CN115671032A - 一种含生物蛋白的医用抗hpv生物蛋白凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，本发明以18‑22份甘油、12‑15份卡波姆、0.08‑0.12份生物蛋白、2‑5份的三乙醇胺为原料，分别将生物蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液，将卡波姆和甘油搅拌，加水静置，制得卡波姆甘油混合溶液，将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，制得成品。制备一种医用抗HPV生物蛋白凝胶，所述生物蛋白为酸酐化牛β‑乳球蛋白。本发明生物蛋白凝胶具有生物相容性良好，对宫颈癌HeLa细胞有很好的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及抗HPV生物蛋白凝胶领域，特别涉及含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法。
背景技术
由于引发宫颈癌病变的高危型HPV病毒为弱病毒，如能及时发现感染，及时清除，可达到防治宫颈癌的目的。控制宫颈癌的发生，重在预防，关键在早期筛查，而难点是，目前还没有理想的方法能有效地有效地将HPV病毒清除。
HPV主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。HPV感染具有宿主和组织特异性，只能感染人类的皮肤黏膜受损细胞。HPV感染这些细胞后，以少量的游离DNA状态潜伏在基底细胞内，实现免疫逃逸。当基底细胞不断分化、成熟、向黏膜表层迁移，HPV病毒就大量增殖。随着黏膜表层上皮细胞的凋亡，病毒颗粒大量释放到上皮表面，作为新的感染源可进一步加重感染。HPV治疗的关键之一在于药物能够有效进入靶组织及靶细胞，从而杀灭HPV病毒。
目前，治疗妇科疾病常见的给药方式为阴道给药，阴道给药是指将药物置于阴道内，药物经过阴道黏膜吸收进入局部病灶或全身血液循环。国内常见的阴道给药的剂型有以下几种：
栓剂：常温下为固体，放入阴道后，在体温作用能迅速软化，熔融或溶解于分泌液中，逐步释放药物达到治疗妇科疾病的作用，但栓剂在高温时容易变形，从而影响它的使用效果。
片剂：常用的阴用片剂为泡腾片，阴道为酸性环境，能够促进片剂的崩解，但是片剂的辅料大多在阴道中无法完全溶解，容易引起病人不适。
外用洗剂：洗剂作用时间较短，难以进入阴道深处，在制备预防宫颈癌药物时制成外用洗剂，使用效果下降。
常见剂型中还包括凝胶剂、膜剂、膏剂、胶囊、气雾剂等。本发明中提出一种含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，制得的凝胶剂能够提高对宫颈癌HeLa细胞抑制效果。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将生物蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液；
(2)将卡波姆和甘油搅拌，加水静置，制得卡波姆甘油混合溶液；
(3)将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，制得成品。
进一步的，按重量份计，原料包括18-22份甘油、12-15份卡波姆、0.08-0.12份生物蛋白、2-5份的三乙醇胺。
进一步的，所述生物蛋白为酸酐化牛β-乳球蛋白。
进一步的，步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.5-8。
进一步的，步骤(1)中，所述生物蛋白和磷酸盐缓冲液的质量比为0.01-0.03:1。
进一步的，步骤(2)中，所述卡波姆和甘油在40-50℃使用100-120r/min搅拌20-25min，加水继续搅拌5-7min，静置12-16h，制得卡波姆甘油混合溶液。
进一步的，所述水和卡波姆质量比为0.3-0.5:1。
进一步的，步骤(3)中，所述搅拌为使用200-300r/min搅拌1-2min，再使用100-120r/min搅拌3-5min。
进一步的，含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶在制备预防阴道HPV感染药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以甘油、卡波姆、酸酐化牛β-乳球蛋白和三乙醇胺制备一种医用抗HPV生物蛋白凝胶，本发明中将磷酸盐缓冲液和酸酐化牛β-乳球蛋白混合，能够改变酸酐化牛β-乳球蛋白表面电荷，有利于提高凝胶的使用效果。本发明中先将卡波姆和甘油混合，使卡波姆充分分散，再加入水混合，能够使卡波姆充分吸涨，提高凝胶的使用效果。本发明中将pH值为7.5-8磷酸盐缓冲液和卡波姆甘油混合溶液混合，能够进一步提高生物蛋白凝胶的黏度，提高生物蛋白凝胶和阴道内壁的贴合性。本发明制得的医用抗HPV生物蛋白凝胶对宫颈癌HeLa细胞有很好的抑制效果。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶
(1)按重量份计，称取以下原料：18份甘油、12份卡波姆、0.08份酸酐化牛β-乳球蛋白、2份的三乙醇胺。
(2)将酸酐化牛β-乳球蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液，所述酸酐化牛β-乳球蛋白和磷酸盐缓冲液的质量比为0.01:1，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.5。
(3)所述卡波姆和甘油在40℃使用100r/min搅拌20min，加水继续搅拌5min，静置12h，所述水和卡波姆质量比为0.3:1，制得卡波姆甘油混合溶液。
(4)将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，所述搅拌为使用200r/min搅拌1min，再使用100r/min搅拌3min，制得成品。
实施例2含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶
(1)按重量份计，称取以下原料：20份甘油、13.5份卡波姆、0.1份酸酐化牛β-乳球蛋白、3.5份的三乙醇胺。
(2)将酸酐化牛β-乳球蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液，所述酸酐化牛β-乳球蛋白和磷酸盐缓冲液的质量比为0.02:1，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.8。
(3)所述卡波姆和甘油在45℃使用110r/min搅拌25min，加水继续搅拌6min，静置14h，所述水和卡波姆质量比为0.4:1，制得卡波姆甘油混合溶液。
(4)将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，所述搅拌为使用250r/min搅拌1.5min，再使用110r/min搅拌4min，制得成品。
实施例3含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶
(1)按重量份计，称取以下原料：22份甘油、15份卡波姆、0.12份酸酐化牛β-乳球蛋白、5份的三乙醇胺。
(2)将酸酐化牛β-乳球蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液，所述酸酐化牛β-乳球蛋白和磷酸盐缓冲液的质量比为0.03:1，所述磷酸盐缓冲液pH值为8。
(3)所述卡波姆和甘油在50℃使用120r/min搅拌25min，加水继续搅拌7min，静置16h，所述水和卡波姆质量比为0.5:1，制得卡波姆甘油混合溶液。
(4)将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，所述搅拌为使用300r/min搅拌2min，再使用120r/min搅拌5min，制得成品。
实施例4含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶
(1)按重量份计，称取以下原料：20份甘油、15份卡波姆、0.1份酸酐化牛β-乳球蛋白、4份的三乙醇胺。
(2)将酸酐化牛β-乳球蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液，所述酸酐化牛β-乳球蛋白和磷酸盐缓冲液的质量比为0.03:1，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.8。
(3)所述卡波姆和甘油在45℃使用110r/min搅拌25min，加水继续搅拌6min，静置14h，所述水和卡波姆质量比为0.4:1，制得卡波姆甘油混合溶液。
(4)将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，所述搅拌为使用250r/min搅拌1.5min，再使用110r/min搅拌4min，制得成品。
试验例1
将对数生长期的宫颈癌HeLa细胞配制成15000个/m培养液。取200μl的细胞悬液接种至96孔板，置于浓度为5％C02的37℃培养箱中培养24h，然后每孔分别加入实施例1-4，所述实施例1-4使用含1％二甲基亚砜的DMEM培养基稀释至200μg/mL。每组设置6个复孔，培养48h后每孔加入20浓度为5mg/ml的MTT溶液，置于37C恒温培养箱反应4h，弃去培养基，每孔加入150μl的DMSO溶液，避光反应10min，置酶标仪于490nm测定各孔的光密度值(OD)。
细胞存活率＝(实验组OD值一空白组OD值)/(阴性对照组D值-一空白组OD值)×100％。
应用GraphPadPrism5软件计算IC50值。
| 名称 | IC<sub>50</sub>(μmol/L) |
| 实施例1 | 1.06 |
| 实施例2 | 1.12 |
| 实施例3 | 1.10 |
| 实施例4 | 1.08 |
实验结果表明本发明制得的医用抗HPV生物蛋白凝胶对宫颈癌HeLa细胞有很好的抑制效果。本发明中将磷酸盐缓冲液和酸酐化牛β-乳球蛋白混合，能够改变酸酐化牛β-乳球蛋白表面电荷，有利于酸酐化牛β-乳球蛋白和HPV病毒结合，阻断HPV病毒和阴道皮肤底层的细胞接触，从而预防hpv病毒感染人体的目的。本发明中先将卡波姆和甘油混合，使卡波姆在充分分散，再加入水混合，能够使卡波姆充分吸涨，提高凝胶的使用效果。本发明中将pH值为7.5-8磷酸盐缓冲液和卡波姆甘油混合溶液混合，能够进一步提高生物蛋白凝胶的黏度，提高生物蛋白凝胶和阴道内壁的贴合性。
对比例1
(1)在实施例2的基础上调整原料组分，具体为：按重量份计，称取以下原料：13.5份甘油、13.5份卡波姆、0.1份酸酐化牛β-乳球蛋白、3.5份的三乙醇胺。
(2)将酸酐化牛β-乳球蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液，所述酸酐化牛β-乳球蛋白和磷酸盐缓冲液的质量比为0.02:1，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.8。
(3)所述卡波姆和甘油在45℃使用110r/min搅拌25min，加水继续搅拌6min，静置14h，所述水和卡波姆质量比为0.4:1，制得卡波姆甘油混合溶液。
(4)将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，所述搅拌为使用250r/min搅拌1.5min，再使用110r/min搅拌4min，制得成品。
经过试验分析，对比例1的制得的医用抗HPV生物蛋白凝胶使用效果下降，由于调整了原料配比，导致医用抗HPV生物蛋白凝胶的使用效果下降。
对比例2
在实施例2的基础上调整制备方法，具体为：
(1)按重量份计，称取以下原料：20份甘油、13.5份卡波姆、0.1份酸酐化牛β-乳球蛋白、3.5份的三乙醇胺。
(2)将酸酐化牛β-乳球蛋白加入水中混合，制得生物蛋白溶液，所述酸酐化牛β-乳球蛋白和水的质量比为0.02:1。
(3)所述卡波姆和甘油在45℃使用110r/min搅拌25min，加水继续搅拌6min，静置14h，所述水和卡波姆质量比为0.4:1，制得卡波姆甘油混合溶液。
(4)将生物蛋白溶液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，所述搅拌为使用250r/min搅拌1.5min，再使用110r/min搅拌4min，制得成品。
经过试验分析，对比例2的制得的医用抗HPV生物蛋白凝胶使用效果下降，本发明中使用磷酸盐缓冲液和生物蛋白复配，能够改变生物蛋白表面电荷，使生物蛋白能够快速与病毒蛋白结合，同时，本发明中将pH值为7.5-8磷酸盐缓冲液和卡波姆甘油混合溶液混合，能够进一步提高生物蛋白凝胶的黏性，提高生物蛋白凝胶和阴道内壁的贴合性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物蛋白加入磷酸盐缓冲液中混合，制得生物蛋白磷酸盐缓冲液；
(2)将卡波姆和甘油搅拌，加水静置，制得卡波姆甘油混合溶液；
(3)将生物蛋白磷酸盐缓冲液、三乙醇胺加入卡波姆甘油混合溶液中搅拌，制得成品。
2.如权利要求1所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，按重量份计，原料包括18-22份甘油、12-15份卡波姆、0.08-0.12份生物蛋白、2-5份的三乙醇胺。
3.如权利要求2所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，所述生物蛋白为酸酐化牛β-乳球蛋白。
4.如权利要求1所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.5-8。
5.如权利要求1所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物蛋白和磷酸盐缓冲液的质量比为0.01-0.03:1。
6.如权利要求1所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述卡波姆和甘油在40-50℃使用100-120r/min搅拌20-25min，加水继续搅拌5-7min，静置12-16h，制得卡波姆甘油混合溶液。
7.如权利要求6所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，所述水和卡波姆质量比为0.3-0.5:1。
8.如权利要求1所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述搅拌为使用200-300r/min搅拌1-2min，再使用100-120r/min搅拌3-5min。
9.权利要求1-8任一项所述的含生物蛋白的医用抗HPV生物蛋白凝胶在制备预防阴道HPV感染药物中的应用。
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