KR20060025647A

KR20060025647A - 동물에서 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법

Info

Publication number: KR20060025647A
Application number: KR1020040074388A
Authority: KR
Inventors: 강춘; 박미선; 정윤석; 김민경
Original assignee: 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2006-03-22
Also published as: KR100741374B1

Abstract

본 발명은 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 이중가닥 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 전기 siRNA를 이용하여, 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법은 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 이중가닥 siRNA를 세포내로 도입시켜, 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 본 발명의 siRNA를 이용할 경우, 아데노바이러스 E1A 유전자의 발현을 저해하여, 아데노바이러스의 증식을 억제시킬 수 있으므로, 아데노바이러스의 감염으로 인하여 유발되는 질환의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

아데노바이러스, E1A, 작은 간섭 RNA(siRNA)

Description

동물에서 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법{Method for Inhibiting Proliferation of Adenovirus in Animal}

도 1은 아미노산 서열에 기초한 다양한 아데노바이러스의 E1A 지역의 계통학적 유연관계를 나타내는 계통수이다.

도 2는 본 발명의 siRNA로 형질전환된 A549세포를 Adv 2K2/507/KNIH로 감염시킨 뒤, 플라크형성 정도를 보여주는 사진이다.

도 3a는 바이러스 감염후 1일부터 5일까지 1일 단위로 수득한 세포로부터 아데노바이러스 E1A mRNA의 수준을 실시간 RT-PCR을 통하여 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3b는 도 4a의 점선부분을 확대한 그래프이다.

도 4는 Adv 2K2/507/KNIH에 대한 형광분석결과를 보여주는 사진이다.

도 5a는 Adv 2K2/507/KNIH에 대한 siRNA 295의 바이러스 증식 억제정도를 나타내는 플라크 감소분석결과를 나타내는 그래프이다.

도 5b는 Adv 2K2/507/KNIH에 대한 siRNA 499의 바이러스 증식 억제정도를 나타내는 플라크 감소분석결과를 나타내는 그래프이다.

도 6a는 본 발명의 siRNA 295로 형질전환되고 Adv11 프로토타입 스트레인에 감염된 세포로부터 mRNA를 추출하여 수행한 실시간 RT-PCR반응 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6b는 본 발명의 siRNA 499로 형질전환되고 Adv11 프로토타입 스트레인에 감염된 세포로부터 mRNA를 추출하여 수행한 실시간 RT-PCR반응 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 Adv11 프로토타입 스트레인에 대한 siRNA 295 및 siRNA 499의 플라크 형성 억제정도를 보여주는 사진이다.

본 발명은 동물에서 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 이중가닥 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 전기 siRNA를 이용하여, 동물에서 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.

아데노바이러스(Adv) 과(family)는 51가지의 공지된 혈청형(serotype)으로 구성되어 있으며, A 내지 F의 6개의 아과(subgenera)로 구분된다. 아데노바이러스는 호흡기관, 소장관, 결막 및 기타 기관에 감염되고, 감염에 의한 임상적 증상은 매우 다양하며, 대부분은 경증이고 특별한 화학적 요법없이도 자연적으로 치료되나, 백혈병, 에이즈, 신장 또는 골수이식 환자 등 면역력이 떨어진 환자의 경우에는 심각한 아데노바이러스 감염증이 나타날 수 있다. 특히, Adv 혈청형 11은 출혈성 방광염(hemorrhagic cystitis)이나 골수 수령자 및 에이즈 환자와 같이 면역력이 떨어진 환자에게서 심각한 호흡기 및 비뇨기 감염을 일으키는 원인으로 알려져 있어서, 증상에 대한 신속한 화학요법의 개발히 절실히 요구되고 있는 실정이다(참조: Eiichi Kodama et al., Antiviral Research, 31:159-164, 1996; Ya-Fang Mei et al, Journal of General Virology, 84:2061-2071, 2003).

아직까지, 아데노바이러스에 대한 효과적인 항바이러스 화학요법은 없는 실정이나, 몇몇 연구진에 의하여 아데노바이러스에 대한 생체외에서 항바이러스 활성을 가진 일부 제제들이 보고되고 있다(참조: Eiichi Kodama et al., Antiviral Research, 31:159-164, 1996; Hiatoshi Kaneto et al., Antiviral Research, 52:281-288, 2001). 예를 들어, 히드록시포스포닐메톡시프로필((S)-1-(3-hydroxy-2-phosphonylmethoxy propyl) cytosine, HPMPC) 및 잘시타빈(zalcitabine)으로 불리우는 2',3'-디디옥시시티딘(2',3'-dideoxycytidine, ddC)이 아데노바이러스 증식을 억제하는 것으로 알려졌다. 전기 HPMPC는 토끼에서 국소적으로 사용할 경우, 아데노바이러스의 안구감염을 억제할 수 있는 것으로 알려졌으며(참조: Gordon Y. J. et al, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35(12):4135-4143, 1994), HIV(human immunodeficiency virus)의 역전사효소 억제제로 알려진 ddC는 생체내 또는 생체외에서 항 아데노바이러스 활성을 보이는 것으로 알려졌다(참조: Mentel R and Wegner U., Antiviral. Res., 47(2):79-87, 2000). 그러나, HPMPC를 Adv 감염에 의한 각결막염(keratoconjunctivitis)의 치료에서 안약으로 사용되는 점을 제외하고는 HPMPC 및 ddC 모두 임상적으로 사용되고 있지 않으며, 현재까지 아데노바이러스 감염에 대하여 특이적이고 효과적인 항바이러스 화학요법은 개발되고 있지 않다.

아데노바이러스 증식 주기는 초기와 후기의 두 단계로 구분된다. 6개의 구분되는 초기 지역은 E1A, E1B, E2A, E2B, E3 및 E4이다. E1 지역은 감염직후 즉각적으로 전사되는 유일한 지역으로 최초로 형성되는 mRNA 및 단백질은 E1A이다. Adv11의 E1A 지역에서 다양한 스플라이싱 양상을 갖는 세 개의 다른 ORF(open reading frame) 유형이 확인되었다. E1A를 암호화하는 스플라이싱된 E1A mRNA는 감염 초기 단계에서 발현된다. E1A 단백질은 초기 바이러스 프로모터로부터의 전사를 활성화시키는데, 이를 위하여는 E1A내의 40개의 아미노산으로 구성된 징크 핑거(zinc finger) 활성화 도메인이 필요하다(참조: Gang Wang and Arnold J. Berk, J. Virology, 76(18):9186-9193, 2002; Ya-Fang Mei et al., Journal of General Virology, 84:2061-2071, 2003). 아울러, E1A 단백질은 세포내 전사조절자와의 상호작용을 통하여 감염된 세포내에서 유전자 발현을 재조정하는 역할을 수행한다(참조: Nikita Avvakumov et al., Journal of General Virology, 83:517-524, 2002; Tiejun Zhao, et al., Cancer Research, 63:3073-3078, 2003).

한편, RNA 간섭(RNAi) 현상은 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의하여 염기서열 특이 적인 mRNA의 분해되는 과정을 의미한다(참조: Qing Ge et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 100(5):2718-2723, 2003). 최근에는, 유전자 발현을 저하시키거나 차단하는 RNAi 현상이 다양한 포유동물에서도 관찰되었다(참조: Matthew McCown et al., Virology, 313:514-524, 2003). 작은간섭 RNA(siRNA)는 RISC(RNA-induced silencing complex)로 불리우는 뉴클라제 복합체에 편입되어 표적 mRNA를 인식하고 절단하는 역할을 수행한다(참조: Chanxian Shen et al., FEBS Letters, 539:111-114, 2003; Keisuke Hamasaki et al., FEBS Letters, 543:51-54, 2003). 따라서, siRNA를 이용하여, 외생적(exogenous) 또는 내생적(endogenous) 유전자의 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서의 발현억제를 통한 질병치료의 가능성이 제시되었으며(참조: Xia H. et al., Nat. Biotechnol., 20(10):1006-1010, 2002), RNAi 매개 유전자 발현억제가 바이러스의 증식을 억제하는데 잠재적인 강력한 도구가 될 수 있는 가능성이 제시되었다(참조: Keisuke Hamasaki et al., FEBS Letters, 543:51-54, 2003). 그러나, 아직까지 siRNA를 이용한 항아데노바이러스 화학요법은 개발되지 않은 실정이다.

따라서, 아데노바이러스의 증식을 억제할 수 있는 항아데노바이러스 화학요법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 아데노바이러스의 증식을 억제할 수 있는 항아데노바이 러스 화학요법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 목적 세포에 도입시킬 경우, 동물에서 아데노바이러스의 증식을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 이용하여, 아데노바이러스의 증식을 억제시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 동물에서 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법은 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 이중가닥 siRNA를 세포내로 도입시켜, 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다: 이때, 이중가닥 siRNA는 이에 특별히 제한되지 않으나, siRNA 135(서열번호 4 및 5), siRNA 295(서열번호 6 및 7), siRNA 499(서열번호 8 및 9), siRNA 509(서열번호 10 및 11) 또는 siRNA 794(서열번호 12 및 13)를 사용함이 바람직하고, 보다 바람직하게는 siRNA 295(서열번호 6 및 7) 또는 siRNA 499(서열번호 8 및 9)를 사용한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 아데노바이러스의 초기 단계 유전자 중의 하나인 E1A으로부터 전사된 mRNA를 siRNA에 의한 RNA 간섭(RNAi) 반응으로 분해시킬 경우, 아데노바이러스의 증식을 억제할 수 있을 것이라는데 착안하여, Adv 혈청형 11와 근연관계에 있는 Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 유전자(서열번호 1)를 분리하고, 이의 염기서열로부터 상응하는 siRNA를 작제하였다. 이 때, 작제된 siRNA는 각각 siRNA 135, siRNA 295, siRNA 499, siRNA 509 및 siRNA 749이었으며, 이들은 각각 Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 유전자인 서열번호 3의 핵산서열에서 숫자로 표시된 위치번호로부터 19개의 염기서열을 선택하고, 상기와 같이 선택된 염기서열에 상응하는 19-머(mer)의 리보폴리뉴클레오티드와 3'-말단에 디옥시티민 두 개가 부가된 총 21머의 센스 폴리뉴클레오티드와 이와 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되었다. 전기 siRNA로 아데노바이러스 감수성인 A549 세포주를 형질전환시키고 아데노바이러스를 감염시켰다. 이후, 바이러스 증식이 억제되는 지 여부를 플라크 감소분석, 실시간 RT-PCR 분석, 면역형광분석 및 세포변성(cytopathic) 분석을 통하여 확인하였다.

플라크 감소분석 결과, 전기 siRNA 모두 바이러스 증식 억제효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 특히 siRNA 295 및 siRNA 499의 경우, 바이러스 증식 억제효과가 매우 탁월함을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 실시간 RT-PCR을 통한 E1A mRNA의 정량분석, 면역형광분석 및 감염세포의 형태변성 분석의 결과와 일치하였다. 이에, 본 발명자들은 본 발명의 siRNA가 아데노바이러스 특히 Adv 혈청형 11의 효과적인 증식 억제제로 사용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 siRNA는 인간의 알려진 어떤 유전자와도 상동성이 없기 때문에, 인간의 내재적 유전자에 대한 발현 억제 등의 부작용이 없을 것으로 기대된다.

본 발명의 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질의 생산을 저해하는 이중가닥 작은 간섭 RNA(siRNA)는 주사용 조성물과 혼합하여 포유동물에서 바이러스감염에 의하여 염증이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 혼합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 투여함으로써 구현된다: 이때, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 및/또는 리포좀 제제)를 함유하며, 겔 조성물은 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴(carbopol) 등의 젤제제와 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하며, 경피흡수용 점착제제는 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물층을 포함하고, 치료약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유한다. 한편, 전기 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질의 생산을 저해하는 이중가닥 siRNA는 투여직전에, 약학적 제제화가 수행될 수 있는데, 필요에 따라, 리포좀 등의 물질에 캡슐화한 제형의 형태로도 사용될 수 있으며 (참조: Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 90(23):11307-11311, 1993), 전기 siRNA의 투여량은 특별한 투여 형태, 투여 경로 및 목적 및 치료하려는 포유동물의 연령, 체중 및 증상에 따라 적절하게 결정되는데, 일반적으로, 성체의 경우, 1일 투여량은 제제안에 함유된 활성성분의 양으로 10ng 내지 100mg/kg이다.

투여될 siRNA의 양은, 치료대상, 개체의 체중, 고통의 정도, 투여방법 및 처방의사의 판단에 따라 당연히 달라진다.

본 발명의 siRNA를 이용할 경우, 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 유전자의 발현을 저해하여, 아데노바이러스의 증식을 억제시킬 수 있으므로, 아데노바이러스의 감염으로 인하여 유발되는 질환의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 아데노바이러스 2K2/507/KNIH, 혈청형(serotype) 11의 분리 및 염기서열 분석

기침과 고열을 수반한 호흡기 감염환자로부터 아데노바이러스 Adv 2K2/507/KNIH 혈청형 11을 분리하였으며, 전기 아데노바이러스를 인간 폐 암종 세포주인 A549 세포(ATCC, USA)에 감염시켰다. 전기 감염된 A594 세포는 5%(v/v) 우태아혈청(Gibco BRL, USA)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, JBI, 대한민국)에서 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건으로 배양하였다.

전기 Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 지역을 서열번호 2의 센스 프라이머(5'-gagtgccagcgagaagag-3') 및 서열번호 3의 안티센스 프라이머(5'-gtaaacacggatatggaacact-3')을 이용한 PCR 반응으로 증폭하여 870bp 크기의 PCR 산물을 수득하였다(서열번호 1). 전기 증폭된 PCR 산물의 염기서열분석을 직접 염기서열분석 키트(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) 및 ABI Prism 3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 전기 Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 지역과 다른 종류의 아데노바이러스의 E1A 지역과의 상동성 분석을 염기서열분석 프로그램(DNAStar, DNASTAR, Inc, USA)을 이용하여 수행하였다(참조: 도 1). 도 1은 아미노산 서열에 기초한 다양한 아데노바이러스의 E1A 지역의 계통학적 유연관계를 나타내는 계통수로서, Hadv는 인간 아데노바이러스를 나타내며, Sadv는 유인원 아데노바이러스를 각각 나타낸다.

실시예 2: Adv 2k2/507/KNIH의 E1A 지역에 대응하는 siRNA의 작제

Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 지역에 대응하는 각각의 siRNA는 GC 함량이 30% 정도가 되고, 인간의 알려진 모든 유전자와 상동성이 없도록 고안하였다. 각각의 siRNA는 센스 폴리뉴클레오티드로서 Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 지역의 핵산서열에 상응하는 19-머의 리보폴리뉴클레오티드 및 전기 리보폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 두 개의 디옥시티민(dT)이 부가된 21-머의 뉴클레오티드; 및, 안티센스 폴리뉴클레오티드로서 전기 19-머의 리보폴리뉴클레오티드와 상보적인 19-머의 리보폴리뉴클레오티드 및 3'-말단에 두 개의 디옥시티민이 부가된 21-머의 폴리류클레오티드로 구성되도록 합성하였다(참조: 표 1).

Adv 2K2/507/KNIH E1A 지역에 상응하는 siRNA 목록

siRNA 명칭	서열번호	방향	염기서열	서열번호 1내에서의 위치
siRNA 135	4	센스	5'-ucaggaacuguaugauuuauu-3'	135-153
siRNA 135	5	안티센스	5'-uaaaucauacaguuccugauu-3'	135-153
siRNA 295	6	센스	5'-gguacagguguaagaaaauuu-3'	295-313
siRNA 295	7	안티센스	5'-auuuucuuacaccuguaccuu-3'	295-313
siRNA 499	8	센스	5'-gaauuucacaggaaaaauauu-3'	499-517
siRNA 499	9	안티센스	5'-uauuuuuccugugaaauucuu-3'	499-517
siRNA 509	10	센스	5'-ggaaaaauacuggaguaaauu-3'	509-527
siRNA 509	11	안티센스	5'-uuuacuccaguauuuuuccuu-3'	509-527
siRNA 794	12	센스	5'-uggaaaaacuugaggacuuuu-3'	794-812
siRNA 794	13	안티센스	5'-aaguccucaaguuuuuccauu-3'	794-812

상기 표 1은 각각의 siRNA를 구성하는 21-머의 폴리뉴클레오티드 핵산서열(센스 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드) 및 Adv 2K2/507/KNIH의 E1A PCR 산물의 핵산서열(서열번호 1)로부터 전기 19-머의 리보폴리뉴클레오티드가 선택된 위치번호를 나타낸다.

전기 표 1에 개시된 각각의 센스 폴리뉴클레오티드와 안티센스 폴리뉴클레오티드를 동일한 양으로 혼합한 다음, 끓는 물에서 용해시키고, 상온으로 60분 동안 냉각하여 혼성화시켰다. 전기 혼성화된 siRNA는 동일 분량으로 나누어 -80℃에서 사용전까지 보관하였다.

실시예 3: siRNA를 이용한 세포의 형질전환 및 바이러스 증식 억제활성의 분석

전기 실시예 2에서 작제된 각각의 siRNA로 동물세포주 A549 세포주를 형질전환시키고 전기 형질전환된 세포주에 아데노바이러스를 감염시킨 다음, 바이러스 증식 억제활성을 분석하였다.

실시예 3-1: siRNA를 이용한 세포의 형질전환

전기 실시예 2에서 작제된 각각의 siRNA로 동물세포주 A549 세포주를 다음과 같은 방법으로 형질전환시켰다: 먼저 형질전환시키기 24시간 전에 A549세포(ATCC, USA)를 12웰 플레이트에 각각 10⁵개 정도씩 분주하고, 5%(v/v) 우태아혈청이 함유된 무항생제 DMEM를 가하였다. siRNA 형질전환용 리포좀(siPORT Lipid, Ambion, USA) 8㎕를 형질전환용 저혈청 배지인 Opti-MEM1(Gibco-BRL, USA) 22㎕에 희석하여 리포좀 용액을 제조하였다. 한편, 전기 실시예 2에서 작제한 각각의 siRNA를 20pmol/㎕과 2pmol/㎕의 두 가지 농도로 멸균 증류수에 희석하고, 각각 10㎕를 Opti-MEM1 360㎕와 혼합한 다음, 전기 제조된 리포좀 용액과 혼합하였다. 전기 혼합물을 상온에서 20분간 정치시킨 다음, Opti-MEM1으로 2회 세척한 전기 플레이트의 각각의 웰에 가하였다. 전기 플레이트를 35℃에서 4시간 동안 배양한 다음, 10%(v/v) 우태아혈청이 함유된 DMEM 1ml을 가하였다.

실시예 3-2: 바이러스 증식 억제분석

전기 실시예 3-1에서 형질전환된 A549세포를 아데노바이러스로 감염시키고, 바이러스의 증식 억제여부를 플라크 감소분석, 면역형광 분석, 실시간 RT-PCR 및 세포변형(cytopathic) 분석을 통하여 확인하였다.

실시예 3-2-1: siRNA의 아데노바이러스 증식 억제효과 분석

전기 실시예 3-1의 방법을 사용하여 A549 세포를 siRNA로 형질전환시키고, 다음과 같은 과정을 통하여 바이러스 증식 억제여부를 분석하였다: 먼저, 전기 실시예 2에서 작제된 siRNA로 12웰 플레이트에 도포된 A549 세포를 전기 실시예 3-1 과 동일한 방법으로 형질전환시키고, 4시간이 경과한 다음, Adv 2K2/507/KNIH로 감염시켰다. 이어, 전기 플레이트로부터 배지를 제거하고, PBS(phosphate buffered saline)에 용해된 0.8%(w/v) 아가로오스 용액과 2×MEM(Gibco-BRL, USA)가 1:1(v/v)로 혼합된 혼합용액을 전기 Adv 2K2/507/KNIH로 감염된 A549 세포 위에 도포시켰다. 전기 혼합용액이 도포된 감염된 Adv 2K2/507/KNIH로 감염된 A549 세포를 35℃에서 5일간 배양한 다음, 10%(v/v) 포름알데히드가 용해된 PBS로 고정을 하고, 1%(w/v) 크리스탈 바이올렛(Sigma Chem. Co., USA)로 염색하여, 형성된 플라크 수를 계수하였다. 한편, 대조군으로서, siRNA로 형질전환시키지 않고, 아데노바이러스로 감염시키지 않은 A549 세포(세포 대조군), siRNA 없이 리포좀만 처리하고, 바이러스를 감염시킨 A549 세포(리포좀 대조군) 및 siRNA로 형질전환시키지 않고, 아데노바이러스를 감염시킨 A549 세포(바이러스 대조군)을 사용하였다(참조: 도 2). 도 2는 본 발명의 siRNA로 형질전환된 A549세포를 Adv 2K2/507/KNIH로 감염시킨 뒤, 플라크형성 정도를 보여주는 사진으로서, a는 세포 대조군이고, b는 바이러스 감염없이 리포좀만 처리한 실험군이며, c는 리포좀 대조군이고, d는 바이러스 대조군이며, e 내지 i는 각각, siRNA 135, siRNA 295, siRNA 499, siRNA 509 및 siRNA 794로 형질전환시킨 다음 바이러스에 감염시킨 실험군을 나타낸다.

도 2에서 보듯이, siRNA 없이 바이러스에 감염된 세포에서는 많은 플라크가 형성되는 반면, 각각의 siRNA로 형질전환시킨 세포에서는 바이러스로 인한 플라크의 형성이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 siRNA 295 및 siRNA 499는 플라크 감소효과가 더욱 두드러지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3-2-2: 실시간 RT-PCR 분석

Adv 2K2/507/KNIH에 특이적인 siRNA가 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 지 확인하기 위하여, 전기 실시예 2에서 작제된 siRNA로 전기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질전환시킨 A549세포를 Adv 2K2/507/KNIH로 감염시킨 다음, 다음과 같이 실시간 RT-PCR 분석을 수행하였으며, 이때, 바이러스 대조군으로는 siRNA로 형질전환되지 않은 A549 세포를 사용하였다:

먼저, siRNA로 형질전환된 A549세포를 형질전환시키고 4시간이 경과한 다음, Adv 2K2/507/KNIH로 감염시키고, 감염 후 각각 하루 및 이틀이 경과하면, 세포를 수득하여, mRNA를 mRNA 분리 키트(MagNA Pure LC mRNA Isolation Kit, Roche, Germany)로 추출하였다. 전기 추출된 mRNA를 RT-PCR 키트(TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents, Roche, Germany)와 실시간 RT-PCR 기기(ABI 7900 HT Sequence Detection System, Applied Biosystems, USA)를 사용하여, 48℃에서 30분동안 실시간 RT-PCR반응을 수행하여 cDNA를 수득하였다. 이어, 전기 cDNA를 주형으로 하고, 센스프라이머(5‘-tggtgcacgccctgatg-3'(서열번호 14)), 안티센스 프라이머(5’-ctgaagcgtaggaggctcaaaa-3'(서열번호 15)) 및 TaqMan 프로브(5‘-FAM-acgatccggagccacc-3'(서열번호 16))를 사용하여, 중합효소 연쇄반응을 수행하여, PCR 산물을 수득하고, 이를 정량함으로써, E1A mRNA의 수준을 측정하였다(참조: 도 3a 및 3b). 도 3a는 바이러스 감염후 1일부터 5일까지 1일 단위로 수득한 세포로 부터 아데노바이러스 E1A mRNA의 수준을 실시간 RT-PCR을 통하여 정량한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 도 4a의 점선부분을 확대한 그래프로서, (▲)는 siRNA의 형질전환없이 바이러스만 감염시킨 세포로부터 측정한 E1A mRNA 수준을 나타내며, (●)는 본 발명의 siRNA 295로 형질전환시킨 세포로부터 측정한 E1A mRNA 수준을 나타낸다.

도 3a 및 3b에서 보듯이, siRNA 295로 형질전환시킨 세포를 아데노바이러스로 감염시킨 경우, E1A mRNA 수준이 siRNA로 형질전환시키지 않은 바이러스 대조군에 비하여 현저하게 낮아짐을 확인할 수 있었으며, 바이러스 감염 후 5일째에는 바이러스 대조군에서도 E1A mRNA의 수준이 저하됨을 알 수 있는데, 특히 siRNA 295 및 siRNA 499는 E1A mRNA 수준을 현저하게 저하시켰다. 이는 E1A는 바이러스의 감염 초기 발현되는 유전자이므로, 감염 후 일정시간이 지나면 그 유전자 발현이 자연히 감소되는데 기인하는 현상으로 보인다.

실시예 3-2-3: 면역형광분석

siRNA 295 200pmol로 A549세포를 전기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질전환시키고 4시간이 경과한 다음, 전기 형질전환된 세포를 Adv 2K2/507/KNIH로 감염시켰으며, 이때, 세포 대조군으로는 전기 siRNA로 형질전환시키지 않고, 아데노바이러스로도 감염시키지 않은 A549 세포를 사용하였으며, 바이러스 대조군으로는 전기 siRNA로 형질전환시키지 않고 아데노바이러스에 감염시킨 A549를 사용하였다. 바이러스 감염 후, 이틀이 지난 다음, 전기 siRNA로 형질전환시킨 바이러스 감염 세포를 수확하였다. 원심분리에 의하여 형성된 세포 펠렛(pellet)을 PBS로 2회 세척하고, PBS 20㎕로 현탁하였다. 이어, 현탁된 세포를 슬라이드 글래스 위에 5mm 직경의 크기로 점적하고, 고정액(에탄올:아세톤=1:4(v/v))으로 15분간 고정하였다. 그런 다음, 고정된 바이러스 감염 세포를 PBST(0.05%(v/v) Tween20 in PBS)에 1:50(v/v)으로 희석한 항아데노바이러스 단클론성 항체(MAB805, Chemicon International, USA)를 처리하고, 전기 단클론성 항체가 처리된 세포에 PBST에 1:250(v/v)로 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC: fluorescein isocyanate)가 결합된 항-마우스 IgG 염소 폴리클로날 2차항체(Abcam, UK)를 처리한 후, 전기 항체로 표지된 세포를 형광현미경(Leica DC 300F, Germany)으로 관찰하였다(참조: 도 4). 도 4는 Adv 2K2/507/KNIH에 대한 형광분석결과를 보여주는 사진으로서, a는 세포 대조군을 b는 바이러스 대조군을 나타내며, c는 siRNA 295 200pmol로 형질전환된 A549세포를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, siRNA로 형질전환시키지 않고, 아데노바이러스를 감염시킨 바이러스 대조군에서는 형광을 띠는 세포가 많은 반면, siRNA 295로 형질전환된 세포에서는 형광이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다(억제율: 95%).

실시예 3-2-4: 플라크 감소분석

전기 실시예 3-2-1의 분석에 이어, 바이러스의 역가를 보다 정밀하게 측정하 기 위하여, 플라크 감소분석을 수행하였다.

즉, siRNA 295 및 siRNA 499로 A549 세포를 각각 형질전환시키고, 4시간이 경과한 다음, 10^-4로 희석된 Adv 2K2/507/KNIH를 감염시켰으며, 바이러스의 역가를 측정하였다(참조: 도 5a 및 5b). 이때, 대조군으로는 siRNA로 형질전환시키지 않고, 아데노바이러스로 감염시키지 않은 A549 세포(세포 대조군), 형질전환없이 Adv 2K2/507/KNIH로만 감염시킨 A549 세포(바이러스 대조군)를 사용하였다.

도 5a는 Adv 2K2/507/KNIH에 대한 siRNA 295의 바이러스 증식 억제정도를 나타내는 플라크 감소분석 결과이다. 도 5a에서, a는 세포 대조군이고, b는 바이러스 대조군이며, c는 siRNA 295를 200pmol 처리한 실험군이고, d는 siRNA 295를 20pmol 처리한 실험군이다. 도 5a에서 보듯이, 대조군에 비하여 siRNA 295로 형질전환된 세포에서는 플라크 수가 매우 감소하여, 아데노바이러스 증식이 90%까지 억제됨을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5b는 Adv 2K2/507/KNIH에 대한 siRNA 499의 바이러스 증식 억제정도를 나타내는 플라크 감소분석 결과이다. 도 5b에서, a는 세포 대조군이고, b는 바이러스 대조군이며, c는 siRNA 499를 200pmol 처리한 실험군이고, d는 siRNA 499를 20pmol 처리한 실험군이다. 도 5b에서 보듯이, 대조군에 비하여 siRNA 499로 형질전환된 세포에서는 플라크 수가 매우 감소하여, 아데노바이러스 증식이 95%까지 억제됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4: siRNA 295 및 siRNA 499의 Adv11 프로토타입 스트레인에 대한 증식 억제효과 분석

siRNA 295 및 siRNA 499는 Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 지역에 상응하도록 고안되었으며, 전기 Adv 2K2/507/KNIH에 대하여 효과적인 RNA 간섭반응을 일으키는 것으로 확인되었다. Adv 2K2/507/KNIH의 E1A 지역은 Adv11 프로토타입 스트레인의 E1A 지역과 그 변이가 크지 않으므로, 본 발명의 siRNA 295 및 siRNA 499가 다른 Adv11 스트레인에도 효과적인지 확인하기 위하여, Adv 2K2/507/KNIH 대신에 Adv11 프로토타입 스트레인 슬로비스키(Slobitski)(ATCC VR-849)를 사용한 점을 제외하고는, 전기 실시예 3-2-2와 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다(참조: 도 6a 및 6b). 이때, 바이러스 대조군으로는 전기 siRNA로 형질전환시키지 않고, 전기 Adv11 프로토타입 스트레인을 감염시킨 A549 세포를 사용하였다.

도 6a는 본 발명의 siRNA 295로 형질전환되고 Adv11 프로토타입 스트레인에 감염된 세포로부터 mRNA를 추출하여 수행한 실시간 RT-PCR반응 결과를 나타내는 그래프로서, a는 바이러스 대조군으로 감염시킨 후 2일 경과한 세포를 의미하고, b는 siRNA 처리군으로 감염시킨 후 2일 경과한 세포를 의미하며, c는 바이러스 대조군으로 감염시킨 후 1일 경과한 세포를 의미하고, d는 siRNA 처리군으로 감염시킨 후 1일 경과한 세포를 의미한다. 도 6a에서 보듯이, 본 발명의 siRNA 295은 Adv11 프로토타입 스트레인의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 도 6b는 본 발명의 siRNA 499로 형질전환되고 Adv11 프로토타입 스트 레인에 감염된 세포로부터 mRNA를 추출하여 수행한 실시간 RT-PCR반응 결과를 나타내는 그래프로서, a는 바이러스 대조군으로 감염시킨 후 2일 경과한 세포를 의미하고, b는 siRNA 처리군으로 감염시킨 후 2일 경과한 세포를 의미하며, c는 바이러스 대조군으로 감염시킨 후 1일 경과한 세포를 의미하고, d는 siRNA 처리군으로 감염시킨 후 1일 경과한 세포를 의미한다. 도 6b에서 보듯이, 본 발명의 siRNA 499는 Adv11 프로토타입 스트레인의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

한편, Adv 2K2/507/KNIH 대신에 Adv11 프로토타입 스트레인, 슬로비스키(Slobitski)를 사용한 점을 제외하고는, 전기 실시예 3-2-4와 동일한 방법으로 본 발명의 siRNA 295 및 siRNA 499로 형질전환된 A549 세포에 대한 플라크 감소분석을 수행하였다(참조: 도 7). 도 7은 Adv11 프로토타입 스트레인에 대한 siRNA 295 및 siRNA 499의 플라크 형성 억제정도를 보여주는 사진으로서, a는 세포 대조군, b는 바이러스 대조군, c는 siRNA 295 200pmol 처리군, d는 siRNA 499 200pmol 처리군을 나타낸다.

도 7에서 보듯이, 본 발명의 siRNA 295 및 siRNA 499는 Adv 2K2/507/KNIH은 물론 Adv11 프로토타입 스트레인에서도 효과적으로 플라크 형성을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 siRNA들은 특정 아데노바이러스 뿐만이 아니라, 다른 변이가 크지 않은 Adv11 스트레인에도 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 이중가닥 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 전기 siRNA를 이용하여, 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법은 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 이중가닥 siRNA를 세포내로 도입시켜, 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 본 발명의 siRNA를 이용할 경우, 아데노바이러스 E1A 유전자의 발현을 저해하여, 아데노바이러스의 증식을 억제시킬 수 있으므로, 아데노바이러스의 감염으로 인하여 유발되는 질환의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

<110> Korea Center for Disease Control & Prevention <120> Method for Inhibiting Proliferation of Adenovirus in Animal <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2K2/507/KNIH <400> 1 atgagacact tgcgatttct gcctcaggaa ataatttctg ctgagactgg aaacgaaata 60 ctggagtttg tggtgcacgc cctgatggga gacgatccgg agccacctgt gcagcttttt 120 gagcctccta cgcttcagga actgtatgat ttagaggtag agggatcgga ggattctaat 180 gaggaagctg tgaatggctt ttttaccgat tctatgcttt tagctgctaa tgaaggatta 240 gaattagatc cgcctttgga cactttcgat actccagggg tgattgtgga aagcggtaca 300 ggtgtaagaa aattacctga tttgggttcc gtggactgtg atttgcactg ctatgaagac 360 gggtttcctt tgagtgatga ggaggaccgt gaaaaggagc agtttatgca gactgcagcg 420 ggtgagggag tgaaggctgc cagtgttggt tttcagttgg attgcccgga gcttcctgga 480 catggctgta agtcttgtga atttcacagg aaaaatactg gagtaaagga actgttatgt 540 tcgctttgtt atatgagagc gcactgccac tttatttaca gtaagtgtgt taagttaaaa 600 tttaaaggaa tatgctgttt tcacatgtat atgagtggga gatttgtgct tcttattata 660 ggtcctgtgt ctgatgctga tgagtcacca tctcctgatt ctactacctc acctcctgag 720 attcaagcac ctgttcctgt ggacgtgcac aagcccattc ctgtaaagct taagcctgga 780 aaacgtccag cagtggaaaa acttgaggac ttgttacagg gtggggacgg acctttggac 840 ttgagtacac ggaaacggcc aagacaataa 870 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gagtgccagc gagaagag 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtaaacacgg atatggaaca ct 22 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 135 <400> 4 ucaggaacug uaugauuuau u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 135 <400> 5 uaaaucauac aguuccugau u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA295 <400> 6 gguacaggug uaagaaaauu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 295 <400> 7 auuuucuuac accuguaccu u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 499 <400> 8 gaauuucaca ggaaaaauau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 499 <400> 9 uauuuuuccu gugaaauucu u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 509 <400> 10 ggaaaaauac uggaguaaau u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 509 <400> 11 uuuacuccag uauuuuuccu u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 794 <400> 12 uggaaaaacu ugaggacuuu u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 794 <400> 13 aaguccucaa guuuuuccau u 21 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tggtgcacgc cctgatg 17 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgaagcgta ggaggctcaa aa 22 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 acgatccgga gccacc 16

Claims

아데노바이러스 E1A(early region 1A) 단백질을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 이중가닥 siRNA를 세포내로 도입시켜, 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 동물세포내에서 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법.
제 1항에서 있어서,

이중가닥 siRNA는 siRNA 135(서열번호 4 및 5), siRNA 295(서열번호 6 및 7), siRNA 499(서열번호 8 및 9), siRNA 509(서열번호 10 및 11) 및 siRNA 794(서열번호 12 및 13)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

동물에서 아데노바이러스의 증식을 억제하는 방법.
서열번호 6의 센스 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성된 이중가닥 작은 간섭 RNA인 siRNA 295.
서열번호 8의 센스 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9의 안티센스 폴리뉴클레 오티드로 구성된 이중가닥 작은 간섭 RNA인 siRNA 499.