KR101048415B1 - 마우스 신경아세포종 세포의 내인성 프리온 단백질의 발현을 억제하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 이용한 소해면상뇌증 특이적인 세포 모델 - Google Patents

마우스 신경아세포종 세포의 내인성 프리온 단백질의 발현을 억제하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 이용한 소해면상뇌증 특이적인 세포 모델 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마우스 프리온 유전자의 발현을 억제하는 siRNA(small interfering RNA), 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy; 이하 'BSE'라 약칭함) 특이적인 세포 모델 제조 방법 및 이를 이용한 세포 모델에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 마우스 신경 세포주에 소 프리온 유전자를 삽입하여 외인성 소 프리온 단백질의 발현을 유도하고, siRNA 를 이용하여 내인성 마우스 프리온 단백질의 발현을 억제함으로써 BSE에 특이적인 병원성 기작을 연구하는데 적합한 세포 모델에 관한 것이다.
본 발명은 BSE의 병원성 기작이나 분자세포생물학적 연구의 기본적인 수단으로 사용되어 질병에 대한 이해를 돕고, 이를 바탕으로 BSE 조기진단을 위한 새로운 기법의 개발이나 예방과 치료를 위한 바이오마커 개발의 가능성을 높여 줄 것이다.

Description

마우스 신경아세포종 세포의 내인성 프리온 단백질의 발현을 억제하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 이용한 소해면상뇌증 특이적인 세포 모델{siRNA Sequences Targeting Endogenous Prion Protein of Mouse Neuroblastoma and Bovine Spongiform Encephalopathy Specific Cell Culture Model}
본 발명은 마우스 프리온 유전자(서열 번호 3, Genebank Accession No. NM-011170)의 발현을 억제하는 siRNA(small interfering RNA), 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy)에 특이적인 세포 모델 제조 방법 및 이를 이용한 세포 모델에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 마우스 신경 세포주에 소 프리온 유전자를 삽입하여 외인성 소 프리온 단백질의 발현을 유도하고, siRNA 기법을 이용하여 내인성 마우스 프리온 단백질의 발현을 억제함으로써 BSE에 특이적인 병원성 기작을 연구하는데 적합한 세포 모델에 관한 것이다.
소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy)을 포함한 프리온 질병은 사람을 포함한 여러 동물에서 신경퇴행성 질병을 유발하는 질병으로 세포표면 당단백질인 정상 프리온 단백질 (PrPC)이 비정상 병원성 프리온 단백질 (PrPSc)로 전환 (conversion) 되어 발병한다. PrPSc는 질병을 유발하는 비정상적인 형태이다. 또한, PrPC는 뇌속에 존재하며 코일 모양으로 초촘하게 꼬여있는 불안정하지만 정상적인 종류로 뇌와 다른 조직 세포의 막표면에 정상적으로 존재하는 당단백질이다. PrPSc와 PrPC의 커다란 차이점은 이들의 3차원적 구조인데 P r PC의 경우 β-sheet 구조가 전체의 3 %이고 P r PS c의 경우 약 4 3 %의 β-sheet 구조를 나타낸다는 것이다. 그리고 이와 같은 구조의 변화로 PrPSc 는 PrPC보다 쉽게 f i b r i l을 형성할 뿐만 아니라 세포 안과 밖의 침착으로 인한 아밀로이드 플라크(PrP amyloid plaque)를 형성한다.
프리온 단백질은 정상적인 상태에서는 뇌세포의 활동에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으나 자체 구조를 고도로 안정적인 구조로 변형시키는 성질이 있어 이런 비정상 병원성 프리온 단백질로 변형이 일어날 경우 뇌에 치명적인 분자를 만드는 것으로 알려져 있다. 또한, 자외선이나 방사선, 화학약품에서도 매우 강해 사람들 죽일 수 있는 수천 배의 강도와 용량에서도 파괴되지 않는다. 더구나 비정상 프리온 단백질이 인체 내에 유입되어도 면역계가 이를 감지해 파괴시키지 못해 문제의 심각성이 있다. 이는 침투 당시에는 인체 내에서 만들어낸 단백질처럼 면역계가 인지하지 못하는 구조를 가지고 있다가 시간이 경과함에 따라 마치 일정한 온도에서 특정한 모양을 갖추는 형상기억함금처럼 뇌신경에 독성을 미치는 구조로 변하는 것이다.
프리온 단백에 대한 많은 분자생물학적 연구를 통하여 본 단백의 근원은 외부에서 유입된 병원체의 유전자에서 유래된 이종단백이 아니라 사람의 경우 2 0번 염색체( s h o r tarm of chromosome 20)에서 유래되고 마우스의 경우는 2번 염색체에서 유래되는 동정 단백으로 밝혀졌다. 그 후 프리온 단백을 코딩( c o d i n g )하는 유전자를 사람의 경우 P R N P라고 하며, 마우스는 P r n p로 명명하게 되었다.
특히, 프리온 질병 중 BSE는 원래 소의 해면체성 뇌병증(bovine spongiform encephalopathy, BSE)이라고 불려지는 질환으로 대부분 3년 이상 성장된 소에서 주로 나타나는 퇴행성 신경질환이다. 일명 '광우병(mad cow disease)'으로 불려지고 있다. BSE는 4 년 또는 5 년의 긴 잠복기를 가지며, 보행장애와 비틀거림, 주변에 대한 관심부족, 먹이와 물에 대한 무관심,또는 난폭한 행동 등의 예상치 못한 행동 등의 증상을 보이는 소의 정신상태의 진행성 변성질환이다. 감염된 소는 3~ 10 세령이 되어서야 그 증상이 나타난다. BSE는 1986년 11월에 영국에서 최초 동정된 이래로 100,000 건 이상의 발병이 보고되고 있다. 감염된 소의 뇌의 사후(死後) 분석(post mortem)으로부터 신경세포의 파괴와 비정상 단백질 섬유의 침적으로 인하여 뇌에 스펀지(해면상) 형태의 특이한 패턴의 공포(空胞)가 형성되었음을 확인할 수 있다. 유사한 해면상 질환이 한 세기 이상 동안 사람(예를 들어, 크로이츠펠트-야콥병 또는 (CJD))에게서 알려지고 있으며, 양(스크래피)에게서는 200 년 이상 동안 나타나고 있다. 전염성 해면상 뇌병증의 원인으로 여겨지는 병원체는 프리온(prion)이라 불리는 감염 단백질이다. 핵산을 필요로 하는 일반 바이러스의 경우와 달리, 프리온은 아무런 핵산을 포함히지 않고 단백질로만 이루어진 감염 입자이다. 특히 스크래피에서 감염성으로 공동정제(co-purify)할 수 있는 프리온 단백질 또는 PrPsc 로 알려진 하나의 단백질이 발견되었고, 이를 이용하여 실험실 조건 하의 햄스터 등의 다른 동물에서 추출한 뇌세포 배양물을 스크래피-유사 조건으로 만들 수 있다.
영국의 젖소에게 단백질 보충 사료로서 일상적으로 제공되던 재활용 동물조직(recycled animal tissue)이 감염원으로 동정되었다. 애초 BSE는 스크래피에 감염된 양의 뇌에서부터 퍼지기 시작했고, BSE에 감염되어버린 소의 뇌조직을 섭취함으로써 뜻밖에도 가속적으로 확산된 것으로 여겨진다. 따라서, 영국 정부는 1988년 초반에 감염되었을지도 모르는 동물과 그 사체의 강제 도살을 발표하였다. 1988년 7월, 영국에서는 소에게 동물조직사료를 먹이는 것을 금지시켰다.
이러한 질환의 보고 초기 이후, 특히 뉴기니 원주민의 식인 풍습으로 전염되는 것으로 알려진 관련 질환인 쿠루병이 발생한 이후로, 소비자들은 이러한 질환이 우유나 쇠고기 제품을 통하여 사람에게로 전염될지도 모른다는 두려움에 휩싸였다. 1990년 후반에는 BSE가 사람에게 전염될 수 있다는 소비자들의 우려로 쇠고기 시장이 심각한 타격을 입었으며, 1994년 중반 독일에서도 비슷한 상황이 벌어졌다. 1996년에는 10 건의 새로운 형태의 치명적인 CJD(변이형(Variant) CJD)가 동정되었다. 희생자들은 독특한(distinct) 뇌조직 증상을 보였고, 모두 42 세 이하의 연령이었으며, 질환의 유전 기록도 없었다. 희생자들은 감염되었을지도 모르는 동물의 도살 전에 BSE 감염된 가축과의 접촉을 통하여 상기 질환에 노출될 수 있었다는 설이 있다. 변이형 CJD의 동정으로 영국에서의 쇠고기 소비가 엄청나게 줄어들었고, 전세계 각국에서는 영국 쇠고기 수입과 몇몇 경우에는 아일랜드 쇠고기 수입을 금지하는 명령을 선포하였다. 따라서, BSE에 대한 심도 깊은 연구가 요구된다.
RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 모든 진핵세포에 이중 가닥 RNA(dsRNA)을 도입함으로써 (내인성과 외인성) 유전자의 발현이 억제되는 진화적으로 보존되어 있는 과정이다. RNAi는 긴 dsRNA를 21-23 nt의 작은 간섭 RNA(shortinterfering, siRNA)로 연속적으로 절단하는 Dicer라 부르는 RNase III-유사 엔도뉴클라제에 의해 개시된다(Bernsteinet al., Nature, 409: 363, 2001). siRNA는 ATP 존재하에서 siRNA를 푸는 RNA-유도된 침묵화 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 삽입된다(Hammond et al., Nature, 404: 293, 2000). RISC에 삽입된 안티센스 RNA는 상동 RNA를 인지하고 세포내 세포질에서 그의 분해를 유도한다. 30 nt 이상의 dsRNA는 비특이적인 인터페론 반응을 유도하여 단백질 키나제 K(protein kinase K, PKR) 및 RNase L을 활성화시킨다 (Balachandran et al., Immunity, 13: 129, 2000). PKR 및 RNase L 활성의 유도는 궁극적으로 포유동물 세포에서 비특이적으로 mRNA를 분해하고, mRNA의 번역을 억제한다. 그러나 siRNA는 인터페론 경로는 피하고 염기서열 특이적으로 유전자 침묵화를 유도할 수 있을 만큼 충분히 짧다 (Elbashir et al., Nature, 411: 494, 2001). siRNA의 생성은 부분적으로 또는 전체적으로 긴 dsRNA를 가지고 있는 전이인자 (transposon), 전이유전자 (transgene) 및 바이러스에 의한 유전적 침입을 보호하는 것으로 예상된다 (Plasterk, Science, 296: 1263, 2002; Zamore, Science, 296: 1265, 2002; Hannon, Nature, 418: 244, 2002). siRNA는 이와 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA (messenger RNA)에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀져 있다. siRNA 기법은 현재 가장 강력한 유전자 침묵 (gene-silencing) 기법으로 고려되고 있다. 크게 siRNA, shRNA (short hairpin RNA), 및 miRNA (micro RNA)로 구분되며 이들을 포괄적으로 RNAi (RNA interference)라고 부른다.
많은 연구자들이 RNAi 기법을 동물세포배양 및 동물모델을 대상으로 유전자 기능 분석을 비롯한 다양한 연구에 적용하고 있다: 1) 특정 유전자의 기능에 관한 연구, 2) 세포 배양 모델을 이용한 신약 개발 연구, 3) 암의 발생부터 말기까지 진행되는 과정에 관련 연구, 4) 암 또는 바이러스성 질환에 대한 치료제 개발, 5) siRNA 라이브러리 (library) 구축을 통하여, 인체 질환과 관련된 모델 시스템을 개발하고 각종 유전자들의 연구에 이용하고 있다.
프리온 질병의 임상적, 병리학적 증상은 각각의 프리온 스트레인 (strain)들과 숙주 종 (species)에 따라 서로 상이한 것으로 알려져 있다. 기존의 유전자 도입 마우스를 이용한 연구 결과들은 프리온 생물학에 관한 중요한 정보들을 축적시켰다. 하지만 프리온 도메인 (domain), 아미노산 잔기 (amino acid residue), 종 특이 (species-specific) 발병 기전 등, 서로 다른 프리온 스트레인들과 변종 (mutant)들이 요구되는 연구에 종 특이적인 유전자 도입 마우스를 적용하는 것은 한계가 있다.
따라서 BSE의 연구를 위한 세포 모델의 개발은, 병원성 프리온 단백질의 형성과 관계된 아미노산 서열의 분자적 메커니즘 또는 정상 프리온 단백질에서 병원성 프리온 단백질로의 전환에 있어서 프리온 도메인의 구조적 특성 등 프리온 스트레인들과 숙주 종에 따라 그 성격을 달리하는 기전을 이해하는데 필수적이다. 하지만, 현재 BSE 연구는 마우스 모델과 햄스터 (hamster) 모델에 국한되어 있는 상황이다.
이에 본 발명자들은 소 프리온 단백질을 발현하고 내인성 마우스 프리온 단백질의 발현을 억제함으로써 BSE의 기초 연구를 위한 세포 모델을 제공할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 프리온 스트레인들과 숙주 종에 따라 그 성격을 달리하는 BSE의 연구 모델을 개발하고자 마우스 프리온 유전자의 발현을 억제하는 siRNA, BSE 특이적인 세포 모델 제조 방법 및 이를 이용한 세포 모델을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 마우스 프리온 유전자 (서열 번호 3으로 표시되는 NM-011170 유전자)의 발현을 억제하는 서열 번호 1로 표시되는 siRNA (small interfering RNA) 및 마우스 프리온 유전자의 발현을 억제하는 서열 번호 2로 표시되는 siRNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 소 프리온 유전자 (boPrnp ORF, 서열 번호4로 표시되는 AF517842 유전자)를 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하는 제1단계; 2) 상기 벡터를 형질 감염 운반체를 통하여 마우스 신경 세포주 내로 이식하는 제2단계; 3) 상기 마우스 신경 세포주에 제1항 또는 제2항의 siRNA을 도입하여 마우스 프리온 단백질의 발현을 억제하는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 소해면상뇌증 (Bovine Spongiform Encephalopathy) 특이적 세포 모델 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 소해면상뇌증 특이적 세포 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 모델을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열 번호 1 로 표시되는 siRNA 또는 서열 번호 2 로 표시되는 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터를 제공한다.
본원에 사용된 모든 과학적 및 기술적 용어들은 달리 명시되지 않는 한 당해 분야에 통상적으로 사용된 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 다음 단어들은 명시된 의미를 갖는다.
본 발명의 "마우스 프리온 유전자"란 정상 프리온 단백질 (PrPC)또는 비정상 병원성 프리온 단백질 (PrPSc)을 발현하는 유전자를 말한다. 본 발명의 "내인성 마우스 프리온 유전자"란 마우스가 본래 가지고 있는 프리온 유전자를 의미한다.
본 발명의 "소 프리온 유전자"란 정상 프리온 단백질 (PrPC)또는 비정상 병원성 프리온 단백질 (PrPSc)을 발현하는 유전자를 말한다. 본 발명의 "외인성 소 프리온 유전자"란 외부에서 도입된 소 프리온 유전자를 의미한다.
본 발명의 "siRNA(small interfering RNA)"란 ds(double-strand)RNA가 dicer에 의해 절단되어 생성되는 21~25nt(nucleotide)크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 기능을 하는 것을 의미한다.
본 발명의 "소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE)"이란 프리온 단백질의 화학구조에 의해 발생하며, 소의 뇌에 구멍이 생겨 갑자기 포악해지고 정신 이상과 거동불안 그리고 난폭해지는 등의 행동을 보이는 것이 특징인 질환을 말한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 마우스 프리온 유전자(Genebank accession No.NM-011170, 서열번호 3)의 발현을 억제하는 서열 번호 1로 표시되는 siRNA 및 마우스 프리온 유전자의 발현을 억제하는 서열 번호 2로 표시되는 siRNA를 제공한다.
소 프리온 유전자 (Genebank accession No. AF517842, 서열번호 4) 염기 서열과 정렬시켜 상동성(homology)이 적은 염기서열을 표적 부위로 선발한다.
소 프리온 유전자(Genebank accession AF517842)의 염기서열은 이하와 같다.(서열 번호 4)
1 atggtgaaaa gccacatagg cagttggatc ctggttctct ttgtggccat gtggagtgac
61 gtgggcctct gcaagaagcg accaaaacct ggaggaggat ggaacactgg ggggagccga
121 tacccaggac agggcagtcc tggaggcaac cgttatccac ctcagggagg gggtggctgg
181 ggtcagcccc atggaggtgg ctggggccag cctcatggag gtggctgggg ccagcctcat
241 ggaggtggct ggggtcagcc ccatggtggt ggctggggac agccacatgg tggtggaggc
301 tggggtcaag gtggtaccca cggtcaatgg aacaaaccca gtaagccaaa aaccaacatg
361 aagcatgtgg caggagctgc tgcagctgga gcagtggtag ggggccttgg tggctacatg
421 ctgggaagtg ccatgagcag gcctcttata cattttggca gtgactatga ggaccgttac
481 tatcgtgaaa acatgcaccg ttaccccaac caagtgtact acaggccagt ggatcagtat
541 agtaaccaga acaactttgt gcatgactgt gtcaacatca cagtcaagga acacacagtc
601 accaccacca ccaaggggga gaacttcacc gaaactgaca tcaagatgat ggagcgagtg
661 gtggagcaaa tgtgcattac ccagtaccag agagaatccc aggcttatta ccaacgaggg
721 gcaagtgtga tcctcttctc ttcccctcct gtgatcctcc tcatctcttt cctcattttt
781 ctcatagtag gatag
서열 번호 1로 표시되는 siRNA의 염기서열은 Genebank accession No. NM_011170인 마우스 프리온 유전자의 182부터 206 뉴클레오타이드를 표적화 (targeting)한 것이다. 또한, 서열 번호 2로 표시되는 siRNA의 염기서열은 819부터 843 뉴클레오타이드를 표적화 (targeting) 한 것이다. 하기와 같은 염기서열을 갖는다. (표 1 및 도 4 참고)
siRNA 시작 뉴클레오타이드 염기서열 ( 5′- 3′) 끝 사이즈
서열번호1 182 GGCCCTCTTTGTGACTATGTGGACT 206 25mer
서열번호2 819 CAGGCCTATTACGACGGGAGAAGAT 843 25mer
마우스 프리온 유전자(Genebank accession NM_011170)의 염기 서열은 이하와 같다.(서열 번호 3)
1 gtcggatcag cagaccgatt ctgggcgctg cgtcgcatcg gtggcaggac tcctgagtat
61 atttcagaac tgaaccattt caaccgagct gaagcattct gccttcctag tggtaccagt
121 ccaatttagg agagccaagc agactatcag tcatcatggc gaaccttggc tactggctgc
181 tggccctctt tgtgactatg tggactgatg tcggcctctg caaaaagcgg ccaaagcctg
241 gagggtggaa caccggtgga agccggtatc ccgggcaggg aagccctgga ggcaaccgtt
301 acccacctca gggtggcacc tgggggcagc cccacggtgg tggctgggga caaccccatg
361 ggggcagctg gggacaacct catggtggta gttggggtca gccccatggc ggtggatggg
421 gccaaggagg gggtacccat aatcagtgga acaagcccag caaaccaaaa accaacctca
481 agcatgtggc aggggctgcg gcagctgggg cagtagtggg gggccttggt ggctacatgc
541 tggggagcgc catgagcagg cccatgatcc attttggcaa cgactgggag gaccgctact
601 accgtgaaaa catgtaccgc taccctaacc aagtgtacta caggccagtg gatcagtaca
661 gcaaccagaa caacttcgtg cacgactgcg tcaatatcac catcaagcag cacacggtca
721 ccaccaccac caagggggag aacttcaccg agaccgatgt gaagatgatg gagcgcgtgg
781 tggagcagat gtgcgtcacc cagtaccaga aggagtccca ggcctattac gacgggagaa
841 gatccagcag caccgtgctt ttctcctccc ctcctgtcat cctcctcatc tccttcctca
901 tcttcctgat cgtgggatga gggaggcctt cctgcttgtt ccttcgcatt ctcgtggtct
961 aggctggggg aggggttatc cacctgtagc tctttcaatt gaggtggttc tcattcttgc
1021 ttctctgtgt cccccatagg ctaatacccc tggcactgat gggccctggg aaatgtacag
1081 tagaccagtt gctctttgct tcaggtccct ttgatggagt ctgtcatcag ccagtgctaa
1141 caccgggcca ataagaatat aacaccaaat aactgctggc tagttggggc tttgttttgg
1201 tctagtgaat aaatactggt gtatcccctg acttgtaccc agagtacaag gtgacagtga
1261 cacatgtaac ttagcatagg caaagggttc tacaaccaaa gaagccactg tttggggatg
1321 gcgccctgga aaacagcctc ccacctggga tagctagagc atccacacgt ggaattcttt
1381 ctttactaac aaacgatagc tgattgaagg caacaggaaa aaaaaaatca aattgtccta
1441 ctgacgttga aagcaaacct ttgttcattc ccagggcact agaatgatct ttagccttgc
1501 ttggattgaa ctaggagatc ttgactctga ggagagccag ccctgtaaaa agcttggtcc
1561 tcctgtgacg ggagggatgg ttaaggtaca aaggctagaa acttgagttt cttcatttct
1621 gtctcacaat tatcaaaagc tagaattagc ttctgcccta tgtttctgta cttctatttg
1681 aactggataa cagagagaca atctaaacat tctcttaggc tgcagataag agaagtaggc
1741 tccattccaa agtgggaaag aaattctgct agcattgttt aaatcaggca aaatttgttc
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또한, 내인성 마우스 프리온 유전자를 표적화 (targeting)하는 siRNA는 소 프리온 유전자와 오프-타겟 효과 (off-target effect)가 없도록 디자인하는 것이 바람직하다. 본 발명의 "오프-타겟 효과 (off-target effect)"란 도입한 siRNA에 의해 target mRNA 즉, 마우스 프리온 유전자의 mRNA가 아닌 소 프리온 유전자의 mRNA가 RNAi의 대상이 되어 non-specific knock-down 현상이 일어나는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시 태양에서, 합성 siRNA는 생리학적 안정성을 획득하고 세포 내의 분포를 추적하기 위하여 화학적 유도체 또는 태그-분자로 변형될 수 있다.
본 발명의 siRNA는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는, 즉 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 siRNA 서열(서열번호 1, 서열번호 2)과 70% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘 (Altschul, S. F. J. Mol . Biol. 219, 555-565, 1991; Henikoff, S. and Henikoff, J. G. Proc . Natl . Acad . Sci. USA 89, 10915-10919, 1992)을 이용하여 폴리뉴클레오타이드의 서열을 표적 폴리뉴클레오타이드의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다(Caruthers et al., Methods in Enzymology, 211: 3,1992; Wicott et al., Nucleic Acids Res, 23: 2677, 1995; Brennan et al., Biotechnol Bioeng, 61: 33, 1998). siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당 업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002), 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR et al., Science 296:550-553, 2002), 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 (Lee NS et al., Nature Biotechnology 20:500-505, 2002) 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법(Castanotto D et al., RNA 8:1454-1460, 2002) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
siRNA를 제조하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.
siRNA의 2차 구조에 따라 유전자 억제력에 차이가 있고 표적 mRNA와 siRNA가 서로 접근하기 쉬운 2차 구조를 가졌을 때, 그렇지 않은 경우보다 무려 1,000배의 IC50 값의 차이를 보일 수 있다. RNA의 2차 구조를 예측한 후 구조적으로 표적 RNA에 가장 접근이 쉬운 siRNA를 선택할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 통해 RNA의 2차 구조를 예측하여 유전자 억제력이 뛰어날 것으로 예측되는 siRNA를 선택한다. siRNA의 유전자 억제력을 조사하기 위한 대조군으로는 GAPDH같은 housekeeping 유전자와 함께, 제놈상의 유사성이 없도록 고안된 scrambled siRNA를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 소 프리온 유전자(boPrnp ORF)를 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하는 제1단계; 2) 상기 벡터를 형질 감염 운반체를 통하여 마우스 신경 세포주 내로 이식하는 제2단계; 및 3) 상기 마우스 신경 세포주에 제1항 또는 제2항의 siRNA을 도입하여 마우스 프리온 단백질의 발현을 억제하는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy) 특이적 세포 모델 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 siRNA 또는 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터는 리포솜, 하이드로겔, 세포흡착 미소구체 등과 같은 형질감염 운반체를 사용하여 표적 세포로 전달되어 질 수 있다(Akhtar et al., Trends Cell Bio, 2: 139, 1992).
보다 바람직하게는 리포솜을 통해 신경 세포주로 전달시키는 것이다. 리포솜은 세포막의 구성성분인 인지질로서 약물이나 기타 단백질 등 다양한 외래 물질을 세포 내에 이식하기 위한 운반체로 사용될 수 있다.
가장 바람직하게는 양전하를 띤 리포솜을 통해 신결 세포주 내로 전달시키는 것이 바람직하다. 양전하를 띤 리포솜은 음전하를 가진 siRNA와 반응하여 siRNA를 둘러싸 복합체 형태를 이루게 되고, 양전하를 띄는 복합체는 다리 음전하의 세포막과 반응하여 siRNA를 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주 신경 세포주에 siRNA의 도입은 인산칼슘를 이용한 형질감염(Graham, F.L. 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염(Wong, T.K. 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법(Neumann E. 등, EMBO J., 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션과 같이 문헌(Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 제조될 수 있다.
보다 바람직하게는 트랙스펙션에 의한다. 트랜스펙션 효율은 세포의 종류 뿐만 아니라 세포 배양조건, 트랜스펙션 시약 등에 따라 많은 차이가 날 수 있다.
본 발명에서 siRNA의 도입 대상이 되는 신경 세포주는 50 passage 이하의 세포를 사용하는 것이 바람직하나 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 Ambion의 SilencerTM siRNA Transfection Kit를 트랜스펙션 시약으로 사용하는 것이 바람직하나 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 마우스 신경 세포주는 N2a (마우스 신경아세포종, mouse neuroblastoma)인 것을 특징으로 한다. 지속적인 감염 유지를 위해, 본 발명에서는 N2a 세포주를 소해면상뇌증 특이적인 세포 모델 개발을 위한 세포주로 하는 것이 바람직하나 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 siRNA의 농도는 각각 20~400nM 임을 특징으로 한다. siRNA의 농도를 높일 경우 비특이적으로 많은 유전자가 억제될 가능성이 있다. 따라서 각각의 세포마다 적절한 농도의 siRNA를 사용하여야 특이적 유전자 억제를 기대할 수 있다. 본 발명에서는 세포주에 siRNA 농도 20~400nM를 사용하여 마우스 프리온 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
마우스 프리온 유전자의 발현 억제 정도를 분석하기 위해서 RNA나 단백질의 변화를 측정하거나 리포터의 활성을 측정할 수 있다. Northern, RT-PCR, Western등의 방법이 사용될 수 있으며, GFP나 luciferase등의 리포터 유전자가 사용될 수 있다. Rhodamine-tagged siRNA등을 제작하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy) 특이적 세포 모델을 제공한다. 본 발명에서 siRNA 트렌스펙션 후 48시간 정도 경과한 후의 세포 모델이 마우스 프리온 유전자 발현 억제율이 가장 높아 소해면상뇌증 특이적 세포 모델로 바람직하다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy) 특이적인 세포 배양 모델은 질병의 병원성 기작이나 분자세포생물학적 연구의 기본적인 수단으로 사용되어 질병에 대한 이해를 돕고, 이를 바탕으로 소해면상뇌증의 조기진단을 위한 새로운 기법의 개발이나 예방과 치료를 위한 바이오마커 개발의 가능성을 높여 줄 것이다.
도 1은 소 프리온 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 genomic PCR의 결과 사진이다. Lane 1번은 100bp size marker, lane 2번부터 4번은 소 프리온 유전자가 삽입된 세포 클론, lane 5번부터 7번은 벡터만 삽입된 세포 클론, lane 8번은 음성 대조군이다.
도 2는 삽입된 소 프리온 유전자의 전사를 확인한 RT-PCR 결과이다. Lane 1번은 100bp size marker, lane 2번과 3번은 소 프리온 유전자가 삽입된 세포 클론, 4번은 벡터만 삽입된 세포 클론, 5번은 N2a 음성 대조군, 6번은 소 프리온 유전자가 삽입된 벡터로 양성 대조군, 7번은 음성 대조군이다. (가)는 RT-PCR이고 (나)는 역전사 효소 없이 DNA 중합효소만 첨가된 실험군이다.
도 3은 삽입된 소 프리온 유전자의 단백질 발현을 확인하기 위한 Western blot 결과이다. (가)는 프리온 단백질에 특이적인 단클론 항체인 3F10과 (위) GAPDH에 특이적인 다클론 항체를 (아래) 이용하여 Western blot을 실시하였다. (나)는 densitometry를 이용하여 Western blot 를 평가한 결과이다. N2a는 소 프리온 유전자를 삽입하지 않은 세포이고 NbP는 N2a 세포에 소 프리온 유전자를 삽입한 세포이다.
도 4는 내인성 마우스 프리온 유전자 (Genebank accession No. NM_011170, 서열번호 3)의 발현을 억제하기 위해 디자인된 siRNA의 표적 염기서열을 표로 나타낸 것이다. 소 프리온 유전자 (Genebank accession No.AF517842, 서열번호 4) 염기 서열과 alignment를 실시하여 상동관계 (homology) 적은 염기서열을 표적 부위로 선발하였다. siRNA 1번 염기서열은 Genebank accession 번호 NM_011170인 마우스 프리온 유전자의 182부터 206 뉴클레오타이드를 표적화 (targeting)하고 siRNA 2번 염기서열은 819부터 843 뉴클레오타이드를 표적화한다.
도 5는 디자인된 siRNA에 의한 마우스 프리온 유전자의 전사 억제 정도를 확인하기 위한 real-time RT-PCR 결과이다. N2a 세포를 서로 다른 농도의 서열 번호 1로 표시되는 siRNA (위)과 서열 번호 2로 표시되는 siRNA(아래)을 트렌스펙션 (transfection)한 후, 마우스 프리온 유전자의 전사 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 디자인된 서열 번호 1로 표시되는 siRNA과 서열 번호 2로 표시되는 siRNA에 의한 마우스 프리온 유전자의 전사 억제 정도를 확인하기 위한 Western blot 결과이다. (가)는 프리온 단백질에 특이적인 단클론 항체인 3F10과 (위) GAPDH에 특이적인 다클론 항체를 (아래) 이용하여 Western blot을 실시한 것을 나타낸다. (나)는 densitometry를 이용하여 Western blot 를 평가한 결과이다. N2a는 소 프리온 유전자를 삽입하지 않은 세포이고 NbP는 N2a 세포에 소 프리온 유전자를 삽입한 세포이다.
도 7은 시간 경과에 따른 프리온 유전자 발현 억제 효율을 확인하기 위한 Western blot 결과이다. NbP 세포주에 100nM 농도의 서열 번호 1로 표시되는 siRNA과 서열 번호 2로 표시되는 siRNA을 각각 주입하고 24, 48, 72, 96시간에 세포를 수거하여 Western blot를 실시한 것을 나타낸다. (가)는 프리온 단백질에 특이적인 단클론 항체인 3F10과 (위) GAPDH에 특이적인 다클론 항체를 (아래) 이용하여 Western blot 결과이며, (나)는 densitometry를 이용하여 Western blot 를 평가한 결과이다.
이하에서는 본 발명을 하기의 실시를 위한 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실기 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 소 프리온 유전자의 발현 벡터에의 클로닝
소 프리온 유전자 (boPrnp ORF)를 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하고 퓨로마이신 (puromycine)으로 약제선발 (drug selection)을 하였다. 한계희석 (limiting dilution) 기법을 이용하여 세포 클론 (cell clone)을 확보하였다.
< 실시예 2> 소 프리온 유전자의 삽입 여부 확인
소 프리온 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위해 사용된 벡터에 대하여 증폭산물의 크기가 300bp가 되도록 벡터 프라이머 (vector primer)를 제작하여 genomic PCR를 실시하였다. boPrnp가 삽입된 클론에서는 1095bp의 양성 증폭산물 (positive amplicon)이 확인되었고, 벡터만 삽입된 클론에서는 300bp의 음성 증폭산물 (negative amplicon)이 확인되었다 (도1).
< 실시예 3> 삽입된 소 프리온 유전자의 전사 ( transcription ) 여부 확인
소 프리온 유전자 삽입이 확인된 클론에 대하여 소 프리온 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 RT-PCR을 실시하여 유전자의 전사 (transcription)을 확인하였다. 동시에 정제된 total RNA에 DNA 오염 (contamination) 여부를 확인하기 위해 역전사 효소 (reverse-transcriptase) 없이 DNA 중합효소 (polymerase)만 첨가된 실험군에 대한 RT-PCR를 실시하였다. 도 2에서 보듯이, 소 프리온 유전자가 삽입된 클론에서 795bp의 양성 증폭산물이 확인되었으나 벡터만 삽입된 클론과 및 유전자를 삽입하지 않은 N2a 대조구에서는 반응이 확인되지 않았고, DNA 오염에 의한 의양성 (false-positive) 반응도 없는 것으로 확인되었다.
< 실시예 4> 삽입된 소 프리온 단백질의 발현 여부 확인
삽입된 소 프리온 단백질의 발현을 확인하기 위해 단클론 항체인 3F10을 이용하여 Western blot을 실시하였다. 단클론 항체로 프리온 단백질의 발현을 확인한 후, blotting 막 (membrane)을 스트리핑 (stripping) 하였고 동일한 방법으로 세포 마커 (cellular marker)인 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 특이적인 항체와 반응시켰다. 도 3에서 보듯이, Western blot 결과, 대조구 N2a 세포와 비교하여 소 프리온 유전자가 삽입된 N2a 세포 (NbP)에서 발현된 프리온 단백질은 약 2kDa 정도 크기가 컸으며, 발현량도 각각 1.2배 많게 나타났다.
< 실시예 5> siRNA 합성
소 프리온 유전자의 발현이 확인된 NbP 세포주에 대하여 내인성 마우스 프리온 단백질의 발현을 억제 위해 siRNA를 디자인하였다. siRNA는 이미 삽입된 소 프리온 유전자와 교차 반응이 없도록 제작되었으며, 발현 억제 효율을 확인하기 위한 real time RT-PCR 프라이머 및 probe도 마우스 프리온 유전자에만 특이적으로 반응하도록 디자인하였다. siRNA는 Invitrogen사의 Stealth RNAi를 사용하였고 algorithm을 이용하여 10개의 target site를 확보하였다. Alinement를 실시하여 siRNA는 소 프리온 유전자와 상동관계 (homology)가 적은 2개의 염기서열을 최종적으로 선발하였다 (도4). siRNA 1번 염기서열은 Genebank accession 번호 NM_011170인 마우스 프리온 유전자의 182부터 206 뉴클레오타이드를 표적화 (targeting)하고 siRNA 2번 염기서열은 819부터 843 뉴클레오타이드를 표적화한다. siRNA의 효율은 target sequence의 선발과 동시에 디자인된 siRNA가 모든 cell에 충분히 transfection 되어야 하기 때문에 실험에 앞서, siRNA와 동일 size이며 FITC가 label된 dsRNA oligomer (200nM of BLOCK-iT fluorescent oligo)를 이용하여 transfection 효율을 확인하였다. 다양한 조건에서 BLOCK-iT fluorescent oligo와 transfection reagent를 반응시켜 90% 이상의 cell이 transfection될 수 있는 조건을 확립하고, 디자인된 siRNA를 transfection 하였다.
< 실시예 6> siRNA transfection
siRNA를 transfection하기 위해 우선, 실험 전날 N2a 를 2.5X104이 되도록 24well plate에 subculture를 하고 lipofectamine 2000을 이용하여 antibiotics가 포함되지 않은 serum-free medium에서 6시간 동안 transfection을 실시하였다.
< 실시예 7> siRNA 에 의한 마우스 프리온 단백질의 발현 억제 효율 확인
N2a에 siRNA를 트렌스펙션하고 24시간 후 siRNA에 의한 마우스 프리온 단백질의 발현 억제 효율을 확인하기 위해 real-time RT-PCR과 Western blot을 실시하였다. 각각 0, 20, 100, 200, 300, 400 nM 농도의 siRNA 1번과 2번을 처리하여 내인성 마우스 프리온 유전자의 발현 억제를 유도하였다. Real time RT-PCR 결과, 대조구에 비해 200nM의 siRNA 1번과 300nM의 siRNA 2번으로 처리된 세포에서 90% 이상 표적 마우스 유전자의 발현이 억제되었음을 확인하였다 (도5). Wester blot 결과도 real time RT-PCR과 동일한 패턴을 보였고 (도6), 시간 경과에 따른 프리온 유전자 발현 억제 효율은 siRNA 트렌스펙션 후 48시간 시점에서 94.9%와 96.6%로 가장 높게 나타났으며 점차 효율이 낮아지는 양상을 보였다 (도7).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열 번호2로 표시되는 siRNA(small interfering RNA).
  2. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 마우스 프리온 유전자(서열 번호 3, Genebank Accession No.NM_011170)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 서열 번호2의 siRNA.
  3. 소 프리온 유전자(boPrnp ORF, 서열 번호4)를 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하는 제1단계;
    상기 벡터를 형질감염 운반체를 통하여 마우스 신경 세포주 내로 이식하는 제2단계; 및
    상기 마우스 신경 세포주에 서열번호 2로 표시되는 siRNA를 도입하여 마우스 프리온 단백질의 발현을 억제하는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy)에 특이적인 세포 모델 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 마우스 신경 세포주는 N2a (mouse neuroblastoma)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 마우스 신경 세포주는 50 passage 이하의 세포임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 siRNA의 농도는 20~400nM 인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 siRNA의 도입은 트랜스펙션 (transfection)에 의함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 소해면상뇌증에 특이적인 세포모델.

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