CN105031623A - 生物制剂及在制备预防和控制埃博拉病毒的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用以下步骤制备：将酸酐用二甲基亚砜配制成浓度为1M的母液；配制0.1M的磷酸氢二钠溶液，用于制备蛋白溶液，蛋白浓度为20mg/ml；将酸酐溶液加入待修饰的蛋白溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；重复进行上述酸酐与蛋白溶液混合过程，最终使蛋白溶液中酸酐的终浓度为60mM，溶液pH9.0，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；将酸酐化蛋白溶液装入透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析48h，将酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存。
Description
技术领域
本发明涉及一类医药技术领域中新型抗病毒生物制剂，具体为一种预防和控制埃博拉病毒感染的生物制剂。
背景技术
埃博拉病毒病（Ebolavirusdisease，EVD）是由埃博拉病毒（Ebolavirus，EBOV）感染引起的经体液或密切接触传播的病毒性传染病。埃博拉病毒在自然界的保存宿主是果蝠，主要对包括人类在内的灵长类致病，自上世纪七十年代发现埃博拉病毒以来，该病毒感染已经零星在中非地区有过局部爆发，但从2014年蔓延到今年的西非埃博拉疫情远超历史上任何一次爆发，据世卫组织统计，截至2015年4月8日，总感染人数为25550人，其中超过10587人死亡。该病的潜伏期为2至21天，早期症状为发热、胃肠道不适、肌肉疼痛等，随着病情的发展，逐渐出现内外出血、极度虚弱等症状，最后发展为肝肾等脏器衰竭。
埃博拉病毒属于丝状病毒科（Filoviridae），目前发现的埃博拉病毒有五种型，分别是Zaireebolavirus(ZEBOV)，Sudanebolavirus(SEBOV)，Bundibugyoebolavirus(BEBOV)，TaiForestebolavirus(TFEBOV)和Restonebolavirus(REBOV)。其中Zaire和Sudan型埃博拉病毒的致病性最高，并且是历史上造成埃博拉流行的主要病毒型，本次疫情中流行的埃博拉病毒也属于Zaire型。埃博拉病毒在自然界中有特定的保存宿主和完整的感染循环，所以不能像天花病毒一样通过在人群中预防接种疫苗而被灭绝，非洲独特的自然环境、风俗习惯和相对落后的公共卫生体系是造成埃博拉在非洲爆发的重要因素，每次埃博拉疫情基本都源于人类与携带病毒的野生动物的接触。由于人类与野生动物接触而感染病毒属于随机事件，无法预测下一次疫情出现的时间和地点，而全球一体化的进程使得每次疫情都可能向全球蔓延，例如本次疫情已经波及欧洲和美洲。
目前防控埃博拉疫情主要依靠诊断和隔离，对病人采取对症支持治疗。针对该病的特效药物和疫苗都处于临床前或临床试验阶段。一些抗埃博拉药物在先期临床试验中已经显示出比较好的疗效，其中最著名的是抗体类药物ZMapp，但ZMapp用于治疗存在以下两个问题。首先，ZMapp由三种针对Zaire型埃博拉病毒的中和抗体组成，能否在未来可能爆发的疫情中针对变异后的抗原或是其他型别的埃博拉病毒产生有效保护，还未能证实；其次，ZMapp的生产工艺比较复杂，成本较高，且需要较完备的储存、运输条件，因此如何在非洲经济相对落后的国家用于疫情控制也是一个难题。
因此，研发一种安全、有效（同时针对不同型别的埃博拉病毒）、廉价（在非洲及广大欠发达地区能广泛使用），易于长期储存（可作为战略储备药物）的药物对于控制未来可能出现的埃博拉疫情十分重要。
发明内容
本发明的目的是针对抗埃博拉病毒药物的缺乏和不足状况，提供一种新型的预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物药物制剂。通过设计蛋白质多肽类的病毒进入抑制剂，阻断埃博拉病毒进入其靶细胞，使人体细胞免于病毒感染，从而起到预防和控制病毒感染的目的。使用活性酸酐来修饰和封闭经纯化的蛋白质表面带正电荷的氨基酸，从而使修饰后的蛋白具有阻断多种基因型的埃博拉病毒进入和感染靶细胞的活性，成为抗埃博拉候选药物。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用以下步骤制备：
（1）、将3-羟基-邻苯二甲酸酐用二甲基亚砜配制成浓度为1M的母液；
（2）、配制浓度为0.1M、pH为8.5的磷酸氢二钠溶液，人血清白蛋白加入磷酸氢二钠溶液制成HSA溶液，HSA溶液浓度为20mg/ml；
（3）、将母液加入待修饰的HSA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用NaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）、重复进行步骤（3）所述的母液与HSA溶液混合过程，最终使HSA溶液中酸酐的终浓度为60mM，调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）、将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液，4℃下透析48h，将酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
所述3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）可以用马来酸酐（maleicanhydride，缩写为ML）或者琥珀酸酐（succinicanhydride，缩写为SU）代替。
所述人血清白蛋白（HSA）可以用牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，缩写为BSA）、牛β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，缩写为β-LG）、鼠血清白蛋白（mouseserumalbumin，缩写为MSA）、卵清蛋白（ovalbumin，缩写为OVA）、RNA酶1（RNase1）或者RNA酶7（RNase7）代替。
上述生物制剂具有在制备预防和控制Zaire型和Sudan型埃博拉病毒的药物中的应用。
一、酸酐修饰蛋白浓度测定
将上述制备得到的酸酐化蛋白样品按照BCA蛋白浓度分析试剂盒的操作步骤测定浓度，具体方法如下：
（1）使用PBS溶液稀释蛋白标准品（BSA），使BSA终浓度为0、0.1、0.2、0.4、1、2mg/mL；
（2）分别将20μl各浓度标准品和20μl待测样品（使用PBS进行稀释）加入96孔板中；
（3）制备BCA工作液，将A液与B液按1：50比例混匀；
（4）每孔加入200μl工作液，轻柔混匀，37℃孵育20min；
（5）待冷却至室温后，使用酶标仪在562nm处读取各空吸光度；
（6）根据蛋白标准品OD读数，使用Excel和SigmaPlot软件绘制蛋白浓度标准曲线，如图5所示，根据标准曲线及对应公式计算酸酐化蛋白样品浓度。
二、埃博拉假病毒的制备
（1）分别对2014年Zaire型埃博拉病毒株（GenBank：KM034549.1）和2012年Sudan型埃博拉病毒株（Genebank：KC545389.1）的包膜蛋白（GP蛋白）基因序列进行密码子优化，并进行基因合成。Zaire型GP蛋白基因合成序列记为“合成基因1”（碱基序列见序列表），Sudan型GP蛋白基因合成序列记为“合成基因2”（碱基序列见序列表）。
（2）运用分子克隆的方法将合成基因1与合成基因2分别装载于pcDNA3.1（Invitrogen）表达载体的多克隆位点上，重组质粒分别命名为pcDNA3.1-Zaire-GP和pcDNA3.1-Sudan-GP；将鉴定正确的重组质粒保存于Top10大肠杆菌菌株中。
（3）使用终浓度10%胎牛血清的DMEM培养基在T75细胞培养瓶中培养人胚肾细胞HEK293T。当细胞生长接合度约为70%时，更换无血清的DMEM培养基，37℃继续培养1h。将210μl的PEI转染试剂（1μg/μl）与3μg的pcDNA3.1-Zaire-GP质粒以及65μg的pNL4-3Luc.R-E-质粒混合后，与T75培养瓶中的HEK293T细胞于37℃孵育6h。更换DMEM培养基，37℃培养60h后收集培养基上清液，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，分装后于-80℃保存。该上清液中包含Zaire型埃博拉病毒假病毒，同理，将转染质粒换为pcDNA3.1-Sudan-GP与pNL4-3Luc.R-E-质粒的混合物，可以制备得到Sudan型埃博拉病毒假病毒。
埃博拉假病毒由展示埃博拉病毒包膜蛋白的病毒包膜和携带萤光素酶（Luciferase）报告基因的缺陷型慢病毒核衣壳构成，其中慢病毒衣壳与报告基因核酸由pNL4-3Luc.R-E-质粒合成。埃博拉假病毒可以单次感染埃博拉病毒易感细胞，模拟埃博拉病毒与细胞受体结合、内吞以及膜融合过程。
三、利用埃博拉假病毒研究酸酐化蛋白对埃博拉病毒的进入抑制作用（抗病毒活性）
使用终浓度10%胎牛血清的DMEM培养基在T75细胞培养瓶中培养人肝癌细胞系Huh7。将Huh7细胞使用胰酶消化处理后铺于96孔板，待细胞生长密度接近80%时，取浓度10μM的HP酸酐修饰的HSA酸酐化蛋白（HP-HSA）溶液，使用DMEM培养基进行2倍梯度稀释，分别将50μl各浓度梯度的HP-HSA稀释液与50μl的Zaire型埃博拉假病毒溶液混合（HP-HSA终浓度为5μM），室温孵育0.5h。将100μl上述各梯度混合溶液分别加入96孔板单个孔中，每个药物浓度设三个复孔。使用相同浓度梯度稀释的未修饰的HSA溶液作为药物阴性对照组，同样与假病毒混合；同时设定只加入假病毒而没有加入HP-HSA的感染阳性对照组和既不加HP-HSA也无假病毒的感染阴性对照组。37℃培养细胞至感染后12h，换新鲜培养基；继续培养细胞至感染后72h，使用PBS溶液清洗细胞一次，每孔加入20μl细胞裂解液，室温裂解细胞1h，每孔取10μl细胞裂解混合物，加入50μl荧光素酶反应底物溶液，使用荧光读数器读取各孔荧光值。使用以下计算公式计算各浓度梯度药物对假病毒的进入抑制率：
病毒进入抑制率（%）=[(感染阳性对照组荧光读数均值-实验组各孔荧光读数)/(感染阳性对照组荧光读数均值-感染阴性对照组荧光读数均值)]*100。
根据各浓度病毒进入抑制率，使用SigmaPlot软件做出抑制率与药物浓度的曲线关系图（如图1所示）；使用CalcuSyn软件计算HP-HSA抑制Zaire型假病毒进入的半数抑制浓度（IC50值）。
同理，可以用相同的方法得到ML-HSA、SU-HSA与Zaire型假病毒的抑制率与药物浓度的曲线关系图，以及对应的IC50值（如图2所示）；用相同的方法得到HP-HSA、ML-HSA、SU-HSA与Sudan型假病毒的抑制率与药物浓度的曲线关系图，以及对应的IC50值（如图3所示）。
按照相同的方法，测定包括HP-β-LG、ML-β-LG、SU-β-LG、HP-OVA、HP-BSA、HP-RNase1、HP-MSA等多种酸酐化蛋白的病毒抑制曲线和IC50值，如表1所示。
表1
四、酸酐化蛋白的细胞毒性研究
HP-HSA的细胞毒性检测，方法如下：
（1）将Huh7细胞以4×103个/孔的比例均匀的铺到96孔细胞培养板中，37℃培养过夜；
（2）将待测HP-HSA样品和未经修饰的HSA分别用DMEM培养基进行倍比稀释，HP-HSA和HSA样品的起始浓度均为100μM；
（3）将上述过夜培养的Huh7细胞的培养液吸出，并将稀释好的样品以100μl/孔的体积加入Huh7细胞中，同时设置含有1%TritonXl00的细胞毒性对照组和只加入DMEM培养基的细胞对照组，每种每个稀释度做5个复孔，37℃继续培养细胞48h；
（4）吸出各孔的培养液，每孔加入100μl含有3μlCCK8试剂的DMEM培养液，37℃继续孵育3h；
（5）使用酶标仪在450nm处读取吸光度值（OD），使用以下公式计算各孔细胞存活率：
活性细胞比率（%）=[(OD450nm样品-OD450nm细胞毒性对照组均值)/(OD450nm细胞对照组均值-OD450nm细胞毒性对照组均值)]*100。
使用SigmaPlot软件制作细胞存活率柱状图（如图6所示），该图体现HP-HSA作为生物药物制剂的细胞毒性与剂量间的关系。
五、检测酸酐化蛋白氨基酸修饰率与病毒抑制活性的关系
（1）分别用HP最终浓度为2.5、5、12、25、36、48、60mM的体系制备HP酸酐化的HSA蛋白；
（2）将以上酸酐化HSA样品和未经酸酐化修饰的HSA（阴性对照组）用0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5）稀释至1mg/ml浓度，以25μl/孔的体积加入96孔板中，同时设置每孔加入25μl的0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5）的空白对照组，以上各组样品均设置4个复孔；每孔加入25μl浓度为0.1M的四硼酸钠，混合均匀，室温放置5min；每孔加入10μl的2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，缩写为TNBS），混合均匀，室温放置5min；每孔加入100μl的反应终止液（0.1M的磷酸氢二钠溶液，1.5mM的亚硫酸钠，pH8.5）；使用酶标仪在420nm处检测各孔的OD值，根据下列公式计算HSA表面赖氨酸的酸酐化修饰率：
赖氨酸修饰率（%）=[1-(OD420nm样品-OD420nm空白对照组均值)/(OD420nm阴性对照组均值-OD420nm空白对照组均值)]*100。
使用SigmaPlot软件制作酸酐化修饰体系中HP的终浓度与HSA表面赖氨酸的酸酐化修饰率的对应关系图（如图7所示）。
（3）同样将以上酸酐化HSA样品和未经酸酐化修饰的HSA（阴性对照组）用0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH9.0）稀释至1mg/ml浓度，以90μl/孔的体积加入96孔板中，同时设置每孔加入90μl的0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH9.0）的空白对照组，以上各组样品均设置4个复孔；每孔加入10μlρ-HPG（10mM），混合均匀并调节pH值至9.0，置于室温并避光静置120min；使用酶标仪在340nm处检测各孔的OD值，根据下列公式计算HSA表面精氨酸的酸酐化修饰率：
精氨酸修饰率（%）=[1-(OD340nm样品-OD340nm空白对照组均值)/(OD340nm阴性对照组均值-OD340nm空白对照组均值)]*100。
使用SigmaPlot软件制作酸酐化修饰体系中HP的终浓度与HSA表面精氨酸的酸酐化修饰率的对应关系图（如图8所示），
分别检测上述各种HP酸酐修饰率的HSA样品针对Zaire-PsV和Sudan-PsV假病毒的进入抑制作用；用CalcuSyn软件计算不同HP酸酐修饰率的HSA蛋白抑制Ebola假病毒进入的半数抑制浓度（IC50值）和90%进入抑制浓度（IC90值），如表2所示。
表2
本发明所述的生物制剂具有阻断Zaire型和Sudan型埃博拉病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染的作用，具有安全无毒副作用、稳定性高、成本低廉等显著优势，可用于开发成为以其为主要活性成分的预防和控制埃博拉病毒感染的各种剂型，如溶液制剂、干粉制剂、喷雾剂、搽洗剂或者盥洗剂，且制备和储存方法简单，尤其适用于非洲埃博拉流行疫区。
附图说明
图1表示HP-HSA针对Zaire型埃博拉假病毒的进入抑制曲线。
图2表示ML和SU酸酐化修饰的HSA针对Zaire型埃博拉假病毒的进入抑制曲线。
图3表示三种酸酐化修饰的HSA针对Sudan型埃博拉假病毒的进入抑制曲线。
图4表示HP-β-LG针对Sudan型埃博拉假病毒的进入抑制曲线。
图5表示BCA蛋白定量实验标准品曲线。
图6表示HP-HSA针对Huh7细胞的细胞毒性实验结果。
图7表示酸酐化反应体系中HP终浓度与HSA的赖氨酸残基修饰率的关系。
图8表示酸酐化反应体系中HP终浓度与HSA的精氨酸残基修饰率的关系。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
实施例1
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用如下方法制备：
（1）将3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1M的母液；
（2）配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5），加入人血清白蛋白制成HSA溶液，HSA浓度为20mg/ml；
（3）将步骤（1）中制备的酸酐溶液加入待修饰的HSA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4MNaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）重复进行步骤（3）共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液（4℃），共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成换液的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
步骤（1）中所述的3-羟基-邻苯二甲酸酐可以用马来酸酐或者琥珀酸酐代替。
实施例2
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用如下方法制备：
（1）将马来酸酐（ML）用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1M的母液；
（2）配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5），加入牛β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，缩写为β-LG）制成β-LG溶液，β-LG浓度为20mg/ml；
（3）将步骤（1）中制备的酸酐溶液加入待修饰的β-LG溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4MNaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）重复进行步骤（3）共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液（4℃），共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成换液的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
步骤（1）中所述的马来酸酐可以用3-羟基-邻苯二甲酸酐或者琥珀酸酐代替。
实施例3
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用如下方法制备：
（1）将HP用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1M的母液；
（2）配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5），加入卵清蛋白（ovalbumin，缩写为OVA）制成OVA溶液，OVA浓度为20mg/ml；
（3）将步骤（1）中制备的酸酐溶液加入待修饰的OVA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4MNaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）重复进行步骤（3）共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液（4℃），共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成换液的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
步骤（1）中所述的3-羟基-邻苯二甲酸酐可以用马来酸酐或者琥珀酸酐代替。
实施例4
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用如下方法制备：
（1）将HP用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1M的母液；
（2）配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5），加入RNA酶1（RNase1）制成RNase1溶液，RNase1浓度为20mg/ml；
（3）将步骤（1）中制备的酸酐溶液加入待修饰的RNase1溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4MNaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）重复进行步骤（3）共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液（4℃），共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成换液的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
步骤（1）中所述的3-羟基-邻苯二甲酸酐可以用马来酸酐或者琥珀酸酐代替。
实施例5
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用如下方法制备：
（1）将琥珀酸酐（SU）用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1M的母液；
（2）配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5），加入牛血清白蛋白（BSA）制成BSA溶液，BSA浓度为20mg/ml；
（3）将步骤（1）中制备的酸酐溶液加入待修饰的BSA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4MNaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）重复进行步骤（3）共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液（4℃），共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成换液的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
步骤（1）中所述的琥珀酸酐可以用马来酸酐或者3-羟基-邻苯二甲酸酐代替。
实施例6
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用如下方法制备：
（1）将琥珀酸酐（SU）用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1M的母液；
（2）配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5），加入鼠血清白蛋白（MSA）制成MSA溶液，MSA浓度为20mg/ml；
（3）将步骤（1）中制备的酸酐溶液加入待修饰的MSA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4MNaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）重复进行步骤（3）共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液（4℃），共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成换液的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
步骤（1）中所述的琥珀酸酐可以用马来酸酐或者3-羟基-邻苯二甲酸酐代替。
实施例7
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用如下方法制备：
（1）将马来酸酐（ML）用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1M的母液；
（2）配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液（pH8.5），加入RNA酶7（RNase7）制成RNase7溶液，RNase7浓度为20mg/ml；
（3）将步骤（1）中制备的酸酐溶液加入待修饰的RNase7溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4MNaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）重复进行步骤（3）共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液（4℃），共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成换液的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
步骤（1）中所述的马来酸酐可以用3-羟基-邻苯二甲酸酐或者琥珀酸酐代替。
上述实施例制备的生物制剂具有阻断Ebola病毒进入细胞、阻止病毒扩大感染的作用，且兼具稳定性高、生产过程简单、易于推广等显著优势，可用于开发成为以其为主要活性成分的预防和控制Ebola感染的药物，特别是针对抗埃博拉病毒药物的缺乏现状。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
合成基因1
GCCACCATGGGCGTGACCGGAATCCTGCAGCTGCCCAGAGATAGGTTTAAGAGGACCAGCTTTTTCCTGTGGGTGATCATCCTGTTCCAGAGGACCTTCTCCATTCCTCTCGGAGTGATCCACAACAGCACACTGCAGGTCTCCGACGTGGACAAGCTGGTCTGCAGGGATAAGCTGAGCAGCACCAATCAGCTGAGGTCCGTGGGCCTGAATCTGGAAGGCAATGGCGTCGCCACAGATGTCCCTTCCGTGACCAAGAGATGGGGCTTTAGGAGCGGAGTCCCCCCCAAGGTGGTGAATTACGAGGCCGGCGAGTGGGCTGAAAACTGCTACAACCTGGAGATCAAGAAGCCCGACGGAAGCGAATGTCTCCCTGCCGCCCCCGATGGCATCAGAGGCTTCCCTAGGTGCAGATACGTGCACAAAGTCAGCGGAACAGGCCCCTGCGCCGGAGACTTCGCCTTCCACAAAGAGGGCGCCTTCTTTCTCTACGATAGACTGGCCAGCACCGTCATCTACAGGGGCACAACCTTTGCCGAAGGCGTGGTGGCCTTCCTCATCCTGCCTCAAGCCAAGAAGGACTTCTTCTCCAGCCATCCTCTGAGAGAGCCCGTGAATGCCACAGAGGACCCCTCCAGCGGATATTACTCCACCACCATCAGATACCAGGCCACAGGCTTCGGCACCAACGAGACAGAGTACCTCTTCGAGGTGGACAATCTGACCTACGTGCAGCTGGAGAGCAGATTTACCCCCCAATTTCTCCTGCAGCTGAACGAGACCATCTACGCTTCCGGCAAAAGAAGCAACACAACCGGCAAGCTGATCTGGAAAGTGAACCCCGAGATCGATACCACAATCGGAGAGTGGGCCTTCTGGGAGACCAAGAAAAATCTGACCAGAAAGATCAGGTCCGAAGAACTGTCCTTTACAGCCGTCAGCAACGGCCCCAAAAACATCTCCGGCCAGAGCCCCGCTAGAACAAGCTCCGATCCCGAGACAAACACCACCAACGAGGACCACAAGATCATGGCCAGCGAAAACTCCTCCGCCATGGTCCAGGTCCACTCCCAAGGCAGGAAGGCCGCCGTGTCCCACCTGACAACCCTGGCCACCATTAGCACCAGCCCCCAGCCCCCTACAACCAAGACAGGACCCGATAACTCCACCCACAACACACCTGTGTATAAGCTGGACATCAGCGAGGCCACACAAGTGGGCCAACATCACAGGAGGGCTGACAATGACTCCACCGCTAGCGACACCCCCCCTGCCACAACAGCTGCTGGCCCCCTGAAGGCCGAGAATACCAACACCAGCAAGAGCGCCGACAGCCTGGACCTCGCCACCACAACCAGCCCCCAAAATTACTCCGAGACAGCCGGAAATAACAATACCCATCACCAGGATACCGGAGAAGAGTCCGCCTCCAGCGGCAAGCTGGGCCTCATTACAAATACCATCGCCGGCGTCGCTGGCCTGATTACAGGCGGCAGGAGAACCAGGAGAGAGGTGATCGTGAATGCCCAGCCCAAGTGCAATCCCAACCTGCACTATTGGACCACACAAGACGAAGGCGCTGCCATTGGACTGGCCTGGATTCCCTACTTCGGACCCGCCGCTGAAGGAATTTACACCGAGGGCCTGATGCATAATCAGGACGGCCTGATTTGCGGCCTGAGGCAGCTGGCCAACGAGACAACCCAGGCCCTGCAACTCTTCCTCAGAGCCACCACCGAGCTGAGGACCTTCAGCATCCTGAATAGAAAGGCCATCGACTTCCTGCTGCAAAGGTGGGGCGGAACCTGTCACATCCTGGGACCCGATTGCTGCATTGAGCCCCACGACTGGACAAAAAACATCACCGATAAAATCGACCAGATCATCCACGATTTCGTGGACAAGACCCTGCCTGACCAGGGCGACAACGATAACTGGTGGACCGGATGGAGGCAGTGGATTCCCGCTGGCATTGGCGTGACAGGCGTGATCATCGCCGTGATCGCCCTGTTCTGCATTTGCAAGTTCGTCTTCTAGTAA
合成基因2
GCCACCATGGGCGGACTCAGCCTGCTGCAGCTGCCCAGGGACAAGTTCAGGAAGTCCTCCTTCTTCGTGTGGGTGATCATCCTCTTTCAGAAAGCCTTTAGCATGCCCCTCGGAGTCGTGACCAACTCCACACTGGAGGTCACAGAGATCGACCAGCTGGTCTGCAAAGACCACCTGGCCTCCACCGACCAGCTGAAGAGCGTGGGCCTGAATCTGGAGGGAAGCGGCGTCAGCACCGATATCCCCTCCGCCACCAAGAGGTGGGGATTCAGGAGCGGCGTCCCCCCCAAAGTCGTGAGCTACGAAGCCGGCGAGTGGGCTGAGAACTGCTACAACCTGGAGATCAAGAAGCCTGACGGCAGCGAGTGTCTGCCTCCTCCTCCTGACGGCGTGAGAGGCTTCCCCAGATGTAGGTACGTGCACAAGGCCCAAGGCACCGGACCTTGCCCTGGCGACTATGCCTTCCATAAAGACGGCGCCTTCTTTCTGTACGACAGGCTGGCCAGCACAGTGATCTACAGGGGCGTGAATTTCGCTGAAGGCGTCATTGCCTTCCTGATTCTCGCCAAACCTAAGGAGACCTTCCTCCAGAGCCCCCCCATTAGAGAGGCCGTGAACTACACCGAGAACACAAGCAGCTACTACGCCACAAGCTACCTGGAATACGAGATCGAGAACTTCGGCGCCCAGCACAGCACCACACTGTTCAAAATCGACAACAACACATTTGTGAGGCTGGACAGACCCCATACCCCCCAATTCCTCTTCCAGCTCAACGACACCATCCACCTCCACCAACAGCTGAGCAACACCACCGGCAGGCTGATCTGGACACTGGACGCCAACATCAACGCTGACATCGGCGAATGGGCCTTTTGGGAGAACAAAAAGAACCTGTCCGAGCAGCTCAGGGGCGAAGAGCTGTCCTTTGAGGCTCTCTCCCTGAACGAGACCGAGGACGACGACGCTGCCTCCTCCAGAATCACCAAGGGCAGGATTTCCGACAGAGCTACCAGGCAGTATTCCGACCTGGTCCCCAAGAATCCTCCCGGCATGGTGCCTCTCCACATCCCTGAGGGCGAGACAACCCTGCCCAGCCAGAACAGCACCGAGGGAAGGAGGGTGAGCGTCAATACCCAGGAAACCATCACCGAGACAGCCGCCACCATCATCGGCACCAATGGAAACCACATGCAAATTTCCACAATCGGCATCAGACCGTCCAGCAGCCAGATTCCCAGCTCCAGCCCTACAACAGCCCCCAGCCCCGAAGCTCAAACCCCCACAACCCACACCTCCGGACCCAGCGTGATGGCTACCGAAGAACCTACAACACCTCCCGGGAGCAGCCCTGGACCCACAACCGAGGCTCCCACCCTGACCACACCCGAGAATATCACAACCGCCGTGAAGACCGTGCTGCCTCAGGAGTCCACAAGCAACGGCCTGATCACCAGCACCGTGACAGGCATCCTCGGCAGCCTGGGCCTCAGAAAGAGATCCAGAAGACAGACCAATACCAAGGCCACAGGCAAGTGTAACCCTAACCTGCACTACTGGACCGCTCAGGAGCAACACAACGCTGCCGGAATCGCTTGGATACCGTACTTCGGACCTGGCGCCGAGGGCATCTACACCGAGGGCCTGATGCATAATCAGAACGCCCTCGTGTGTGGACTGAGGCAGCTGGCTAACGAGACCACACAGGCTCTCCAGCTGTTCCTGAGAGCTACCACCGAGCTGAGGACCTATACCATCCTGAACAGGAAGGCCATCGACTTCCTGCTGAGAAGGTGGGGAGGCACCTGCAGGATTCTGGGACCTGATTGCTGTATCGAGCCCCACGACTGGACCAAAAACATCACCGATAAGATCAACCAGATTATTCACGACTTCATCGACAATCCCCTGCCCAACCAGGATAACGATGACAACTGGTGGACCGGCTGGAGACAGTGGATACCGGCTGGCATTGGAATCACCGGAATCATCATCGCTATCATTGCCCTCCTGTGCGTGTGCAAGCTGCTGTGCTAGTAA
Claims (5)
1.一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，其特征在于：采用以下步骤制备：
（1）、将3-羟基-邻苯二甲酸酐用二甲基亚砜配制成浓度为1M的母液；
（2）、配制浓度为0.1M、pH为8.5的磷酸氢二钠溶液，人血清白蛋白加入磷酸氢二钠溶液制成HSA溶液，HSA溶液浓度为20mg/ml；
（3）、将母液加入待修饰的HSA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用NaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
（4）、重复进行步骤（3）所述的母液与HSA溶液混合过程，最终使HSA溶液中酸酐的终浓度为60mM，调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
（5）、将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液，4℃下透析48h，将酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
2.根据权利要求1所述的预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，其特征在于：所述人血清白蛋白用牛血清白蛋白、牛β-乳球蛋白、鼠血清白蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白、RNA酶1或者RNA酶7代替。
3.根据权利要求1或2所述的预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，其特征在于：所述3-羟基-邻苯二甲酸酐用琥珀酸酐或者马来酸酐代替。
4.根据权利要求1或2所述的预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，其特征在于：所述生物制剂的剂型为溶液制剂、干粉制剂、喷雾剂、搽洗剂或者盥洗剂。
5.权利要求1或2或3所述的生物制剂在制备预防和控制Zaire型和Sudan型埃博拉病毒的药物中的应用。
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