WO2014123384A1 - 세포 내 rpS3 발현 억제를 위한 siRNA - Google Patents

세포 내 rpS3 발현 억제를 위한 siRNA Download PDF

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WO2014123384A1
WO2014123384A1 PCT/KR2014/001053 KR2014001053W WO2014123384A1 WO 2014123384 A1 WO2014123384 A1 WO 2014123384A1 KR 2014001053 W KR2014001053 W KR 2014001053W WO 2014123384 A1 WO2014123384 A1 WO 2014123384A1
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sirna
rps3
protein
present
cells
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PCT/KR2014/001053
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김준
김학동
이세현
양희웅
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고려대학교산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to siRNA (small interference RNA) that binds to a specific site that can specifically inhibit the expression of ribosomal protein present in the cell.
  • siRNA small interference RNA
  • Ribosomes are cellular organelles that link amino acids to protein synthesis and are made up of large complexes made up of many ribosomal proteins and ribosomal RNA.
  • Ribosomal protein S3 (rpS3) is a constituent of ribosomes located on the outer surface of the 40S subunit and is cross-linked to the initiation factors eIF2 and eIF3. rpS3 has a nuclear localization signal at the N-terminus, which means that it has a function in the cytoplasm and repair in the nucleus of rpS3. Many ribosomal proteins also have a second function, such as replication, transcription, RNA processing, DNA repair, and malignant transformation.
  • the rpS3 gene is located on 11q13.3-q13.5 of human chromosome 11.
  • the rpS3 gene is overexpressed in patients with colorectal cancer. Therefore, the gene product of rpS3 is overexpressed in colorectal cancer and is very likely related to other cancers.
  • studies of the 11q13.3-q13.5 region frequently involve structural abnormality, amplification of genes, multiple endocrine neoplasia type I, and breast carcinoma.
  • overexpression of human cancers such as B cell neoplastic tumors (Pogue-Geile et al., Mol. Cell. Biol., 11: 3842-3849, 1991).
  • siRNA small interference RNA
  • RNA interference refers to a short double-chain RNA consisting of a dozen to dozens of base sequences.
  • RNA interference (“RNAi”) is a post-transcriptional gene regulation method that is preserved in many eukaryotic organisms. It is a sense RNA having a sequence homologous to an mRNA of a target gene and an antisense RNA having a sequence complementary thereto.
  • double-stranded RNA double strand RNA
  • double strand RNA composed of cells, such as a phenomenon that can selectively induce degradation of the mRNA of the target gene or inhibit the expression of the target gene.
  • RNAi is induced by short (ie, less than 30 nucleotides) double-stranded RNA (“dsRNA”) molecules present in cells (Fire A. et al., Nature , 391: 806-811, 1998).
  • dsRNA double-stranded RNA
  • the siRNA is injected into cells to inhibit the gene expression of mRNA of the target gene complementary to the siRNA.
  • siRNA and targeting mRNA bind to an RNA-induced silencing complex (“RISC”) that cleaves the target mRNA.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • siRNAs are explicitly recycled like multi-conversion enzymes, where one siRNA molecule can induce cleavage of approximately 1000 mRNA molecules.
  • siRNA mediated RNAi is more effective than other current techniques used to inhibit expression of target genes.
  • siRNA is prepared by selecting a plurality of target sites per mRNA of a gene, and at least at the cellular level, a process of discovering an optimal position having excellent expression suppression efficacy by identifying their effects is required.
  • rpS3 siRNA that inhibits the expression of ribosomal protein (rpS3) As a result of intensive efforts to develop siRNA that inhibits the expression of ribosomal protein (rpS3), rpS3 siRNA that binds to a specific target site in rpS3 is produced, and the produced siRNA is a commercially available product. It was confirmed that the effect is excellent in inhibiting the expression of the endogenous rpS3 (endogenous rpS3) protein compared to, and completed the present invention.
  • the present invention provides an siRNA for the rpS3 protein that binds to the 777-795 base sequence or the 796-914 base sequence of the rpS3 mRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Figure 1 shows the results of confirming the efficacy (efficiency) of the intracellularly infiltrated rpS3 siRNA (lane 1: Scramble, lane 2: RPS3-203, lane 3: RPS3-635, lane 4: RPS3-777, lane 5: RPS3-796).
  • Figure 2 shows the results of comparing the efficacy (efficiency) of rpS3 siRNA (lane1: Control, lane 2: RPS3-777, lane 3: B company, lane 4: company S).
  • FIG. 3 shows the results of identifying stable cells expressing rpS3 not affected by siRNA (lane 1: Scramble, lane 2: RPS3-203, line 3: RPS3-635, lane 4: RPS3). -777, lane 5: RPS3-796).
  • an siRNA was produced that does not affect the overexpressed protein and has an excellent effect of specifically inhibiting the expression of rpS3 protein (endogenous rpS3) originally present in cells.
  • siRPS3-777 and 796 specifically inhibit the expression of rpS3 protein.
  • the present invention binds to a target nucleotide sequence selected from the group consisting of the 777-795 th base sequence and the 796-914 th base sequence of rpS3 mRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to thereby express the expression of the rpS3 protein. It relates to inhibitory siRNA (SEQ ID NOs: 2 and 3).
  • SiRNA according to the invention is characterized in that it has a length of 15 to 21 nucleotides.
  • RNA refers to a short double-chain RNA capable of inducing degradation of a target mRNA or inhibiting expression of a target gene through cleavage of a target mRNA.
  • SiRNAs that bind to the 777-795th and 796-914th nucleotide sequences of the rpS3 mRNA according to the present invention are represented by SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively.
  • the siRNA of the present invention is not limited to being completely complementary to the target mRNA and is not paired by mismatches (corresponding bases are not complementary) or bulges (there is no base corresponding to one chain). This may be included.
  • the nucleotide length constituting the siRNA of the present invention may be double-stranded RNA of 10 to 40 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides, more preferably 19 to 21 nucleotides, which may interfere with the activity and expression of rpS3.
  • the length of the siRNA refers to the length of the nucleotide double stranded (pairing).
  • the siRNA terminal structure of the present invention can be either blunt or cohesive, as long as the expression of the target gene can be suppressed by the RNAi effect.
  • the cohesive end structure can be a structure in which the 3 'end is overhanged and the 5' end is protruded.
  • the number of protruding nucleotides is not limited, but can be, for example, 1 to 8 nucleotides, preferably 1 to 4 nucleotides.
  • siRNA is a sequence consistent with or complementary to the rpS3 mRNA in the range capable of maintaining the expression inhibitory effect of the target gene, e.g., dTdT, UU, or double-stranded formation at one end of the protruding portion. It may include.
  • the siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure at both sides, and may be a stem loop type structure in which one terminal portion of the double chain RNA is connected by a linker RNA.
  • the length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with pairing of stem portions.
  • the siRNA of the present invention may be chemically modified by general methods known in the art to prevent rapid degradation by nucleic acid enzymes in vivo and to increase in vivo stability.
  • the hydroxyl group at the 2'-position of the rib ring of at least one nucleotide contained in the siRNA is a hydrogen atom, a halogen atom, an -O-alkyl group, an -O-acyl group or an amino group, specifically H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I or the like (wherein R is alkyl or aryl, preferably of 1 to 6 carbon atoms) Alkyl group, R 'may be alkylene, preferably alkylene having 1 to 6 carbon atoms), phosphoric acid backbone is phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphonate, phosphoramidate, or boranophosphate And the like.
  • At least one nucleotide included in the siRNA of the present invention is a nucleic acid analog form of any one of a locked nucleic acid (LNA), an unlocked nucleic acid (UNA), a morpholino, and a peptide nucleic acid (PNA). It may be characterized in that it is substituted to have.
  • LNA locked nucleic acid
  • UNA unlocked nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • Preparation of these LNA, UNA, PNA, morpholino and the like can be prepared by knowledge known in the art based on the siRNA sequence information provided in the present invention, reference can be made to existing literature (Veedu RN, Wengel J.
  • siRNA sense or antisense strands can be substituted with boranophosphate or phosphorothioate to increase resistance to nucleic acid degradation.
  • Ethylene bridge nucleic acid Ethylene bridge nucleic acid (ENA) or Locked nucleic acid (LNA)
  • Ethylene bridge nucleic acid LNA
  • LNA Locked nucleic acid
  • the siRNA of the present invention may include variants having one or more substitutions, insertions, deletions, and combinations thereof, which are functional equivalents with changes that do not degrade their activity.
  • the siRNA of the present invention may exhibit at least 80% homology with the siRNA of each corresponding SEQ ID NO, preferably 90%, more preferably may include at least 95% homology.
  • homology can be readily determined by using computer algorithms well known in the art, such as the Align or BLAST algorithms, to compare the sequence of nucleotides with corresponding portions of the target gene.
  • the siRNA of the present invention is basically a form in which two strands of RNA are paired to form a double strand, that is, a form in which siRNA is directly synthesized in vitro and then introduced into a cell through transfection. Or may be modified in a structure having a short hairpin to be used for transfection by a plasmid-based shRNA vector and a PCR-derived siRNA expression cassette.
  • siRNA direct chemical synthesis (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99: 5515-5520, 2002), synthesis using in vitro transcription (Brummelkamp TR et al., Science , 296: 550-553, 2002), Method for cleaving long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using RNaseIII family enzymes (Paul CP et al., Nature Biotechnology , 20: 505-508, 2002), and the like can be synthesized by various methods known in the art.
  • the same amount of siRNA is infiltrated into mouse fibroblasts (mouse fibroblast) by the amount of rpS3 protein present in the actual cells Western It was performed by Western blotting.
  • the quantitative change of the rpS3 protein was very large, while the siRNA of B company was generally less efficient, while the S company reduced the amount of protein by about 50 to 60%, but the siRNA of the present invention was about 80 to 90 It was confirmed that there is an effect of knock down of rpS3 protein of about% (FIG. 2).
  • SiRNA according to the present invention is characterized in that it can be easily used in human (mouse) and monkey (monkey) cells.
  • Flag-rpS3 protein increases the expression level of other mutant-types in addition to the wild-type, allowing us to study how the protein functions biologically. You can build a system.
  • siRNA according to the present invention is characterized by inhibiting the expression of the rpS3 protein inherently present, and does not affect the protein that is overexpressed by tagging.
  • the rpS3 DNA sequence was divided into three parts, which were actually synthesized into proteins, and further divided into front (5'-UTR) and rear (3'-UTR) parts. Plasmids made for overexpression of the rpS3 protein are actually made of only the parts that are made of protein. And using a program that finds a target sequence with high siRNA efficiency in the 3'-UTR, including exon-7, which is exon but not translation. (Ambion, Promega, dharmacon). In addition, the target sequence (target sequenc), which has high efficiency in common, was substituted by inserting DNA sequences of human and mouse, respectively.
  • the siRNA target sequence was determined by using a part common to each program among the predicted sequences that can obtain a high effect when targeting.
  • the siRNA of the determined sequence was synthesized by the dharmacon manufacturer.
  • Control siRNA as a control was used AccuTarget TM Negative control siRNA of Bioneer manufacturer in Korea.
  • siRPS3-777 targets 777-795 portions of rpS3 mRNA
  • siRPS3-796 targets 796-914 portions of rpS3 mRNA.
  • siRNA oligo siRNA sequence Sequence length siRPS3-777 CAG CTG TAT TCT GGA GTC T SEQ ID NO: 2 19 Mer siRPS3-796 GGA TGT TGC TCT CTA AAG A SEQ ID NO: 3 19 Mer
  • the scramble (scramble) siRNA used as a control did not show a quantitative change of the intracellular rpS3 protein, whereas RPS3-777 and 796 according to the present invention has been used It was confirmed that further suppress the expression level of rpS3 protein than RPS3-203 and 635.
  • siRNAs for many proteins are sold by various companies.
  • siRNA targeting the mouse rpS3 protein in preparation for the mouse cell line (mouse cell line) used in the experiments are also sold by reagent companies.
  • siRNA produced in Example 1 siRPS3-777
  • the same amount (200 pmole) of siRNA is injected into mouse fibroblast cells. The efficiency was compared.
  • siRNA (RPS3-777) according to the present invention is about Knock down of rpS3 protein of 80-90% was shown.
  • infiltrated rpS3 construct (DNA) tagged with lag in HT1080 cells to make rpS3 overexpressing cells, G418 (800 ug) to select only cells containing DNA. / ml) to give a single cell (single cell).
  • the cells thus obtained are called “stable cells” because they have the characteristic of stably expressing specific proteins.
  • scramble or RPS3-777 and 796 siRNA were treated.
  • the results of the siRNA treatment had no effect as a control scramble (scramble), as previously, siRNA and bone that had been previously used by siRNA in wild cell lines
  • the siRNAs according to the invention all reduced the expression level of endogenous rpS3, but decreased in 203 (RPS3-203) and 635 (RPS3-635) in the amount of rpS3 protein tagged with Flag.
  • 777 RPS3-777
  • 796 RS3-796 was found to increase rather. This suggests that Flag-rpS3, which is stably expressed, is also quantitatively controlled with endogenous rpS3.
  • the flag-rpS3 protein which stably increases the expression level, increases the expression level in other mutant-types in addition to the wild-type to study how the protein functions biologically.
  • the results obtained using siRNA can be confirmed once again by the same method as in this example, so the off-target effect which is the most problematic in the experiment using siRNA (off- target effect) can be excluded.
  • SiRNA according to the present invention is a siRNA that specifically inhibits the expression of rpS3 protein inherently present in cells and does not affect a protein that is over-tagged by tagging, and has an ability to inhibit the expression of rpS3 as compared to conventional commercial products. As it is excellent, it has an excellent effect in terms of economy and efficiency.

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Abstract

본 발명은 세포 내에 존재하는 리보솜 단백질의 발현을 특이적으로 억제하는 짧은 간섭(small interference RNA; siRNA)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포내 내재적으로 존재하는 rpS3 단백질의 발현은 특이적으로 억제시키고, 태깅(tagging)되어 과발현되는 단백질에는 영향을 미치지 않는 siRNA에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA은 종래 상업화된 상품에 비해 경제적 및 효율적 측면에서 우수한 효과가 있다.

Description

세포 내 rpS3 발현 억제를 위한 siRNA
본 발명은 세포 내에 존재하는 리보솜 단백질의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 특정부위에 결합하는 siRNA(small interference RNA)에 관한 것이다.
단백질은 세포신호로부터 기관의 작용을 위한 조직의 재편성에 이르는 모든 생리과정에 관여한다. 그래서 세포 내에서 단백질 합성은 매우 중요한 과정인데, 이러한 기능을 리보솜이 담당한다. 리보솜은 아미노산을 연결하여 단백질 합성을 담당하는 세포 소기관으로 많은 리보솜단백질들과 리보솜 RNA (ribosomal RNA)의 결합으로 만들어지는 거대한 복합체로 이루어져 있다.
rpS3(Ribosomal protein S3)는 리보솜의 구성성분으로 40S 서브유닛(subunit)의 외부 표면에 위치하며 개시인자(initiation factor) eIF2와 eIF3에 교차연결(cross-link)되어 있다. rpS3는 N-말단 부위에 핵 위치화 신호(nuclear localization signal)를 가지고 있는데, 이것은 rpS3의 세포질에서의 기능과 핵에서의 회복(repair)능을 가지고 있다는 것을 의미한다. 또한, 많은 리보솜 단백질들은 복제, 전사, RNA 프로세싱, DNA 회복(repair), 악성 형질전환(malignant transformation) 등의 두 번째 기능을 가지고 있다.
rpS3 유전자는 인간 염색체 11번의 11q13.3 - q13.5에 위치한다. 특이할 점은 rpS3 유전자는 결장직장암(colorectal cancer) 환자에서 과발현된다는 보고가 있다. 그러므로 rpS3의 유전자 산물은 대장암에서는 과발현되며, 다른 암과도 관련이 되어 있을 가능성이 매우 높다. 이 뿐 아니라 11q13.3-q13.5 부위의 연구는 자주 유전자의 구조적 이상(structural abnormality), 증폭(amplification)이 일어나고, 다발성 내분비 신생물 타입 Ⅰ(multiple endocrine neoplasia type Ⅰ), 유방암(breast carcinoma), B 세포 신생종양과 같은 인체 암의 발생시에 과발현 되는 현상이 있다 (Pogue-Geile et al., Mol. Cell. Biol., 11: 3842-3849, 1991).
siRNA(small interference RNA)는 RNAi(RNA interference)를 유도하는 물질로서 십여 개에서 수십 개 정도의 염기서열로 구성된 짧은 이중사슬의 RNA를 말한다. RNA 간섭(interference)(“RNAi”)은 다수의 진핵세포 생물체에 보존되어 있는 전사후 유전자 조절 방법으로, 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. RNAi는 세포에 존재하는 짧은(즉, 30개 미만의 뉴클레오타이드) 이본쇄 RNA(“dsRNA”) 분자에 의해 유도된다 (Fire A. et al., Nature, 391: 806-811, 1998). 이와 같이 RNAi는 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 비효율적인 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 방법을 대신하는 간단한 유전자 넉-다운(knock down) 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다. siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 표적 유전자의 mRNA의 유전자 발현을 억제하게 된다.
siRNA 및 표적화 mRNA는 표적 mRNA를 절단하는 RNA-유도된 사일런싱 컴플렉스(RNA-induced silencing complex; “RISC”)에 결합한다. siRNA는 다-전환율 효소처럼 명백하게 재활용되는데, 1개의 siRNA 분자는 대략 1000개의 mRNA 분자의 절단을 유도할 수 있다. 따라서 siRNA 매개된 RNAi는 표적 유전자의 발현을 억제하는데 이용되는 현재의 다른 기술들보다 효과적이다.
그러나, RNAi 기술은 모든 유전자의 RNA에 적용됨으로써 선택적 발현 억제가 가능할 것이라는 애초의 기대와는 달리, 근래 대규모의 RNAi 탐색 과정에서 일부 유전자는 알려지지 않은 이유로 인해 RNAi 기술이 적용되지 않음이 밝혀지고 있다 (Krueger et al., Oligonucleotides, 17:237-250, 2007). 또한, 지난 수 년 간의 데이터베이스를 바탕으로 통계 분석을 통해 siRNA 서열을 예측하는 알고리즘이 개발되고 있으나, 컴퓨터 알고리즘이 불완전하기 때문에 이를 이용하여 인 실리코(in silico) 방법으로 결정된 모든 siRNA가 실제 세포 및 생체 중에서 표적 mRNA를 효과적으로 억제하는 것은 아니며 실험을 통한 검증을 통해서만 가장 효율적인 siRNA를 결정할 수 있다는 것이 알려져 있다 (Derek et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 8:377-402, 2006).
이와 같이, 이론적으로 예상되는 siRNA가 반드시 목표로 하는 mRNA의 능력을 효과적으로 억제시키지는 않으며, 고효율의 siRNA 염기서열을 찾아야 치료 목적을 달성할 수 있기 때문에, 표적 mRNA 상에서 억제 효율이 높은 특정 타겟 부위 (hyperactive target)을 찾는 것이 매우 중요하다. 또한, 한 유전자의 mRNA 당 다수의 타겟 부위를 선정하여 siRNA를 제조하고 적어도 세포 수준에서 직접적으로 이들의 효과를 확인함으로써 발현 억제 효능이 우수한 최적 위치의 서열을 발굴하는 과정이 필요하다.
따라서, 본 발명에서는 리보솜 단백질(ribosomal protein S3; rpS3)의 발현을 억제시키는 siRNA를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, rpS3내 특정 타겟 부위에 결합하는 rpS3 siRNA를 제작하고, 상기 제작된 siRNA가 시판중인 상품에 비해 내재 rpS3 (endogenous rpS3) 단백질의 발현을 억제시키는데 효과가 탁월하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 rpS3의 발현을 특이적으로 억제시키는 siRNA를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 rpS3 mRNA의 777 내지 795번째 염기서열 또는 796 내지 914번째 염기서열에 결합하는 rpS3 단백질에 대한 siRNA를 제공한다.
도 1은 세포내 침투된 rpS3 siRNA의 효능(efficiency)을 확인한 결과를 나타낸 것이다 (lane 1: Scramble, lane 2: RPS3-203, lane 3: RPS3-635, lane 4: RPS3-777, lane 5: RPS3-796).
도 2는 rpS3 siRNA의 효능(efficiency)을 비교한 결과를 나타낸 것이다 (lane1: Control, lane 2: RPS3-777, lane 3: B사, lane 4: S사).
도 3은 siRNA에 의해 영향을 받지 않는 rpS3를 발현하는 안정한 세포(stable cell)를 확인한 결과를 나타낸 것이다 (lane 1: Scramble, lane 2: RPS3-203, line 3: RPS3-635, lane 4: RPS3-777, lane 5: RPS3-796).
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 과발현되는 단백질에는 영향을 미치지 않으며, 세포 내 원래 존재하는 rpS3 단백질 (endogenous rpS3)의 발현을 특이적으로 억제시키는 효능이 탁월한siRNA를 제작하였다.
본 발명에서는, 제작된 rpS3의 siRNA가 세포 내로 침투되었을 경우에 효율적으로 작동하는지를 확인하기 위하여, 여러 가지 동물세포를 이용하여 대조군으로 쓰이는 스크렘블(scramble) siRNA, 기존에 본 연구진이 rpS3 단백질을 타겟으로 제작한 siRPS-203, 635 및 본 발명에서 제작한 siRPS3-777 및 796 등을 각 siRNA를 세포 내로 침투시켜 실제 세포 내에 존재하는 rpS3 단백질의 양을 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 측정하였다. 그 결과, 대조군으로 사용된 스크렘블(scramble) siRNA는 세포 내 rpS3 단백질의 양적인 변화를 보이지 못한 반면에, 본 발명에서 새롭게 제작된 777 및 796 siRNA는 rpS3 단백질의 양적인 변화를 매우 크게 억제시킨다는 것을 확인하였으며, 게다가 기존에 사용되어져 오던 203 및 635 siRNA 보다 더 많은 양의 단백질을 억제시키는 것을 확인하였다 (도 1).
즉, 본 발명의 일 실시예에서 siRPS3-777 및 796이 rpS3 단백질의 발현양을 특이적으로 억제시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 rpS3 mRNA의 777 내지 795번째 염기서열 및 796 내지 914번째 염기서열로 이루어지는 군에서 선택되는 타겟 염기서열에 결합하여 rpS3 단백질의 발현을 억제하는 siRNA(서열번호 2 및 3)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 siRNA는 15 내지 21 뉴클레오타이드 길이를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, “siRNA”란 표적 mRNA의 절단을 통하여 표적 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 짧은 이중사슬의 RNA를 의미한다.
본 발명에 따른 rpS3 mRNA의 777 내지 795 번째 및 796 내지 914 번째 염기서열에 결합하는 siRNA는 각각 서열번호 2 및 3으로 표시된다.
본 발명의 siRNA는 표적 mRNA와 완전히 상보적 결합을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음) 또는 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 본 발명 siRNA를 이루는 뉴클레오타이드 길이는 rpS3의 활성 및 발현을 방해할 수 있는, 10 내지 40 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 19 내지 21 뉴클레오타이드 길이의 이중가닥 RNA일 수 있다.
본 발명에서 siRNA의 길이는 뉴클레오타이드가 이중가닥(페어링)을 이루는 길이를 말한다. 본 발명 siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단이 모두 가능하다.
점착 말단 구조는 3’ 말단 쪽이 돌출(overhang)한 구조와 5’ 말단쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하다. 돌출하는 뉴클레오타이드 수는 한정되지 않으나, 예를 들어 1 내지 8 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1 내지 4 뉴클레오타이드일 수 있다. 또한, siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서, 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 dTdT, UU, 또는 이중가닥 형성부에서 계속해서 rpS3 mRNA와 일치하는 또는 상보적인 서열 등을 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 siRNA는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막고 생체 내 안정성을 높이기 위해 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당(ribose ring)의 2’-위치의 수산기를 수소 원자, 할로겐 원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기, 구체적으로는 H, OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 수식하거나 (이 때 R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기, R’은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬렌일 수 있다), 인산 백본을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트, 또는 보라노포스페이트 등으로 수식할 수 있다.
상기 화학적 변형은, 본 발명의 siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), 몰포리노(morpholino), PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나의 핵산 유사체 형태를 가지도록 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이들 LNA, UNA, PNA, 몰포리노 등의 제조는 본 발명에서 제공하는 siRNA 서열 정보를 바탕으로 당업계에 알려진 지식에 의하여 제조할 수 있으며, 기존의 문헌을 참고할 수 있다 (Veedu RN, Wengel J., Chem Biodivers, 7(3):536-42, 2010; Demidov VV., Trends Biotechnol, 21(1):4-7, 2003; Shantanu Karkare et al., Appl Microbiol Biotechnol, 71:575-586, 2006).
siRNA의 화학적 변형의 일례로, siRNA 센스 또는 안티센스 가닥의 포스포디에스테르 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하여 핵산 분해에 대한 저항성을 높일 수 있다. 일례로, siRNA 센스 또는 안티센스 가닥의 3’ 말단 또는 5’ 말단 또는 양 말단, 바람직하게는 RNA의 종결 위치, 예컨대, 3’ 말단 돌출부(예컨대 (dT)n, n=1-5, 바람직하게는 2-4의 정수)에만 도입할 수 있다.
다른 일례로, siRNA 센스(sense) 또는 안티센스 가닥의 5’ 말단, 3’ 말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid) 혹은 LNA(Locked nucleic acid)를 도입하는 방법이 있으며, 바람직하게는 siRNA 센스 (sense) 가닥의 5’ 말단에 도입할 수 있다. 이를 통해 RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 siRNA 안정성을 증가시키고 면역 반응 및 비특이적 억제 효과를 줄일 수 있다.
본 발명의 siRNA는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 각 해당 서열번호의 siRNA와 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오타이드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA가 쌍을 이루어 이중가닥을 형성하는 완전한 형태, 즉 인 비트로(in vitro)에서 siRNA를 직접 합성한 뒤 트랜스펙션(transfection)을 통해 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 플라스미드계 shRNA 벡터와 PCR-유도 siRNA 발현 카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.
siRNA를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법 (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99:5515-5520, 2002), 인 비트로(in vitro) 전사를 이용하여 합성하는 방법 (Brummelkamp TR et al., Science, 296:550-553, 2002), 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 RNaseIII 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al., Nature Biotechnology, 20:505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 siRNA가 판매되는 siRNA와 효율적인 면에서 어떠한 차이가 있는지 확인하기 위하여, 동일한 양의 siRNA를 마우스 섬유아세포(mouse fibroblast) 내로 침투시켜 실제 세포 내에 존재하는 rpS3 단백질의 양을 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 수행하였다. 그 결과, rpS3 단백질의 양적 변화는 매우 컸으며, B 사의 siRNA는 전반적으로 효율이 적은 반면, S사의 제품은 약 50~60% 가량 단백질의 양을 줄였지만, 본 발명의 siRNA는 약 80~90% 가량의 rpS3 단백질의 넉 다운(knock down)의 효과가 있음을 확인하였다 (도 2).
본 발명에 따른 siRNA는 인간(human), 마우스(mouse) 및 원숭이(monkey) 세포까지 용이하게 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명에서는 세포 내에 원래 존재하는 rpS3 단백질만을 조절하고, 외부로부터 들어온 과발현되는 rpS3 단백질에는 영향을 주지 않는 siRNA 시스템 구축하고자, HT1080 세포에 Flag이 tagging된 rpS3 construct (DNA)를 침투시킨 뒤, DNA가 들어간 세포만을 수득하기 위해 G418 (800 ug/ml)을 처리하여 단일세포(single cell)를 얻었다.
상기 세포에서의 siRNA의 효과 및 태깅(tagging)된 단백질의 발현 정도를 확인하기 위하여, 스크렘블(scramble) 또는 RPS3-77 및 796 siRNA를 처리하여 rpS3 단백질 및 Flag-rpS3 단백질의 양 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 측정하였다. 그 결과, 대조군인 스크렘블(scramble)에 의해서는 아무 영향이 없었으며, RPS3-777 및 796에 의해서 내재성(endogenous) rpS3의 존재량이 억제하지만, 플렉(Flag)이 태깅(tagging)된 rpS3 단백질의 양이 오히려 증가되는 것을 확인하였다 (도 3).
이러한 결과로부터 안정적으로 발현 양이 증가된 Flag-rpS3 단백질이 야생형(wild-type) 외에도 다른 돌연변이종(mutant-type)도 발현 양을 증가시켜서, 이 단백질이 생물학적으로 어떤 기능을 보이는지 연구할 수 있는 시스템을 구축할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 siRNA는 내재적으로 존재하는 rpS3 단백질의 발현은 억제시키고, 태깅(tagging)되어 과발현되는 단백질에는 영향을 미치지 않는 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: siRNA에 대한 타겟 서열(target sequence) 탐구
siRNA의 타겟(target) 부위를 찾기 위해서 rpS3 DNA 서열(DNA sequence)의 타겟 서열(target sequenc)을 찾아주는 프로그램에 대입하여 결과들을 비교/분석하였다(Ambion, Promega, OligoEngine, dharmacon).
rpS3 DNA 서열(DNA sequence)을 세 부분으로 구분하여, 실제로 단백질로 합성되는 부분과 그 외에 앞 (5’-UTR), 뒤 (3’-UTR) 부분으로 나누었다. rpS3 단백질의 과발현을 위해 만들어진 플라스미드(plasmid)는 실제로 단백질로 만들어지는 부분으로만 만들어져 있다. 그리고 엑손(exon)이지만, 해독(translation)이 되지는 않는 엑손-7(exon-7)을 포함한 3’-UTR에서 siRNA 효율(siRNA efficiency)이 높은 타겟 서열(target sequenc)를 찾아주는 프로그램을 사용하였다 (Ambion, Promega, dharmacon). 또한 인간(human)과 마우스(mouse)의 DNA 서열(DNA sequence)을 각각 대입하여서 공통적으로 효율(efficiency)이 높게 나타나는 타겟 서열(target sequenc)을 조사하였다.
타겟으로 했을 경우에 높은 효과를 얻을 수 있는 예상 서열 중에서 각 프로그램에서 공통적으로 제시된 부분을 이용하여 siRNA 타겟 서열로 결정하였다. 결정된 서열의 siRNA는 dharmacon 제조사를 통해서 합성하였다. 대조군인 Control siRNA는 국내의 Bioneer 제조사의 AccuTarget™ Negative control siRNA를 사용하였다.
siRPS3-777(RPS3-777, siRNA777, 777)은 rpS3 mRNA의 777~795 부분을 타겟으로 하며, siRPS3-796(RPS3-796, siRNA796, 796)는 rpS3 mRNA의 796~914 부분을 타겟으로 하도록 합성하였다 (표 1).
표 1
siRNA oligo siRNA sequence Sequence 길이
siRPS3-777 CAG CTG TAT TCT GGA GTC T 서열번호 2 19 Mer
siRPS3-796 GGA TGT TGC TCT CTA AAG A 서열번호 3 19 Mer
실시예 2: siRNA를 통한 세포내 rpS3 발현양 조절
제작된 rpS3의 siRNA가 세포내로 침투되었을 경우에 효율적으로 작동하는지를 확인하기 위하여, 여러 가지 동물세포(mammalian cell)를 이용하여 실험하였다. 각 siRNA (200pmole)를 리포펙타민(Lipofectamine) RNAiMAX (Invitrogen) 8μl를 이용하여 역방향 트랜스펙션(reverse transfection) 방법을 통해 세포내로 침투시켜 주었다. 이때 각 동물세포의 수는 60mm 디쉬(dish)에 약 20,000개의 세포가 들어가도록 하였다. 트랜스펙션(transfection)시키고, 16시간이 지난 후에 세포를 수득(harvest)하여 실제 세포내 존재하는 rpS3 단백질의 양을 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 확인하였다.
동물세포인 HeLa(KCLB 10002)와 293T(KCLB 21573) 세포에 대조군으로 쓰이는 스크렘블(scramble) siRNA와 기존에 본 연구진이 rpS3 단백질을 타겟으로 만들었던 RPS3-203(203) 및 635(635)와 함께, 본 실시예에서 제작된 siRPS3-777 및 796을 침투시켰다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용된 스크렘블(scramble) siRNA는 세포내 rpS3단백질의 양적인 변화를 보이지 못한 반면에, 본 발명에 따른 RPS3-777 및 796은 기존에 사용되어져 오던 RPS3-203 및 635 보다 rpS3 단백질의 발현량을 더욱 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 시판중인 siRNA(mouse)와의 비교
여러 회사들에 의해서 많은 단백질들에 대한 siRNA가 판매되고 있다. 이중 인간(Human) 뿐만 아니라, 실험에 많이 사용되는 마우스 세포주(mouse cell line)를 대비하여 마우스 rpS3 단백질을 타겟으로 하는 siRNA도 시약회사에서 판매되고 있다. 본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 siRNA(siRPS3-777)가 시판중인 siRNA와 효율적인 면에서 어떠한 차이가 있는지 알아보기 위해, 동일한 양(200pmole)의 siRNA를 마우스 섬유아세포(mouse fibroblast cell)에 투입시켜서 그 효율을 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, B 사의 siRNA는 전반적으로 효율이 적은 반면, S사의 제품은 약 50~60% 가량 단백질의 양을 억제시켰지만, 본 발명에 따른 siRNA(RPS3-777)는 약 80~90% 가량의 rpS3 단백질의 넉 다운(knock down)의 효과를 나타냈다.
실시예 4: 안정적인 siRNA-resistant rpS3를 발현하는 세포의 구축
실제로 실험을 진행할 시에는 원래의 단백질 (WT)과 그 기능을 변화시킨 변형(mutant) 단백질의 비교가 매우 중요하다. 따라서 본 실시예에서는 둘 사이의 비교를 위해 태깅(tagging) 시스템을 이용해 단백질 과발현을 유도하였다. 그런데, 이때에 과발현을 시켜도 내재적으로(endogenous) 존재하는 단백질로 인해 정확한 분석이 곤란하다. 따라서 본 실시예에서는 태깅(tagging)된 단백질이 침투를 받지 못하는 siRNA 시스템을 구축하고자 하였다.
먼저 rpS3 과발현 세포를 만들기 위해서 HT1080 세포에 플랙(Flag)이 태깅(tagging)된 rpS3 컨스트럭트(construct) (DNA)를 침투시킨 뒤, DNA가 들어간 세포만을 선별(selection)하기 위해 G418 (800 ug/ml)을 처리하여 단일 세포(single cell)를 수득하였다. 이렇게 얻어진 세포는 특정 단백질을 안정적으로 발현하는 특징을 갖게 되기 때문에 “안정한 세포(stable cell)”라고 한다. 이 세포에서 siRNA의 효과 및 태깅(tagging)된 단백질의 발현 정도를 확인하기 위하여, 스크렘블(scramble) 또는 RPS3-777 및 796 siRNA를 처리하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, siRNA를 처리한 결과는 이전과 마찬가지로 대조군인 스크렘블(scramble)에 의해서는 아무 영향이 없었으며, 야생성 세포주에서 siRNA에 의해서 기존에 사용되어져 오던 siRNA 및 본 발명에 따른 siRNA가 모두 내재(endogenous) rpS3의 발현량을 감소하였지만, 플랙(Flag)이 태깅(tagging)된 rpS3 단백질의 양에 있어서, 203(RPS3-203) 및 635(RPS3-635)에서는 감소한 반면, 777(RPS3-777) 및 796(RPS3-796)에서는 오히려 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이는 안정되게 발현되는 Flag-rpS3도 내재성(endogenous) rpS3와 함께 양적인 조절을 받고 있음을 말해주는 것이다. 이러한 방법으로 안정적으로 발현 양이 증가된 Flag-rpS3 단백질이 야생성(wild-type) 외에 다른 돌연변이(mutant-type)에서도 발현 양을 증가시켜서, 이 단백질이 생물학적으로 어떤 기능을 보이는지 연구할 수 있는 시스템을 구축하였다. rpS3단백질 이외의 다른 단백질에도 적용가능하며, siRNA를 이용하여 얻은 결과를 본 실시례와 같은 방법을 통해 다시 한 번 확인할 수 있기 때문에, siRNA를 이용한 실험에서 가장 문제가 되는 오프-타겟 효과(off-target effect)를 배제할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 의한 siRNA는 세포내 내재적으로 존재하는 rpS3 단백질의 발현은 특이적으로 억제시키고, 태깅(tagging)되어 과발현되는 단백질에는 영향을 미치지 않는 siRNA로써, 종래 상업화된 상품에 비해 rpS3의 발현 억제능이 탁월하므로 경제적 및 효율적 측면에서 우수한 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다
전자파일 첨부하였음.

Claims (4)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 가지는 rpS3 mRNA의 777 내지 795번째 염기서열 또는 796 내지 914번째 염기서열에 결합하는 rpS3 단백질에 대한 siRNA.
  2. 제 1항에 있어서, 15 내지 21 뉴클레오타이드 길이를 가지는 rpS3 단백질에 대한 siRNA.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 rpS3 mRNA의 777 내지 795 번째 염기서열에 결합하는 siRNA는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 rpS3 단백질에 대한 siRNA.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 rpS3 mRNA의 796 내지 914 번째 염기서열에 결합하는 siRNA는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 rpS3 단백질에 대한 siRNA.
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