JPWO2019026860A1 - 遺伝子発現制御方法および遺伝子発現制御物質 - Google Patents

Abstract

本発明は、効率よく遺伝子発現を抑制するポリヌクレオチドおよび方法を提供する。ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド；該ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、ポリヌクレオチド；該ポリヌクレオチドを有効成分とする、遺伝子発現抑制剤が開示される。

Description

本発明は、遺伝子発現の制御に関する。より詳しくは、mRNAの発現を抑制するポリヌクレオチドおよびその使用方法に関する。

従来、遺伝子発現を抑制する方法としては、アンチセンスRNA、リボザイム、RNAiなどの技術が知られている。

例えば、特許文献１に記載の発明は、mRNAのポリＡより3’-側にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてmRNAの発現を抑制するものであるが、投与量が多く必要であり、組織への毒性の問題もあった。

特許文献２に記載の発明は、特許文献１のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、mRNAの5’-非翻訳領域のアンチセンスオリゴヌクレオチドの２種類のオリゴヌクレオチドを使用してmRNAの発現を抑制するものであるが、この場合、２種類のオリゴヌクレオチドが必要であり、投与量もその分多くなり、組織へ毒性を与えるおそれもあった。

さらに、従来のLNAを用いたアンチセンスオリゴヌクレオチド（gapmer）を用いて標的のmRNAを分解して遺伝子発現を抑制する場合（特許文献３および４）に、肝臓に対する毒性があるため、医薬として用いることが困難である、という問題があった（非特許文献１）。

そこで、投与量が少なく、人体や動物への毒性が低く、効率よく遺伝子発現を抑制する薬剤および方法が求められていた。

特許第５９５３６１７号公報 ＷＯ２０１６／１０４６１２号公報 米国特許第５９６２４２５号公報 米国特許第５９５５５８９号公報

Nucleic Acids Research, 44(5), p2093-2109 (2016)

本発明は、効率よく遺伝子発現を抑制するポリヌクレオチドおよび方法を提供する。

本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
（２）ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列にハイブリダイズし得る配列のみを有するポリヌクレオチド。
（３）ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチド。
（４）ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチド。
（５）前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチド
（６）前記ヌクレオチド類似体が、LNA、２’−Ｏ−メチル化RNA、２’−Ｏ−メトキシエチル化RNA、および／またはモルフォリノ核酸である、（５）のポリヌクレオチド。
（７）前記ポリヌクレオチドが、前記ヌクレオチド類似体を両末端および中央部に有する非ギャップマーである、（５）または（６）のポリヌクレオチド。
（８）（１）〜（７）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含有する、遺伝子発現抑制剤。
（９）遺伝子発現抑制剤が、翻訳阻害剤である、（８）の遺伝子発現抑制剤。
（１０）（１）〜（７）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含有する、医薬、化粧品および／または食品。
（１１）（１）〜（７）のいずれかのポリヌクレオチドを投与することを包含する、遺伝子発現抑制方法。
（１２）遺伝子発現抑制方法が、翻訳阻害方法である、（１１）の遺伝子発現抑制方法。
（１３）医薬を製造するための、（１）〜（７）のいずれかのポリヌクレオチドの使用。

本発明によれば、副作用が少なく、効率よく、遺伝子発現を抑制できるポリヌクレオチドが得られる。

図１は、gapmerの構造の特徴と作用機序を示す図である。 図２は、レポータージーンアッセイの説明の図である。 図３は、3’RACE法を用いたヒトRelA mRNAの3’末端付近の塩基配列の決定を示す図である。 図４は、mRNAの3’末端側のプロセッシングを示す図である。 図５は、ヒトRelA mRNAの3’末端の塩基配列とgapmerの設計を示す図である。 図６は、図５に示す各gapmerを用いたHeLa細胞におけるレポータージーンアッセイ結果を示す図である。 図７は、マウスRelA mRNAの3’末端の塩基配列とgapmerの設計を示す図である。 図８は、図７に示す各gapmerを用いたNIH3T3細胞におけるレポータージーンアッセイ結果を示す図である。 図９は、ヒトRelA mRNAの3’末端の塩基配列とgapmerの設計を示す図である。 図１０は、図９に示す各gapmerを用いたHeLa細胞におけるレポータージーンアッセイ結果を示す図である。 図１１は、図９に示す各gapmerを用いたHeLa細胞におけるRelAの発現解析のための定量PCRの結果を示す図である。 図１２は、マウスを用いたASO評価のためのプロトコールを示す図である。 図１３は、ASOを尾静脈より投与したマウスの血液中の各コレステロールの値を示す図である。 図１４は、ASOを尾静脈より投与したマウスの血液中のASTおよびALTの値を示す図である。 図１５は、マウスを用いた対称型gapmerからなるASO評価のためのプロトコールを示す図である。 図１６は、マウスApoB mRNAに対する対称型gapmerの配列情報とそれらを投与したマウスの血液中の各コレステロールの値を示す図である。 図１７は、gapmerを腹腔内投与したマウスの血液中のASTおよびALTの値を示す図である。 図１８は、マウスApoB mRNAに対する対称型gapmerを投与したマウスの肝臓のApoB mRNA量の解析を示す図である。 図１９は、non-gapmer型ASOの塩基配列情報を示す図である。 図２０は、図１９のASOをトランスフェクションしたHeLa細胞におけるレポータージーンアッセイの結果を示す図である。 図２１は、図１９のASOをトランスフェクションしたHeLa細胞におけるRelAmRNA量の定量PCRによる測定を示す図である。 図２２は、ASOをHeLa細胞にトランスフェクションする手順とレポータージーンアッセイのプロトコール（A）および結果（B）を示す図である。 図２３は、ASO -7/+7をトランスフェクションしたHeLa細胞内のRelA mRNAの局在を示す図である。 図２４は、ASO 1,2,8,13,14をトランスフェクションしたHeLa細胞内のRelA mRNAの局在を示す図である。 図２５は、gap P/CをトランスフェクションしたHeLa細胞内のRelA mRNAの局在を示す図である。 図２６は、NTSをトランスフェクションしたHeLa細胞内のRelA mRNAの局在を示す図である。 図２７は、未処理のHeLa細胞内のRelA mRNAの局在を示す図である。 図２８は、ASO -7/+7をトランスフェクションしたHeLa細胞内のRelA mRNAの局在とASO -7/+7の関係を示す図である。 図２９は、3’-gapAcsl1、3’-non-gapAcsl1、SGgapAcsl1およびSGnon-gapAcsl1のいずれかを投与したマウスの肝臓中のAcsl1 mRNA量を示す図である。 図３０は、3’-gapAcsl1、3’-non-gapAcsl1、SGgapAcsl1およびSGnon-gapAcsl1のいずれかを投与した個々のマウスの血清中のAST値およびALT値の推移を示す図である。 図３１は、3’-gapAcsl1、3’-non-gapAcsl1、SGgapAcsl1およびSGnon-gapAcsl1のいずれかを投与したマウスの血清中のAST値およびALT値の推移の平均を示す図である。

本発明によれば、標的mRNAからのタンパク質の翻訳を抑制する翻訳抑制剤および翻訳抑制方法が提供される。本明細書において、標的mRNAとは、翻訳を抑制する標的となるmRNAであって、遺伝子からＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写され、3’-末端にポリＡを付加されるために切断される前のmRNAを言う。好ましくは真核生物のmRNAである。真核生物とは、例えば、ヒト、ヒトを除く動物、植物、真核微生物（例えば、酵母、カビなど）、古細菌などを含むが、mRNAの3’-末端にポリＡ配列を有する生物であれば本発明の対象となり得る。また、インビトロにおける培養細胞も本発明の対象となり得る。必要に応じて、これらの真核生物の全部または一部を適用対象として選択してもよい。

本明細書において、「mRNAの3’-末端」とは、転写後、ポリAが付加されるために、切断されたmRNAの3’-末端の塩基をいう。すなわち、mRNAは転写後、ポリＡが付加されるために3’-非翻訳領域で切断されるが、切断され、ポリＡが付加されるmRNAの3’-末端の塩基を「mRNAの3’-末端」という。

標的mRNAの種類は特に限定されず、タンパク質が翻訳されるmRNAであれば全て対象になりうる。例えば、疾患に関連するタンパク質を翻訳するmRNA、代謝に関連するタンパク質を翻訳するmRNA、転写・翻訳等の遺伝子発現に関与するタンパク質を翻訳するmRNA、生合成に関与するタンパク質を翻訳するmRNA、細胞周期、増殖関連タンパク質を翻訳するmRNAなどが挙げられるがこれらに限られない。また、機能が未知のタンパク質を翻訳により発現するmRNAであってもよい。

本発明の翻訳抑制剤および翻訳抑制方法においては、標的mRNAの3’-末端を中心として、その両方向に５〜９塩基の連続した配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる。この配列を3’-末端を跨ぐ配列ともいう。すなわち、本発明は、mRNAの3’-末端切断前の3’-末端を跨ぐ配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いることにより効率よく標的mRNAの翻訳を抑制することができる。ここでハイブリダイズする、とは、細胞内において標的mRNAと本発明のポリヌクレオチドとが水素結合により結合して二本鎖を形成することをいう。

本発明のより好ましい実施形態としては、本発明の翻訳抑制剤および翻訳抑制方法において、標的mRNAの3’-末端を跨ぐ配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを使用する。この場合、3’-末端の切断点から5’-側に５〜９塩基（切断点の3’-末端（「mRNAの3’-末端」）の塩基を含む）、3’-末端の切断点の3’-側に５〜９塩基（切断点の5’-末端の塩基を含むが、上記切断点の3’-末端の塩基（「mRNAの3’-末端」）を含まない）の合計、１０〜１８塩基の標的mRNA配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いることが好ましい。要は、標的配列に特異的に結合してmRNAの3’-末端の切断に影響を与え、翻訳を抑制できればよい。より好ましくは、3’-末端の切断点から5’-側に６〜８塩基、3’-末端の切断点の3’-側に６〜８塩基、最も好ましくは、3’-末端の切断点から5’-側に７塩基、3’-末端の切断点の3’-側に７塩基であるが、これらに限られない。また、3’-末端を跨ぐ配列にハイブリダイズして翻訳を抑制できる限り、3’-末端を跨ぐ配列のみではなく、該配列を含む配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いてもよい。ただし、RNaseHによるmRNAの分解を誘導しないポリヌクレオチドであることが好ましい。

本発明の翻訳阻害剤のポリヌクレオチドの１つの実施態様は、標的mRNAの3’-末端を跨ぐ配列にハイブリダイズする配列を有するポリヌクレオチドを使用するものである。この場合、あらゆる標的mRNAに対して機械的に容易に翻訳を阻害するポリヌクレオチドを設計し、翻訳阻害剤を作成できるという利点がある。従来技術においては、アンチセンス技術により遺伝子発現を阻害するためには、アンチセンス鎖として使用する領域を設計するだけでは足りず、実験により翻訳阻害効果があるかどうかを確かめる必要があった。領域によってはアンチセンスヌクレオチド（ASO）を導入しても阻害活性が出ない場合があるからである。本願発明はこの問題を解決し、あらゆるmRNAに対して翻訳抑制効果のあるアンチセンスヌクレオチドの配列を容易に設計し、その配列を有するアンチセンスヌクレオチドを用いて安定的に翻訳を阻害し得る。すなわち、本実施形態の発明は特にスクリーニング実験を必要とせず、あらゆるmRNAに対して機械的に適用可能である。

本発明においては、ギャップマー（gapmer）および非ギャップマー（nongapmer）を使用することができる。ギャップマー（gapmer）とは、図１に示すように、ヌクレオチド類似体（例えば、糖が修飾されたヌクレオチド類似体（例えばLNA））を両末端の１〜３塩基（各末端の塩基数は異なっていてもよい）に有し、残りの配列がDNAからなるポリヌクレオチドをいう。非ギャップマー（nongapmer）とは、例えば、ヌクレオチド類似体（例えば、糖が修飾されたヌクレオチド類似体（例えばLNA））を両末端の１〜３塩基（各末端の塩基数は異なっていてもよい）および中央部の１〜３塩基に有し、残りの配列がDNAからなるポリヌクレオチドである。gapmerは図１に示すように、標的mRNAとハイブリダイズして二重鎖を形成し、RNaseHによる分解により標的mRNAの発現を抑制するものである。しかしながら、後に述べるように、従来のgapmerの場合は肝毒性が出るという問題がある。本発明のASOの設計方法により設計した場合は、gapmer、nongapmerとも肝毒性がほとんど出ないという特徴がある。

翻訳抑制の効果は、図２に記載のプラスミドを用いて図２のNF-κBの転写活性化機構を利用して測定することができる。すなわち、プロモーターの上流にNF-κBと結合する領域を有し、プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドを用い、NF-κB転写因子のサブユニットであるRelA遺伝子のmRNAを標的とするポリヌクレオチドと共に細胞に導入すると、図２において、RelAタンパク質の翻訳が抑制されることから、ルシフェラーゼの転写活性化が抑制され、ルシフェラーゼ活性が低くなる現象を利用する。

本発明の標的mRNAの3’-末端を跨ぐ配列にハイブリダイズして翻訳を阻害するポリヌクレオチドは、全てのポリヌクレオチド配列が3’-末端を跨ぐ配列のみにハイブリダイズする必要はなく、一部分でも3’-末端を跨ぐ配列にハイブリダイズすればよい。すなわち、標的mRNAの3’-末端を跨ぐ配列に一部でもハイブリダイズする限り、mRNAの翻訳阻害が起きると考えられる。

また、本発明のポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチドの代わりにヌクレオチドの類似体を含んでいても良い。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、LNA（locked nucleic acids）を含むポリヌクレオチド、モルフォリノ核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、モルフォリノオリゴヌクレオチド（MO：morpholino oligonucleotides））のようなヌクレオチドの類似体を含むポリヌクレオチドであってもよく、上記標的mRNAの翻訳を抑制できる限り、そのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基および／またはリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチド類似体であっても良い。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジン又はシチジン（例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等）；８位修飾アデノシン又はグアノシン（例えば、８−ブロモグノシン等）；デアザヌクレオチド（例えば７−デアザ−アデノシン等）；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン等）等が挙げられる。

また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、LNA（2’,4’−BNA（2’,4’−Bridged nucleic acids）ともいう）、リボヌクレオチドの２’位のＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ＯＲ’ＯＲ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ₂、ＮＨＲ、ＮＲ₂、もしくはＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１−６のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示し、Ｒ’は−（ＣＨ_２）_ｍ−（ｍは、１〜３の整数である）を示す）等によって置換された２’位糖修飾、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾、核酸のリボースまたはデオキシリボースの代わりにモルフォリン環を含むモルフォリノ核酸等が挙げられる。２’位糖修飾には、例えば、Ｏ−メチル（修飾核酸は２’−Ｏ−メチル化RNA、２’−Ｏ−メチル（Me）とも称される）またはＯ−メトキシエチル（修飾核酸は２’−Ｏ−メトキシエチル化RNA、２’-MOEとも称される）が好ましく用いられる。

リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。

これらのヌクレオチド類似体は、化学合成など公知の方法によりポリヌクレオチドに導入することができる。

本発明の翻訳抑制剤により翻訳が抑制される標的mRNAは、炎症反応を引き起こすタンパク質を発現するmRNAであってもよい。炎症反応を引き起こすタンパク質としては、例えば、炎症性サイトカイン（IL-12、IL-6、TNF-α）などが挙げられるがこれらに限られない。かかる炎症性サイトカイン遺伝子は、NF-κB複合体からIκBが遊離することによりRelAとP50により転写が活性化されることにより、mRNAが転写され、サイトカインタンパクに翻訳される。従って、これらサイトカイン自身のmRNAを標的として本発明の翻訳抑制剤により翻訳を抑制してもよいが、サイトカイン遺伝子発現を促進する転写因子の全部または一部の遺伝子発現を抑制することによってもサイトカインの発現を抑制し、炎症反応を抑制することができる。かかるサイトカイン遺伝子の転写因子としては、例えば、NF-κB、AP-1、STAT3が挙げられる。したがって、NF-κB遺伝子の翻訳抑制剤は、抗炎症剤として使用できる。

本発明の翻訳抑制剤は炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患および症状にも適用し得る。炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患および症状としては以下のものが含まれるがこれらに限られない。

全身性炎症性応答症候群には以下が含まれる：敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷性出血、唸音、電離放射線曝露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）。

再還流傷害には以下が含まれる：後ポンプ症候群、虚血再還流傷害。

心臓血管性疾患には以下が含まれる：心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全。

感染性疾患には以下が含まれる：ＨＩＶ感染／ＨＩＶニューロパシー、髄膜炎、肝炎、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎喉頭蓋炎、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、溶血性尿毒症症候群／血栓崩壊性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、らい病、トキシックショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス壊疸、Mycobacterium結核（ヒト型結核）、Mycobacterium aviun Intracellulare（鳥型結核菌細胞内物質感染）、Pneumocystis Carinii（ニューモシスティスカリニ）肺炎、骨盤炎症性疾患、睾丸炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、Ａ型インフルエンザ、エプスタイン−バーウイルス、ウイルス関連血球貪食(hemiaphagocytic)症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎。

産科学／婦人科学的症状には以下を含む：早産、流産、不妊症。

炎症性疾患／自己免疫疾患には以下が含まれる：リウマチ性関節炎／セロネガティブ関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎視神経炎、特発性肺繊維症、全身性脈管炎／ウェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス睾丸炎／精管切除反転術。

アレルギー性／アトピー性疾患には以下が含まれる：喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎。

悪性疾患には以下が含まれる：ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＣＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、新生物随伴症候群／悪性疾患の高カルシウム血症。

移植片には以下を含む：器官移植片拒絶、移植片対宿主疾患、悪液質。

先天性、これは以下を含む：嚢胞性繊維症、家族性血液食細胞性リンパ組織球増殖症、鎌状赤血球貧血。

皮膚科学的には以下を含む：乾癬、脱毛症。

神経学的な疾患には以下を含む：多発性硬化症、片頭痛。

腎臓性疾患には以下を含む：ネフローゼ症候群、血液透析、尿毒症。

毒性のあるものには以下を含む：ＯＫＴ３療法、抗ＣＤ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法、慢性サリチレート中毒。

代謝性／特発性疾患には以下を含む：ウィルソン病、血液色素症、α−１アンチトリプシン欠損症、糖尿病、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変。

これらの炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患および症状を引き起こすタンパク質をコードするmRNAを標的として本発明の翻訳阻害剤を適用することで炎症を軽減し得、および／または治療し得る。

また、本発明の翻訳抑制剤により翻訳が抑制される標的mRNAは、腫瘍性障害を引き起こすタンパク質を発現するmRNAであってもよい。「腫瘍性障害」とは、限定されるわけではないが：白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫を含む、ヒトに見出されるあらゆる種類の癌または新生物または悪性腫瘍を意味する。本発明の抗がん剤および／またはがん治療方法の対象としてはこれらの腫瘍性障害を含み得る。

「肉腫」という用語は概して、胚性結合組織のような物質から成り、概して線維物質または均質物質に埋込まれた密に充填された細胞から構成される腫瘍を指す。本発明の抗がん剤および／またはがん治療方法によって処置できる肉腫の例は、限定されるわけではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバネシー（Abmethy’s）肉腫、脂肪肉腫、リポ肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛癌腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽細胞肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クップファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉肉腫、傍骨性肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細管拡張性（telangiectaltic）肉腫を含む。

「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。本発明の抗がん剤および／またはがん治療方法によって処置できる黒色腫は、限定されるわけではないが、例えば末端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫を含む。

「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。本発明の抗がん剤および／またはがん治療方法によって処置できる癌腫は、限定されるわけではないが、例えば腺房癌腫、腺房細胞癌腫、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫性癌腫、副腎皮質の癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞（basal cell）癌腫、基底細胞（basocellulare）癌腫、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様（cerebriform）癌腫、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、コロイド癌腫、面皰癌腫、子宮体癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫、皮膚癌腫、円柱癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、硬癌腫、胎児性癌腫、脳様癌腫、類表皮（epiermoid）癌腫、腺様上皮癌腫、外向発育癌腫、潰瘍癌腫、線維（fibrosum）癌腫、膠様（gelatiniform）癌腫、膠様（gelatinous）癌腫、巨細胞（giant cell）癌腫、巨細胞（gigantocellulare）癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血性（hematoid）癌腫、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫、明細胞腺（hypemephroid）癌腫、小児胎児性癌腫、上皮内癌腫、表皮内癌腫、上皮内癌腫、Krompecher癌腫、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状（lenticular）癌腫、レンズ状（lenticulare）癌腫、脂肪性癌腫、リンパ上皮癌腫、髄様癌腫（carcinoma medullare）、髄様癌腫（medullary carcinoma）、黒色癌腫、軟癌腫（carcinoma molle）、粘液性癌腫、粘液分泌癌腫（carcinoma muciparum）、粘液細胞癌腫、粘液性類表皮癌、粘膜癌腫（carcinoma mucosum）、粘膜癌腫（mucous carcinoma）、粘液腫癌腫（carcinoma myxomatodes）、上咽頭癌、燕麦細胞、骨化性癌腫、類骨癌腫、乳頭状癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、有棘細胞癌腫、粥状癌腫（pultaceous carcinoma）、腎細胞癌腫、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド（solanoid）癌腫、回転楕円面細胞癌腫、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、ストリング癌腫（string carcinoma）、血管拡張性癌腫、毛細管拡張症様癌腫、移行細胞癌腫、結節状癌腫（carcinoma tuberosum）、結節状癌腫（tuberous carcinoma）、いぼ状癌腫、および絨毛癌腫を含む。

癌関連遺伝子としては、例えば、myc、src、ras、abl、bcl、rb、p53, apc、brca1、brca2、akt2、braf、hras、kras、kit、msh2、cdk4、pten、egfr、erbb2、fgfr1、fgfr3、flt3、jak2、pdgfra、plk3ca、ret遺伝子等が挙げられ、これらの遺伝子発現を抑制することにより、抗癌作用を発揮できる。

また、本発明の医薬が適用し得る疾患としては、例えば、癌、エイズ、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、小脳変性症、癌、真性糖尿病、糸球体腎炎、心不全、黄斑変性、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、パーキンソン病、前立腺過形成、乾癬、喘息、網膜変性、網膜色素変性症、関節リウマチ、アテロームプラーク破裂、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ウイルス感染、虚血再灌流損傷、脊髄損傷、神経損傷、心肥大、およびダイアモンドブラックファン貧血などが挙げられるがこれらに限られない。要は、特定の遺伝子の発現を抑制することにより治療できる疾患であれば特に制限されずに使用できる。現在原因遺伝子が判明しているものでも、未解明のものであってもよく、将来的に原因遺伝子が見つかったら、その遺伝子に対して本発明の翻訳阻害剤を適用して疾患を治療することができる場合があり得る。

特に有望と考えられるものとしては、以下の遺伝子、疾患を標的にすることが好ましい（遺伝子名：疾患名の組み合わせで記載）。factor IX（血液凝固IX因子）：血友病、aminolevulinic acid synthase 1（アミノレブリン酸合成酵素１）：急性間欠性ポルフィリン症、transthyretin（トランスチレチン、TTR）：家族性アミロイド心筋症、TGF-β：緑内障、VLA-4：多発性硬化症、insulin-like growth factor-1（インスリン様成長因子1）：先端巨大症、Grb2：急性骨髄性白血病、Androgen receptor（アンドロゲンレセプター）：前立腺がん、survivin：固形癌、Hif-1α：固形癌、insulin receptor substrate-1（インスリン受容体基質- 1）:目血管新生、乾癬、ICAM-1：回腸嚢炎、huntintin：ハンチントン病、SOD-1：筋萎縮性側索硬化症、factor IX：凝固障害、Hsp27：癌、Bcl-2：黒色腫、白血病、骨髄腫、clusterin（クラステリン）：前立腺癌、非小細胞肺癌、CTGF：肥厚性瘢痕。

また、本発明によれば、翻訳抑制剤を導入した細胞が得られる。細胞への本発明に係るポリヌクレオチドの導入は、通常の遺伝子導入の方法が使用でき、リン酸カルシウム法、リポソーム法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、遺伝子銃（ジーンガン）、ウイスカー法、マイクロインジェクション法、レーザーインジェクション法、プロトプラスト法（植物、酵母）、アグロバクテリウム法（植物）、塩化リチウム法（酵母）などが用いられるがこれらに限られない。個体への導入は尾部や腹腔内等への注射やジーンガン、外用剤などにより患部に投与することも可能である。本発明の翻訳抑制剤は、インビトロでもインビボでも使用できる。すなわち、試験管内などの培養容器中の細胞における翻訳を阻害して当該遺伝子の機能を調べたり、代謝を調節して物質生産等に利用できる。

また、本発明によれば、翻訳抑制剤を含むキットが提供される。キットとしては、上述の遺伝子導入試薬、選択試薬（抗生物質等）と本発明のポリヌクレオチドを含むキット、それらに培地を加えたキットなどが挙げられる。

また、本発明によれば、3’-末端を跨ぐ配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを標的mRNAにハイブリダイズさせ、標的mRNAの翻訳を抑制する方法が提供される。本発明の標的mRNAの翻訳を抑制する方法によれば、標的mRNA毎に複数のアンチセンスを作成して抑制効率を測定して最適なものを選択する手間が不要で、機械的に遺伝子発現を抑制することができる。

本発明のポリヌクレオチドは連続的に投与することも可能である。ＤＤＳ技術を用いて、細胞、組織に徐々に放出して継続的に遺伝子発現を抑制することもでき、慢性病の予防、治療にも用いることができる。

本発明によれば、in vitro翻訳系（in vitro translation system）を用いて翻訳阻害活性を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。in vitro翻訳系とは、無細胞抽出液中または翻訳酵素および翻訳に必要な基質等を含む溶液中でタンパク質を翻訳するシステムである。in vitro翻訳系としては、例えば、ウサギ網状赤血球の系（Rabbit Reticulocyte Lysate System）、小麦胚芽抽出物の系（Wheat Germ Extract）、昆虫培養細胞抽出物、ヒト培養細胞抽出液（実施例８参照）、および大腸菌抽出物などの細胞抽出液を用いるものと、翻訳に関わるタンパク質などを個別に生産し、精製したものの混合物を用いるものとがあるが、本発明にはどちらのシステムも用いることができる。また、翻訳系のみでなく、同一の系で転写、翻訳までできるシステムも開発されているが、これらも本発明に使用できる。

in vitro翻訳系により翻訳阻害物質をスクリーニングするには、翻訳阻害活性を有する可能性のある候補物質を標的mRNAとともに、あるいは必要に応じて導入時期をずらしてin vitro翻訳系内に導入し、標的mRNAからのタンパク質の合成活性を測定すればよい。タンパク質の合成活性の測定は、タンパク質が酵素活性を持つものであれば、その酵素活性によりタンパク質の合成量を測定できる。酵素活性としては、例えば、ルシフェラーゼによる発光、β−ガラクトシダーゼによる基質切断による発色、発光、リン酸化酵素によるリン酸化の放射性同位元素による測定、転移酵素による基質転移活性の測定などが挙げられるがこれらに限られない。タンパク質が酵素活性を持たない場合は、例えば、SDS-PAGE等の電気泳動（ウエスタンブロットを含む）、HPLC、MASS、抗体による定量（ELISA、dot blot等）などの方法により定量することができるがこれらに限られない。また、これらの定量方法を複数組み合わせて翻訳阻害活性を測定してもよい。

本発明のオリコヌクレオチドに加えて、他のアンチセンス鎖のポリヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、抗生物質、抗体、タンパク質などを組み合わせて用いてもよい。その場合、in vitro翻訳系により翻訳阻害物質をスクリーニングする方法を用いるのが好ましい。

本発明のsiRNAを含む翻訳阻害剤は、抗炎症剤および／または抗がん剤であってもよく、また、該抗炎症剤および／または該抗がん剤を含むキットの形態でもよい。また、該翻訳阻害剤を含む細胞も本発明の範囲に含まれる。

レポータージーンアッセイ
ASOによる遺伝子発現抑制効果を解析する目的で、レポータージーンアッセイを採用した（図２）。図２に示すように、プラスミドpGL4.32からのホタルルシフェラーゼの発現は、転写因子NF-κB応答配列を有するプロモーターに依存している。ホタルルシフェラーゼ活性は、NF-κB活性に依存するので、NF-κBのサブユニットRelAタンパク質の発現が抑制されるとホタルルシフェラーゼ活性は低下する。ウエスタンブロット法や定量PCRにより、RelA遺伝子の発現をタンパク質レベルあるいはmRNAレベルで評価することができる。NF-κB応答配列を有しないプラスミドpGL4.75（ウミシイタケルシフェラーゼを発現する）をプラスミドpGL4.32と一緒に培養細胞にトランスフェクションすることにより、トランスフェクション効率を補正し、細胞内のNF-κB活性を定量的に評価できる。siScrable（最終濃度40nM）はsiRNAのネガティブコントロール、siRelA ±0はRelA mRNAのポリＡシグナル配列を含む標的配列に対するsiRNA（最終濃度40nM）、同領域に対する19merのgapmer(gapRelA ±0/19、最終濃度10nM)あるいは10merのgapmer(gapRelA ±0/10、最終濃度10nM)、Untreatedは未処理の細胞をそれぞれ表す。

図２中にある２種類のプラスミド（pGL4.32とpGL4.75、プロメガ社製）をHeLa細胞にトランスフェクションした。本発明におけるASOの標的の1つは、ヒトRelA mRNAとした。転写因子NF-κBのサブユニットの1つであるRelAタンパク質の翻訳反応がASOにより抑制されると、NF-κB活性が低下し、レポーター遺伝子からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現が低下する（図２）。その結果、ルシフェラーゼ活性は減少する。ASOによる遺伝子発現抑制効果は、ウエスタンブロット法（RelAタンパク質の解析）や定量PCR法（RelA mRNAの解析）で解析できる（図２）。また、NF-κB応答配列を有しないpGL4.75プラスミドは、レポータージーンアッセイにおける内部標準として用いた。図２は、RelA mRNAに対するgapmer（ポジティブコントロールでRelA mRNAのポリAシグナルを含む配列を標的とした19merからなるgapRelA±0/19（あるいはgap P/C）と呼ぶ）や同領域に対するsiRNA（siRelA±0）の遺伝子発現抑制効果を、レポータージーンアッセイ法、ウエスタンブロット法および定量PCRで観察した結果を示している。gapRelA±0/19とsiRelA±0は、どのアッセイにおいてもRelA遺伝子の発現抑制効果を示している。gapRelA ±0/10はgapRelA ±0/19と同じ領域を標的とするが長さが10merと短いため、アンチセンス効果を示さないネガティブコントロールである。

ヒトRelA mRNAの3’末端の塩基配列の決定
発明者らは、NCBIに登録されているヒトRelA mRNAの塩基配列情報(NM_001145138.1)と使用しているHeLa細胞中のRelA mRNAの3’末端の塩基配列を比較するための実験を行った。HeLa細胞から全RNAを抽出し、3’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法により塩基配列を決定した。その結果、HeLa細胞内のRelA mRNAの3’末端の塩基配列は、NCBIに登録されていたもの（上段(RelA_NM_001145138.1)）より約5塩基短いことがわかった（図３）。22個クローンを解析した結果、7塩基あるいは4塩基短いものも若干ながら存在することがわかった（図３）。図３Ａに、NCBIで登録された3’末端の塩基配列と共に各クローンの配列（7塩基短い配列、5塩基短い配列、および4塩基短い配列）を示す。図３Ｂは、NCBIで登録された3’末端より、7塩基、5塩基、あるいは4塩基短いクローンの比率(割合)を示している。

mRNAの3’側プロセッシング
図４で示したように、転写伸長反応はmRNA重合酵素であるRNA polymerase II (Pol II)が仲介する(Proudfoot, N. J. Genes ＆ Dev., 25:1770-1782, 2011.)。Pol IIは、ポリAシグナル（AAUAAA）を超え、下流にRNA鎖を伸長する（図４(Ａ)）。その後、図４(Ａ)に示したように、AAUAAAに3’側プロセッシング因子CPSFが結合し、さらにpoly(A) polymerase(PAP)やmRNA切断因子(CF)、さらにはGU rich配列に結合する3’側プロセッシング因子(CstF)が結合して、mRNAの3’末端配列の開裂（切断）が矢印部分で生じる（図４(Ｂ)）。ここからPAPによりpoly(A)鎖の伸長が始まる(C)。発明者らは3’RACE法により、この矢印部分を決定した（図５）。開裂部位からは、poly(A)鎖伸長酵素（PAP）によりpoly(A)鎖の伸長が生じる（図４(Ｃ)）。ちなみにこれら一連の3’プロセッシング反応は、核内で生じる。

poly(A)鎖が付加される前の段階で標的mRNAに作用するgapmer
発明者らは、mRNA開裂部位を跨ぐようなASOを設計した（図５）。開裂部位より下流の配列はpoly(A)鎖が付くため、NCBI等のデータベースのmRNAの配列情報からでは知ることはできない。そのため、ゲノム由来の配列情報を基にして開裂部位より下流（図5の矢印より下流部分）の塩基配列情報を取得し、4種類の13merからなるgapmerを設計した。図５には、設計に用いた配列と共に、これらの4種のgapmerの配列を示す。これらの4種のgapmerの配列は、以下の表１にも示す。それぞれの標的配列の位置情報に従い、開裂部分を原点として命名した。ASOの塩基配列の大文字はLNA、小文字はDNAを表している。

これらをHeLa細胞にトランスフェクションしてレポータージーンアッセイを行った。結果を図６に示す。図６は、図５のgapmerを終濃度1、3、あるいは10nMとなるようにHeLa細胞にトランスフェクションしたもので、縦軸（Relative luciferase activity）は、補正後のルシフェラーゼの相対活性を表している。ポジティブコントロールとしてgapP/C（gapRelA ±0/19、終濃度10nM）、RelA mRNA に対する市販のsiRNA（si P/C、終濃度40nM）、あるいは非特異的な配列に対するgapmer（NTS、終濃度10nM）をそれぞれトランスフェクションした。その結果、標的配列が下流にずれていくに従って発現抑制効果は減少した（図６）。しかし、いずれのgapmerにおいても強弱に差はあるが発現抑制効果を観察することができた（図６）。非特異的な配列に対するgapmer NTSは抑制効果を示さない(図６、Kakiuchi-Kiyota, S., et al., Toxicol. Sci., 138, 234-248, 2014.)。

同様のことがマウス由来の培養細胞で生じるか確認する目的で、NIH3T3細胞にレポータープラスミドと図７に示した4種類の13merのgapmerをそれぞれトランスフェクションした。図７の矢印は、mRNAの開裂部分を示している。上段(Mouse RelA_NM_009045.4)は、NCBIに登録済みの配列情報で、本来は矢印以降の部分はpoly(A)鎖となっていた。3’RACE法で肝臓由来の全RNAを材料としてマウスRelA mRNAの3’末端配列を決定すると、NCBIの情報と同一であった。矢印以降の配列は、ゲノム情報を基にして抽出し、記載した。4種類のgapmer型ASOを図７のように設計した。図７には、設計に用いた配列と共に、これらの4種のgapmerの配列を示す。これらの4種のgapmerの配列は、以下の表１にも示す。それぞれの標的配列の位置情報に従い、開裂部分を原点として命名した。ASOの塩基配列の大文字はLNA、小文字はDNAを表している。

図７のgapmerを終濃度1、3、あるいは10nMとなるようにNIH3T3細胞にトランスフェクションした。このようにトランスフェクションしたNIH3T3細胞におけるレポータージーンアッセイ結果を図８に示す。図８の縦軸（Relative luciferase Activity）は、補正後のルシフェラーゼの相対活性を表している。ネガティブコントロールとして非特異的な配列に対するgapmer（NTS、終濃度10nM）をトランスフェクションした。その結果、HeLa細胞と同様に、すべてのASOにおいて強弱に差はあるものの発現抑制活性を観察することができた（図８）。

この結果から、ASOは細胞の核内でpoly(A)鎖付加が生じる前の段階にある標的mRNAにハイブリダイズしてアンチセンス効果を発揮する可能性が強く示唆された。興味深いことにNIH3T3細胞の結果から、-8/+5、すなわちmRNAの開裂部位をASOの中央付近に有するものが一番強い発現抑制活性を誘導することがわかった（図７と８）。よって、本発明者らは以降の実験で、ASOの中央部分に標的mRNAの開裂部位がくるように設計した。

対称型gapmerは強い遺伝子発現抑制効果を発揮する
ヒトRelA mRNAに対して開裂部位(矢印)を中央にして、上流・下流、すなわち開裂部位を中央にして両側にそれぞれ9塩基のもの（-9/+9）、8塩基のもの（-8/+8）、7塩基のもの(-7/+7)、6塩基のもの(-6/+6)、5塩基のもの(-5/+5)のASOを準備した（図９）。本来、矢印以降の部分はpoly(A)鎖である。よって、ゲノム情報を基にして矢印以降の配列を抽出し、記載した。図９には、設計に用いた配列と共に、準備したgapmerの配列を示す。これらのgapmerの配列は、以下の表１にも示す。ASOの塩基配列の大文字はLNA、小文字はDNAを表している。-8/+5は図５に記載済みである。それらすべての5’と3’端の2塩基はLNAで、それら以外は全てDNAから成る。以下、開裂部位を中央に配置した対称型をしているという構造上の特徴から、「対称型gapmer」と呼ぶ（図９）。

図９のgapmerを終濃度10 nMとなるようにHeLa細胞にトランスフェクションした。図９に示す各gapmerでトランスフェクションしたHeLa細胞におけるレポータージーンアッセイ結果を図１０に示す。図１０の縦軸（Relative luciferase activity）は、補正後のルシフェラーゼの相対活性を表している。ポジティブコントロールとしてgapmer（gapP/C；gapRelA ±0/19、終濃度10nM）、RelA mRNAに対する市販のsiRNA（siP/C、終濃度40nM）、あるいは非特異的な配列に対するgapmer（NTS、終濃度10nM）をそれぞれトランスフェクションした。UTは、未処理の細胞を表している。図１０中の数値は、補正後のルシフェラーゼ活性である。レポータージーンアッセイの結果、-9/+9、-8/+8と-7/+7は、未処理のものに比較して約5%までルシフェラーゼ活性を低下させた（図１０）。ポジティブコントロールとして用いたgapRelA ±0/19（gap P/C）やRelA mRNAに対する市販のsiRNA（siP/C、Takaesu, G., et al., J. Mol. Biol. 326, 105-115, 2003.）の示すレポータージーンアッセイの値が約10%であることを考慮すると、-9/+9、-8/+8、-7/+7は非常に強い発現抑制効果を示すものと言える（図１０）。-6/+6や-5/+5は抑制効果が若干弱くなった（図１０）。

次に定量PCRアッセイによりASOをトランスフェクションした細胞内のRelA mRNA量について検討した。この結果を図１１に示す。図１０と同様に図９の各gapmerまたはポジティブコントロールのgapmer（gapP/C）を終濃度10nMあるいはsiRNA（siP/C）を終濃度40nMとなるようにHeLa細胞にトランスフェクションし、これらのトランスフェクションしたそれぞれの細胞から、全RNAを調整した。逆転写反応をoligo(dT)（各処理群の左側のハッチングを施した棒）あるいはrandom primer（各処理群の右側の白抜きの棒）を用いて行い、できたcDNAを材料として定量PCRによりRelA mRNA量を解析した（図１１）。図１１の縦軸（Relative RelA mRNA level）は、内部標準で補正後のRelA mRNAの相対量を示している。図１１中の数値は、補正後のRelA mRNAの相対量を表している。

その結果、ポジティブコントロールのgap P/CやsiP/Cは、未処理のものに比較してmRNA量を約10%程度まで減少させていた（図１１）。-7/+7はoligo(dT)で逆転写した場合、RelA mRNA量はポジティブコントロールのgap P/Cと同じレベルで減じているように見えたが、randomプライマーで逆転写反応した場合は、RelA mRNA量を未処理の約半分までしか減少させていなかった（図１１）。この違いは、RelA mRNAにpoly(A)が付加される反応をgapmer -7/+7は阻害している。レポータージーンアッセイでコントロールに比較して約80%までルシフェラーゼ活性を低下させる能力を有する-6/+6のRelA mRNA量への影響は、randomプライマーで逆転写した場合は、未処理のものの約70%程度であった（図１１）。すなわち、-6/+6はほとんどmRNA量を減じていないといえる。以上の結果より、従来のgapmerが標的のmRNAを分解して発現抑制活性を発揮している（US005962425A、US005955589A）のに対し、発明者らの開発した対称型gapmerは、標的mRNAをほとんど分解しないで発現抑制活性を示している可能性が示唆された。

マウスApoB遺伝子を標的としたASOのアンチセンス活性評価
apolipoproteinB（apoB）はリポタンパク質の主要な構成要素である。コレステロールはapoBなどのタンパク質成分に取り込まれ、脂質成分が付加されリポタンパク質が合成される（Davidson N.O., and Shelness, G.S., Annu. Rev. Nutr. 20, 169-193, 2000.）。脂質成分は肝臓においてリポタンパク質へと作り変えられてから全身へと送り届けられる。米国で承認されている世界初の全身投与可能な核酸医薬品カイナムロは、apoBを標的としLDL-C値を特異的に低下させることが報告されている（Wong, E., and Goldberg, T. Drug Forecast 39, 119-122, 2014.）。よって、マウスを用いた動物実験においてApoBを候補遺伝子とすれば評価系が既に確立しているため遺伝子発現抑制効果を簡便に確認することができる。本法は一般的に広く採用されているため、本実施例でも使用することにした。

まず、先行研究により強い抑制効果を持つことが示されているApoB mRNAに対するgapmer型のASO（MM13mer（配列を以下の表１および図１２に示す）；Nishina, K., et al., Nature Commun., 6:79692015）を用いて条件検討した（図１２）。ASOを尾静脈よりDay.0で投与した。投与量は1匹あたり0.004mgから0.5mgまで4段階刻みで、2回目に投与する際も各個体に同量を投与した。0.5mg投与は1匹、0.1mgから0.004mgまでの投与は2匹で行い、図は平均値である。PBSは2匹で行い、平均値を示した。ASOを投与する前日（Day.-1）、投与してから3日後（Day.3）、7日後（Day.7）に採血した。7日目の採血後、再びマウス尾静脈にASOを投与した。投与してから10日後（Day.10）に再び採血した（図１２）。採血した血清中の総コレステロール値、HDL-コレステロール値、LDL-コレステロール値をそれぞれ測定した。結果を図１３に示す。

その結果、いずれのコレステロール値においてもASOの投与量が増加するにしたがってDay.-1の値より顕著に低下した（図１３）。同時にこれらのマウスのDay.10に測定した血液中のAST値及びALT値は、投与量の増加に伴い顕著に上昇した（図１４）。特にMM 13merを1匹あたり0.1mgと0.5mgを投与したもののASTおよびALTの値は非常に高く、激しい肝障害を生じている可能性が示唆された。

肝毒性のメカニズムとしては、核酸の種類（Krieg, M., et al., Nature Reviews Drug Discov., 6:471-484, 2006）、その配列（Burdick, A. D., et al., Nucleic Acid Res., 8:4882-4891, 2014）等が関係することが報告されている。以降の実験ではMM 13merをポジティブコントロールとして採用し、AST値及びALT値がほとんど上昇しない1匹あたり0.02mgを投与量として選んだ（図１４）。

マウスを用いた対称型gapmerのアンチセンス活性評価
ApoB mRNAのpoly(A)鎖付加部位を跨ぐように設計した対称型gapmerからなるASOの活性を評価するために、図１５に示したプロトコールを採用した。ASO投与日（Day.0）の5日前（Day.-5）、及び投与した日から3日後のDay.3に採血した。Day.3では、肝臓の摘出も実施した。MM 13merの投与量は、肝毒性の出にくい1匹あたり0.02 mg、対称型gapmerはその25倍量の0.5 mgを腹腔より投与した。実際に投与した対称型gapmerの塩基配列を、図１６Ａに示した。図中の点線は開裂部位を示しており、ここを中央にして対称型gapmerを設計している。ちなみにマウスApoB mRNAの3’末端の塩基配列情報は、肝臓より回収した全RNAを材料として3’RACEを実施し、本発明者らが決定したものである。

図１６Ａに示すように、開裂部位を中央にして3種類の対称型gapmerを設計し、準備した。図１６Ａには、設計に用いた配列と共に、準備したgapmerの配列を示す。これらのgapmerの配列は、以下の表１にも示す。点線部分は開裂部位を示している。本来、点線より下流の部分はpoly(A)鎖である。よって、ゲノム情報を基にして点線以降の配列を抽出し、記載した。最上段はApoB mRNA の配列情報、棒はmRNAを模式的に示し、AAAAの連続はpoly(A)鎖を表している。薄いグレーの丸で大文字はLNA、黒丸で小文字はDNAをそれぞれ表している。図１６ＢからＤは、ASO（投与量は1匹あたり0.5mg）で腹腔より投与した。ポジティブコントロールとしてMM 13merを0.02mg、腹腔より投与した。図１５のプロトコールに従って採血し、血液中のLDL-コレステロール値(LDL-C：図１６Ｂ)、HDL-コレステロール値(HDL-C：図１６Ｃ)、および総コレステロール値(T-CHO：図１６Ｄ)を測定した。MM 13merとPBS投与は2匹で行い、-9/+9、-8/+8と-7/+7投与は4匹で行った。数値は、平均値を示している。

ASOを投与してから3日後の血清中のLDL-C値は、PBS以外のASOを投与した全てのマウスでDay.-5の値に比較して顕著に減少した。ASO -7/+7を投与したマウスのLDL-Cが顕著にDay.3で減少していた（図１６Ｂ ApoB ASO-7/+7 p＜0.01）。-9/+9や-8/+8に関しても減少していた（図１６Ｂ）。HDL-CやT-CHOに関しては、ASO投与による変化はほとんどなかった（図１６ＣとＤ）。ポジティブコントロールのMM 13merは、HDL-CやT-CHOの値を若干減少させているようである（図１６ＣとＤ）。

図１５のプロトコールで実験を実施し、図１６で回収したDay.3の血液を用いて、AST値とALT値を測定した。その結果、肝毒性の指標であるAST値やALT値については、ASO-7/+7で若干の上昇が観察された（図１７、AST値p＜0.05、ALT値p＜0.01）。MM 13merの場合、1匹あたり0.5mg投与すると、AST値は400以上、ALT値は600以上となり、これは激しい肝障害を誘導したためである（図１４）。一方、発明者らの開発した対称型gapmer-7/+7におけるAST値は100以下、ALT値も45以下となり、MM 13merと比較すると極めて弱いものであった（図１７）。以上の結果より、ApoB mRNAの3’末端のpoly(A)鎖付加部位を跨ぐように設計した対称型gapmerは、マウスの肝臓でApoBを発現抑制し、その結果、血中のLDL-C値の低下が誘導されたと考えられる。

実際に腹腔から投与したASOが肝臓に達し、肝臓中のApoB mRNAに作用したか確かめるため、ASO投与3日後に摘出した肝臓より全RNAを抽出し定量PCRで解析した。Aはrandom primer、Bはoligo dT primerでそれぞれ逆転写反応を行った。縦軸は、内部標準で補正後のApoB mRNAの相対量を示している。その結果、3種類の対称型gapmerからなるASOは、PBS処理のものに比較してすべての個体でApoB mRNA量の低下を誘導した（図１８）。特にASO-7/+7では、投与した4匹すべてのマウスで顕著なApoB mRNA量の低下が観察された（図１８）。以上の結果から、対称型gapmerは肝臓のApoB mRNAに働きかけ、ApoBの発現を抑制し、その結果、血液中のLDL-C値の低下を引き起こしたと言える。

gapmer構造を壊すnon-gapmer型ASOは遺伝子発現抑制効果を有する
gapmer型ASOは標的遺伝子の発現を効率的に抑制するものの、マウスに投与した際に強い肝障害を示すことが多数報告されている（Burel, S. A., et. al. Nucleic Acid Res., 44:2093-2109, 2016., Kasuya, T., et. al. Sci. Rep., 27;6:30377, 2016.）。発明者らの実験においても図１４の結果のように、ポジティブコントロールの従来型gapmer(MM 13mer)は、1匹あたり0.1 mg以上投与すると極めて強い肝毒性が惹起された。よって、gapmer型の副作用である肝障害を取り除くことは、核酸医薬品開発において必須の課題である。一方、肝毒性はRNaseH1活性に由来することが報告されている（Burel, S. A., et. al. Nucleic Acid Res., 44:2093-2109, 2016., Kasuya, T., et. al. Sci. Rep., 27;6:30377, 2016.）。すなわち、gapmerによりRNaseH1依存的なmRNA分解が生じ、これが肝毒性の主原因と考えられている。

粕谷らの論文では、gapmer構造の中央部分にLNAを配したnon-gapmerは、肝毒性を全く示さないと報告している（Kasuya, T., et. al. Sci. Rep., 27;6:30377, 2016.）。

そこで、標的mRNAのpoly(A)鎖付加部位を跨ぐ対称型gapmerとASOの配列の中央部付近にLNAを有したnon-gapmer型を準備した。本発明で用いた7種類のASOを図１９に示した（これらのASOの配列を表１にも示す）。矢印は、ヒトRelA mRNAの開裂部分を示している。本来、矢印以降の部分はpoly(A)鎖である。よって、ゲノム情報を基にして矢印以降の配列を抽出し、記載した。開裂部位(矢印)を中央にして、上流・下流に7塩基のもの(-7/+7)を準備した。ASOの塩基配列中でLNAは薄いグレーで表し、DNAは黒で表した。LNAの挿入されている相対位置（番号で表示）に基づき、それぞれを命名した。それらASOの活性をレポータージーンアッセイで検討した。

図１９のASOを終濃度10nMとなるようにHeLa細胞にトランスフェクションした。このようにトランスフェクションしたHeLa細胞におけるレポータージーンアッセイの結果を図２０に示す。図２０の縦軸（Relative luciferase Activity）は、補正後のルシフェラーゼ活性を表している。ポジティブコントロールとしてgapmer（gapP/C；gapRelA ±0/19、終濃度10nM)、RelA mRNAに対する市販のsiRNA（siP/C、終濃度40nM）、あるいは非特異的な配列に対するgapmer（NTS、終濃度10nM）をそれぞれトランスフェクションした。図２０中の数値は、補正後のルシフェラーゼの相対活性である。

その結果、14merからなるnon-gapmer構造の1.2.8.13.14が、最も強い発現抑制効果を示した（図２０）。また、non-gapmer型の1.7.8.14においてもポジティブコントロールのgapmer（gap P/C）の示す値のレベルまで発現を抑制した（図２０）。

次にそれぞれのASOをトランスフェクションしたHeLa細胞から全RNAを抽出し、定量PCRにより細胞中のRelA mRNAに関して検討を加えた。逆転写反応をoligo(dT)（各処理群の左側のハッチングを施した棒）あるいはrandom primer（各処理群の右側の白抜きの棒）を用いて行い、できたcDNAを材料として定量PCRによりRelA mRNA量を解析した（図２１）。図２１の縦軸は、内部標準で補正後のRelA mRNA量を示している。図２１中の数値は、補正後のRelA mRNAの相対量を示している。

その結果、ポジティブコントロールのgap P/Cは、コントロールのNTSに比較して10%レベルまでRelA mRNA量を減じていた（図２１）。これに対してnon-gapmer構造の1.7.8.14や1.2.8.13.14はNTSと比較してRelA mRNA量をおよそ半減するにとどまった（図２１）。以上の結果からpoly(A)鎖付加部位を跨ぐASOでnon-gapmer構造を有するものは、１）遺伝子発現抑制効果を有している、２）mRNAの分解をほとんど経由することなく発現抑制効果を発揮していることが示された。

RelA mRNAの細胞内局在と肝毒性
RNAscopeによるin situハイブリダイゼーションを行い、HeLa細胞中に存在するRelA mRNAに関して検討を加えた。プロトコールを図２２Ａに示した。トランスフェクションの4時間後、細胞を2つに分け、レポータージーンアッセイとin situハイブリダイゼーション（ISH）を実施した（図２２）。その結果、レポータージーンアッセイにおいて対称型gapmerの-7/+7とnon-gapmer構造のASO 1,2,8,13,14およびポジティブコントロールのgap P/Cで強い発現抑制活性を観察した。

一方、ネガティブコントロールの非特異的配列に対するgapmer NTSは、抑制効果を全く示さなかった（図２２Ｂ）。図２３から図２７は、in situハイブリダイゼーションの結果である。RNAscopeを用いてRelA mRNAとcyclohilin B mRNAの細胞内局在を解析した。-7/+7（図２３）とnon-gapmer1,2,8,13,14（図２４）とNTS（図２６）および未処理の細胞（図２７）では、核および細胞質に多数の黒いスポット（RelA mRNAの存在している場所で生じる）を検出することができた。一方、ポジティブコントロールのgap P/Cをトランスフェクションした細胞（図２５）では、細胞全体でほとんどスポットを検出することができなかった。ハウスキーピング遺伝子（house keeping gene）のcyclophilin B mRNAは強く検出されているので、gap P/CのRelA mRNAに相当するスポットが無いのは実験上のミスではない。よって、gap P/Cは細胞内のRelA mRNAを効率的に分解したといえる。

これに対して、発明者らの発明した対称型gapmerの-7/+7とnon-gapmerの1,2,8,13,14からなるASOは、細胞内のRelA mRNAをほとんど分解していないといえる。また、これらの結果は定量PCRの結果を強く反映していた（図２１）。以上の結果より、標的mRNAのpoly(A)鎖付加部位を跨ぐように設計した対称型gapmerあるいはnon-gapmer型のASOは、標的mRNAの分解をほとんど経由せずに発現抑制効果、すなわちアンチセンス効果を発揮していることがわかった。

材料と方法
核酸合成
全てのASOは株式会社ジーンデザインに合成を依頼し購入した。ASOの塩基配列は下記表１にまとめた。LNAを大文字で、DNAを小文字で記した。CがLNA化される場合はメチルシトシンをLNA化している。全ての塩基間はホスホロチオエート化されている。

細胞培養
HeLa細胞、及びNIH3T3細胞は10% 非動化済FBS（Gibco）、penicillin-streptomycin（Life technologies）を含むDMEM（Dulbecco’s-modified Eagle’s medium；Sigma）で37℃、5% CO₂の条件下で培養した。

レポータージーンアッセイ
約0.5×10⁵ cells/mLとなるよう、HeLa細胞あるいはNIH3T3細胞を10%非動化済FBSを含む DMEM培地に懸濁させ、0.5mLずつ24穴プレートに撒いた。24時間後、細胞が40〜50%程度の集密状態の時にトランスフェクションを実施した。0.8μg pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]プラスミド, 20ng pGL4.75[hRluc/CMV]プラスミド, siRNA あるいは各種ASO, 1μL Lipofectamine2000（Ingitrogen）を100μL OptiMEM（Ingitrogen）に混合し、室温で20分間静置した。静置後、混合液を培養液に添加することでトランスフェクションを行った。

NF-κBの活性化のため、トランスフェクション後22時間で、HeLa細胞を培養していた培地をアスピレーターで除去し、500μLの10%非動化済FBS, 20ng/mL TNF-αを含むDMEM培地に交換した。培地を交換後、インキュベーター（37℃, 5% CO₂）に戻し、2時間静置した。

ルシフェラーゼ活性はDual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いて以下のように測定した。トランスフェクションを行ったHeLa細胞を氷冷したPhosphate-Buffered Saline（PBS）（pH 7.4）500μLで二回洗浄後、150μLのpassive lysis buffer（Promega）を加え室温で15分間穏やかに撹拌した。細胞溶解液を室温、10,000gで5分間遠心分離し、得られた上清30μLをLuciferase assayに用いた。発光強度の測定にはLuminoskan luminometer（Thermo Scientific）を用いた。

定量PCR
標的遺伝子の発現量はGoTaq qPCR Master Mix（Promega）あるいは、KAPA SYBR Fast qPCR Kit（日本ジェネティクス）を用いて、StepOnePlus real-time PCR（Life Technologies）で測定した。GoTaq qPCR Master Mixを用いた場合、cDNAにGoTaq qPCR Master Mi×10μL、遺伝子特異的Forward primer及びReverse primerを5pmol加え以下のプロファイルでサイクルを開始した。

初期熱変性 95℃ 5分
PCR反応 (50 cycle) 95℃ 30秒（熱変性）
55℃ 60秒（アニーリング）
72℃ 30秒（伸長）

KAPA SYBR Fast qPCR Kitを用いた場合、cDNAにKAPA qPCR Master Mix 10μL, ROX High Reference Dye 0.4μL, 遺伝子特異的 Forward primer及びReverse primerを4pmol加え以下のプロファイルでサイクルを開始した。

初期熱変性 95℃ 30秒
PCR反応 (40 cycle) 95℃ 5秒（熱変性）
60℃ 30秒（アニーリング・伸長）

標的遺伝子の増幅に用いたプライマー配列は以下の通りである。
ヒトRelA：5’-GCAGTTTGATGATGAAGACC-3’(forward、配列番号１８)，5’-CTGTCACTAGGCGAGTTA-3’(reverse、配列番号１９)
ヒトβ-actin(内在性コントロール)：5’-GATAGCATTGCTTTCGTGTA-3’(forward、配列番号２０)，5’-TTCAACTGGTCTCAAGTCAG-3’(reverse、配列番号２１)
マウスApoB：5’-GCTCAACTCAGGTTACCGTGA-3’(forward、配列番号２２)，5’-AGGGTGTACTGGCAAGTTTGG-3’(reverse、配列番号２３)
マウスSpt5(内在性コントロール)：5’-GGTCCTACTGAGCATTGATGGTGAG-3’(forward、配列番号２４)，5’-TCAGGCTTCCAGGAGCTTCCCTAGG-3’(reverse、配列番号２５)

ウエスタンブロット
HeLa 細胞を300μLのRIPA buffer（25mM Tris・HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS; Pierce）に1×Halt Protease Inhibitor Cocktail-EDTA-Free（Thermo Fisher Scientific）を加えたもので懸濁後、Handy Sonic UR-20P (TOMY)を用いてソニケーションを行った。その後、4℃，15,000gで10分間遠心分離し、上清を得た。得られた上清を用い、ウエスタンブロットを行った。一次抗体としてNF-κB p65 Antibody (C-20): sc-372（Santa Cruz Biotech）、及びMonoclonal Anti-γ-Tubulin antibody produced in mouse（Sigma）を用いた。二次抗体にはECL Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked F(ab)2 Fragment (GE healthcare)、及びpolyclonal rabbit anti mouse immunoglobulins/hrp（DAKO）を用いた。検出にはLuminata Classico Western HRP（Millipore）を用い、LPR-140EX（AISIN）で可視化した。

3’RACE
3’RACEはGeneRacer Kit（Invitrogen）を用いて以下のように行った。各サンプルから調製したtotal RNA 300ngに90ng GeneRacer OligodT, 1μL dNTP Mixture（2.5mM each）、水を加えて全量を7μLにした。混合液を65℃で5分間静置後、氷上で5分間静置した。氷冷したサンプルに、5×First strand buffer 4μL, 0.1M DTT 1mL, 10mM dNTP 1μL, RNasin Plus RNase Inhibitor（Promega）0.5μL, SuperScript III Reverse Transcriptase 0.5μL, 水を加え全量を20μLにした。混合液を50℃で60分インキュベート後、70℃で30分インキュベートし、cDNAを合成した。

合成したcDNA 1μLに10×PCR buffer for KOD plus 5μL, 2mM dNTPs 5μL, 25mM MgSO₄ 2μL, KOD plus（Toyobo）0.5μL, 遺伝子特異的Forward primer及びReverse primerを20pmolずつ、水を加えて全量を50μLにし、以下のプロファイルでサイクルを行った。

初期熱変性 94℃ 5分
PCR反応 (30 cycle) 94℃ 30秒（熱変性）
60℃ 30秒（アニーリング）
68℃ 60秒（伸長）

1st PCR産物を用いてNested PCRを行った。100倍希釈した1st PCR産物に10× ExTaq buffer 5μL, dNTP Mixture (2.5mM each) 4μL, ExTaq 0.25μL,遺伝子特異的Forward primer及びReverse primerを20pmolずつ、水を加えて全量を50μLにし、以下のプロファイルでサイクルを行った。

初期熱変性 98℃ 5分
PCR反応 (30 cycle) 98℃ 30秒（熱変性）
60℃ 30秒（アニーリング）
72℃ 60秒（伸長）

PCR産物を1.2%アガロースゲルで電気泳動し、切出精製を行った。切出精製にはFastGene Gel/PCR Extraction（日本ジェネティクス）を用い、プロトコールに従って精製した。

切出精製した産物にExTaqを用いてA-tailing反応を行った。切出精製したPCR産物25μLに10 x ExTaq buffer 5μL, 10mM dATP(NEB) 1μL, ExTaq 0.25μL, 水を加え全量を50μLにし70℃で30分間静置した。A-tailing反応を行った産物はFastGene Gel/PCR Extraction（日本ジェネティクス）を用い、プロトコールに従って精製した。

A-tailing反応を行った産物をpGEM T-easy vectorにライゲーションした。A-tailing反応を行った産物1μLにT4 ligation buffer 5μL, pGEM T-easy（Promega）1ng, T4 ligase（Promega）1μL、水を加えて全量を10μLにし、室温で60分間静置した。静置後、反応液全量をDH5a（Toyobo）に加え、氷中で30分静置した。静置後、42℃の水浴で45秒間ヒートショックを与え氷中で2分以上静置した。あらかじめ、37℃に保温したSOC培地を1mL加え、37℃で60分間静置した。静置後、アンピシリン（50μg/mL）を含むLB培地に播種した。37℃で一晩静置後、得られたコロニーからQiaprep miniprep kit（Qiagen）を用い、プロトコールに従ってプラスミドを調製した。調製したプラスミドはユーロフィン株式会社にシークエンス解析サービス依頼し、クローニング部位の塩基配列を決定した。

in situ ハイブリダイゼーション
in situ ハイブリダイゼーションはRNAscopeHD reagent-BROWN（Advanced cell diagnostics）を使用し、以下のように行った。

ミリセルEZスライド（millipore）上で培養した細胞をPBSで洗浄後10%中性緩衝ホルマリンで30分間、室温で固定した。その後、50%エタノール、70%エタノール、100%エタノールに段階的に浸漬し、脱水した。次に、70%エタノール、50%エタノール、PBSに段階的に浸漬することで再水和した。水和した試料の水分を軽く切り、試料に直接過酸化水素水を滴下し、室温で10分間静置した。静置した試料をPBSで洗浄した後、ProteasePlusを試料に直接滴下し、室温で10分間静置した。試料をPBSで洗浄後、遺伝子特異的プローブを滴下し、40℃で2時間静置した。試料をwash バッファーで洗浄し、AMP1試薬からAMP6試薬で順次処理した。AMP6試薬処理を行った後、washバッファーで洗浄し、DAB試薬を試料に滴下し、室温で10分間静置した。試料を蒸留水で洗浄後、マイヤーヘマトキシリン（Merck）でカウンター染色した。染色後、エタノール で脱水し、レモゾール（nacalai tesque）で透徹を行った。試料をマウントクイック（大道産業株式会社）で封入し、顕微鏡で観察した。

マウスの飼育
5〜6週齢の雌Jc1:ICRマウスを日本クレア株式会社（以下、クレア）から購入し、コンベショナルな条件下で飼育した。実験開始まで1週間以上の順化期間を設けた。マウスは、23±2℃で、湿度60%±5%、12時間おきの明暗サイクルで飼育した。標準的な飼料（CE-2、クレア）と水は、自由に食する条件にした。すべての実験は、2006年に日本学術会議が策定した動物実験の適正な実施に向けたガイドラインに従って行った。本実験のプロトコールは、国立大学法人大阪大学の実験動物委員会の承認を得ている(承認No. 25-1-1)。

ASOの投与
ASOは尾静脈あるいは腹腔から図中および明細書中に示したそれぞれの量及び日程でマウスに投与した。図１２〜１４に示すMM 13mer ASOの条件検討を行った実験では、最初の核酸投与日をDay.0として2回目の投与をDay.7に行い、採血はDay.-1、3、7、10日に行い各種コレステロール値を測定した。Day.10についてはAST値及びALT値の測定も行った。核酸は1匹あたり0.5、0.1、0.02、0.004mgになるように尾静脈より注射した（各2個体）。0.5mg容量のみ2回目の投与を行わなかった（1個体）。図１５〜１８に示す本発明の核酸を投与した実験では、核酸を投与した日をDay.0とするとDay.-5及びDay.3に採血を行い、コレステロール値の測定を行った。Day.3に関してはAST値及びALT値の測定を行った。MM 13mer ASOのみ0.02mg/匹（2個体）、他の核酸は0.5mg/匹の容量で腹腔内投与した（各4個体）。全ての実験において、陰性対照としてPBSを投与した（2個体）。

コレステロールやAST、ALT値の測定
Goldenrod ANIMAL LANCET（Bio Research Center）を用いてマウスの頬より採血を行い、BD Microtainer Tubes（Becton, Dickinson and Company）中に血液を回収後15分〜30分以内の間に10,000rpm、室温で2分間遠心して血清を分離した。血清はオリエンタル酵母工業株式会社に送付し、総コレステロール、LDL-コレステロール、HDL-コレステロール、AST、ALTそれぞれの数値を測定した。

RNA抽出
培養細胞あるいは摘出したマウスの肝臓を、セパゾールRNA IスーパーG（ナカライテスク）により説明書に従って処理した。マウス肝臓組織よりRNAを抽出する場合は、ビーズ式細胞破砕装置Micro Smash^TM（TOMY）を用いて4,500rpm、10秒で1回破砕処理を行った。チューブには3.0σのジルコニアビーズを各3個加えた。破砕後トップスピード（17,900g）で4℃、5分間遠心して上清だけ回収し組織片を取り除いた。RNAの精製は、Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research)により説明書に従って精製した。続いて、50〜1000ngのRNAを用いて50〜500ng oligo (dT)あるいはrandom primerとdNTP Mixture（最終濃度0.77mM）の混合液(13μL)を65℃で5分間静置後、氷上で5分静置した。氷冷したサンプルに、5×First strand buffer 4μL、0.1M DTT 1μL、RNasin Plus RNase Inhibitor（Promega）1μL、SuperScript III Reverse Transcriptase（逆転写酵素）1μLをそれぞれ加えて全量を20μLにした。混合液を50℃で30分から60分インキュベート後、70℃で30分あるいは80℃で10分インキュベートして逆転写酵素を失活させ、cDNAとした。

mRNAのpoly(A)鎖付加部位を跨ぐ対称型gapmerが、血清中のAST値やALT値の上昇をほとんど誘導しない理由
対称型gapmer-7/+7を従来のgapmer(MM13mer)と比較すると、gapmer-7/+7からなるASOをマウスに投与した場合、肝毒性の指標となる血清中のAST値およびALT値の上昇が顕著に抑えられていた（図１４と１７）。

レポータージーンアッセイで対称型gapmer-7/+7と従来のgapmer（gap P/C）は強い発現抑制活性を示しているので、抑制効果は両者間で同等であるといえる。興味深いことにin situハイブリダイゼーションの結果から、細胞内のRelA mRNAの局在とその存在量に対する影響は両者で大きく異なっていることがわかった（図２８）。図２８Ａは、ASO -7/+7をトランスフェクションしたHeLa細胞内のRelA mRNAの局在とASO -7/+7の関係を示し、図２８Ｂはgap P/CをトランスフェクションしたHeLa細胞内のRelA mRNAの局在とgap P/Cの細胞内での振る舞いを示す。

すなわち、-7/+7はRelA mRNAの局在や存在量にほとんど影響を与えていない（図２３）。しかし、gap P/CはRelA mRNA量を顕著に減じていた（図２５）。これらを考察すると、-7/+7をトランスフェクションした細胞内にはRelA mRNAが存在し続けているので、ASOである-7/+7はRelA mRNAと持続的にハイブリダイゼーションしている。また、RelA mRNAの翻訳反応が効率的に抑制されていることからも、ハイブリダイゼーションが細胞中で継続していることは明らかである。

一般にASO、すなわち一本鎖のアンチセンス核酸が標的mRNAにハイブリダイズして形成された2本鎖は、非常に安定である。加熱、すなわちASOのTmを上回る温度になるか、あるいは強いアルカリ性を示すような物質で処理しないと2本鎖が解け一本鎖状態に戻ることはない。

また、gapmer -7/+7とRelA mRNA間で作られた2本鎖を特異的に解離させるような活性を有するヘリケース（helicase）の存在と関与が考えられるが、上述したようにRelA mRNAが細胞質に存在し続けているのにgapmer -7/+7は翻訳を抑制した状態を保つことができているので（図２２）、ヘリケースが2本鎖状態を解消したとは考えられない。

よって、gapmer -7/+7をトランスフェクションした細胞内にRelA mRNA が存在し続けている以上、両者間で形成される2本鎖状態は存在し続けているといえる（図２８Ａ）。一方、gap P/Cのin situハイブリダイゼーションの結果は、RNaseH1活性で標的のmRNA（本発明ではRelA mRNA）が効率的に分解したことを明確に示している。そうするとgap P/Cの標的のmRNAは細胞中に存在しない。要するにgap P/Cは一旦標的であるRelA mRNAと2本鎖状態を形成するが、RNaseH1活性によりRelA mRNAの分解が生じるため、この2本鎖状態は解消し、結局、ASOであるgap P/Cは細胞内で一本鎖の状態に戻る。一本鎖状態となったgap P/Cは本来の標的であるRelA mRNAが細胞内に存在しないので、RelA mRNAと類似のアンチセンス配列を有するoff target mRNAに対してハイブリダイズし、2本鎖が形成され、RNaseH1により分解が生じる（図２８Ｂ）。そして、再びASO gap P/Cは1本鎖状態に戻る。この連鎖反応により、次々に標的以外のoff target mRNAの分解が生じてしまう。

Burelらや粕谷らの論文では、肝毒性の主因はgapmerのoff target効果、すなわち標的以外のmRNAでASOの標的配列と似た配列を有したmRNAのRNaseH1依存的な分解だとしている(Burel, S. A., et. al. Nucleic Acid Res., 44:2093-2109, 2016., Kasuya, T., et. al. Sci. Rep., 27;6:30377, 2016.)。

然るに、本発明者らの発明した対称型gapmerは標的を分解しないという特性から、gapmer-標的mRNA間の2本鎖状態は継続し、その結果、細胞内で容易にgapmerが一本鎖状態に戻ることはない。そのためoff target効果の可能性は低く、結果として肝毒性の誘導がきわめて低いレベルに抑えられていると考えられる。よって、図１９にあるようにpoly(A)鎖付加部位を跨ぐ対称型gapmerは、血液中のAST値やALT値の上昇をほとんど誘導しなかったものと考察することができる。

さらに、マウスAcsl1遺伝子のmRNAに対して、上記粕谷らの論文（Kasuya, T., et. al. Sci. Rep., 27;6:30377, 2016.）の情報に従ってgapmer型ASOとnon-gapmer型ASOを準備した。具体的には、gapmer型ASO（表２、SGgapAcsl1）およびそのASOの中央部分の12残基のDNAが連続する箇所の中央に2残基のLNAを導入したASO（表２、SGnon-gapAcsl1）を準備した。さらに、我々は粕谷らの設計したASOと同じ構造を有するASOで、その標的配列のみを変えて準備した。具体的には、Acsl1 mRNAのpoly(A)鎖が付加される部分を跨ぐ対称型ASOのgapmer型（3’-gapAcsl1）およびnon-gapmer型（3’-non-gapAcsl1）を準備した（表２）。各ASOは、株式会社ジーンデザインに合成を依頼し購入した。CがLNA化される場合は、メチルシトシンをLNA化した。全ての塩基間をホスホロチオエート化した。

表２に加えて、3’-gapAcsl1および3’-non-gapAcsl1の塩基配列を配列番号３３に、そしてSGgapAcsl1およびSGnon-gapAcsl1の塩基配列を配列番号３４に示す（gapmer型とnon-gapmer型とでは、LNA化した塩基が異なる以外は同じ塩基配列である）。以下の表２では、LNAを大文字で、DNAを小文字で記した。3’-gapAcsl1および3’-non-gapAcsl1では、１０番目の塩基（3’-gapAcsl1の「t」および3’-non-gapAcsl1の「T」）が、その標的mRNAにおいて切断され、ポリＡが付加されるmRNAの3’-末端の塩基である「mRNAの3’-末端」に対して結合し得る位置の塩基である。

手法：
ICRマウスに腹腔から0.5mg/匹の用量でASOを投与した。ネガティブコントロールとしてPBSを投与した。それぞれ3個体ずつ解析した。

1回目のASO投与をDay.0とすると、投与の２日前（Day.-2）と投与から4日後（Day.4）に採血を行い、肝毒性の指標であるAST値およびALT値を確認した（図３０および３１）。また、Day.4においてマウス肝臓組織を回収し、RNAを抽出して組織中に残されたAcsl1 RNA量を定量PCRにより測定した（図２９）。Acsl1遺伝子の発現量はそれぞれの個体のSpt5量により補正し、1個体あたりに含まれるAcsl1 mRNA量の相対値を表示した（図２９の縦軸「relative quantity/normalized by Spt5」）。Acsl1に対するプライマーセットは下記の2種類を用いた。図２９に、各プライマーセットを用いた場合の結果を示す（Primer-1のセットの結果を「Primer1」、そしてPrimer-2の結果を「Primer2」で表した）。

定量PCRに用いたプライマーセットの各プライマーの配列は以下に示した通りである：
Acsl1 Forward Primer-1：5’-TGCCAGAGCTGATTGACATTC-3’（配列番号３５）
Acsl1 Reverse Primer-1：5’-GGCATACCAGAAGGTGGTGAG-3’（配列番号３６）
Acsl1 Forward Primer-2：5’-ACCAGCCCTATGAGTGGATTT-3’（配列番号３７）
Acsl1 Reverse Primer-2：5’-CAAGGCTTGAACCCCTTCTG-3’（配列番号３８）

AST値、ALT値、Acsl1 mRNA量の平均値から標準偏差を計算し、エラーバーを表記した （図２９Ｂ、図３１）。統計解析ソフトRを用いてANOVAの分散分析を行い、Tukey法により統計学的有意差の検定を行った（***,p＜0.005、*,p＜0.05）。

結果：
図２９は、3’-gapAcsl1、3’-non-gapAcsl1、SGgapAcsl1およびSGnon-gapAcsl1のいずれかを投与したマウスの肝臓中のAcsl1 mRNA量を示し、Ａはそれぞれの投与マウス個体の結果であり、そしてＢは、各投与マウス個体群の平均を示す。ASOを投与したすべての個体群において、PBSを投与した個体群と比較するとAscl1発現量の有意な低下が認められた（図２９Ｂ、p=0.0000063（SGgapAcsl1）、p=0.0046（SGnon-gapAcsl1）、p=0.0000055（3’-gapAcsl1）、p=000043（3’-non-gapAcsl1））。上記粕谷らの論文を参考にして合成した核酸SGnon-gapAcsl1については、gapmer型SGgapAcsl1を投与した個体群と比較して有意な差が認められた（それぞれp=0.0011（Primer1の場合）, p=00091（Primer2の場合））。これに対して、本発明を基にnon-gapmer型として設計したASOを投与した個体群については、gapmer型のASOを投与した個体群と比較すると若干分解は緩やかであるように見えるものの有意な差は認められなかった（それぞれp=0.31（Primer1の場合）、p=0.25（Primer2の場合））。また、non-gapmer型として合成したASOを投与した個体群同士についても有意な差が認められた（図２９Ｂ、p=0.021（SGnon-gapAcsl1 vs. 3’-non-gapAcsl1））

図３０は、3’-gapAcsl1、3’-non-gapAcsl1、SGgapAcsl1およびSGnon-gapAcsl1のいずれかを投与した個々のマウスの血清中のAST値（Ａ）およびALT値（Ｂ）の推移を示し、図３１は、各投与マウス個体群における血清中のAST値（Ａ）およびALT値（Ｂ）の推移の平均を示す。血清中AST値及びALT値を測定した結果、粕谷らの論文において顕著な肝毒性を示すことが報告されているASO（SGgapAcsl1）を投与した個体群でのみ、顕著なAST値及びALT値の上昇が認められた（図３０および図３１、p＜0.05）。本発明のgapmer型ASO（3’-gapAcsl1）を投与した個体群についてのみ、SGgapAcsl1を投与した個体群と有意な差が認められなかった（AST値，p=0.26，ALT値，p=0.066）。

総括：
粕谷らの論文における報告の通り、gapmer型の核酸では著しい遺伝子発現抑制効果が認められ、non-gapmer型では抑制効果は見られなかった。本発明の核酸を投与した個体群では、gapmer型のASOは粕谷らの論文のASOと同程度の遺伝子発現抑制活性を示したものの、肝毒性は生じなかった。さらに、non-gapmer型のASOでもgapmer型ほどではないものの強い遺伝子発現抑制効果を示し、その一方で顕著な肝毒性は認められなかった。以上の結果から、本発明のpoly(A)鎖付加部位を跨ぐASOは、緩やかに標的遺伝子のmRNAを分解、あるいは分解せず、標的遺伝子の発現を抑制している可能性が示された。

本発明者らの開発したASOの有用性
2014年時点で、gapmer活性を利用した核酸医薬品47品目が臨床試験段階にある(Sharma, V.K., et. al., Med.Chem.Comm., 5, 1454-1471, 2014)。しかし、gapmerで特にLNAを採用している場合、甚大な副作用として肝毒性が知られている。これは解決しなければならない危急の課題であった。発明者らは、本発明によりマウスでほとんど肝毒性を示さないASOを創出した。そして、発明者らの開発したASOは、標的mRNAの分解を引き起こさないかほとんど分解しない。この特性により、細胞中におけるoff target効果が抑制されていることがわかった。さらに、non-gapmer構造でありながら、特異的に標的遺伝子の発現を抑制することができるASOの開発にも成功した。先行研究によりnon-gapmer型ASOは肝毒性を誘導しないことが報告されている。よって、発明者らの発明したnon-gapmer型のASOは、今後広範に核酸医薬品開発現場で採用され、今後の核酸医薬品の主流となることが期待される。

参考文献
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本発明は、医薬産業、健康食品産業等に利用可能である。

Claims (13)

1. ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
2. ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列にハイブリダイズし得る配列のみを有するポリヌクレオチド。
3. ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチド。
4. ゲノム配列中、mRNAの3’-末端に対応する塩基から5’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基を含む）、および3’-側の５〜９塩基（mRNAの3’-末端の塩基は含まない）の連続した配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチド。
5. 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
6. 前記ヌクレオチド類似体が、LNA、２’−Ｏ−メチル化RNA、２’−Ｏ−メトキシエチル化RNA、および／またはモルフォリノ核酸である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記ポリヌクレオチドが、前記ヌクレオチド類似体を両末端および中央部に有する非ギャップマーである、請求項５または６に記載のポリヌクレオチド。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有する、遺伝子発現抑制剤。
9. 遺伝子発現抑制剤が、翻訳阻害剤である、請求項８に記載の遺伝子発現抑制剤。
10. 請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有する、医薬、化粧品および／または食品。
11. 請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを投与することを包含する、遺伝子発現抑制方法。
12. 遺伝子発現抑制方法が、翻訳阻害方法である、請求項１１に記載の遺伝子発現抑制方法。
13. 医薬を製造するための、請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。