CN105008537A - 抑制核糖体蛋白的胞内表达的小干扰rna - Google Patents
抑制核糖体蛋白的胞内表达的小干扰rna Download PDFInfo
- Publication number
- CN105008537A CN105008537A CN201480011939.6A CN201480011939A CN105008537A CN 105008537 A CN105008537 A CN 105008537A CN 201480011939 A CN201480011939 A CN 201480011939A CN 105008537 A CN105008537 A CN 105008537A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirna
- rps3
- cell
- protein
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 title abstract description 7
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 title abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title description 2
- 101100254610 Caenorhabditis elegans rps-3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 109
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 23
- 102100033409 40S ribosomal protein S3 Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010033804 ribosomal protein S3 Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 14
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 10
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001118 alkylidene group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 description 1
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 206010014714 Endocrine neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- -1 phosphonate ester Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150013092 rps3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于特异性抑制在细胞中的核糖体蛋白表达的小干扰RNA(siRNA)，并且更具体地，涉及特异性抑制内源rpS3蛋白在细胞中的表达而不会影响标记的过表达蛋白质的siRNA。相对于传统的市售产品，本发明的siRNA在经济性和效率方面是优异的。
Description
技术领域
本发明涉及可结合到细胞中的核糖体蛋白的特定位点以特异地抑制核糖体蛋白表达的siRNA(小干扰RNA)。
背景技术
蛋白质参与从细胞信号转导到组织重塑乃至器官功能的所有生理过程。因此，细胞中的蛋白质的合成是非常重要的过程，并且核糖体执行此功能。核糖体是连接氨基酸以形成蛋白质的细胞器，并且是由核糖体蛋白和核糖体RNA所组成的大亚基。
rpS3(核糖体蛋白S3)是核糖体的一个组件，位于40S亚基的外表面并且与起始因子eIF2和eIF3交联。因为rpS3在N-末端区域具有核定位信号，据信rpS3的翻译功能是在细胞质中操作，并且修复功能是在细胞核中操作。除了其在核糖体功能中的作用，许多核糖体蛋白在复制、转录、RNA加工、DNA修复和恶性转化中具有次要作用。
rpS3基因位于人类染色体11q13.3-q13.5。具体地，报道称rpS3基因在结肠直肠癌患者中过表达。因此，rpS3基因产物在结肠直肠癌中过表达，并且非常可能与其它癌症相关联。此外，对区域11q13.3-q13.5的研究表明，常常会发生该基因的结构异常和扩增，并且该基因在人类癌症发展时过表达，所述癌症例如多发性内分泌肿瘤I型、乳腺癌或B细胞瘤(Pogue-Geile et al.,Mol.Cell.Biol.,11:3842-3849,1991)。
如本文所用，术语“siRNA(小干扰RNA)”是指约10个核苷酸至几十个核苷酸组成的、诱导RNAi(RNA干扰)的短双链RNA。RNA干扰(“RNAi”)是在许多真核生物中都保守的基因表达的转录后抑制方法，并且是指双链RNA被引入到细胞等中使得它能选择性地诱导靶基因的mRNA的降解或者能抑制靶基因表达的现象，所述双链RNA由具有与靶基因同源的序列的有义RNA和具有与该有义RNA互补的序列的反义RNA组成。RNAi是由存在于细胞中的短(即，少于30个核苷酸)的双链RNA(“dsRNA”)分子所诱导(Fire A.et al.,Nature,391:806-811,1998)。因为如上所述RNAi能够选择性地抑制靶基因的表达，它作为简单的基因敲除方法来替代基于低效同源重组的常规基因破坏方法吸引了相当大的注意。当siRNA被引入到细胞中时，具有与siRNA的核苷酸序列互补的靶基因的mRNA表达将被抑制。
siRNA与靶mRNA结合到RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)，其裂解靶mRNA。siRNA显然是再循环的，其很像多周转酶，1个siRNA分子能够诱导约1000个mRNA分子裂解。因此，mRNA的siRNA介导的RNAi降解比目前可用于抑制靶基因表达的技术更有效。
然而，与最初期望的RNAi技术能够适用于所有基因的RNA以选择性抑制所述RNA的表达不同，最近已发现因为一些基因在高通量的RNAi筛选程序中是未知的，因此不能应用RNAi技术(Krueger et al.,Oligonucleotides,17:237-250,2007)。此外，在过去的几年里，已经开发出通过基于数据库的统计分析来预测siRNA序列的算法。然而，已知的是，因为计算算法不完善，并不是使用所述算法通过在计算机上的模拟方法(insilico method)确定的所有siRNA都能有效地抑制细胞中以及体内的靶mRNA，并且最有效的siRNA只能通过实验验证来确定(Derek et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.,8:377-402,2006)。
如上所述，理论上预测的siRNA不能有效抑制mRNA的能力，并且为实现治疗目的应发现高效的siRNA核苷酸序列。由于这个原因，非常重要的是找到对靶mRNA具有高抑制作用的特定的极度活跃的靶标。此外，需要通过基于每个基因的mRNA选择若干靶标位点来制备siRNA，并且至少在细胞水平上直接检查该siRNA的作用，识别具有优异的表达抑制效果的最佳序列。
因此，本发明人进行了广泛的努力来开发用于抑制核糖体蛋白S3(rpS3)表达的siRNA，并且结果是，构建了结合到rpS3的特定靶标位点的rpS3siRNA，并发现所构建的siRNA相对于商购的产品具有优异的抑制内源rpS3蛋白表达的效果，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种特异性抑制rpS3表达的siRNA。
为了实现上述目的，本发明提供了用于抑制rpS3蛋白表达的siRNA，所述siRNA结合至对应于具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的rpS3mRNA的位置777至795或796至914的核苷酸序列。
附图说明
图1示出分析被引入到细胞中的rpS3siRNA的效率的结果(泳道1：打乱的siRNA，泳道2：RPS3-203，泳道3：RPS3-635，泳道4：RPS3-777，和泳道5：RPS3-796)。
图2示出比较rpS3siRNA的效率的结果(泳道1：对照，泳道2：RPS3-777，泳道3：B公司，和泳道4：S公司)。
图3示出鉴定不被siRNA影响的表达rpS3的稳定细胞的结果(泳道1：打乱的siRNA，泳道2：RPS3-203，泳道3：RPS3-635，泳道4：RPS3-777，泳道5：RPS3-796)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。大体上，将在下面描述的本文中使用的命名法和实验方法是本领域公知的且通常采用的。
本发明人已经构建了具有优异的特异性抑制内源rpS3蛋白在细胞中的表达效果而不会影响过表达蛋白的siRNA。
在本发明中，为了确认所构建的rpS3siRNA在被引入细胞内后是否有效地操作，将作为对照的扰乱的siRNA，由本发明人以前构建的靶向rpS3蛋白质的siRPS-203中每种，以及本发明构建的siRPS3-777和796每种，引入到各种动物细胞中，并通过Western印迹测量rpS3蛋白在细胞中的水平。结果发现，用作对照的扰乱的siRNA在细胞中的rpS3蛋白质水平没有显示出变化，而新构建的本发明的777和796siRNAs大大抑制rpS3蛋白的表达水平，并且相比在现有技术中已使用的203和635siRNA，也显著抑制蛋白的表达水平(图1)。
换句话说，在本发明的例子中，可以看出，siRPS3-777和796特异地抑制rpS3蛋白的表达水平。
因此，在一个方面，本发明涉及通过结合到选自下组的靶核苷酸序列，抑制rpS3蛋白表达的siRNA(SEQ ID NO：2和3)，所述组对应于具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的rpS3mRNA的位置777到795和796到914的核苷酸序列。
根据本发明的siRNA可以具有15-21个核苷酸的长度。
如本文所用，术语“siRNA”是指可诱导靶mRNA的降解或通过切割靶mRNA抑制靶基因表达的短双链RNA。
根据本发明的结合到对应于rpS3mRNA的位置777到795的核苷酸序列和对应于rpS3mRNA和位置796到914的核苷酸序列的siRNA分别由SEQ ID NO：2和3表示。
本发明的siRNA不限于完全配对，并且可以含有由于错配(对应的核苷酸不互补)而产生的非配对部分，凸起部分(在一条链上缺乏对应的互补核苷酸)等。本发明的siRNA可以是能干扰rpS3的活性和表达的、包括10-40个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选19-21个核苷酸的双链RNA。
如本文所用，术语“siRNA的长度”指的是形成双链(配对)的核苷酸的数目。本发明的siRNA的末端结构可以是平末端或粘性末端，只要该siRNA可以由于其RNAi效应而使靶基因的表达沉默、减少或抑制。
粘性末端结构可以是3'-末端突出结构和5'末端突出结构。突出核苷酸的数量没有特别的限制，但可以是，例如1-8个核苷酸，优选1-4个核苷酸。此外，在siRNA一端的突出部分可包括dTdT、UU或双链形成部分继续可包括与rpS3mRNA一致或互补的序列。此外，siRNA不一定在两末端都具有切断结构，并且可以具有这样的茎环结构，即在双链RNA每一侧的末端通过接头RNA连接。此外，接头的长度没有特别的限制，只要它的长度不妨碍茎部的配对。
为了防止核酸酶造成的体内迅速降解并增强体内稳定性，本发明的siRNA可以通过本领域已知的普通方法进行化学修饰。例如，siRNA的至少一个核苷酸的糖(核糖环)的2'位置的羟基可以被氢、卤素、-O-烷基、-O-酰基或氨基取代，具体地被H、OR、R、R'OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br、I等取代，其中R可以是烷基或芳基，优选具有1至6个碳原子的烷基，并且R'可以被亚烷基，优选具有1-6个碳原子的亚烷基。可替代地，构成核苷酸的磷酸骨架可以被例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或胺基磷酸酯修饰。
在化学修饰中，在本发明siRNA的至少一个核苷酸可以被取代，这样它会呈现为LNA(锁核酸)、UNA(解锁核酸)、吗啉基和PNA(肽核酸)中的任何一种核酸类似物。LNA、UNA、PNA、吗啉基等的制备可以根据本领域中已知的知识基于本发明提供的siRNA序列信息来进行，并且可以参照以往的文献(Veedu RN,Wengel J.,Chem Biodivers,7(3):536-42,2010；Demidov VV.,Trends Biotechnol,21(1):4-7,2003；Shantanu Karkare et al.,Appl Microbiol Biotechnol,71:575-586,2006)进行。
在siRNA的化学修饰的例子中，siRNA有义或反义链的磷酸二酯键可以被硼烷磷酸酯(boranophosphate)或硫代磷酸酯取代，以增加siRNA的核酸酶抗性。例如，取代可以被引入到siRNA有义或反义链的3'末端或5'末端或这两端，优选RNA末端，例如，3'末端突出(例如，(dT)n，n＝1至5的整数，优选2至4)。
作为另一例子，可以将ENA(乙烯桥核酸)或LNA(锁核酸)引入到siRNA有义或反义链的5'末端或3'末端或这两端。优选地，可以引入到siRNA有义链的5'末端。在这种情况下，siRNA稳定性会增加而不影响RNAi活性，并且可以减小siRNA的免疫应答和非特异性抑制效果。
本发明的siRNA可以包括具有至少一个取代、插入、缺失或其组合的变体，它们与不会降低该siRNA活性的变异是功能等效物。例如，本发明的siRNA可包括与其核苷酸序列示出至少80％，优选至少90％，更优选至少95％同源性的那些核苷酸。这种同源性可通过使用本领域公知的计算机算法(例如Align或BLAST算法)比较该核苷酸序列与靶基因的相应部分而容易地确定。
本发明的siRNA可以是两个RNA链都配对而形成双链的完整形式，也就是，siRNA在体外直接合成并由转染引入到细胞的形式。或者，也可以是具有短发夹结构的修饰形式，使得它可以通过基于质粒的shRNA载体和PCR诱导的siRNA表达盒被用在转染中。
siRNA可以通过本领域中已知的各种方法，包括直接化学合成方法(Sui G et al.,Proc Natl Acad Sci USA,99:5515-5520,2002)，基于体外转录的合成法(Brummelkamp TR et al.,Science,296:550-553,2002)，以及用RNaseIII家族酶切割通过体外转录合成的长双链RNA的方法(Paul CP et al.,Nature Biotechnology,20:505-508,2002)来合成。
在本发明中，为了检查本发明的siRNA与市售siRNA在效率方面的差异，将相同量的siRNA导入小鼠成纤维细胞，并且通过Western印迹测量细胞中的rpS3水平。结果是，发现rpS3蛋白水平的变化非常显著。具体而言，B公司的siRNA显示出低效率，而S公司的产品的蛋白水平降低大约50-60％，但本发明siRNA具有敲低约80-90％的rpS3蛋白的效果(图2)。
根据本发明的siRNA可以方便地用于人、小鼠和猴的细胞。
在本发明的一个实例中，为了构建仅调节细胞中的内源性rpS3蛋白质而不影响外源过表达rpS3蛋白的siRNA体系，将Flag标记的rpS3构建体(DNA)导入HT1080细胞中，之后用G418(800μg/ml)处理细胞以筛选只导入了DNA的细胞，从而获得单细胞。
为了检查siRNA在细胞中的作用，以及被标记蛋白在细胞中的表达，将细胞用扰乱的siRNA以及RPS3-777和796siRNAs每一种进行处理，并且通过Western印迹测量rpS3蛋白和Flag-rpS3蛋白的水平。结果是，示出对照的扰乱的siRNA没有效果，而RPS3-777和796抑制内源性rpS3的水平，但Flag标记的rpS3蛋白的水平增加，而不是降低(图3)。
基于这样的结果，可以看出，Flag-rpS3蛋白的表达水平稳固地增加，并且因此其不仅是野生型，而且突变型中的表达水平都会提高。因而可以构建能研究该蛋白质的生物功能的体系。
因此，根据本发明的siRNA的特征在于它们抑制内源性rpS3蛋白质的表达而不影响被标记的过表达的蛋白质。
以下，参照实施例对本发明进行更详细的说明。本领域的普通技术人员显而易见的是，这些实施例是说明性的目的，并且不应被解释为限制或改变本发明的范围。
实施例1：用于siRNA的靶序列的调查
为了找到siRNA靶向的位点，将序列代入到搜索靶向rpS3的DNA序列的序列的程序，并对结果进行比较分析(Ambion，Promega，OligoEngine，Dharmacon)。
将rpS3DNA序列被分成三个部分：即，合成为蛋白质的部分；5'-UTR部分；和3'-UTR部分。为过表达rpS3蛋白质所构建的质粒仅由形成蛋白质的那部分组成。此外，使用包括非翻译的外显子-7的3'-UTR搜索具有高siRNA效率的靶序列的程序(Ambion，Promega，Dharmacon)。此外，将人和小鼠DNA序列代入该程序来搜索在人和小鼠DNA两者中都示出高效率的靶序列。
在靶向时能够呈现高效果的预测的序列中，由该程序共同呈现的部分被确定为siRNA靶序列。由Dharmacon公司合成所确定的siRNA序列。使用所用对照siRNA是由Bioneer(韩国)制造的AccuTargetTM阴性对照siRNA。
合成sirpS3-777(rpS3-777、siRNA777或777)以靶向由rpS3mRNA的位置777-795的核苷酸组成的序列，并且合成sirpS3-796(rpS3-796、siRNA796或796)以靶向由rpS3mRNA的位置796-914的核苷酸组成的序列(表1)。
表1：用于rpS3的siRNA的核苷酸序列和长度
[表1]
实施例2：通过siRNA对细胞中的rpS3表达水平的调控
为了检验所构建的rpS3siRNA是否在导入细胞内后有效地操作，使用各种哺乳动物细胞进行实验。具体而言，使用8μl的LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)通过反向转染将各siRNA(200皮摩)导入到细胞中。这里，将动物细胞以每个培养皿大约20,000个细胞的密度加入到60mm培养皿中。转染16小时后，收获细胞，并通过Western印迹分析细胞中的rpS3蛋白水平。
将作为对照的扰乱的siRNA，由本发明人先前构建的靶向rpS3蛋白的rpS3-203(203)和635(635)，以及在此实施例中构建的sirpS3-777和796中每种导入HeLa(KCLB 10002)和293T(KCLB 21573)动物细胞。
结果是，从图1可以看出，用作对照的扰乱的siRNA在细胞中的rpS3蛋白水平没有显示出变化，而相比已经在现有技术中使用的rpS3-203和635，根据本发明的rpS3-777和796大大抑制了rpS3蛋白的表达水平。
实施例3：与市售siRNA(小鼠)的比较
用于众多蛋白质的siRNA可购自各公司。其中，实验中经常使用的不仅靶向人类rpS3蛋白，也靶向小鼠细胞系中的小鼠rpS3蛋白的siRNA也可购自试剂公司。在此实施例中，为了检查实施例1的siRNA(sirpS3-777)与市售的siRNA在效率方面的差异，将siRNA的样品量(200皮摩)导入小鼠成纤维细胞，并且比较它们的效率。
结果是，可以从图2看出，B公司的siRNA通常显示出低效率，而S公司的商品抑制约50-60％的蛋白质，但本发明的siRNA(rpS3-777)显示出约80-90％的rpS3蛋白敲低的效果。
实施例4：组成型表达siRNA抗性rpS3的细胞的构建
在实际实验中，通过改变野生型蛋白的功能而得到的具有突变蛋白的野生型(WT)蛋白质是很重要的。因此，在该实施例中，使用标记体系来比较两种蛋白质，并且诱导蛋白质的过表达。然而，即使当蛋白质过表达时，对该蛋白质的精确分析因为内源蛋白也很困难。出于这个原因，在本实施例中，试图构建不渗透标记蛋白的siRNA体系。
具体而言，为了制备rpS3过表达细胞，将Flag标记的rpS3构建体(DNA)导入HT1080细胞，然后将细胞用G418(800μg/ml)处理，以筛选仅导入该DNA的细胞，从而获得单个细胞。所获得的细胞具有组成型表达特定蛋白质的性质，因此被称为“稳定的细胞”。为了检查siRNA在细胞中的作用以及标记蛋白在细胞中的表达水平，将细胞用扰乱的siRNA、或rpS3-777和796siRNA中每种进行处理。
结果是，可以从图3看出，用siRNA处理的结果表明，对照的扰乱的siRNA对蛋白表达没有影响，传统的siRNA和本发明的siRNA都降低野生型细胞系中内源性rpS3的表达。然而，Flag标记的rpS3蛋白的水平被203(rpS3-203)和635(rpS3-635)降低，但被777(rpS3-777)和796(rpS3-796)增加。这表明组成性表达的Flag-rpS3与内源性rpS3一起受到定量调控。因此，可以看出，Flag-rpS3蛋白的表达水平稳固增加，并且因此其不仅在野生型而且在突变型中的表达水平都会提高。因此构建了能够研究该蛋白质的生物功能的体系。本发明也可以应用于除rpS3蛋白以外的蛋白质，并且使用所述siRNA所获得的结果可以再次通过本实施例所述的方法进行确认。因此，可以消除在采用siRNA的实验中成为最大问题的脱靶效应。
工业实用性
如上所述，根据本发明的siRNA特异性抑制细胞中内源rpS3蛋白的表达而不影响标记的过表达蛋白。相比于常规的市售商品，它对rpS3的表达有优异的抑制效果，因此在经济性和效率方面是优异的。
尽管参照具体特征对本发明作了详细描述，对本领域技术人员显而易见的是该描述仅仅用于优选实施方式，而并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物来限定。
序列目录Free Text
附电子文件。
Claims (4)
1.一种用于抑制rpS3蛋白表达的siRNA，所述siRNA结合到对应于具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的rpS3mRNA的位置777到795或796到914的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的siRNA，其中所述siRNA具有15-21个核苷酸的长度。
3.权利要求1所述的siRNA，其中结合到对应于rpS3mRNA的位置777到795的核苷酸序列的siRNA由SEQ ID NO：2表示。
4.权利要求1所述的siRNA，其中结合到对应于rpS3mRNA的位置796到914的核苷酸序列的siRNA由SEQ ID NO：3表示。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2013-0014075 | 2013-02-07 | ||
| KR20130014075A KR101480523B1 (ko) | 2013-02-07 | 2013-02-07 | 세포 내 rpS3 발현 억제를 위한 siRNA |
| PCT/KR2014/001053 WO2014123384A1 (ko) | 2013-02-07 | 2014-02-07 | 세포 내 rpS3 발현 억제를 위한 siRNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105008537A true CN105008537A (zh) | 2015-10-28 |
| CN105008537B CN105008537B (zh) | 2018-01-16 |
Family
ID=51299928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201480011939.6A Active CN105008537B (zh) | 2013-02-07 | 2014-02-07 | 抑制核糖体蛋白的胞内表达的小干扰rna |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9540644B2 (zh) |
| EP (1) | EP2955228B1 (zh) |
| KR (1) | KR101480523B1 (zh) |
| CN (1) | CN105008537B (zh) |
| WO (1) | WO2014123384A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154869A (zh) * | 2018-11-08 | 2020-05-15 | 北京大学 | 肝癌诊断的生物标志物及其试剂盒 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101940061B1 (ko) * | 2017-06-02 | 2019-01-21 | 김준 | 리보솜 단백질 S3에 대한 siRNA를 포함하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050245475A1 (en) * | 2002-11-14 | 2005-11-03 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional siRNA directed against Bcl-2 |
| WO2008110624A2 (en) * | 2007-03-14 | 2008-09-18 | Universita' Degli Studi Di Milano-Bicocca | Sirna-mediated silencing of genes for treating chemotherapeutic drug-resistant epithelial tumors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100468238B1 (ko) | 2001-11-06 | 2005-01-26 | (주)바이오인스티튜트 | 리보솜 단백질 ｓ3에 대한 다클로날항체 및 이를 이용한 암진단 킷트 |
| US20090258002A1 (en) | 2005-02-01 | 2009-10-15 | Government Of The Us, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Biomarkers for Tissue Status |
| WO2008131426A1 (en) * | 2007-04-23 | 2008-10-30 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | RIBOSOMAL PROTEIN S3: A FUNCTIONAL COMPONENT OF NF-KAPPA B p65 BINDING COMPLEXES |
| KR101181728B1 (ko) * | 2009-02-06 | 2012-09-19 | 고려대학교 산학협력단 | 세포 내 ｒｐＳ3 발현 억제 ｓｉＲＮＡ |
-
2013
- 2013-02-07 KR KR20130014075A patent/KR101480523B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-02-07 US US14/766,379 patent/US9540644B2/en active Active
- 2014-02-07 EP EP14748563.5A patent/EP2955228B1/en active Active
- 2014-02-07 WO PCT/KR2014/001053 patent/WO2014123384A1/ko active Application Filing
- 2014-02-07 CN CN201480011939.6A patent/CN105008537B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050245475A1 (en) * | 2002-11-14 | 2005-11-03 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional siRNA directed against Bcl-2 |
| WO2008110624A2 (en) * | 2007-03-14 | 2008-09-18 | Universita' Degli Studi Di Milano-Bicocca | Sirna-mediated silencing of genes for treating chemotherapeutic drug-resistant epithelial tumors |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HEGDE ET AL.: "Knockdown of ribosomal protein S3 protects human cells from genotoxic stress", 《DNA REPAIR》 * |
| WAN ET AL.: "Ribosomal Protein S3:A KH Domain Subunit in NF-kB Complexes that Mediates Selective Gene Regulation", 《CELL》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154869A (zh) * | 2018-11-08 | 2020-05-15 | 北京大学 | 肝癌诊断的生物标志物及其试剂盒 |
| CN111154869B (zh) * | 2018-11-08 | 2021-09-28 | 北京大学 | 肝癌诊断的生物标志物及其试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014123384A1 (ko) | 2014-08-14 |
| CN105008537B (zh) | 2018-01-16 |
| US9540644B2 (en) | 2017-01-10 |
| EP2955228B1 (en) | 2018-05-09 |
| KR101480523B1 (ko) | 2015-01-08 |
| EP2955228A1 (en) | 2015-12-16 |
| US20160046937A1 (en) | 2016-02-18 |
| KR20140100826A (ko) | 2014-08-18 |
| EP2955228A4 (en) | 2016-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shang et al. | microRNAs in action: biogenesis, function and regulation | |
| Pitchiaya et al. | Dynamic recruitment of single RNAs to processing bodies depends on RNA functionality | |
| US8841437B2 (en) | Precursor miRNA loop-modulated target regulation | |
| CN105705640B (zh) | 抑制lncRNA用于治疗黑素瘤 | |
| EP2143792B1 (en) | Single-stranded cyclic RNA, and method of production thereof | |
| VanGompel et al. | The roles of the DAZ family in spermatogenesis: More than just translation? | |
| Shi et al. | An unusual Dicer-like1 protein fuels the RNA interference pathway in Trypanosoma brucei | |
| US20090004668A1 (en) | Pre-miRNA loop-modulated target regulation | |
| CN113633656A (zh) | 包含微小核糖核酸作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物 | |
| CN101283106A (zh) | 小细胞肺癌的诊断方法 | |
| CN101622349A (zh) | 作为治疗性干预靶标的miR-21调节的基因和途径 | |
| CN103301475A (zh) | 药物组合物和表达载体以及调节基因表达的方法和核酸分子的应用 | |
| CN101278059A (zh) | 诊断和治疗肾细胞癌的方法 | |
| EP2235180B1 (en) | Apoptosis inducing positive control for expression modulating experiments | |
| WO2005017145A1 (ja) | 機能性ｒｎａが制御する被制御遺伝子の同定・予測方法及びその利用方法 | |
| Li et al. | Small RNAs> 26 nt in length associate with AGO1 and are upregulated by nutrient deprivation in the alga Chlamydomonas | |
| CN105008537A (zh) | 抑制核糖体蛋白的胞内表达的小干扰rna | |
| CN100357436C (zh) | 抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法 | |
| Doyle et al. | Dicer proteins and their role in gene silencing pathways | |
| JP2007082436A (ja) | 機能性ＲＮＡが制御するターゲットｍＲＮＡの予測・同定方法及びその利用方法 | |
| Zhang et al. | Cloning, characterization and widespread expression analysis of testicular piRNA-like chicken RNAs | |
| Haindl et al. | Use of the giant multinucleate plasmodium of Physarum polycephalum to study RNA interference in the myxomycete | |
| KR101859029B1 (ko) | 항노화 형질전환 예쁜꼬마선충 | |
| CN112481308B (zh) | 新型性别决定基因hakai、其调控作用及其应用 | |
| Li et al. | A novel class of long small RNAs associates with Argonaute1 and is up-regulated by nutrient deprivation in the alga Chlamydomonas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |