JPWO2016104612A1 - 翻訳抑制方法および翻訳抑制剤 - Google Patents
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Abstract
mRNAからタンパク質への翻訳を効率よく安定的に抑制する方法を提供する。標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズし得る第二のポリヌクレオチドとを含む標的mRNAの翻訳抑制剤および/または前記翻訳抑制剤を用いて標的mRNAからの翻訳を抑制する方法が開示されている。本発明によれば、標的mRNAからの翻訳を安定的に抑制できる。
Description
本発明は、遺伝子発現の抑制方法および抑制剤、より詳しくは、mRNAの翻訳抑制方法および翻訳抑制剤に関する。
バイオ医薬品分野が活況を呈している。現行は主にタンパク質製剤である。今後は比較的低分子で化学合成可能な核酸医薬品の伸びが期待されている(非特許文献1)。
核酸医薬品は、DNAあるいはRNA、あるいはそれらの類縁体からなる。大きさはタンパク質製剤より小さく低分子医薬品より大きい。核酸医薬品あるいはその候補物質は、長さがおよそ10から20塩基程度の1本鎖あるいは2本鎖の分子からなるものが主流である(非特許文献2)。塩基間で形成される水素結合により標的核酸、主にmRNAと2重鎖状態を呈する。mRNAの特定領域で部分的に2重鎖が生じると、1)標的mRNAが分解される、2)標的mRNAと特定の機能性タンパク質間との結合が阻害される(非特許文献2)。1)や2)の性質を利用することにより、特定遺伝子の発現を抑制することができる。つまり、核酸医薬品の有する遺伝子発現抑制活性を利用し、疾病治療に用いることができる。
遺伝子発現を抑制する方法として、アンチセンス法(非特許文献2)、リボザイム法(非特許文献3)、あるいはRNAi(small interfering RNA : siRNAを用いる)法(非特許文献4)が開発されてきた。アンチセンス法では、主に1本鎖状態にあるDNAあるいはその類縁体、例えばLNA(locked nucleic acids)を含むポリヌクレオチドやMO(morpholino oligonucleotides)からなる核酸類縁体をmRNAの翻訳開始コドン周辺領域やスプライシング部位周辺領域で2重鎖を形成するように設計する。これにより、翻訳阻害や正常なスプライシング反応を阻害することにより遺伝子発現の抑制効果を得る。しかしながら、これらアンチセンス法によっては十分な抑制効果を安定的に得ることは困難であるという問題があった。
リボザイム法とRNAi法は、主にRNAを用いて標的遺伝子のmRNAの切断と分解を誘導することにより遺伝子発現抑制を達成する。リボザイムによる遺伝子発現抑制も必ずしも十分な抑制効果が得られるものでは無かった。
RNAiメカニズムの発見をきっかけにして、生理的条件下で働く短鎖の2本鎖RNA、microRNA(miRNA)が見出された。miRNAはmRNAの3’非翻訳領域(UTR)で2重鎖を形成する。これによりdeadenylaseが活性化され、poly(A)鎖が短くなる(非特許文献5)。同時にmRNAの5’UTRに作用する翻訳開始因子複合体の活性が阻害される(非特許文献6)。結果として、翻訳反応が抑制される。siRNAは標的mRNAと完全に相補的な塩基配列からなる2重鎖を形成してmRNAの分解を誘導する。これに対してmiRNAではミスマッチを含む2重鎖を標的mRNA間と形成し、mRNAの切断や分解は生じない(非特許文献5)。
我々は、最近、母性mRNAのpoly(A)鎖ジャンクションすぐ上流に設計した25塩基からなるMOをゼブラフィッシュ初期胚やイトマキヒトデ卵中にマイクロインジェクションすることにより、poly(A)鎖の短小化あるいは切断が生じ、その結果、標的遺伝子の翻訳反応を人為的に抑制できる方法の開発に成功した(特許文献1、非特許文献7)。この方法は2重鎖が形成されるmRNA上の位置と抑制メカニズムの相違から、従来のアンチセンス法やリボザイム法あるいはRNAi法と異なる新規のアンチセンス法に属すると考えられる。しかしながら、その適用範囲は限られており、幅広い標的mRNAに対する効率のよい翻訳抑制方法が求められていた。
Mizuho Industry Focus/156、No.12(2014)
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mRNAからの翻訳を効率よく安定的に抑制する翻訳抑制剤および翻訳抑制方法を提供する。
本発明によれば、以下の発明が提供される。
(1)標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドとを含む標的mRNAの翻訳抑制剤。
(2)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである(1)の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(3)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−末端または翻訳開始コドンを含む領域にハイブリダイズすることを特徴とする(1)または(2)の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(4)前記第二のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAのポリA配列の直前にハイブリダイズすることを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(5)前記第一のポリヌクレオチドが、18〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(1)〜(4)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(6)前記第二のポリヌクレオチドが、6〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(1)〜(5)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(7)前記ポリヌクレオチドがDNA、RNA、LNAを含むポリヌクレオチドまたはモルフォリノオリゴ核酸である(1)〜(6)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(8)前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む、(1)〜(7)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(9)前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドを少なくとも1つのスペーサーを介して連結したポリヌクレオチドを、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域ならびに3’−非翻訳領域にそれぞれハイブリダイズし得るようにしたものである、(1)〜(8)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(10)前記標的mRNAが炎症反応を引き起こすタンパク質のmRNAである、(1)〜(9)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(11)前記標的mRNAがNFκBのmRNAである、(1)〜(10)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(12)(10)または(11)の標的mRNAの翻訳抑制剤を含む抗炎症剤および/または抗がん剤。
(13)(1)〜(11)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤または(12)に記載の抗炎症剤および/または抗がん剤が導入された細胞。
(14)(1)〜(11)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤および/または請求項12に記載の抗炎症剤および/または抗がん剤を含むキット。
(15)標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該標的mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドとを該標的mRNAにハイブリダイズさせる、標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(16)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである、(15)の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(17)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−末端または翻訳開始コドンを含む領域にハイブリダイズする、(15)または(16)の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(18)前記第二のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAのポリA配列の直前にハイブリダイズすることを特徴とする(15)〜(17)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(19)前記第一のポリヌクレオチドが、18〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(15)〜(18)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(20)前記第二のポリヌクレオチドが、6〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(15)〜(19)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(21)前記ポリヌクレオチドがDNA、RNA、LNAを含むポリヌクレオチドまたはモルフォリノオリゴ核酸である(15)〜(20)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(22)前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドである、(15)〜(21)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(23)前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドを少なくとも1つのスペーサーを介して連結したポリヌクレオチドを、標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域ならびに3’−非翻訳領域にそれぞれハイブリダイズし得るようにしたものを用い、(15)〜(22)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(24)前記標的mRNAが炎症反応を引き起こすタンパク質のmRNAである、(15)〜(23)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(25)前記標的mRNAがNFκBのmRNAである、(15)〜(24)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(26)(24)または(25)の標的mRNAの翻訳抑制方法を用いる炎症治療方法および/またはがん治療方法。
(27)in vitro翻訳系を用いて、翻訳阻害活性を有する物質をスクリーニングする方法。
(28)前記翻訳阻害活性を有する物質がポリヌクレオチドである(27)に記載の方法。
(29)前記ポリヌクレオチドが(1)に記載の第一のポリヌクレオチドおよび/または第二のポリヌクレオチドである(28)に記載の方法。
(30)第二のポリヌクレオチドがsiRNAである、(1)〜(11)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤、(12)の抗炎症剤および/または抗がん剤、(13)の細胞、ならびに/または(14)の抗炎症剤および/または抗がん剤を含むキット。
(31)第二のポリヌクレオチドがsiRNAである、(15)〜(25)の翻訳を抑制する方法、ならびに/または(26)の炎症治療方法および/またはがん治療方法。
(1)標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドとを含む標的mRNAの翻訳抑制剤。
(2)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである(1)の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(3)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−末端または翻訳開始コドンを含む領域にハイブリダイズすることを特徴とする(1)または(2)の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(4)前記第二のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAのポリA配列の直前にハイブリダイズすることを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(5)前記第一のポリヌクレオチドが、18〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(1)〜(4)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(6)前記第二のポリヌクレオチドが、6〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(1)〜(5)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(7)前記ポリヌクレオチドがDNA、RNA、LNAを含むポリヌクレオチドまたはモルフォリノオリゴ核酸である(1)〜(6)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(8)前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む、(1)〜(7)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(9)前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドを少なくとも1つのスペーサーを介して連結したポリヌクレオチドを、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域ならびに3’−非翻訳領域にそれぞれハイブリダイズし得るようにしたものである、(1)〜(8)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(10)前記標的mRNAが炎症反応を引き起こすタンパク質のmRNAである、(1)〜(9)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(11)前記標的mRNAがNFκBのmRNAである、(1)〜(10)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
(12)(10)または(11)の標的mRNAの翻訳抑制剤を含む抗炎症剤および/または抗がん剤。
(13)(1)〜(11)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤または(12)に記載の抗炎症剤および/または抗がん剤が導入された細胞。
(14)(1)〜(11)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤および/または請求項12に記載の抗炎症剤および/または抗がん剤を含むキット。
(15)標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該標的mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドとを該標的mRNAにハイブリダイズさせる、標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(16)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである、(15)の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(17)前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−末端または翻訳開始コドンを含む領域にハイブリダイズする、(15)または(16)の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(18)前記第二のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAのポリA配列の直前にハイブリダイズすることを特徴とする(15)〜(17)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(19)前記第一のポリヌクレオチドが、18〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(15)〜(18)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(20)前記第二のポリヌクレオチドが、6〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、(15)〜(19)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(21)前記ポリヌクレオチドがDNA、RNA、LNAを含むポリヌクレオチドまたはモルフォリノオリゴ核酸である(15)〜(20)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(22)前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドである、(15)〜(21)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(23)前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドを少なくとも1つのスペーサーを介して連結したポリヌクレオチドを、標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域ならびに3’−非翻訳領域にそれぞれハイブリダイズし得るようにしたものを用い、(15)〜(22)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(24)前記標的mRNAが炎症反応を引き起こすタンパク質のmRNAである、(15)〜(23)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(25)前記標的mRNAがNFκBのmRNAである、(15)〜(24)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
(26)(24)または(25)の標的mRNAの翻訳抑制方法を用いる炎症治療方法および/またはがん治療方法。
(27)in vitro翻訳系を用いて、翻訳阻害活性を有する物質をスクリーニングする方法。
(28)前記翻訳阻害活性を有する物質がポリヌクレオチドである(27)に記載の方法。
(29)前記ポリヌクレオチドが(1)に記載の第一のポリヌクレオチドおよび/または第二のポリヌクレオチドである(28)に記載の方法。
(30)第二のポリヌクレオチドがsiRNAである、(1)〜(11)のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤、(12)の抗炎症剤および/または抗がん剤、(13)の細胞、ならびに/または(14)の抗炎症剤および/または抗がん剤を含むキット。
(31)第二のポリヌクレオチドがsiRNAである、(15)〜(25)の翻訳を抑制する方法、ならびに/または(26)の炎症治療方法および/またはがん治療方法。
本発明によれば、標的mRNAからの翻訳を安定的に抑制できる。
本発明によれば、標的mRNAからのタンパク質の翻訳を抑制する翻訳抑制剤および翻訳抑制方法が提供される。本明細書において、標的mRNAとは、翻訳を抑制する標的となるmRNAであって、遺伝子からRNAポリメラーゼIIにより転写され、3’−末端にポリAを有するmRNAを言う。好ましくは真核生物のmRNAである。真核生物とは、例えば、ヒト、ヒトを除く動物、植物、真核微生物(例えば、酵母、カビなど)、古細菌などを含むが、mRNAの3’−末端にポリA配列を有する生物であれば本発明の対象となり得る。また、インビトロにおける培養細胞も本発明の対象となり得る。必要に応じて、これらの真核生物の全部または一部を適用対象として選択してもよい。
標的mRNAの種類は特に限定されず、タンパク質が翻訳されるmRNAであれば全て対象になりうる。例えば、疾患に関連するタンパク質を翻訳するmRNA、代謝に関連するタンパク質を翻訳するmRNA、転写・翻訳等の遺伝子発現に関与するタンパク質を翻訳するmRNA、生合成に関与するタンパク質を翻訳するmRNA、などが挙げられるがこれらに限られない。また、機能が未知のタンパク質を翻訳により発現するmRNAであってもよい。
本発明の翻訳抑制剤および翻訳抑制方法においては、標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドを使用し得る。ここでハイブリダイズする、とは、細胞内で標的mRNAと本発明のポリヌクレオチドとが水素結合により結合して二本鎖を形成することをいう。
本発明のより好ましい実施形態としては、本発明の翻訳抑制剤および翻訳抑制方法において、標的mRNAの5’−非翻訳領域(5’−UTR)を含む領域および、3’−非翻訳領域(3’−UTR)にハイブリダイズするポリヌクレオチドを使用する。
本明細書において、非翻訳領域とは、標的mRNAのタンパク質をコードする領域(翻訳領域)以外の領域をいう。すなわち、mRNA中のタンパク質をコードする領域とは、開始コドンAUGから終止コドンの一つ手前のコドンまでがタンパク質をコードする領域であり、その開始コドンの5’−上流側と終止コドンの3’−下流側であってポリA領域の手前までをそれぞれ、5’−非翻訳領域、3’−非翻訳領域という。本発明においては、標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドを使用し得る。より好ましいポリヌクレオチドの組合せとしては、5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドおよび3’−非翻訳領域(3’−UTR)にハイブリダイズするポリヌクレオチド、さらに好ましくは、5’−非翻訳領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドおよび3’−非翻訳領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、特に好ましくは、5’−非翻訳領域中5’−末端領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドおよび3’−非翻訳領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、最も好ましくは、5’−非翻訳領域中5’−末端領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドおよび3’−非翻訳領域中ポリAの直前領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを用いることができる。
本発明の翻訳阻害剤のポリヌクレオチドの1つの実施態様は、標的mRNAの5’−末端領域と、3’−末端のポリAの直前から上流の配列にハイブリダイズする配列を有するポリヌクレオチドを使用するものである。この場合、あらゆる標的mRNAに対して機械的に容易に翻訳を阻害するポリヌクレオチドを設計し、翻訳阻害剤を作成できるという利点がある。従来技術においては、アンチセンス技術により遺伝子発現を阻害するためには、アンチセンス鎖として使用する領域を設計するだけでは足りず、実験により翻訳阻害効果があるかどうかを確かめる必要があった。領域によってはアンチセンスヌクレオチドを導入しても阻害活性が出ない場合があるからである。本願発明はこの問題を解決し、あらゆるmRNAに対して翻訳抑制効果のあるアンチセンスヌクレオチドの配列を容易に設計し、その配列を有するアンチセンスヌクレオチドを用いて安定的に翻訳を阻害し得る。すなわち、本実施形態の発明は特にスクリーニング実験を必要とせず、あらゆるmRNAに対して機械的に適用可能である。
本発明の標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域を含む領域にハイブリダイズして翻訳を阻害する第一のポリヌクレオチドの長さの範囲としては、18〜30塩基が好ましく、より好ましくは18〜22塩基、さらに好ましくは19〜21塩基、最も好ましくは20塩基である。これらのうちでも、最も好ましくは、標的mRNAの5’−非翻訳領域のうちでも、5’−末端からの1〜50塩基にハイブリダイズするポリヌクレオチドが好適に用いられ、より好ましくは5’−末端から1〜30塩基、さらに好ましくは1〜22塩基、最も好ましくは1〜20塩基、にハイブリダイズするポリヌクレオチドが用いられる。
翻訳抑制の効果は、図1に記載のプラスミドを用いて図2のNFκBの転写活性化機構を利用して測定することができる。すなわち、プロモーターの上流にNFκBと結合する領域を有し、プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドを用い、NFκB転写因子のサブユニットであるRel遺伝子のmRNAを標的とするポリヌクレオチドと共に細胞に導入すると、図2において、Relタンパク質の翻訳が抑制されることから、ルシフェラーゼの転写活性化が抑制され、ルシフェラーゼ活性が低くなる現象を利用する。
本発明の標的mRNAの5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズして翻訳を阻害するポリヌクレオチドは、全てのポリヌクレオチド配列が5’−非翻訳領域のみにハイブリダイズする必要はなく、一部分でも5’−非翻訳領域にハイブリダイズすればよい。すなわち、標的mRNAの5’−非翻訳領域に一部でもハイブリダイズする限り、標的mRNAの翻訳開始部位である開始コドンなどにもハイブリダイズしてもよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドの全領域が非翻訳領域のみにハイブリダイズする必要はなく、一部が非翻訳領域にハイブリダイズすればよい。また、一部はタンパク質をコードするコーディング領域の配列とハイブリダイズしてもよい(図3参照)。
本発明の標的mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズし得る第二のポリヌクレオチドは、終止コドンの下流からポリA鎖の手前までの配列にハイブリダイズする。3’−非翻訳領域にハイブリダイズして翻訳を阻害するポリヌクレオチドの長さの範囲としては、10〜50塩基が好ましく、より好ましくは10〜30塩基、さらに好ましくは10〜20塩基、最も好ましくは10〜19塩基である。これらのうちでも、最も好ましくは、標的mRNAの3’−非翻訳領域のうちでも、3’−末端(ポリA領域の直前。AAA・・・の1つ5’−側から開始する配列。図3参照)からの10〜30塩基にハイブリダイズするポリヌクレオチドが好適に用いられる。
本発明の翻訳抑制剤または翻訳抑制方法に用いられる第一および第二のポリヌクレオチドは、核酸、アミノ酸、PEG(ポリエチレングリコール)、o-ニトロベンジル基、メチレン基、テレフタルアミド骨格、スチルベン骨格およびホーノキオールなど生理活性を有する低分子化合物などからなるスペーサーを介して連結していてもよい。第一および第二のポリヌクレオチドを連結するスペーサーの数は少なくとも1つであり、複数のスペーサーを用いて(例えば、介して)第一および第二のポリヌクレオチドを連結してもよい。スペーサーの長さは、核酸を用いる場合は、3〜50塩基が好ましく、より好ましくは3〜30塩基、さらに好ましくは3〜20塩基、最も好ましくは3〜18塩基である。スペーサーとしてアミノ酸を用いる場合は、2〜30アミノ酸が好ましく、より好ましくは、3〜20アミノ酸、最も好ましくは3〜18アミノ酸である。PEGの場合は、[-C-C-O-]を単位として2〜30量体が好ましく、より好ましくは、3〜20量体、最も好ましくは3〜18量体である。これら以外の分子からなるスペーサーを用いる場合はこれらに相当する繰り返し単位または長さを有するスペーサーを用いることが好ましい。スペーサーは、ポリヌクレオチドが標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域ならびに3’−非翻訳領域にそれぞれハイブリダイズし得るように長さと配列を設計する。
また、本発明のポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチドの代わりにヌクレオチドの類似体を含んでいても良い。例えば、LNA(locked nucleic acids)を含むポリヌクレオチドやMO(morpholino oligonucleotides)核酸からなる核酸類縁体であってもよく、上記標的mRNAの翻訳を抑制できる限り、そのヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド)が、糖、塩基および/またはリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチド類似体であっても良い。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジン又はシチジン(例えば、5−プロピニルウリジン、5−プロピニルシチジン、5−メチルシチジン、5−メチルウリジン、5−(2−アミノ)プロピルウリジン、5−ハロシチジン、5−ハロウリジン、5−メチルオキシウリジン等);8位修飾アデノシン又はグアノシン(例えば、8−ブロモグノシン等);デアザヌクレオチド(例えば7−デアザ−アデノシン等);O−及びN−アルキル化ヌクレオチド(例えば、N6−メチルアデノシン等)等が挙げられる。
また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、LNA、MO、リボヌクレオチドの2’−OHが、H、OR、R、ハロゲン原子、SH、SR、NH2、NHR、NR2、もしくはCN(ここで、Rは炭素数1−6のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す)等によって置換された2’位糖修飾、5’末端がモノリン酸化された5’末端リン酸化修飾が挙げられる。
リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。
これらのヌクレオチド類似体は、化学合成など公知の方法によりポリヌクレオチドに導入することができる。
本発明の翻訳抑制剤により翻訳が抑制される標的mRNAは、炎症反応を引き起こすタンパク質を発現するmRNAであってもよい。炎症反応を引き起こすタンパク質としては、例えば、炎症性サイトカイン(IL−12、IL−6、TNF−α)などが挙げられるがこれらに限られない。かかる炎症性サイトカイン遺伝子は、NFκB複合体からIκBが遊離することによりRelAとP50により転写が活性化されることにより、mRNAが転写され、サイトカインタンパクに翻訳される(図2参照)。従って、これらサイトカイン自身のmRNAを標的として本発明の翻訳抑制剤により翻訳を抑制してもよいが、サイトカイン遺伝子発現を促進する転写因子の全部または一部の遺伝子発現を抑制することによってもサイトカインの発現を抑制し、炎症反応を抑制することができる。かかるサイトカイン遺伝子の転写因子としては、例えば、NFκB、AP-1、STAT3が挙げられる。したがって、NFκB遺伝子の翻訳抑制剤は、抗炎症剤として使用できる。
本発明の翻訳抑制剤は炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患および症状にも適用し得る。炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患および症状としては以下のものが含まれるがこれらに限られない。
全身性炎症性応答症候群には以下が含まれる:敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷性出血、唸音、電離放射線曝露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)。
再還流傷害には以下が含まれる:後ポンプ症候群、虚血再還流傷害。
心臓血管性疾患には以下が含まれる:心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全。
感染性疾患には以下が含まれる:HIV感染/HIVニューロパシー、髄膜炎、肝炎、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎喉頭蓋炎、大腸菌O157:H7、溶血性尿毒症症候群/血栓崩壊性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、らい病、トキシックショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス壊疸、Mycobacterium結核(ヒト型結核)、Mycobacterium aviun Intracellulare(鳥型結核菌細胞内物質感染)、Pneumocystis Carinii(ニューモシスティスカリニ)肺炎、骨盤炎症性疾患、睾丸炎/精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、A型インフルエンザ、エプスタイン−バーウイルス、ウイルス関連血球貪食(hemiaphagocytic)症候群、ウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎。
産科学/婦人科学的症状には以下を含む:早産、流産、不妊症。
炎症性疾患/自己免疫疾患には以下が含まれる:リウマチ性関節炎/セロネガティブ関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、虹彩毛様体炎/ブドウ膜炎視神経炎、特発性肺繊維症、全身性脈管炎/ウェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス
睾丸炎/精管切除反転術。
睾丸炎/精管切除反転術。
アレルギー性/アトピー性疾患には以下が含まれる:喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎。
悪性疾患には以下が含まれる:ALL、AML、CML、CLL、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、新生物随伴症候群/悪性疾患の高カルシウム血症。
移植片には以下を含む:器官移植片拒絶、移植片対宿主疾患、悪液質。
先天性、これは以下を含む:嚢胞性繊維症、家族性血液食細胞性リンパ組織球増殖症、鎌状赤血球貧血。
皮膚科学的には以下を含む:乾癬、脱毛症。
神経学的な疾患には以下を含む:多発性硬化症、片頭痛。
腎臓性疾患には以下を含む:ネフローゼ症候群、血液透析、尿毒症。
毒性のあるものには以下を含む:OKT3療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法、慢性サリチレート中毒。
代謝性/特発性疾患には以下を含む:ウィルソン病、血液色素症、α−1アンチトリプシン欠損症、糖尿病、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変。
これらの炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患および症状を引き起こすタンパク質をコードするmRNAを標的として本発明の翻訳阻害剤を適用することで炎症を軽減し得、および/または治療し得る。
また、本発明の翻訳抑制剤により翻訳が抑制される標的mRNAは、腫瘍性障害を引き起こすタンパク質を発現するmRNAであってもよい。「腫瘍性障害」とは、限定されるわけではないが:白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫を含む、ヒトに見出されるあらゆる種類の癌または新生物または悪性腫瘍を意味する。本発明の抗がん剤および/またはがん治療方法の対象としてはこれらの腫瘍性障害を含み得る。
「肉腫」という用語は概して、胚性結合組織のような物質から成り、概して線維物質または均質物質に埋込まれた密に充填された細胞から構成される腫瘍を指す。本発明の抗がん剤および/またはがん治療方法によって処置できる肉腫の例は、限定されるわけではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバネシー(Abmethy’s)肉腫、脂肪肉腫、リポ肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛癌腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、B細胞の免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、T細胞の免疫芽細胞肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クップファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉肉腫、傍骨性肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細管拡張性(telangiectaltic)肉腫を含む。
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。本発明の抗がん剤および/またはがん治療方法によって処置できる黒色腫は、限定されるわけではないが、例えば末端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、S91黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫を含む。
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。本発明の抗がん剤および/またはがん治療方法によって処置できる癌腫は、限定されるわけではないが、例えば腺房癌腫、腺房細胞癌腫、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫性癌腫、副腎皮質の癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞(basal cell)癌腫、基底細胞(basocellulare)癌腫、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様(cerebriform)癌腫、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、コロイド癌腫、面皰癌腫、子宮体癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫、皮膚癌腫、円柱癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、硬癌腫、胎児性癌腫、脳様癌腫、類表皮(epiermoid)癌腫、腺様上皮癌腫、外向発育癌腫、潰瘍癌腫、線維(fibrosum)癌腫、膠様(gelatiniform)癌腫、膠様(gelatinous)癌腫、巨細胞(giant cell)癌腫、巨細胞(gigantocellulare)癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血性(hematoid)癌腫、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫、明細胞腺(hypemephroid)癌腫、小児胎児性癌腫、上皮内癌腫、表皮内癌腫、上皮内癌腫、Krompecher癌腫、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状(lenticular)癌腫、レンズ状(lenticulare)癌腫、脂肪性癌腫、リンパ上皮癌腫、髄様癌腫(carcinoma medullare)、髄様癌腫(medullary carcinoma)、黒色癌腫、軟癌腫(carcinoma molle)、粘液性癌腫、粘液分泌癌腫(carcinoma muciparum)、粘液細胞癌腫、粘液性類表皮癌、粘膜癌腫(carcinoma mucosum)、粘膜癌腫(mucous carcinoma)、粘液腫癌腫(carcinoma myxomatodes)、上咽頭癌、燕麦細胞、骨化性癌腫、類骨癌腫、乳頭状癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、有棘細胞癌腫、粥状癌腫(pultaceous carcinoma)、腎細胞癌腫、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド(solanoid)癌腫、回転楕円面細胞癌腫、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、ストリング癌腫(string carcinoma)、血管拡張性癌腫、毛細管拡張症様癌腫、移行細胞癌腫、結節状癌腫(carcinoma tuberosum)、結節状癌腫(tuberous carcinoma)、いぼ状癌腫、および絨毛癌腫を含む。
癌関連遺伝子としては、例えば、myc、src、ras、abl、bcl、rb、p53, apc、brca1、brca2、akt2、braf、hras、kras、kit、msh2、cdk4、pten、egfr、erbb2、fgfr1、fgfr3、flt3、jak2、pdgfra、plk3ca、ret遺伝子等が挙げられ、これらの遺伝子発現を抑制することにより、抗癌作用を発揮できる。
また、本発明によれば、翻訳抑制剤を導入した細胞が得られる。細胞への本発明に係るポリヌクレオチドの導入は、通常の遺伝子導入の方法が使用でき、リン酸カルシウム法、リポソーム法、電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、遺伝子銃(ジーンガン)、ウイスカー法、マイクロインジェクション法、レーザーインジェクション法、プロトプラスト法(植物、酵母)、アグロバクテリウム法(植物)、塩化リチウム法(酵母)などが用いられるがこれらに限られない。個体への導入は注射やジーンガン、外用剤などにより患部に投与することも可能である。本発明の翻訳抑制剤は、インビトロでもインビボでも使用できる。すなわち、試験管内などの培養容器中の細胞における翻訳を阻害して当該遺伝子の機能を調べたり、代謝を調節して物質生産等に利用できる。
また、本発明によれば、翻訳抑制剤を含むキットが提供される。キットとしては、上述の遺伝子導入試薬、選択試薬と本発明のポリヌクレオチドを含むキット、それらに培地を加えたキットなどが挙げられる。
また、本発明によれば、標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドとを標的mRNAにハイブリダイズさせ、標的mRNAの翻訳を抑制する方法が提供される。本発明の標的mRNAの翻訳を抑制する方法によれば、標的mRNA毎に複数のアンチセンスを作成して抑制効率を測定して最適なものを選択する手間が不要で、機械的に遺伝子発現を抑制することができる。
本発明のポリヌクレオチドは連続的に投与することも可能である。DDS技術を用いて、細胞、組織に徐々に放出して継続的に遺伝子発現を抑制することもでき、慢性病の予防、治療にも用いることができる。
本発明によれば、in vitro翻訳系(in vitro translation system)を用いて翻訳阻害活性を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。in vitro翻訳系とは、無細胞抽出液中または翻訳酵素および翻訳に必要な基質等を含む溶液中でタンパク質を翻訳するシステムである。in vitro翻訳系としては、例えば、ウサギ網状赤血球の系(Rabbit Reticulocyte Lysate System)、小麦胚芽抽出物の系(Wheat Germ Extract)、昆虫培養細胞抽出物、ヒト培養細胞抽出液(実施例8参照)、および大腸菌抽出物などの細胞抽出液を用いるものと、翻訳に関わるタンパク質などを個別に生産し、精製したものの混合物を用いるものとがあるが、本発明にはどちらのシステムも用いることができる。また、翻訳系のみでなく、同一の系で転写、翻訳までできるシステムも開発されているが、これらも本発明に使用できる。
in vitro翻訳系により翻訳阻害物質をスクリーニングするには、翻訳阻害活性を有する可能性のある候補物質を標的mRNAとともに、あるいは必要に応じて導入時期をずらしてin vitro翻訳系内に導入し、標的mRNAからのタンパク質の合成活性を測定すればよい。タンパク質の合成活性の測定は、タンパク質が酵素活性を持つものであれば、その酵素活性によりタンパク質の合成量を測定できる。酵素活性としては、例えば、ルシフェラーゼによる発光、β−ガラクトシダーゼによる基質切断による発色、発光、リン酸化酵素によるリン酸化の放射性同位元素による測定、転移酵素による基質転移活性の測定などが挙げられるがこれらに限られない。タンパク質が酵素活性を持たない場合は、例えば、SDS−PAGE等の電気泳動(ウェスタンブロット含む)、HPLC、MASS、抗体による定量(ELISA、dot blot等)などの方法により定量することができるがこれらに限られない。また、これらの定量方法を複数組み合わせて翻訳阻害活性を測定してもよい。
本発明のin vitro翻訳系により翻訳阻害物質をスクリーニングする方法において、用いられる翻訳阻害物質としては特に制限はされず、例えば、アンチセンス鎖のポリヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、抗生物質、抗体、タンパク質などが挙げられるがこれらに限られない。また、in vitro翻訳系は本発明の翻訳阻害剤の活性を測定し、より活性の高いポリヌクレオチドおよび/またはスペーサーの組合せなどをスクリーニングするためにも好適に使用し得る。
本発明の翻訳阻害剤、特にスペーサーを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいては、細胞への導入率が一定ではないため、細胞への導入工程を含まないin vitro翻訳系を用いることで、細胞への導入率の低い翻訳阻害剤についても迅速に翻訳阻害活性を測定でき、ハイスループットスクリーニングによる網羅的スクリーニングも可能になるという利点を有する。
本発明の翻訳阻害剤は、siRNAを含んでいてもよい。その場合、siRNAの配列としては、mRNAの3’―末端をターゲットとするsiRNAが好ましい。この場合、siRNAの塩基数としては、15〜40、より好ましくは19〜30、さらに好ましくは19〜25塩基、特に好ましくは19塩基であり、3’−末端にチミンのオーバーハングを付したものが好ましく用いられる。
本発明のsiRNAを含む翻訳阻害剤は、抗炎症剤および/または抗がん剤であってもよく、また、該抗炎症剤および/または該抗がん剤を含むキットの形態でもよい。また、該翻訳阻害剤を含む細胞も本発明の範囲に含まれる。
本発明の翻訳を阻害する方法には、siRNAを使用してもよく、該siRNAは標的mRNAの3’-末端の直前に結合するものが好ましく用いられる。siRNAを使用する翻訳を阻害する方法は、炎症治療および/またはがん治療方法としても用いられる。
<実施例1>
HeLa細胞は10%非動化済FBS(Gibco)、penicillin-streptomycin(Life technologies) を含むDMEM(Sigma-Aldrich)で37℃、5%CO2の条件下で培養した。このHeLa細胞に、図1に示す、転写因子RelAを標的mRNAとし、RelAの5’−非翻訳領域、開始コドン領域、ポリAの直前領域等に結合するアンチセンス核酸(LNAを含むポリヌクレオチド)を合成して導入した。
HeLa細胞は10%非動化済FBS(Gibco)、penicillin-streptomycin(Life technologies) を含むDMEM(Sigma-Aldrich)で37℃、5%CO2の条件下で培養した。このHeLa細胞に、図1に示す、転写因子RelAを標的mRNAとし、RelAの5’−非翻訳領域、開始コドン領域、ポリAの直前領域等に結合するアンチセンス核酸(LNAを含むポリヌクレオチド)を合成して導入した。
HeLa細胞へのトランスフェクションは以下のようにして行った。約1x106cells/mLとなるよう、HeLa細胞を10%非動化済FBSを含むDMEM培地に懸濁させ、0.5mLずつ24穴プレートに撒いた。24hr後、細胞が40〜50%程度の集密状態の時に、pGL4.32(図1参照。NFκBのcis-element+promoter+Luciferase gene; Promega)1μg, pGL4.75(Promega) 20ng, LNA ASO及び1μL Lipofectamine2000(Invitrogen)を100μL OptiMEM (Invitrogen)に混合したものを添加した。RelAの翻訳阻害の程度により、RelA下流のプロモーターに連結したルシフェラーゼ遺伝子の発現の変化を測定することにより、RelAの翻訳阻害活性を測定した。
ASO(アンチセンスオリゴ)は単独では3.3, 5, 10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nM, 三つの組合わせでは各3.3nMを使用した。
5’-end:RelA mRNAの5’端20mer(配列番号1:5’-TCGCGCGTCCGCGCCGGCCT-3’)を標的とするASO。
First AUG:開始コドンを含む20mer(配列番号2:5’-CTGGGGCCGGTACCTGCTTG-3’)を標的とするASO。
3’-end/19mer:RelA mRNA 3’端19mer(配列番号3:5’-GACAACGGTTCGACCGATC-3’)を標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10mer(配列番号4:5’-TCGACCGATC-3’)を標的とするASO。
5’-end:RelA mRNAの5’端20mer(配列番号1:5’-TCGCGCGTCCGCGCCGGCCT-3’)を標的とするASO。
First AUG:開始コドンを含む20mer(配列番号2:5’-CTGGGGCCGGTACCTGCTTG-3’)を標的とするASO。
3’-end/19mer:RelA mRNA 3’端19mer(配列番号3:5’-GACAACGGTTCGACCGATC-3’)を標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10mer(配列番号4:5’-TCGACCGATC-3’)を標的とするASO。
使用したASOの配列は以下のとおりである。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merのASO(配列番号12:5’-TCCGGCCGCGCCTGCGCGCT-3’)
First AUG:開始コドンを含む20merのASO(配列番号13:5’-GTTCGTCCATGGCCGGGGTC-3’)
3’-end/19mer:RelA mRNA 3’端19merのASO(配列番号14:5’-CTAGCCAGCTTGGCAACAG-3’)
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merのASO(配列番号15:5’-CTAGCCAGCT-3’)
5’-end:RelA mRNAの5’端20merのASO(配列番号12:5’-TCCGGCCGCGCCTGCGCGCT-3’)
First AUG:開始コドンを含む20merのASO(配列番号13:5’-GTTCGTCCATGGCCGGGGTC-3’)
3’-end/19mer:RelA mRNA 3’端19merのASO(配列番号14:5’-CTAGCCAGCTTGGCAACAG-3’)
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merのASO(配列番号15:5’-CTAGCCAGCT-3’)
TNF-αによる刺激は以下のようにして行った。トランスフェクション後 22hrの時点で、HeLa 細胞を培養していた培地を10% 非動化済 FBS, 20ng/mL TNF-αを含む DMEM 培地 に交換した。その後、2hrでHeLa細胞を回収した。Luciferase Assayは以下のようにして行った。回収した細胞は氷冷したPBS 0.5 mLで洗浄後、150μLのPassive Lysis Buffer(Promega)で溶解した。アッセイにはDual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いた。
その結果を図4に示す。ASO無添加の場合のルシフェラーゼ活性を100として、それに対する阻害活性を相対値で示す(以下同様)。5’−末端(図の5’-end)、開始コドン(First AUG)、3’−末端19mer(3’-end/19mer),10mer(3’-end/10mer)の1種類のヌクレオチドの場合、10nM添加しても約65%程度は活性が残存していた。しかしながら、5’+F(5’-end+First AUG)、5’+19(5’-end+3’-end/19mer)、5’+10(5’-end+3’-end/10mer)、F+19(First AUG+3’-end/19mer)、F+10(First AUG+3’-end/10mer)、5’+F+19(5’-end+First AUG+3’-end/19mer)、5’+F+10(5’-end+First AUG+3’-end/10mer)の組合せについては、39〜23%のルシフェラーゼ活性で、77〜61%の抑制効果が得られた。
<実施例2>
次にRelA mRNAの3’-endと5’-endを標的とするASOを組合せて作用させたときの抑制効果が特異的であることを証明するためにjunB mRNAの(配列番号5:5’-GCTGAGCGGCTGGACCTTGA-3’)を標的としたASO(配列番号16:5’-TCAAGGTCCAGCCGCTCAGC-3’)とRelA mRNAの3’-endを標的とするASO(配列番号15)を組合わせて作用させた時の抑制効果をLuciferase assayを用いて測定した。ASOは単独では5, 10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nMを使用した。
次にRelA mRNAの3’-endと5’-endを標的とするASOを組合せて作用させたときの抑制効果が特異的であることを証明するためにjunB mRNAの(配列番号5:5’-GCTGAGCGGCTGGACCTTGA-3’)を標的としたASO(配列番号16:5’-TCAAGGTCCAGCCGCTCAGC-3’)とRelA mRNAの3’-endを標的とするASO(配列番号15)を組合わせて作用させた時の抑制効果をLuciferase assayを用いて測定した。ASOは単独では5, 10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nMを使用した。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
junB-AS:junB mRNAの5’端20merを標的とするASO。
junB-S:junB mRNAの5’端20merを標的とするセンス鎖。
ルシフェラーゼアッセイの結果を図5に示す。junB-ASおよびjunB-Sとも3’-end/10merと組合わせても約70%の活性が残存しており非特異的な抑制ではないことがわかる。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
junB-AS:junB mRNAの5’端20merを標的とするASO。
junB-S:junB mRNAの5’端20merを標的とするセンス鎖。
ルシフェラーゼアッセイの結果を図5に示す。junB-ASおよびjunB-Sとも3’-end/10merと組合わせても約70%の活性が残存しており非特異的な抑制ではないことがわかる。
<実施例3>
RelA mRNAの3’-endと5’-endを標的とするASOを組合せて作用させたときの抑制効果が特異的であることを証明するためにRelA mRNAの5’-endを標的としたASOと3’-endを標的とするASOにミスマッチを入れたものを組合わせて作用させた時の抑制効果をLuciferase assayを用いて測定した。ASOは単独では5, 10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nMを使用した。
RelA mRNAの3’-endと5’-endを標的とするASOを組合せて作用させたときの抑制効果が特異的であることを証明するためにRelA mRNAの5’-endを標的としたASOと3’-endを標的とするASOにミスマッチを入れたものを組合わせて作用させた時の抑制効果をLuciferase assayを用いて測定した。ASOは単独では5, 10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nMを使用した。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
3’-end/10mer 3MM:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASOに3塩基ミスマッチを入れたもの(配列番号6:5’-CTCTCCATCT-3’)。
3’-end/10mer 4MM:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASOに4塩基ミスマッチを入れたもの(配列番号7:5’-TTCTCCATCT-3’)。
結果を図6に示す。ミスマッチがあると抑制効果が低下することがわかる。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
3’-end/10mer 3MM:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASOに3塩基ミスマッチを入れたもの(配列番号6:5’-CTCTCCATCT-3’)。
3’-end/10mer 4MM:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASOに4塩基ミスマッチを入れたもの(配列番号7:5’-TTCTCCATCT-3’)。
結果を図6に示す。ミスマッチがあると抑制効果が低下することがわかる。
<実施例4>
RelA mRNAの3’-endに設計したASOを8mer, 6merを短くしたときの翻訳抑制効果をLuciferase assayを用いて測定した。ASOは単独では5, 10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nMを使用した。
RelA mRNAの3’-endに設計したASOを8mer, 6merを短くしたときの翻訳抑制効果をLuciferase assayを用いて測定した。ASOは単独では5, 10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nMを使用した。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
3’-end/8mer:RelA mRNA 3’端8merを標的とするASO。
3’-end/6mer:RelA mRNA 3’端6merを標的とするASO。
結果を図7に示す。3’-endの配列が短くなるほど翻訳抑制効果は低くなることがわかる。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
3’-end/8mer:RelA mRNA 3’端8merを標的とするASO。
3’-end/6mer:RelA mRNA 3’端6merを標的とするASO。
結果を図7に示す。3’-endの配列が短くなるほど翻訳抑制効果は低くなることがわかる。
<実施例5>
RelA mRNAの5’-endに設計したASOと3’-endに設計したASOをPEG型スペーサー(ジーンデザイン社製)で一分子化したポリヌクレオチドを上記と同様にしてHeLa細胞に導入し翻訳阻害活性を調べた。
RelA mRNAの5’-endに設計したASOと3’-endに設計したASOをPEG型スペーサー(ジーンデザイン社製)で一分子化したポリヌクレオチドを上記と同様にしてHeLa細胞に導入し翻訳阻害活性を調べた。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
5’/20-Sp9-3’/10:9分子のスペーサーを挿入
5’/20-Sp18-3’/10:18分子のスペーサーを挿入
結果を図8に示す。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
5’/20-Sp9-3’/10:9分子のスペーサーを挿入
5’/20-Sp18-3’/10:18分子のスペーサーを挿入
結果を図8に示す。
<実施例6>
RelA mRNAを標的とするFull LNA ASOを導入した細胞からtotal RNAを調製し、qReal-Time PCR用いてRelA mRNAの量を定量した。全RNAは、回収した細胞からSepasol-RNA I super(Nacalai Tesque)を使用して抽出した。RT-PCRはSuperScript III transcriptase (Invitrogen)を用いて実施した。Oligo (dT) Primers(Invitrogen)を逆転写反応用のprimerとして用いた。
RelA mRNAを標的とするFull LNA ASOを導入した細胞からtotal RNAを調製し、qReal-Time PCR用いてRelA mRNAの量を定量した。全RNAは、回収した細胞からSepasol-RNA I super(Nacalai Tesque)を使用して抽出した。RT-PCRはSuperScript III transcriptase (Invitrogen)を用いて実施した。Oligo (dT) Primers(Invitrogen)を逆転写反応用のprimerとして用いた。
抽出した total RNA 100ngにOligo(dT) Primers 50ng,水を加え全量を7μLにした。混合液を65℃で5分間インキュベート後、氷上で5分静置した。氷冷後、5xFirst strand buffer 4 μL、0.1M DTT 1mL、10mM dNTP 1μL、RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega) 0.5μL、Superscript III Reverse Transcriptase 0.5μL、水を加え全量を20μLにした。反応液を50℃で60分インキュベート後、70℃で30分インキュベートし、cDNAを合成した。qReal-Time PCRは、StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Life Technologies)を使用して以下のようにして行った。cDNAにGoTaq qPCR Master Mix(Promega) 10μL、遺伝子特異的Forward Primer及びReverse Primerを5pmol加え以下のプロファイルでサイクルを開始した。PCR反応のサイクル数は50回とした。
初期熱変性 95℃5分
PCR反応(50cycle) 95℃30秒(熱変性)
55℃60秒(アニーリング)
72℃30秒(伸長)
初期熱変性 95℃5分
PCR反応(50cycle) 95℃30秒(熱変性)
55℃60秒(アニーリング)
72℃30秒(伸長)
qReal-Time PCRに用いた遺伝子特異的Primerを下に記す。
RelA Forward:5’-GCAGTTTGATGATGAAGACC-3’(配列番号8)
RelA Reverse:5’-CTGTCACTAGGCGAGTTA-3’(配列番号9)
b-Actin Forward:5’-GATAGCATTGCTTTCGTGTA-3’(配列番号10)
b-Actin Reverse:5’-TTCAACTGGTCTCAAGTCAG-3’(配列番号11)
RelA Forward:5’-GCAGTTTGATGATGAAGACC-3’(配列番号8)
RelA Reverse:5’-CTGTCACTAGGCGAGTTA-3’(配列番号9)
b-Actin Forward:5’-GATAGCATTGCTTTCGTGTA-3’(配列番号10)
b-Actin Reverse:5’-TTCAACTGGTCTCAAGTCAG-3’(配列番号11)
ASOは単独では3.3、5、10nMの濃度で使用し、二つの組み合わせでは各5nM、三つの組合わせでは各3.3nMを使用した。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
First AUG:開始コドンを含む20merを標的とするASO。
3’-end/19mer:RelA mRNA 3’端19merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
結果を図9に示す。ASO添加によるRelA mRNAの減少は3’-end/10merを除いて観察されずむしろmRNAが増加する場合が見られた。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
First AUG:開始コドンを含む20merを標的とするASO。
3’-end/19mer:RelA mRNA 3’端19merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
結果を図9に示す。ASO添加によるRelA mRNAの減少は3’-end/10merを除いて観察されずむしろmRNAが増加する場合が見られた。
<実施例7>
RelA mRNAを標的とするASOを導入した細胞からtotal RNAを調製し、実施例6と同様にしてqReal-Time PCR用いてRelA mRNAの量を定量した。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
5’/20-Sp9-3’/10:9分子のスペーサーを挿入
5’/20-Sp18-3’/10:18分子のスペーサーを挿入
結果を図10に示す。RelAのmRNAレベルはASOによっては抑制されず、むしろ相対mRNA量が増える場合もあった。
RelA mRNAを標的とするASOを導入した細胞からtotal RNAを調製し、実施例6と同様にしてqReal-Time PCR用いてRelA mRNAの量を定量した。
5’-end:RelA mRNAの5’端20merを標的とするASO。
3’-end/10mer:RelA mRNA 3’端10merを標的とするASO。
5’/20-Sp9-3’/10:9分子のスペーサーを挿入
5’/20-Sp18-3’/10:18分子のスペーサーを挿入
結果を図10に示す。RelAのmRNAレベルはASOによっては抑制されず、むしろ相対mRNA量が増える場合もあった。
<実施例8>
in vitro translation用細胞破砕液の調製
細胞破砕液の調製はRakotondrafara & Hentzeの方法に従って行った(Nature protocol 6, 563-571 (2011) An efficient factor-depleted mammalian in vitro translation system、図11参照)。10cmシャーレで培養したHeLa細胞をトリプシン処理によりはがして遠心分離により回収後、ペレットと同体積の低張液(図11)に懸濁し、4℃で45分間静置した。静置後、27Gの注射針を装着した1mLシリンジで懸濁液の出し入れを複数回行うことで細胞を破砕した。遠心後、上清を細胞破砕液とした。
in vitro translation用細胞破砕液の調製
細胞破砕液の調製はRakotondrafara & Hentzeの方法に従って行った(Nature protocol 6, 563-571 (2011) An efficient factor-depleted mammalian in vitro translation system、図11参照)。10cmシャーレで培養したHeLa細胞をトリプシン処理によりはがして遠心分離により回収後、ペレットと同体積の低張液(図11)に懸濁し、4℃で45分間静置した。静置後、27Gの注射針を装着した1mLシリンジで懸濁液の出し入れを複数回行うことで細胞を破砕した。遠心後、上清を細胞破砕液とした。
<実施例9>
in vitro translation系によるアンチオリゴの翻訳阻害試験
in vitro translationは、図12に記載の方法で行った。4 μL 細胞破砕液 (20mg protein/mL)、1 μL of translation buffer (16 mM HEPES, pH 7.6、20 mM クレアチンホスフェイト、0.1 μg/μl クレアチンキナーゼ、0.1 mM スペルミジン、100 μM 各種アミノ酸混合液)、0.4 μL of 1 M KOAc, 0.2 mL of 100 mM Mg(OAc)2, 1 μL RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega), 0.25 pmol mRNA テンプレート, アンチセンスオリゴ を含む10 μLの反応溶液を調製し、30℃で5時間翻訳反応を行った。翻訳反応終了後1×Passive Lysate Bufferを100μL加えることで反応を停止し、Luciferase assay用のサンプルとし、ルシフェラーゼ活性を測定した。
in vitro translation系によるアンチオリゴの翻訳阻害試験
in vitro translationは、図12に記載の方法で行った。4 μL 細胞破砕液 (20mg protein/mL)、1 μL of translation buffer (16 mM HEPES, pH 7.6、20 mM クレアチンホスフェイト、0.1 μg/μl クレアチンキナーゼ、0.1 mM スペルミジン、100 μM 各種アミノ酸混合液)、0.4 μL of 1 M KOAc, 0.2 mL of 100 mM Mg(OAc)2, 1 μL RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega), 0.25 pmol mRNA テンプレート, アンチセンスオリゴ を含む10 μLの反応溶液を調製し、30℃で5時間翻訳反応を行った。翻訳反応終了後1×Passive Lysate Bufferを100μL加えることで反応を停止し、Luciferase assay用のサンプルとし、ルシフェラーゼ活性を測定した。
アンチセンスオリゴはRelA mRNAの5’-末端からの20merのアンチセンスオリゴ(配列番号12)またはJunB 5’-末端からの20merのアンチセンスオリゴ(配列番号16:5’-TCAAGGTCCAGCCGCTCAGC-3’)と、3’-末端からの10merのアンチセンスオリゴ(配列番号15)をPEG型スペーサーにより連結したものを作成して用いた。PEG型スペーサーはTriethylene glycolを用いた。
翻訳の鋳型となる遺伝子は図14に記載のDNA断片(RelA 5’-UTR-Luciferase ORF-RelA 3’-UTR:配列番号17)または図15に記載のDNA断片(JunB 5’-UTR-Luciferase ORF-RelA 3’-UTR:配列番号18)をベクターpcDNA3.1+のHindIII-EcoRIサイト間にそれぞれ連結したものを全合成して作成した。合成したベクターをそれぞれRelA 3’-UTRの下流の制限酵素EcoRIサイトで切断し、T7 RNA polymeraseによりmRNAを転写させ、CAPとpolyAを常法により付加してin vitro翻訳系にアンチセンスオリゴとともに添加して翻訳活性を測定した。その結果を図14および図15に示す。
図14のグラフはルシフェラーゼの相対活性を示す。無処理を1とした場合、5’-LNA、3’-LNAではあまり翻訳阻害が起きないが、5’+3’の場合は約40%の翻訳阻害が観察された。
また、5’-末端が同じ配列のアンチセンスオリゴを用いた場合は、量依存的に翻訳が阻害された。それに対し、5’-末端が異なるJunB-SP9-RelAを用いた場合には翻訳阻害は15%しか起こらなかった。従って翻訳阻害は配列依存性があると考えられた。
次に、翻訳鋳型の5’-末端をJunB 5’-UTRにした遺伝子を上記と同様の方法で作成し、翻訳の阻害活性を測定した。その結果、JunBのアンチセンスオリゴでは量依存的に翻訳阻害が見られたが、RelA-SP9-RelAを添加しても翻訳の低下は少なかった。この実験によってもアンチセンスオリゴの配列特異性が認められた。
また、遺伝子を変えても本発明のアンチセンスオリゴは有効であることが示された。すなわち、種々の遺伝子に対して5’-末端の20塩基、3’-末端の10塩基を合成し、別々に添加するか、スペーサーにより連結して投与することで、該遺伝子の翻訳を阻害できることが示された。
以下の実施例10〜12については以下の方法で行った。
細胞培養
HeLa細胞は10%非動化済FBS(Gibco)、penicillin-streptomycin(Life technologies) を含むDMEM(Dulbecco’s-modified Eagle’s medium; Sigma)で37℃、5% CO2の条件下で培養した。
細胞培養
HeLa細胞は10%非動化済FBS(Gibco)、penicillin-streptomycin(Life technologies) を含むDMEM(Dulbecco’s-modified Eagle’s medium; Sigma)で37℃、5% CO2の条件下で培養した。
トランスフェクション
約1 x 105 cells/mLとなるよう、HeLa細胞を10%非動化済FBSを含むDMEM培地に懸濁させ、0.5 mLずつ24 穴プレートに撒いた。24 時間後、細胞が 40〜50%程度の集密状態の時にトランスフェクションを実施した。pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]プラスミド、pGL4.75[hRluc/CMV]プラスミドを用いた場合、0.8μg pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]プラスミド、20ng pGL4.75[hRluc/CMV]プラスミド、siRNAあるいはアンチセンスオリゴ、1μL Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を100μL OptiMEM (Invitrogen)に混合し、室温で20分間静置した。静置後、混合液を培養液に添加することでトランスフェクションを行った。
約1 x 105 cells/mLとなるよう、HeLa細胞を10%非動化済FBSを含むDMEM培地に懸濁させ、0.5 mLずつ24 穴プレートに撒いた。24 時間後、細胞が 40〜50%程度の集密状態の時にトランスフェクションを実施した。pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]プラスミド、pGL4.75[hRluc/CMV]プラスミドを用いた場合、0.8μg pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]プラスミド、20ng pGL4.75[hRluc/CMV]プラスミド、siRNAあるいはアンチセンスオリゴ、1μL Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を100μL OptiMEM (Invitrogen)に混合し、室温で20分間静置した。静置後、混合液を培養液に添加することでトランスフェクションを行った。
TNF-αによる刺激
pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]プラスミドをトランスフェクションした場合、NF-κB の活性化のため、トランスフェクション後22時間で、HeLa細胞を培養していた培地をアスピレーターで除去し、500μLの10%非動化済FBS、20ng/mL TNF-αを含むDMEM培地に交換した。培地を交換後、インキュベーター(37℃、5%CO2)に戻し、2時間静置した。
pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]プラスミドをトランスフェクションした場合、NF-κB の活性化のため、トランスフェクション後22時間で、HeLa細胞を培養していた培地をアスピレーターで除去し、500μLの10%非動化済FBS、20ng/mL TNF-αを含むDMEM培地に交換した。培地を交換後、インキュベーター(37℃、5%CO2)に戻し、2時間静置した。
Luciferase assay
ルシフェラーゼ活性はDual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いて以下のように測定した。トランスフェクションを行ったHeLa細胞を氷冷したPhosphate-Buffered Saline(PBS)(pH 7.4) 500μLで二回洗浄後、150μLのpassive lysis buffer (Promega)を加え室温で15 分間穏やかに撹拌した。細胞溶解液を室温、10,000gで5分間遠心分離し、得られた上清30μLをLuciferase assayに用いた。発光強度の測定にはLuminoskan luminometer (Thermo Scientific)を用いた。
ルシフェラーゼ活性はDual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いて以下のように測定した。トランスフェクションを行ったHeLa細胞を氷冷したPhosphate-Buffered Saline(PBS)(pH 7.4) 500μLで二回洗浄後、150μLのpassive lysis buffer (Promega)を加え室温で15 分間穏やかに撹拌した。細胞溶解液を室温、10,000gで5分間遠心分離し、得られた上清30μLをLuciferase assayに用いた。発光強度の測定にはLuminoskan luminometer (Thermo Scientific)を用いた。
siRNA
siRNAは、ニッポンジーンマテリアルに合成を依頼し購入した。また、siNegative(ユニバーサルネガティブコントロールsiRNA)はニッポンジーンマテリアルより既存の商品を購入した。
3’-end siRelA/antisense strand; 5’-cuagccagcuuggcaacagTT-3’(配列番号19)
3’-end siRelA/Sense strand: 5’-cuguugccaagcuggcuagTT-3’(配列番号20)
siPositive/antisense strand; 5’-ugacguaaagggauagggcTT-3’(配列番号21)
Tはオーバーハング部分。siRNAはTTをオーバーハングとするdsRNAとして細胞に導入した。
siRNAは、ニッポンジーンマテリアルに合成を依頼し購入した。また、siNegative(ユニバーサルネガティブコントロールsiRNA)はニッポンジーンマテリアルより既存の商品を購入した。
3’-end siRelA/antisense strand; 5’-cuagccagcuuggcaacagTT-3’(配列番号19)
3’-end siRelA/Sense strand: 5’-cuguugccaagcuggcuagTT-3’(配列番号20)
siPositive/antisense strand; 5’-ugacguaaagggauagggcTT-3’(配列番号21)
Tはオーバーハング部分。siRNAはTTをオーバーハングとするdsRNAとして細胞に導入した。
gapmer及びmixmer
gapmerとmixmer はジーンデザイン株式会社に合成を依頼し購入した。
3’-end gapmer 5’-CTagccagcttGG-3’(配列番号22)
5’-end LNA 5’-TCCGGCCGCGCCTGCGCGCT-3’(配列番号23)
5’-end gapmer 5’-TCCGgccgcgcctgcgCGCT-3’(配列番号24)
5’-end Mixmer 1 5’-TccgGccgCgccTgcgCgct-3’(配列番号25)
5’-end Mixmer 2 5’-tccGgccGCGCCTgcgCgct-3’(配列番号26)
大文字はLNAを示す。
gapmerとmixmer はジーンデザイン株式会社に合成を依頼し購入した。
3’-end gapmer 5’-CTagccagcttGG-3’(配列番号22)
5’-end LNA 5’-TCCGGCCGCGCCTGCGCGCT-3’(配列番号23)
5’-end gapmer 5’-TCCGgccgcgcctgcgCGCT-3’(配列番号24)
5’-end Mixmer 1 5’-TccgGccgCgccTgcgCgct-3’(配列番号25)
5’-end Mixmer 2 5’-tccGgccGCGCCTgcgCgct-3’(配列番号26)
大文字はLNAを示す。
<実施例10>
5’-end LNAと3’-end siRNAの組み合わせ
ヒトRelAmRNAの5’-末端にハイブリダイズするように設計したLNAアンチセンスオリゴ(5’-end)と3’-UTR末端にハイブリダイズするように設計したLNA ASO(3’-end/10-mer)、siRNA (3’-siR)、siPositive、siNegativeを単独、あるいは組み合わせて使用し、その翻訳抑制効果を測定した。5’-LNAを単独で使用する場合は10nM、siRNAを単独で使用する場合は40nMの濃度で使用し、二つを組合わせる場合は、5’-LNAは5nM、siRNAは20nMの濃度で使用した。ルシフェラーゼ活性はsiNegativeをトランスフェクションしたときの値を1としたときの相対値で示した。
5’-end LNAと3’-end siRNAの組み合わせ
ヒトRelAmRNAの5’-末端にハイブリダイズするように設計したLNAアンチセンスオリゴ(5’-end)と3’-UTR末端にハイブリダイズするように設計したLNA ASO(3’-end/10-mer)、siRNA (3’-siR)、siPositive、siNegativeを単独、あるいは組み合わせて使用し、その翻訳抑制効果を測定した。5’-LNAを単独で使用する場合は10nM、siRNAを単独で使用する場合は40nMの濃度で使用し、二つを組合わせる場合は、5’-LNAは5nM、siRNAは20nMの濃度で使用した。ルシフェラーゼ活性はsiNegativeをトランスフェクションしたときの値を1としたときの相対値で示した。
[結果]
5’-end LNA、3’-end siRelA、3’-end LNA、siPositiveを単独で作用させた場合、それぞれ32%、35%、40%、91% の抑制効果が得られた(図16)。組合わせて使用したときは、5’-end + 3’-end siRelAでは91%、5-end + 3’-endでは92%、3’-end + siPositive では 91%、5’-end + siNegativeでは43%翻訳抑制効果が得られた(図16)。このことから、5’-end LNAとの組合わせは3’-end LNAだけで無く、3’-end siRNAでも良いことが示唆された。以上の結果より、全てが天然核酸からなるsiRNAと全てが核酸類縁体からなるアンチセンスLNAの組み合わせでも翻訳抑制効果が得られることが明らかとなった。
5’-end LNA、3’-end siRelA、3’-end LNA、siPositiveを単独で作用させた場合、それぞれ32%、35%、40%、91% の抑制効果が得られた(図16)。組合わせて使用したときは、5’-end + 3’-end siRelAでは91%、5-end + 3’-endでは92%、3’-end + siPositive では 91%、5’-end + siNegativeでは43%翻訳抑制効果が得られた(図16)。このことから、5’-end LNAとの組合わせは3’-end LNAだけで無く、3’-end siRNAでも良いことが示唆された。以上の結果より、全てが天然核酸からなるsiRNAと全てが核酸類縁体からなるアンチセンスLNAの組み合わせでも翻訳抑制効果が得られることが明らかとなった。
<実施例11>
5’-end LNAと3’-end gapmerの組み合わせ
ヒトRelA mRNAの5’-末端にハイブリダイズするように設計した5’-end LNA (5’-L)と3’-UTR末端にハイブリダイズするように設計したLNA gapmer (3’-end gapmer/13mer; 3’-G)を単独、あるいは組み合わせて使用し、その翻訳抑制効果を測定した。5’-Lを単独で使用する場合は10nM、あるいは5nMで使用した。二つを組合わせる場合は、5’-LNAは 5nM 3’-Gは 0.1-10nMの間で使用した。ルシフェラーゼ活性はアンチセンスオリゴで処理していない細胞の値を1としたときの相対値で示した。
5’-end LNAと3’-end gapmerの組み合わせ
ヒトRelA mRNAの5’-末端にハイブリダイズするように設計した5’-end LNA (5’-L)と3’-UTR末端にハイブリダイズするように設計したLNA gapmer (3’-end gapmer/13mer; 3’-G)を単独、あるいは組み合わせて使用し、その翻訳抑制効果を測定した。5’-Lを単独で使用する場合は10nM、あるいは5nMで使用した。二つを組合わせる場合は、5’-LNAは 5nM 3’-Gは 0.1-10nMの間で使用した。ルシフェラーゼ活性はアンチセンスオリゴで処理していない細胞の値を1としたときの相対値で示した。
[結果]
3’-G を単独で 0.1、1、5、10nMでトランスフェクションさせた場合、0.1nMでは翻訳抑制効果は見られず(107%)、1nM以上ではそれぞれ、63%、90%、94%の翻訳抑制効果を得た。5nMの5’-Lとそれぞれの濃度の3’-Gを組合わせて使用したとき、0.1nMとでは62%, 1nMとでは93%、5nM、10nMとでは96%の翻訳抑制効果を得た(図17)。以上の結果から、5’-Lとの組合わせは3’-end LNAだけで無く、3’-G(gapmerタイプ)でも良いことが示唆された。さらに3’-Gを3’側アンチセンス核酸として使用することで、強力な翻訳抑制効果を低濃度(10nM以下で)で得ることができた。
3’-G を単独で 0.1、1、5、10nMでトランスフェクションさせた場合、0.1nMでは翻訳抑制効果は見られず(107%)、1nM以上ではそれぞれ、63%、90%、94%の翻訳抑制効果を得た。5nMの5’-Lとそれぞれの濃度の3’-Gを組合わせて使用したとき、0.1nMとでは62%, 1nMとでは93%、5nM、10nMとでは96%の翻訳抑制効果を得た(図17)。以上の結果から、5’-Lとの組合わせは3’-end LNAだけで無く、3’-G(gapmerタイプ)でも良いことが示唆された。さらに3’-Gを3’側アンチセンス核酸として使用することで、強力な翻訳抑制効果を低濃度(10nM以下で)で得ることができた。
<実施例12>
3’-end gapmerと5’-end gapmer、5’-mixmer1、5’-mixmer2の組み合わせ
ヒトRelA mRNAの5’-末端にハイブリダイズするように設計した gapmer(5’-G)、mixmer1 (5’-M1)、mixmer 2 (5’-M2)と3’-UTR末端にハイブリダイズするように設計したLNA gapmer (3’-G)を単独、あるいは組合わせて使用し、その翻訳抑制効果を測定した。それぞれを単独で使用する場合は5nMで使用した。二つを組み合わせる場合は、5’-側のアンチセンスオリゴは1nM、3nM、10nMで使用し3’-Gは5nMで使用した。ルシフェラーゼ活性はアンチセンスオリゴで処理していない細胞の値を1としたときの相対値で示した。
3’-end gapmerと5’-end gapmer、5’-mixmer1、5’-mixmer2の組み合わせ
ヒトRelA mRNAの5’-末端にハイブリダイズするように設計した gapmer(5’-G)、mixmer1 (5’-M1)、mixmer 2 (5’-M2)と3’-UTR末端にハイブリダイズするように設計したLNA gapmer (3’-G)を単独、あるいは組合わせて使用し、その翻訳抑制効果を測定した。それぞれを単独で使用する場合は5nMで使用した。二つを組み合わせる場合は、5’-側のアンチセンスオリゴは1nM、3nM、10nMで使用し3’-Gは5nMで使用した。ルシフェラーゼ活性はアンチセンスオリゴで処理していない細胞の値を1としたときの相対値で示した。
[結果]
3’-end gapmer (3’-G)を5nMの濃度で、トランスフェクションした。3’-G単独では5nMでは81%の翻訳抑制効果を示した。5’-end gapmer (5’-G)、5’-mixmer1 (5’-M1)、5’-mixmer2 (5’-M2)をそれぞれ1、3、10nMの濃度で3’-end gapmer (3’-G)5nMとともにトランスフェクションした。各濃度の5’-G、5’-M1、5’-M2と5nMの3’-Gを組合わせて作用させると、翻訳抑制活性を確認することができた(図18)。以上の結果から、3’-Gと5’-end gapmer (5’-G)、5’-mixmer1 (5’-M1)、あるいは5’-mixmer2 (5’-M2)の組合せでも翻訳を抑制できることが示唆された。
3’-end gapmer (3’-G)を5nMの濃度で、トランスフェクションした。3’-G単独では5nMでは81%の翻訳抑制効果を示した。5’-end gapmer (5’-G)、5’-mixmer1 (5’-M1)、5’-mixmer2 (5’-M2)をそれぞれ1、3、10nMの濃度で3’-end gapmer (3’-G)5nMとともにトランスフェクションした。各濃度の5’-G、5’-M1、5’-M2と5nMの3’-Gを組合わせて作用させると、翻訳抑制活性を確認することができた(図18)。以上の結果から、3’-Gと5’-end gapmer (5’-G)、5’-mixmer1 (5’-M1)、あるいは5’-mixmer2 (5’-M2)の組合せでも翻訳を抑制できることが示唆された。
<実施例13>
マウスRelA mRNAの5’および3’末端領域に対するアンチセンスオリゴ核酸塗布と炎症関連遺伝子の発現抑制
マウスBALB/c 7週齢の両方の耳介部に、以下の核酸類縁体をトータル10μgとトランスフェクション試薬Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific社)と混合して塗布した。1サンプル当たりマウス1匹を使用した。
1.スクランブル配列を有する核酸類縁体(コントロール、5’-GtgtAacaCgtcTataCgccCA-3’)
2.5’-RelA(5’-GgtcCcgtTcccGgccCcgC-3’(配列番号27)
3.3’-RelA(5’-CagcGtgaTaagAcatTtaT-3’(配列番号28)
4.5’-RelA+3’-RelA
5’-RelAおよび3’-RelAはマウスRelA mRNAの5’-末端および3’-末端にハイブリダイズする配列(アンチセンス)を用いた。配列の大文字はLNAである。アンチセンスオリゴ核酸としてLNAとDNAからなるmixmerを使用した。核酸は、ジーンデザイン株式会社により合成されたものを用いた。
2日後、両方の耳介部に10μlの0.15%DNFBを塗布して炎症を惹起した。2時間後、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させ耳介部を回収し、-80℃で保存した。耳介部を液体窒素で冷却し、加圧により破砕してから300μlのRIPAバッファーを添加した。次にヒスコトロンで組織の塊がなくなるまで細かく破砕し、さらに超音波発生器UR−20P(株式会社トミー精工製)を用いてpower controlを7(エッペンドルフチューブ内からサンプルが飛び出さない程度の強度)に設定し、15秒間隔で10回、超音波処理を実施した。溶液を遠心分離して、透明の溶液部分約150μlを回収し、BCA法によりタンパク質濃度を測定した。1レーン当たり15μgのタンパク質になるように10% SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、メンブレンに転写し、抗RelAタンパク質抗体(Santa Cruz, NFκB p65 (c-20) sc-732)、抗チュブリンタンパク質抗体(SIGMA, T6557)、および抗JunBタンパク質抗体(Santa Cruz, JunB (210) sc-73)を用いたウエスタンブロット法によりそれぞれのタンパク質を検出した。また、それぞれのレーンで等量のタンパク質が泳動されているのかを確認する目的で、転写後のメンブレンをポンソーSで染色した。
マウスRelA mRNAの5’および3’末端領域に対するアンチセンスオリゴ核酸塗布と炎症関連遺伝子の発現抑制
マウスBALB/c 7週齢の両方の耳介部に、以下の核酸類縁体をトータル10μgとトランスフェクション試薬Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific社)と混合して塗布した。1サンプル当たりマウス1匹を使用した。
1.スクランブル配列を有する核酸類縁体(コントロール、5’-GtgtAacaCgtcTataCgccCA-3’)
2.5’-RelA(5’-GgtcCcgtTcccGgccCcgC-3’(配列番号27)
3.3’-RelA(5’-CagcGtgaTaagAcatTtaT-3’(配列番号28)
4.5’-RelA+3’-RelA
5’-RelAおよび3’-RelAはマウスRelA mRNAの5’-末端および3’-末端にハイブリダイズする配列(アンチセンス)を用いた。配列の大文字はLNAである。アンチセンスオリゴ核酸としてLNAとDNAからなるmixmerを使用した。核酸は、ジーンデザイン株式会社により合成されたものを用いた。
2日後、両方の耳介部に10μlの0.15%DNFBを塗布して炎症を惹起した。2時間後、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させ耳介部を回収し、-80℃で保存した。耳介部を液体窒素で冷却し、加圧により破砕してから300μlのRIPAバッファーを添加した。次にヒスコトロンで組織の塊がなくなるまで細かく破砕し、さらに超音波発生器UR−20P(株式会社トミー精工製)を用いてpower controlを7(エッペンドルフチューブ内からサンプルが飛び出さない程度の強度)に設定し、15秒間隔で10回、超音波処理を実施した。溶液を遠心分離して、透明の溶液部分約150μlを回収し、BCA法によりタンパク質濃度を測定した。1レーン当たり15μgのタンパク質になるように10% SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、メンブレンに転写し、抗RelAタンパク質抗体(Santa Cruz, NFκB p65 (c-20) sc-732)、抗チュブリンタンパク質抗体(SIGMA, T6557)、および抗JunBタンパク質抗体(Santa Cruz, JunB (210) sc-73)を用いたウエスタンブロット法によりそれぞれのタンパク質を検出した。また、それぞれのレーンで等量のタンパク質が泳動されているのかを確認する目的で、転写後のメンブレンをポンソーSで染色した。
[結果]
ウエスタンブロットの結果、アンチセンスオリゴ核酸5’-RelAおよび3’-RelA、あるいはそれらを混合して使用した場合はscrambleに比較してRelAタンパク質量が顕著に低下していることがわかった(図19)。RelAをサブユニットに持つ転写因子NFκBは、JunB遺伝子のプロモーター領域のNFκB結合サイトに結合してJunB遺伝子を活性化する。その結果発現誘導されたJunBタンパク質は、転写因子AP-1として作用し、炎症反応の悪性化に寄与する。今回、マウス耳介部を用いた実験でRelA mRNAの5’および3’末端を標的とするアンチセンスオリゴ核酸を混合して塗布することにより、JunBタンパク質レベルも低下した(図19)。このことは、RelA mRNAに対するアンチセンスオリゴ核酸が炎症治療薬となりうることを示唆している。すなわち、本発明の抗炎症アンチセンスオリゴ核酸はin vitro、細胞レベルのみでなく、in vivo、個体レベルでも効果を有することが確認された。また、JunBタンパク質の発現を抑制できることから、抗癌剤としても効果があると考えられた。ウェスタンブロット後のポンソーS染色では各レーンでほぼ同じ濃度で染色され、各レーン当たりのタンパク質量が等量であることが確認された(図20)。
ウエスタンブロットの結果、アンチセンスオリゴ核酸5’-RelAおよび3’-RelA、あるいはそれらを混合して使用した場合はscrambleに比較してRelAタンパク質量が顕著に低下していることがわかった(図19)。RelAをサブユニットに持つ転写因子NFκBは、JunB遺伝子のプロモーター領域のNFκB結合サイトに結合してJunB遺伝子を活性化する。その結果発現誘導されたJunBタンパク質は、転写因子AP-1として作用し、炎症反応の悪性化に寄与する。今回、マウス耳介部を用いた実験でRelA mRNAの5’および3’末端を標的とするアンチセンスオリゴ核酸を混合して塗布することにより、JunBタンパク質レベルも低下した(図19)。このことは、RelA mRNAに対するアンチセンスオリゴ核酸が炎症治療薬となりうることを示唆している。すなわち、本発明の抗炎症アンチセンスオリゴ核酸はin vitro、細胞レベルのみでなく、in vivo、個体レベルでも効果を有することが確認された。また、JunBタンパク質の発現を抑制できることから、抗癌剤としても効果があると考えられた。ウェスタンブロット後のポンソーS染色では各レーンでほぼ同じ濃度で染色され、各レーン当たりのタンパク質量が等量であることが確認された(図20)。
本発明の標的mRNAの翻訳抑制剤および翻訳抑制方法は、試薬および/または医薬等の製造業、農業などに利用できる。
Claims (31)
- 標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドとを含む標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである請求項1の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−末端または翻訳開始コドンを含む領域にハイブリダイズすることを特徴とする請求項1または2の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記第二のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAのポリA配列の直前にハイブリダイズすることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記第一のポリヌクレオチドが、18〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、請求項1〜4のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記第二のポリヌクレオチドが、6〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、請求項1〜5のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記ポリヌクレオチドがDNA、RNA、LNAを含むポリヌクレオチドまたはモルフォリノオリゴ核酸である請求項1〜6のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドを少なくとも1つのスペーサーを介して連結したポリヌクレオチドを、標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域ならびに3’−非翻訳領域にそれぞれハイブリダイズし得るようにしたものである請求項1〜8のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記標的mRNAが炎症反応を引き起こすタンパク質のmRNAである、請求項1〜9のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 前記標的mRNAがNFκBのmRNAである、請求項1〜10のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤。
- 請求項10または11の標的mRNAの翻訳抑制剤を含む抗炎症剤および/または抗がん剤。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤または請求項12に記載の抗炎症剤および/または抗がん剤が導入された細胞。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤および/または請求項12に記載の抗炎症剤および/または抗がん剤を含むキット。
- 標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域にハイブリダイズし得る第一のポリヌクレオチドと、該mRNAの3’−非翻訳領域にハイブリダイズしうる第二のポリヌクレオチドとを標的mRNAにハイブリダイズさせる、標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−非翻訳領域を含む領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである、請求項15の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記第一のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAの5’−末端または翻訳開始コドンを含む領域にハイブリダイズする、請求項15または16の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記第二のポリヌクレオチドが、前記標的mRNAのポリA配列の直前にハイブリダイズすることを特徴とする請求項15〜17のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記第一のポリヌクレオチドが、18〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、請求項15〜18のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記第二のポリヌクレオチドが、6〜30塩基からなるポリヌクレオチドである、請求項15〜19のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記ポリヌクレオチドがDNA、RNA、LNAを含むポリヌクレオチドまたはモルフォリノオリゴ核酸である請求項15〜20のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドである、請求項15〜21のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドを少なくとも1つのスペーサーを介して連結したポリヌクレオチドを、標的mRNAの5’−非翻訳領域および/または翻訳領域ならびに3’−非翻訳領域にそれぞれハイブリダイズし得るようにしたものを用い、請求項15〜22のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記標的mRNAが炎症反応を引き起こすタンパク質のmRNAである、請求項15〜23のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 前記標的mRNAがNFκBのmRNAである、請求項15〜24のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳を抑制する方法。
- 請求項24または25の標的mRNAの翻訳抑制方法を用いる炎症治療方法および/またはがん治療方法。
- in vitro翻訳系を用いて、翻訳阻害活性を有する物質をスクリーニングする方法。
- 前記翻訳阻害活性を有する物質がポリヌクレオチドである、請求項27に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが請求項1に記載の第一のポリヌクレオチドおよび/または第二のポリヌクレオチドである請求項28に記載の方法。
- 第二のポリヌクレオチドがsiRNAである、請求項1〜11のいずれかに記載の標的mRNAの翻訳抑制剤、請求項12の抗炎症剤および/または抗がん剤、請求項13の細胞、ならびに/または請求項14の抗炎症剤および/または抗がん剤を含むキット。
- 第二のポリヌクレオチドがsiRNAである、請求項15〜25の翻訳を抑制する方法、ならびに/または請求項26の炎症治療方法および/またはがん治療方法。
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---|---|---|---|
JP2014263578 | 2014-12-25 | ||
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PCT/JP2015/086042 WO2016104612A1 (ja) | 2014-12-25 | 2015-12-24 | 翻訳抑制方法および翻訳抑制剤 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016104612A1 true JPWO2016104612A1 (ja) | 2017-10-19 |
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---|---|---|---|
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EP2735613A1 (en) * | 2011-07-22 | 2014-05-28 | Public University Corporation Yokohama City University | TECHNIQUE FOR CLEAVING OUT PART OF poly(A) CHAIN AND/OR 3'-TERMINAL SEQUENCE OF mRNA TO INHIBIT TRANSLATION REACTION |
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2015
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