又は15℃でインキュベートした。
50体のL1期線虫を、E.coli OP50を播種したNGMプレート上に配置した。L1期線虫を播種したNGMプレートを20℃、25℃又は15℃でインキュベートした。
20℃及び25℃でインキュベートした線虫の体長測定の結果を、それぞれ図4及び図5に示す。それぞれの図が示すとおり、変異型CeR-2a RNAを発現するN2cerX及びMTcerXは、それぞれ対応するN2及びMTcerに対して、体長の伸長速度が遅かった。また、線虫を15℃でインキュベートした場合においても、図4及び図5と同様の傾向を示すことがわかった。
[配列番号1]野生型CeR-2a RNAの塩基配列
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号2]26S rRNAの塩基配列(5’末端側の1位~100位の塩基配列を抜粋)
CUCAACCUGAACUCAGUCGUGAUUACCCGCUGAACUUAAGCAUAUCAUUUAGCGGAGGAAAAGAAACUAAAAAGGAUUCCCUUAGUAACGGCGAGUGAAA
[配列番号3]変異型CeR-2a RNAの塩基配列
GGGUAAUCAGUUUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号4]ヒトU8 snoRNAの塩基配列
AUCGUCAGGUGGGAUAAUCCUUACCUGUUCCUCCUCCGGAGGGCAGAUUAGAACAUGAUGAUUGGAGAUGCAUGAAACGUGAUUAACGUCUCUGCGUAAUCAGGACUUGCAACACCCUGAUUGCUCCUGUCUGAUU
[配列番号5]28S rRNAの塩基配列(5’末端側の1位~100位の塩基配列を抜粋)
CGCGACCUCAGAUCAGACGUGGCGACCCGCUGAAUUUAAGCAUAUUAGUCAGCGGAGGAGAAGAAACUAACCAGGAUUCCCUCAGUAACGGCGAGUGAAC
[配列番号6]Ceの26S rRNAの5’末端側の14位~20位の塩基からなる塩基配列と相補的である塩基配列
CAGUCGU
[配列番号7]変異型CeR-2a RNAの塩基配列において、8位と9位の間にACGACUGが挿入されている配列
GGGUAAUCACGACUGAGUUUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号8]プライマーCP1
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
[配列番号9]プライマーCP2
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
[配列番号10]プライマーCP3
AAACCTGCAGGGGGAAAAATGAGTTGTAGGC
[配列番号11]プライマーCP4
AAACTCGAGCGAAAATCTACCAAATCCTG
[配列番号12]プライマーCF420
TTTCTCACATGTTTTGCTGC
[配列番号13]プライマーCF421
ACATTGTCGAAATGTCCTCC
[配列番号14]プライマーoJL102
CAACCTTGACTGTCGAACCACCATAG
[配列番号15]プライマーoJL103
TCTGCGAGTTGTTTTTGCGTTTGAG
[配列番号16]プライマーRTP1
GTTCAGAATCGGGCTG
[配列番号17]プライマーCeR2aT7F1
CGACTCACTATAGTCTTCAGTATGGGTCA
[配列番号18]プライマーEcoRIT7
AAAGAATTCTAATACGACTCACTATA
[配列番号19]プライマーRTF1
GTCAATCTCTGATCTGCAAC
[配列番号20]プライマーRTR1
CGGGTATTGCGTTCCCA
[配列番号21]プローブNB1
TGGAACGTTGACATTTCGACACTCAACTGA
[配列番号22]プローブNB2
AAGAAGAAGCCTAGACGCATATAGCCACCA
[配列番号23]変異型CeR-2a RNAの塩基配列において、13位及び14位の塩基がそれぞれ「C」と「A」に置き換えられた配列
GGGUAAUCAGUUCAGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号24]プローブcer-2a-BRstr_F
GGGTAATCAGTTTGGGTCAATCTCTGATCTG
[配列番号25]プローブcer-2a-105+xho
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
[配列番号26]プローブcer-2a-BRstr_R
ACCCAAACTGATTACCCGAGAAAGGGTGAAAGTGTGC
[配列番号27]プローブcer+398+sbf
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
[配列番号28]Cele(2b)
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAAGAGAUCGGGCGAUGAAAUUUUGUGAUUAAAUCGCACGGCGAGAUGGGAACGCAAUACCCGUCUGGCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号29]Cino
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAAAUGAUGAGCUCGGGCGAUGAUCUUUUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号30]Cbri1
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUUUGUGAUUAAAUCGCACGGCGAGAUGGGAACGCAAUACCCGUCUGGCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号31]Cbri2
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAAGAGAUCGGGCGAUGAAAUUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGGGGUGGGAAACGCAAUACCUGACCGUCAGCCUCGAUUCUGACA
[配列番号32]Crem1
UAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAAAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCUUCUGUGAUUAUAUCGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCAGCCCGAUUCUGAA
[配列番号33]Crem2
UAGUCUUCAGUAUGGGUCAAAUAUUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGAUCCUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGUUGGGAACGCAAUACCUGACUGCCAGCCCGGUUCUGA
[配列番号34]Cbre1
CAGUCUUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAAUAUGAUGAGUUCGGGCGAUGACUCUCUGUGAUUACAUCGCACGGCGAGGUGGGAACGCAAUACCCGCCUGCCAGCCCGAUUCUGAAC
[配列番号35]Cbre3
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAAAACGGGCGAUGAUCCAUCGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
[配列番号36]Cbre4
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAUAACGGGCGAUGAUCCAUCGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
[配列番号37]Cbre5
UUGUCAUCAGUAUGGGUCAAUCUCUGAUCUGCAACUGAACAUGAUGAAAACGGGCGAUGAUCCUUUGGUGAUUAUAACGCACGGCGAGGAGGGAACGCAAUACCCACCUGUCUGCCCGAAUCUGA
[配列番号38]Hcon
UUGUCUUCAGUAAGGGUCAAUUCAGACCUGAAUCUGAAUAUGAUGAGAUCGGGCGAUGAGUCAAAGUGAGUUACGACGCACGGAUCGUCGGGACCGCAACUCCCGUACGAGGCCCGAAUCUGAA
[配列番号39]Smur
UCGGUCUCAGUAAGGGUCAAUUCAGACCUGAAUCUGAAACGUGAUGAGAUCGGGCGAUGAGUUCCAGAUGAGUUAAAGCGCACGGCGGCGCGAGUGUCGCAACUUGCGUUUGAUGCCUGAGUCUGAGUC
[配列番号40]Haemonchus contortus 26S rRNA
UGCAACCUGAGCUCAGGCGUGAUUACCCGCUGAACUUAAGCAUAUCACUUAGCGGAGA
[配列番号41]Syphacia muris 26S rRNA
UAGUACCUCAACUCAGUCGUGAUUACCCGCUGAAUUUAAGCAUAUACUAAGCGCGGAA
[配列番号42]プライマーcer-2a-BPstr_F
GGGTAATCAGTTTGGGTCAATCTCTGATCTG
[配列番号43]プライマーcer-2a+105+xho
AAACTCGAGATCGTGTATTTTATGTCAACG
[配列番号44]プライマーcer-2a-398+sbfI
AAACCTGCAGGTACTGGTACGATCCCTGTTC
[配列番号45]プライマーcer-2a-BPstr_R
ACCCAAACTGATTACCCGAGAAAGGGTGAAAGTGTGC
Claims (4)
- 配列表の配列番号3、配列番号7又は配列番号23に記載の塩基配列から本質的になる、変異型CeR-2a RNAホモログ。
- 請求項1に記載の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫の成長抑制用組成物又は線虫の産卵抑制用組成物。
- 請求項1に記載の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫のrRNA前駆体蓄積促進用組成物又は線虫のリボソーム合成抑制用組成物。
- 請求項1に記載の変異型CeR-2a RNAホモログを有効成分として含有する、線虫用農薬。
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JP2019188562A JP7406228B2 (ja) | 2019-10-15 | 2019-10-15 | 変異型CeR-2a RNAホモログ及び該RNAホモログの利用 |
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-
2019
- 2019-10-15 JP JP2019188562A patent/JP7406228B2/ja active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
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Y. HOKII et al.,"A small nucleolar RNA functions in rRNA processing in Caenorhabditis elegans",Nucleic Acids Research,2010年05月11日,Vol. 38, No. 17,p.5909-5918,DOI: 10.1093/nar/gkq335 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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