ES2293977T3 - Peptidos antivirales farmacologicamente activos y metodo para su uso. - Google Patents

Peptidos antivirales farmacologicamente activos y metodo para su uso. Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende un péptido antiviral, en la que el péptido antiviral se selecciona del grupo constituido por las SEC ID Nº: 1-4, las SEC ID Nº: 14-15 y las SEC ID Nº: 18-30, en la que: si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 14, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente, tales que cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, m tiene un valor de 0 o de 3 a 10, en la que, además, si m = 0, n tiene un valor de 4 a 10, y si n = 0, m tiene un valor de 4 a 10; si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 15, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente, tales que cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, en la que, además, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, y m tiene un valor de 0 o de 3 a 10; y en la que, además, el péptido antiviral está presenteen una cantidad suficiente para ser eficaz contra un organismo viral, para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección viral.

Description

Péptidos antivirales farmacológicamente activos y métodos para su uso.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a péptidos que tienen propiedades antivirales. Más específicamente, la invención se refiere a péptidos que presentan actividad contra un amplio espectro de virus, a composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos, y al uso de los péptidos en la fabricación de medicamentos para prevenir y/o tratar infecciones virales.
Antecedentes de la invención
En los últimos años, se han descrito diversos grupos de derivados de péptidos que tienen actividad contra virus. Se describen ejemplos de estos péptidos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.700.780, expedida a Beaulieu et al.; la Patente de Estados Unidos Nº 5.104.854, expedida a Schlesinger et al.; la Patente de Estados Unidos Nº 4.814.432, expedida a Freidinger et al., Dutia et al., Nature 321: 439 (1986); y Cohen et al., Nature 321: 441 (1986). No obstante, muchos de los péptidos antivirales conocidos en la técnica son extremadamente hidrófobos y, por lo tanto, no muy biodisponibles. Además, muchos de estos péptidos antivirales conocidos muestran actividad contra sólo unos cuantos tipos de virus, debido a sus mecanismos de acción particulares. Además, muchos de estos péptidos sintéticos no son eficaces en la prevención de la infección viral inicial o no son funcionales cuando se aplican por vía tópica.
O'Brien et al. (J. Virology, 1996, vol. 70, págs. 2825: 2831), describe actividad anti VIH-1 para un compuesto peptídico oligocatiónico. El documento US 5877282 describe nuevos inhibidores polipeptídicos de la translocación citoplasmática de proteínas nucleares, que comprenden una secuencia señal y al menos dos secuencias de localización nuclear. Los polipéptidos son útiles como agentes inmunosupresores, antivirales y antitumorales. El documento WO 99/64449 describe métodos para la administración de moléculas en una célula mediante el uso de un péptido señal modificado al que está unido un ácido nucleico peptídico. La partícula señal comprenderá al menos un resto aminoacídico cargado positivamente o un equivalente funcional del mismo. La extensión del péptido señal mediante la adición de restos o de análogos, con una sola o con múltiples cargas, modificará y mejorará la administración del péptido señal, aumentando las características de solubilidad y la permeabilidad celular del péptido señal.
Uno de los análogos de nucleósidos más satisfactorio desarrollado hasta la fecha como agente antiviral es aciclovir. Aciclovir es un análogo sintético de un nucleósido de purina con actividad inhibidora in vitro e in vivo contra el virus herpes simplex tipo I (HSV-1), el virus herpes simplex tipo II (HSV-2) y el virus varicela zóster (VZV). En cultivo celular, la mayor actividad antiviral de aciclovir es contra HSV-1, seguido de, en orden decreciente de potencia, contra HSV-2 y ZVZ. No obstante, puede estar contraindicado el uso de aciclovir. Además, algunos virus herpes simplex se han vuelto resistentes a aciclovir.
Recientemente, se ha investigado bastante sobre compuestos antivirales que puedan incorporarse en viricidas tópicos y lubricantes de preservativos, para ayudar a detener la propagación del virus de la imunodeficiencia humana (VIH). La necesidad de un producto de este tipo es elevada; el compuesto antiviral y/o viricida apropiado que prevenga la infección por VIH sería de gran utilidad tanto en países desarrollados como no desarrollados.
Por lo tanto, se mantiene la necesidad de antivirales que presenten una alta actividad contra un amplio espectro de virus. También se mantiene la necesidad de antivirales que puedan aplicarse por vía tópica, y que sean eficaces para prevenir infecciones virales.
Sumario de la invención
La invención proporciona una composición, en particular una composición farmacéutica, que comprende un péptido antiviral, en la que el péptido antiviral se selecciona del grupo constituido por las SEC ID Nº: 1-4, las SEC ID Nº 14-15 y las SEC ID Nº: 18-30, en la que: si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 14, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente tales que, cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, m tiene un valor de 0 o de 3 a 10, en la que, además, si m = 0, n tiene un valor de 4 a 10, y si n = 0, m tiene un valor de 4 a 10, o bien m = 0 o n = 0; si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 15, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente tales que, cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, en la que, además, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, y m tiene un valor de 0 o de 3 a 10; y el péptido antiviral está presente en una cantidad suficiente para que sea eficaz contra un organismo viral, para uso en el tratamiento o la prevención de una infección viral.
La invención proporciona adicionalmente el uso de tales péptidos antivirales en la fabricación de un medicamento, administrándose el medicamento en el tratamiento de una infección viral.
Breve descripción de los dibujos
Las Figs. 1A-1C y la Fig. 1E son representaciones gráficas que muestran la inhibición dependiente de la dosis de HSV-1 mediante péptidos antivirales de la presente invención (SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4), en comparación con péptidos de control (SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 17). La Fig. 1C muestra los efectos citotóxicos de la SEC ID Nº: 1 y de la SEC ID Nº: 17.
La Fig. 2 es una representación gráfica que muestra la inhibición viral mediante un péptido antiviral biotinilado (SEC ID Nº: 2) de la presente invención.
La Fig. 3 es una representación gráfica que muestra la inhibición dependiente de la dosis de la formación de HSV-1 mediante un péptido antiviral de la presente invención (SEC ID Nº: 1), en comparación con aciclovir.
Las Figs. 4A y 4B son gráficos que ilustran que un péptido antiviral de la presente invención (SEC ID Nº: 1) inhibe una fase temprana de la infección viral y de la propagación viral.
La Fig. 5 es un gráfico que ilustra que la actividad antiviral de un péptido antiviral de la presente invención (SEC ID Nº: 1) es dependiente de la dosis de virus.
Las Figs. 6A y 6B son gráficos que ilustran el bloqueo de la entrada de virus en células mediante un péptido antiviral de la presente invención (SEC ID Nº: 1).
Las Figs. 7A y 7B son gráficos que ilustran la fase de entrada y la respuesta a la dosis de un péptido antiviral de la presente invención (SEC ID Nº: 1).
Las Figs. 8A y 8B son gráficos que ilustran la actividad viricida de un péptido antiviral de la presente invención (SEC ID Nº: 1).
Las Figs. 9A y 9B son gráficos que ilustran la actividad in vivo de un péptido antiviral de la presente invención (SEC ID Nº: 1).
Descripción detallada de la invención
En la descripción que sigue, se utilizan varios términos. En este documento se proporcionan definiciones de los mismos para facilitar la comprensión de la invención.
Péptido antiviral: El péptido antiviral comprende al menos en parte un péptido de transición de membrana, o un fragmento o un derivado del mismo, que es un agente antiviral farmacológicamente eficaz cuando se administra en una cantidad eficaz.
Cantidad eficaz: Una cantidad predeterminada del péptido antiviral, es decir, una cantidad del péptido suficiente para ser eficaz contra los organismos virales in vivo o por vía tópica, para un efecto de tratamiento o profiláctico.
Péptido de transición de membrana (motivo de transición de membrana): Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que hace al péptido capaz de atravesar membranas de bicapa lipídica para entrar en células o compartimentos subcelulares.
Vehículo farmacéuticamente aceptable: Un vehículo cosmético aceptable para administrar péptidos antivirales a mamíferos, que comprende uno o más excipientes no tóxicos que no reaccionan con, ni reducen la eficacia del péptido antiviral farmacológicamente activo contenido en el mismo.
Señal de solubilidad: Una secuencia peptídica corta compuesta por aminoácidos cargados que, cuando se une a un resto terminal de una secuencia peptídica insoluble más larga, mejorará su solubilidad en un medio acuoso.
En toda esta solicitud, se usan los nombres abreviados convencionales de una letra para los aminoácidos. Véase Lehninger et al. "Principles of Biochemistry", Worth Publishers (Nueva York, Nueva York), pág. 113 (1983). Todas las secuencias de aminoácidos en esta solicitud se representan usando la nomenclatura convencional, siendo el resto aminoacídico más a la izquierda en el extremo de cada secuencia el resto amino-terminal y siendo el resto en el extremo derecho de cada secuencia el resto carboxilo-terminal. Los aminoácidos de los péptidos descritos en este documento pueden ser aminoácidos levógiros o aminoácidos dextrógiros, que se indica con l o d antes de la secuencia peptídica (Véase la Tabla 1).
La presente invención se refiere a nuevos péptidos antivirales que están basados en péptidos de transición de membrana. Se conocen bien en la técnica diversos péptidos de transición de membrana. Sorprendente e inesperadamente, se ha descubierto que los péptidos de transición de membrana presentan un amplio espectro de actividad antiviral, incluyendo tal actividad, la actividad que tienen cuando se aplican por vía tópica o se administran in vivo. Se describen a continuación en la Tabla 1 péptidos antivirales ejemplares derivados de péptidos de transición de membrana, como las SEC ID Nº: 1-4.
TABLA 1 Péptidos antivirales
1
Los péptidos antivirales de la presente invención pueden usarse solos en una cantidad eficaz. Aunque la mayoría de los péptidos de transición de membrana son solubles, algunos no lo son, aunque pueden utilizarse motivos de transición de membrana insolubles en péptidos antivirales mediante el siguiente método. Si el péptido antiviral es insoluble en un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, puede añadirse una señal de solubilidad al péptido antiviral.
Como se muestra en la Tabla 1, las SEC ID Nº: 1-4 tienen una señal de solubilidad unida covalentemente. La presente invención se refiere a péptidos antivirales nuevos tales que comprenden, en parte, una señal de solubilidad unida covalentemente, y que tienen la siguiente secuencia: (X1)_{n}-A-A-V-A-L-L-P-A-V-L-L-A-L-L-A-P-(X2)_{m} (SEC ID Nº: 14) o (X1)_{n}-P-A-V-L-L-A-L-L-A-(X2)_{m} (SEC ID Nº: 15), en las que X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente (por ejemplo, K, R), en las que cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente; y en las que n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, y m tienen un valor de 0 o de 3 a 10, en las que en una realización o m = 0 o n = 0. Un ejemplo de una señal de solubilidad es R-R-K-K (SEC ID Nº: 16). Por lo tanto, todos los restos aminoacídicos cargados de la señal de solubilidad son restos aminoacídicos cargados positivamente. Sorprendente e inesperadamente, se ha descubierto que péptidos de transición de membrana insolubles, cuando se acoplan a una señal de solubilidad, generan péptidos antivirales que presentan una potente actividad antiviral contra un amplio espectro de virus.
Muchos péptidos de transición de membrana pueden funcionar como péptidos antivirales de la presente invención sin la necesidad de señales de solubilidad. Véase la Tabla 1. Además, aunque las señales de solubilidad pueden mejorar la solubilidad de algunos péptidos de transición de membrana, estos péptidos de transición de membrana particulares pueden ser adecuados como péptidos antivirales sin incorporar señales de solubilidad.
Los péptidos antivirales de la presente invención pueden tener diversas señales reactivas unidas a sus restos aminoacídicos terminales. Tales señales pueden ser útiles en la detección/retirada de los péptidos sintéticos de la presente invención. Tales señales pueden incluir, a modo de ejemplo sólo, biotina, así como cualquier otra señal bien conocida en la técnica. La SEC ID Nº: 2 y el Ejemplo 2 muestran la inclusión de tales señales reactivas.
El Ejemplo 2 demuestra que los péptidos antivirales que comprenden motivos de transición de membrana sustituidos conservan la actividad antiviral, como se muestra en la SEC ID Nº: 3, descrita en la Tabla 1. Este derivado difiere de la SEC ID Nº: 1 sólo en que los dos restos aminoacídicos de prolina se han colocado en el extremo carboxi terminal del péptido. La Tabla 2 enumera fragmentos activos potenciales de un péptido antiviral de acuerdo con la presente invención.
TABLA 2 Fragmentos Activos Potenciales de Péptidos Antivirales
2
Tales derivados y fragmentos están dentro del alcance de la presente invención.
Los péptidos de la presente invención pueden prepararse mediante procesos que incorporan métodos comúnmente usados en la síntesis de péptidos, tales como el acoplamiento clásico en solución de restos aminoacídicos y/o de fragmentos peptídicos y, si se desea, técnicas en fase sólida. Tales métodos se describen en los siguientes Ejemplos. Puede usarse cualquier método para síntesis de péptidos bien conocido en la técnica, por ejemplo, Schroeder y Lubke, en "The Peptides", Vol. 1, Academic Press, Nueva York, Nueva York, págs. 2-128 (1965); "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", (E. Gross et al., Eds.), Academic Press, Nueva York, Nueva York, Vol. 1-8, (1979-1987); Stewart y Young, en "Solid Phase Peptide Synthesis", 2ª Ed., Pierce Chem. Co., Rockford, IL (1984); Wild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10537 (1992); y Rimsky et al., J. Virol, 72: 986 (1998).
Como se demuestra en los siguientes Ejemplos, los péptidos antivirales de la presente invención presentan actividad antiviral contra una amplia variedad de virus con envoltura y sin envoltura. Los ejemplos de tales virus con envoltura incluyen, pero sin limitación, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), vesiculovirus (VSV), virus herpes simplex (HSV-1 y HSV-2), y otros virus herpes, por ejemplo, virus varicela zóster (VZV), EBV, virus herpes equino (EHV) y citomegalovirus humano (HCMV). Los ejemplos de virus sin envoltura incluyen, pero sin limitación, virus del papiloma humano (HPV) y adenovirus.
Un método para demostrar el efecto inhibidor de los péptidos antivirales de la presente invención sobre la replicación viral es la técnica bien conocida de cultivo celular, como se muestra en los siguientes Ejemplos. Tales métodos se conocen bien en la técnica. Véase Wild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10537 (1992).
Puede demostrarse la eficacia terapéutica de los péptidos antivirales como agentes antivirales en animales de laboratorio, por ejemplo, usando un modelo murino como se muestra en el Ejemplo 10.
Además, puede demostrarse el efecto terapéutico de los péptidos farmacológicamente activos de la presente invención en seres humanos mediante técnicas que se conocen bien en el campo. Véase, por ejemplo, Kilby et al., Nature Medicine 4: 1302 (1998).
Se empleará un péptido antiviral de la presente invención como agente antiviral administrando el péptido por vía tópica a un animal de sangre caliente, por ejemplo, seres humanos, caballos, otros mamíferos, etc. El péptido puede administrarse en un excipiente que comprende uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, la proporción de los cuales se determina por la solubilidad de la naturaleza química del péptido, la vía de administración elegida y la administración biológica convencional. Se describen excipientes o vehículos adecuados para las formulaciones del péptido en los textos farmacéuticos convencionales. Véase "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18ª Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).
Para la administración por vía tópica, el péptido antiviral puede formularse en un vehículo farmacéuticamente aceptable que contiene una cantidad eficaz del péptido antiviral, típicamente del 0,1 al 10%, preferiblemente el 5%, de un péptido antiviral. Tales formulaciones pueden estar en forma de una solución, crema o loción. Los péptidos antivirales de la presente invención pueden también usarse para tratar infecciones virales de la piel o de parte de las cavidades oral o genital. Los péptidos antivirales pueden usarse individualmente o en combinación, para tratar una mayor diversidad de virus. Tales aplicaciones tópicas pueden aplicarse a materiales protectores para proteger a quien los lleve, tales como guantes, preservativos u otras protecciones conocidas en la técnica.
Para la administración por vía sistémica, los péptidos antivirales de la presente invención pueden administrarse por inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular, solos o en composiciones con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Para la administración por inyección, se prefiere usar el péptido antiviral en una solución en un excipiente acuoso estéril, que puede contener también otros solutos tales como tampones o conservantes, así como cantidades suficientes de sales farmacéuticamente aceptables o de glucosa, para hacer que la solución sea isotónica. Los péptidos antivirales de la presente invención pueden obtenerse en forma de sales terapéuticamente aceptables que se conocen bien en la técnica.
La dosificación de los péptidos antivirales de la presente invención variará con la forma de administración y dependerá del (de los) péptido(s) antiviral(es) particular(es) elegido(s) para la combinación. Además, variará con el hospedador en particular que esté en tratamiento. En general, los péptidos antivirales se administran más deseablemente a un nivel de concentración que generalmente proporcionará resultados antivirales eficaces contra el (los) virus seleccionado(s), sin causar ningún efecto secundario dañino o perjudicial.
La presente invención se describe adicionalmente con referencia los siguientes Ejemplos ilustrados. A menos que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente tienen para cualquier especialista en la técnica de la invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica de la invención, se han descrito los métodos y materiales preferidos. A menos que se indique otra cosa, las técnicas empleadas o contempladas en este documento son metodologías convencionales bien conocidas por cualquier especialista en la técnica. Los materiales, métodos y Ejemplos son sólo ilustrativos y no limitantes. Todas las referencias que se citan en este documento se incorporan como referencia.
Ejemplo 1 Protocolos y Materiales
Cultivo celular y virus: Se utilizaron los procedimientos para desarrollo de células Vero y preparación de reservas de alto título de HSV-1 KOS como se describe en (Grau et al., Invest. Ophtal. and Vis. Sci. 30: 2474 (1989)). Se mantuvieron células Vero en DMEM tamponado con carbonato suplementado con suero de ternero al 5% y suero bovino fetal al 5% (medio regular). Para algunos estudios, las células se cambiaron a DMEM sin suero tamponado con Hepes 25 mM (pH 7,4) y se dejó que se adaptasen a ese medio durante 30 min antes de los tratamientos experimentales. Se sembraron células Vero en pocillos (0,28 cm^{2}) de placas de microtitulación a 3,5 x 10^{4} células/pocillo para usarlas 1 día después (8 x 10^{4} células/pocillo) o a 1 x 10^{4} células/pocillo para usarlas 3 días después (2 x 10^{5} células/pocillo).
Ensayo de reducción de placas: Se infectaron cultivos de células Vero confluentes en placas de microtitulación durante 1 hora a 37ºC en 40 \mul de medio. Excepto cuando se indique otra cosa, los tratamientos peptídicos en 40 \mul de medio duraron desde 1 hora antes hasta 1 hora después de la infección. Al final del periodo de adsorción, se volvió a alimentar a los cultivos con 100 \mul de medio regular. Se puntuó la formación de placas 2 días después y la puntuación del número de placas por pocillo se normalizó con el número contado en ausencia de péptido. Usando un micrómetro ocular, se determinó el tamaño de placa (\pi/2 x L x S) midiendo el diámetro mayor de la placa (L) y el diámetro en un ángulo de 90º con éste (S). Se midió el tamaño de cada una de las 40 primeras placas puntuadas excepto cuando una placa incluía menos de 10 células redondeadas o tocaba el lado del pocillo.
Ensayo de reducción del rendimiento: A los tres días post-infección, se congelaron (-80ºC) y se descongelaron (37ºC) tres veces cultivos de células Vero en placas de microtitulación. Se suspendieron las células mediante pipeteo repetido y se centrifugaron las placas de microtitulación durante 10 min a 700 x g en una centrífuga de sobremesa Beckman modelo TJ-6. Se hicieron diluciones seriadas de los sobrenadantes que contenían virus en medio regular y se titularon en células Vero. Se contaron las placas después de teñir las monocapas con cristal violeta como se enseña en Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 2474 (1989).
Ensayo de unión: Se marcó HSV-1 KOS con [^{32}P]-ortofosfato a una actividad específica de 0,01 cpm/ufp. En resumen, se infectaron células Vero a una moi de 5,0 y a las 6 horas post-infección se añadió [^{32}P]-ortofosfato (0,5 mCi/ml). A las 18 horas post-infección, las células y el medio de cultivo se recogieron por separado. Las células se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación y los residuos celulares se sedimentaron por centrifugación a 2000 x g durante 10 min. El sobrenadante de la congelación-descongelación se combinó con los medios y se sedimentó el virus por centrifugación a través de un colchón de gradiente de sacarosa al 26%, como se enseña en Visalli et al., Virus Res. 29: 167 (1993). El sedimento viral se resuspendió en PBS para su uso. Se cambiaron cultivos de células Vero confluentes en placas de microtitulación a DMEM sin suero, se enfriaron en hielo y se mantuvieron a 4ºC. Después de 30 min se añadieron los péptidos y, 60 min después, se incubaron las células durante 2 horas con virus-^{32}P (2 x 10^{4} cpm/pocillo). Después del marcaje, las células se aclararon con medio enfriado en hielo. Después, se extrajo de manera cuantitativa el ^{32}P unido con SDS al 1% y Tritón X100 al 1% en PBS, y se contó en un contador de centelleo líquido Beckman LS5801.
Ensayo de entrada de virus (hrR3) LacZ^{+}: Se cambiaron cultivos de células Vero confluentes en placas de microtitulación de 96 pocillos a DMEM sin suero tamponado con Hepes, se enfriaron en hielo a 4ºC durante 30 min y se infectaron con hrR3 durante 1 hora a 4ºC en 40 \mul de medio. Se eliminó el virus no unido por aclarado con medio enfriado en hielo. Se realizaron tratamientos con péptido antiviral de SEC ID Nº: 1, denominado EB, o con un péptido de control que comprendía el tetrapéptido RRKK (SEC ID Nº: 16) unido a una versión codificada del péptido de transición de membrana R-R-K-K-L-A-A-L-P-L-V-L-A-A-P-L-A-V-L-A (SEC ID Nº: 17) (denominado EBX), o tratamientos simulados con medio sin péptidos, en DMEM sin suero como se indica. Se inició la entrada de virus transfiriendo los cultivos a 37ºC. Para inactivar cualquier virus extracelular restante, se aclararon los cultivos con PBS y se expusieron a tampón citrato de bajo pH (ácido cítrico 40 mM, KCl 10 mM, NaCl 135 mM, pH 3,0), de acuerdo con Highlander et al., J. Virol. 61: 3356 (1987), durante 1 min a 23ºC. Se aclaró el citrato con PBS y se mantuvieron los cultivos en DMEM suplementado con suero hasta que se fijaron con glutaraldehído al 0,5% en PBS 5x durante 30 min a 23ºC, se tiñeron con X-gal (Fisher Biotech; BP1615-1) para actividad \beta-galactosidasa durante 1 hora o durante una noche a 23ºC en PBS 1x, que contenía MgCl_{2} 2 \muM, K_{4}Fe(CN)_{6} 1,3 mM y K_{3}Fe(CN)_{6} 1,3 mM, y se puntuó la presencia de células azules lacZ^{+}.
Ensayo viricida: Se incubó hrR3 (1,2 x 10^{6} ufp/ml) con diversas concentraciones de EB o de EBX durante 1 hora a 37ºC en 70 \mul de DMEM sin suero (pH 7,4). El virus tratado se diluyó 200 veces con DMEM suplementado con suero y se ensayó su infectividad aproximadamente 1 hora después en pocillos de microtitulación sembrados con células Vero (3,5 x 10^{4} células/pocillo) 1 día antes. Se adsorbieron volúmenes de cuarenta o de 100 microlitros de virus diluido durante 1 ó 2 h a 37ºC y se puntuaron las células lacZ^{+} 8 horas después. En algunos experimentos, primero se dializaron alícuotas de virus diluido (Spectra/Por; MWCO 12-14.000) durante una noche a 4ºC contra un exceso de volumen de 60 veces de DMEM suplementado con suero tamponado con Hepes, o se forzaron mediante jeringa a pasar a través de membranas de 0,22 \mum (Millex-GV; Millipore) antes de ensayar el virus infeccioso restante.
Ensayo de exclusión de azul tripán: Se trataron células Vero no infectadas en DMEM sin suero o suplementado con suero durante 1 hora a 37ºC con péptido antiviral de SEC ID Nº: 1 o con péptido de control EBX (SEC ID Nº: 17), se aclararon con PBS, se tiñeron durante 5 min a 23ºC con azul tripán al 0,4% en PBS, se aclararon de nuevo y se secaron al aire.
Microscopía electrónica: Se trataron viriones HSV-1 KOS purificados (2,5 x 10^{7} ufp/ml), de acuerdo con Visalli et al., Virus Res. 29: 167 (1993), con 25 \muM de péptido antiviral de SEC ID Nº: 1 o del péptido de control EBX (SEC ID Nº: 17) en 40 \mul de DMEM sin suero tamponado con Hepes 25 mM (pH 7,4) durante de 5 a 60 min a 4 ó 23ºC. Se adsorbieron alícuotas (10 \mul) sobre rejillas de pioloform revestidas con poli-L-lisina durante 5 min a 23ºC. Las rejillas se aclararon con PBS, se tiñeron con ácido fosfotúngstico (PTA) en agua ajustado a pH \sim6, y se secaron al aire. Como alternativa, se pre-adsorbió el virus sobre rejillas y se trataron con péptidos después de ello. Se aplicó un total de 4 x 10^{9} ufp/ml de HSV-1 KOS purificado en 5 \mul de PBS en las rejillas revestidas durante 5 min a 23ºC, y las rejillas se aclararon una vez con DMEM sin suero tamponado con Hepes 25 mM (pH 7,4) y se trataron con 15 \mul de EB o de EBX 5 mM en el mismo medio durante 30 min a 37ºC. Se reajustó el pH de soluciones muy concentradas de péptido antiviral de SEC ID Nº: 1 y de EBX a 7,4 con NaOH antes de su uso. Para evitar la evaporación de las soluciones que contienen péptidos, cada rejilla se mantuvo en una placa de tinción flexible Hiraoka y se cubrió con una campana en miniatura hecha a partir de tubos de microcentrífuga de polipropileno de 0,5 ml, lo bastante pequeña como para que los 15 \mul rellenen la mitad de la campana de cara a la superficie revestida de la rejilla. El ensamblaje completo se incubó después en una cámara húmeda durante 30 min a 37ºC. Después del tratamiento, las rejillas se aclararon dos veces con DMEM y una vez con PBS antes de teñirse con PTA y secarse. Se examinaron las rejillas en un microscopio electrónico JEOL JEM-1200EX a 15.000 y 40.000 x aumentos.
Síntesis de péptidos: Se realizó la síntesis y el análisis de péptidos en el Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin-Madison. La síntesis se realizó a una escala de 25 pmoles usando un sintetizador automático (Applied Biosystems Model 432A "Synergy"), siguiendo los principios descritos inicialmente por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 7129 (1963) con modificaciones de Meienhofer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 13: 35 (1979) y Fields et al., Peptide Res. 4: 95 (1991). Se precipitaron los péptidos escindidos con t-butilmetiléter frío, se disolvieron en agua, y se examinaron por HPLC analítica (pureza) y por espectroscopía de masas de ionización de electronebulización (masa molecular, véase la Tabla 1). Se determinaron las concentraciones de péptidos en solución a partir de las lecturas de absorbancia a 215 y a 225 nm, como se enseña en Segel, Biochemical Calculations, 2ª ed. John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY (1976).
Ejemplo 2 Actividad Antiviral de Péptidos Antivirales
El péptido antiviral EB (SEC ID Nº: 1), fue un agente antiviral eficaz cuando estaba presente durante la infección de cultivos de células Vero con HSV-1 KOS, bloqueando la formación de placas como se demuestra en las Fig. 1A (\bullet), Fig. 1B (\bullet) y Fig. 1D (\circ); y reduciendo la producción de virus hasta en ocho órdenes de magnitud, dependiendo de la concentración (véase la Fig. 1E). En comparación con un péptido de control EBX en las Fig. 1A (\circ) y Fig. 1B (\circ), el péptido antiviral EB fue un antiviral mucho más eficaz, bloqueando infecciones a concentraciones 10 ó 100 veces menores, dependiendo de la presencia (Fig. 1A) o ausencia (Fig. 1B) de suero.
Los efectos citotóxicos del péptido antiviral EB, medidos por exclusión de azul tripán en ausencia de suero, se observaron sólo a concentraciones 100 veces mayores (Fig. 1C, (\bullet); CI_{50} = 68 \muM) que las concentraciones antivirales (Fig. 1B, (\bullet); CI_{50} = 0,7 \muM). En presencia de suero, los primeros efectos citotóxicos se observaron a EB 200 \muM (Fig. 1C, (\Delta)). No se asociaron efectos citotóxicos con el péptido de control EBX (SEC ID Nº: 17) (Fig. 1C, (\circ)).
Se descubrió que el tetrámero amino-terminal R-R-K-K cargado era útil para potenciar la solubilidad del péptido antiviral EB, que de otro modo sería hidrófobo, pero que no tiene ninguna actividad antiviral importante por sí mismo. En presencia de suero, no se asoció ninguna actividad antiviral con el tetrámero R-R-K-K libre (SEC ID Nº: 16) a concentraciones de hasta 200 \muM (Fig. 1A, (\ding{115})).
En experimentos diferentes, se descubrió que el tetrámero R-R-K-K libre (SEC ID Nº: 16) inhibía la infección de células Vero por hrR3 en condiciones sin suero a un valor de CI_{50} de 1,3 mM (no se muestran los datos). También se descubrió que concentraciones altas (de exceso molar de hasta 100 veces), pero no antivirales, de péptido R-R-K-K libre (SEC ID Nº: 16) no competían con la actividad antiviral del péptido EB y no podían mitigar la inhibición de infecciones por hrR3 debida al péptido antiviral EB (no se muestran los datos).
Para averiguar si los derivados de una secuencia de proteína de transición de membrana presentaban actividad antiviral, se ensayó un péptido antiviral modificado (SEC ID Nº: 3), denominado EBPP, en el que el resto de prolina central se desplazó al extremo carboxi-terminal. Este péptido EBPP (Tabla 1) era el doble de activo que el péptido EB original tanto en los ensayos de reducción de placas (Fig. 1D) como de rendimiento (no se muestran los datos).
El péptido EB se modificó para que portara biotina (SEC ID Nº: 2), y se ensayó su actividad como se ha descrito anteriormente. Como se demuestra en la Fig. 2, el EB biotinilado era esencialmente tan eficaz como EB. Por lo tanto, la biotinilación del péptido tuvo un efecto insignificante sobre su actividad.
Se determinó la actividad antiviral de varios otros péptidos antivirales y controles de acuerdo con la presente invención, como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación. Como se muestra en la Fig. 1E, el péptido antiviral de SEC ID Nº: 4, denominado "LALA", demuestra una actividad antiviral similar a la de EB.
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Ejemplo 3 Comparación de la Actividad Antiviral del Péptido Antiviral frente a Aciclovir
Se infectaron cultivos de células Vero como los preparados en el Ejemplo 1 con HSV-1 y se ensayó la producción de virus como se describe en el Ejemplo 1. Se comparó la actividad antiviral de un péptido antiviral EB de acuerdo con la presente invención (SEC ID Nº: 1) con la actividad antiviral del actual nucleósido antiviral convencional de HSV, aciclovir. Se añadieron los dos péptidos a las células Vero una hora antes de la infección con HSV. Como ilustra la Fig. 3, aunque aciclovir presenta la mayor actividad antiviral a dosificaciones bajas, a altas concentraciones, es decir, las que exceden de 10 \muM del ingrediente activo, EB demostró la mayor actividad antiviral.
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Ejemplo 4 Efectos tempranos y Efectos sobre la Propagación Célula-Célula
Se determinó que los péptidos antivirales de acuerdo con la presente invención actúan pronto en el ciclo vital de virus. Como se demuestra en la Figura 4A, EB fue sustancialmente más eficaz cuando estaba presente durante la infección y 1 hora antes y después de la infección, que cuando estaba presente de manera continua comenzando 1 hora después de la infección (CI_{50} = 5,5 \muM, (\circ) frente a CI_{50} = 24, (\bullet), respectivamente). Además, cuando estaba presente antes y durante la adsorción, EB no tenía efecto sobre el tamaño de placa. Cuando el péptido EB estaba presente de manera continua después de la infección, se inhibió la propagación de placas de manera dependiente de la dosis (Fig. 4A, (\Delta); CI_{50} = 12 \muM). Para asegurar que las placas se midieran de manera fiable, se infectaron cultivos celulares a muy baja multiplicidad (moi < 0,01) y los tamaños de placas se midieron microscópicamente muy pronto (1 día post-infección). Como se muestra en la Figura 4B, en pocillos de control no tratados, el tamaño de placa estaba ampliamente distribuido (barras negras; media: 66.000 \pm 6200 \mum^{2}), mientras que la adición de concentraciones crecientes de EB 1 hora post-infección cambió progresivamente la distribución hacia clases de menor tamaño (por ejemplo, EB 25 \muM redujo significativamente el tamaño medio de placa en un 70%, hasta 6900 \pm 2600 \mum^{2}; t = 6,88; barras sombreadas). Por el contrario, la presencia de EB hasta 1 hora post-infección no tuvo efecto sobre el tamaño de placa, aunque el número de placas se redujo drásticamente en comparación con el tratamiento post-infección. Por lo tanto, el tamaño medio de placa combinado después de tratamientos transitorios con 6 y 12 \muM de EB (68.000 \pm 11.000 \mum^{2}), era indistinguible de los controles. EB parecía actuar en una fase temprana de la infección viral y reducir el tamaño de placa cuando se añadía después de la infección.
Ejemplo 5 Agregación de Virus por Péptido Antiviral
Se demostró que los péptidos antivirales de la presente invención agregan virus por microscopía electrónica. Se incubaron partículas víricas purificadas a altas concentraciones, como se requiere para una visualización eficaz, con EB 25 \muM, se adsorbieron sobre rejillas revestidas y se tiñeron con PTA. Los resultados demostraron que casi todas las partículas se veían en relativamente pocos agregados grandes. Por el contrario, casi todos los virus no tratados, o las partículas víricas tratadas con EBX 25 \muM, se encontraron esparcidos individualmente y uniformemente sobre la superficie de la rejilla. Las partículas víricas individuales teñidas con PTA dentro de los agregados eran prácticamente indistinguibles de las partículas de control, indicando que EB no inducía grandes anormalidades estructurales en las partículas ví-
ricas. Los agregados inducidos por EB se formaron rápidamente (< 5 min) a temperatura ambiente, así como a 4ºC.
Ejemplo 6 Actividad Antiviral del Péptido Antiviral con Respecto a la Dosis de Virus
Se infectaron cultivos con hrR3 a dosis de 19, 210 y 5700 ufp/pocillo en presencia de diversas concentraciones de EB, se puntuaron 8 horas después para células lacZ^{+}, y los valores de CI_{50} obtenidos fueron de 0,66, 1,2 y 11 \muM, respectivamente, como se muestra en la Fig. 5.
De forma significativa, por encima de la dosis intermedia de 210 ufp/pocillo se producía un mayor incremento en la CI_{50} con títulos crecientes de virus que por debajo de esa dosis, como se muestra en el recuadro de la Fig. 5. Se esperaría una relación inversa entre la CI_{50} y el título de virus si EB actuase únicamente como un agente de agregación, que debería funcionar más eficazmente, es decir, con menor CI_{50}, a la mayor dosis de virus. Por lo tanto, la agregación viral no hace ninguna contribución importante a la actividad antiviral de EB en estos experimentos. Además, el hecho de que la actividad antiviral de EB dependa claramente de las concentraciones de virus, sugiere que los péptidos antivirales de la presente invención interactúan con componentes virales.
Ejemplo 7 Inhibición de la Entrada de Virus
Estudios adicionales con virus hrR3 preadsorbido demostraron que el efecto o los efectos antivirales de un péptido antiviral de la presente invención no están relacionados ni con la adsorción del virus ni con la agregación del virus, sino con la inhibición de la entrada del virus. En estos estudios, se preadsorbió el virus hrR3 sobre células durante 1 hora a 4ºC antes de añadirse EB o EBX 25 \muM enfriado en hielo en DMEM sin suero. Después de 1 hora más a 4ºC, los cultivos se cambiaron a 37ºC para iniciar la entrada de virus. A intervalos de 15 min después del cambio de temperatura, se inactivó cualquier virus que quedara fuera de las células lavando los cultivos con tampón citrato de bajo pH. Después, los cultivos se aclararon y se devolvieron a DMEM sin péptidos suplementado con suero hasta que se fijaron y se tiñeron para \beta-galactosidasa 8 horas después del cambio de temperatura.
Como se muestra en la Fig. 6A, en cultivos de control con tratamiento simulado (\circ) la entrada de virus comenzó 15-30 min después de la transferencia a 37ºC y se completó en aproximadamente 60 min a un nivel de aproximadamente 340 células lacZ^{+} por 6,5 mm^{2} (o 1450 células lacZ^{+}/pocillo). En cultivos tratados con el péptido EB, el número de células lacZ^{+} se redujo en > 90% (\bullet). El péptido EBX no redujo significativamente el número de células lacZ^{+} (\ding{115}). Se obtuvieron esencialmente los mismos resultados cuando se añadieron EB y EBX antes de la adsorción del virus (no se muestran los datos). Cuando el péptido se añadió inmediatamente después de cada tratamiento con citrato, EB ya no tuvo efecto alguno sobre el desarrollo de células lacZ^{+} (Fig. 6B, (\bullet); compárese con Fig. 6A, (\circ)). EBX tampoco inhibió significativamente el desarrollo de células lacZ^{+} cuando se añadió inmediatamente después de los tratamientos con citrato (Fig. 6B, (\ding{115}). Por lo tanto, EB no tuvo efecto sobre la expresión del gen lacZ del promotor temprano ICP6, pero bloqueó selectivamente la entrada de virus.
Esta conclusión se refuerza por el descubrimiento de que la fase de la infección con virus preadsorbido sensible a EB precede claramente a la expresión de los genes lacZ en células infectadas con hrR3 (Fig. 7A). De nuevo, se preadsorbió hrR3 sobre células durante 1 hora a 4ºC, se aclaró el virus no unido y se mantuvieron las células durante una hora más a 4ºC. Los cultivos se transfirieron después a 23ºC durante 30 min antes de cambiarlos a 37ºC. El cambio a 37ºC más gradual permitió que las capas de células permanecieran intactas durante los posteriores cambios frecuentes de medio. Inmediatamente después de la adsorción viral, se trataron las células con EB 50 \muM durante periodos de 1 hora a intervalos de 1 hora consecutivos. Entre 1 y 4 horas post-infección, se inhibió la entrada de virus en un 70-80%. A partir de entonces, ya no se inhibió significativamente la infección (Fig. 7B, (\bullet)). Se fijaron inmediatamente cultivos en paralelo después de tratamientos simulados y se tiñeron con X-gal. En estos cultivos, las primeras células azules (lacZ^{+}) aparecieron a las 7 horas post-infección y su número aumentó casi linealmente durante las 3 horas siguientes (Fig. 7A, (\circ)). A las 7 horas post-infección, EB dejó de ser inhibidor. Por lo tanto, EB sólo bloqueó la entrada de virus durante un breve periodo temprano sensible y no tuvo efecto sobre la expresión del gen lacZ ni sobre el desarrollo de actividad \beta-galactosidasa una vez que el virus hubo entrado en la célula. Como se demuestra en la Fig. 7B, EB inhibió la entrada de virus preadsorbido de manera dependiente de la dosis, con una CI_{50} = 15 \muM (\bullet), mientras que EBX fue menos eficaz (CI_{50} \sim 100 \muM; (\circ)).
Ejemplo 8 Efectos Viricidas del Péptido Antiviral
Se descubrió que la unión de péptidos antivirales de la presente invención a partículas víricas conduce a la inactivación irreversible de virus. Se realizaron ensayos viricidas con hrR3. En el primer experimento (Fig. 8A), EB inhibió la infectividad de viriones de manera dependiente de la concentración con una CI_{50} = 44 \muM (\bullet), mientras que EBX no tuvo efecto inhibidor (\circ). En el segundo experimento, en el que se necesitaron concentraciones ligeramente mayores de EB para conseguir la inhibición (Fig. 10B, (\bullet); CI_{50} = 69 \muM), también se descubrió que los viriones tratados se inactivaban irreversiblemente. Es decir, no pudieron reactivarse alícuotas de viriones tratadas con EB y después diluidas durante la diálisis durante una noche contra medio que contenía suero que podía atrapar cualquier EB unido de manera reversible (compárese la Fig. 1, (\bullet); A frente a B). Por el contrario, los viriones recuperados después de la diálisis (el 31% a cualquier concentración de EB) permanecieron inactivos exactamente como los controles no dializados (Fig. 8B, (\Delta) frente a (\bullet)).
Para evaluar posibles contribuciones de la agregación viral a la inactivación viral, se filtraron alícuotas adicionales de viriones tratados con EB y posteriormente diluidos a través de membranas de 0,22 \mum antes de ensayar su infectividad restante. En ausencia de, o a bajas concentraciones de EB (\leq 3 \muM), el 80-85% de los viriones quedaron atrapados en las membranas. No obstante, los viriones restantes, quedaron retenidos solamente después de exponerse a concentraciones mayores de EB, lo que potenció la adhesión a membrana y/o provocó agregación viral (Fig. 8B, (\ding{115})). Tales cambios en las propiedades adhesivas de los viriones se indujeron muy por debajo de las concentraciones de EB requeridas para la inactivación viral (Fig. 8B, (\ding{115}) frente a (\bullet) y (\Delta)).
Se examinaron por microscopía electrónica los efectos de los tratamientos más intensos con EB en viriones teñidos con PTA que se habían preadsorbido sobre rejillas (para evitar la agregación) y se expusieron a 5 mM de péptido. Los viriones tratados con EB tenían un aspecto esencialmente igual al de los viriones con tratamiento simulado, excepto porque los contornos de las envolturas virales en las partículas tratadas con EB eran menos pleomórficos, sugiriendo que EB estabilizaba a los viriones. A 5 mM, EBX tuvo el mismo efecto que EB.
Ejemplo 9 Actividad In Vivo del Péptido Antiviral
Los péptidos antivirales de acuerdo con la presente invención demostraron actividad in vivo cuando se aplicaron por vía tópica. Se incubó HSV-1 cepa KOS durante 1 hora con el péptido EB o con el péptido EBX a una concentración de 25 \muM a temperatura ambiente en PBS. Se infectaron grupos de diez ratones cada uno por escarificación corneal, con 5,0 x 10^{5} unidades formadoras de placas como se ha descrito anteriormente (Brandt et al., J. Virol. Meth. 36, 209 (1992).
En resumen, se anestesiaron los ratones con halotano, se arañó la córnea 3 veces horizontalmente y 3 veces verticalmente, y se depositó una gota de 5 \mul que contenía virus sobre la córnea. Después, los ratones se devolvieron a sus jaulas y se dejó que se recuperaran. También se incluyó un grupo de control infectado con KOS pero no expuesto al péptido. Los ratones no se trataron con péptido después de la infección.
A varios tiempos post-infección, se midió la gravedad de la enfermedad ocular como se ha descrito anteriormente (misma referencia). En resumen, se puntuó la vascularización. 0, sin vascularización; 1+ < 25% de la córnea implicada; 2+ implicación del 25-50%; 3+ implicación > 50%. Se puntuó la queratitis: 0, sin turbidez corneal; 1+ turbidez, visible algún detalle del iris; 2 + turbio, detalles del iris oscurecidos; 3+ córnea totalmente opaca; 4+ córnea perforada y turbia. Los datos se presentan como la puntuación media de enfermedad cada día en cada uno de los tres grupos. Los resultados se ilustran en la Fig. 9.
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Las siguientes referencias se incorporan adicionalmente como referencia:
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<210> 14
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<212> PRT
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<222> (1)..(1)
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<223> Xaa en la posición 1 puede ser cualquier resto aminoacídico cargado
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<222> (1)..(1)
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<223> Xaa en la posición 1 puede aparecer de 0 a 10 veces
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<222> (18)..(18)
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<223> Xaa en la posición 18 puede ser cualquier resto aminoacídico cargado
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<223> Xaa en la posición 18 puede aparecer de 0 a 10 veces
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<223> Xaa en la posición 1 puede ser cualquier resto aminoacídico cargado
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<223> Xaa en la posición 1 puede aparecer de 0 a 10 veces
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<223> Xaa en la posición 11 puede ser cualquier resto aminoacídico cargado
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<222> (11)..(11)
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<223> Xaa en la posición 1 puede aparecer de 0 a 10 veces
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<223> construcción sintética
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<400> 25
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<222> ()..()
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Claims (11)

1. Una composición que comprende un péptido antiviral, en la que el péptido antiviral se selecciona del grupo constituido por las SEC ID Nº: 1-4, las SEC ID Nº: 14-15 y las SEC ID Nº: 18-30, en la que:
si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 14, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente, tales que cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, m tiene un valor de 0 o de 3 a 10, en la que, además, si m = 0, n tiene un valor de 4 a 10, y si n = 0, m tiene un valor de 4 a 10;
si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 15, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente, tales que cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, en la que, además, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, y m tiene un valor de 0 o de 3 a 10; y
en la que, además, el péptido antiviral está presente en una cantidad suficiente para ser eficaz contra un organismo viral, para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección viral.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el péptido antiviral se selecciona del grupo constituido por las SEC ID Nº: 1-4.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el péptido antiviral se selecciona del grupo constituido por las SEC ID Nº: 14-15.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 14, en la que o m = 0 o n = 0, en la que si m = 0, n tiene un valor de 4 a 10, y si n = 0, m tiene un valor de 4 a 10.
5. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 15, en la que o m = 0 o n = 0.
6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, y en la que la composición es eficaz para tratar o prevenir una infección viral en un hospedador de mamíferos.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la composición es eficaz para tratar o prevenir infecciones por virus con envoltura.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la composición es eficaz para tratar o prevenir infecciones por uno o más virus seleccionados del grupo constituido por virus de la inmunodeficiencia humana, virus herpes simplex y citomegalovirus.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la composición es eficaz para tratar o prevenir infecciones por uno o más virus herpes simplex.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la composición es eficaz para tratar o prevenir infecciones por virus sin envoltura.
11. Uso de un péptido antiviral para la fabricación de un medicamento, administrándose el medicamento en el tratamiento de una infección viral, en el que el péptido antiviral se selecciona del grupo constituido por las SEC ID Nº: 1-4, las SEC ID Nº: 14-15 y las SEC ID Nº: 18-30, en el que:
si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 14, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente, tales que cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, m tiene un valor de 0 o de 3 a 10, en la que, además, si m = 0, n tiene un valor de 4 a 10, y si n = 0, m tiene un valor de 4 a 10;
si el péptido antiviral es la SEC ID Nº: 15, entonces X1 y X2 se seleccionan de entre uno o más restos aminoacídicos cargados positivamente, tales que cada X1 y cada X2 pueden ser el mismo o un resto aminoacídico cargado positivamente diferente, en el que, además, n tiene un valor de 0 o de 3 a 10, y m tiene un valor de 0 o de 3 a 10; y
en el que, además, el péptido antiviral está presente en una cantidad eficaz.
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