CN115192556B - 异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本公开主要涉及了异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)药物中的应用，属于抗病毒应用领域。利用该药物能够在Vero E6细胞上有效抑制PEDV的复制，能够在仔猪体内抑制PEDV的感染，有效保护感染PEDV仔猪、降低仔猪死亡率、减轻仔猪临床病理损伤以及抑制PEDV在仔猪体内的复制，证实了异甘草素在体内外具有抗病毒作用。

Description

异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用
技术领域
本公开涉及抗病毒应用领域，具体涉及异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。
背景技术
猪腹泻病是当前养猪业最常发生的三大类疾病之一，是仔猪死亡的“第一杀手”，严重影响集约化猪场年断奶仔猪数，给生猪养殖业带来沉重打击。猪流行性腹泻(porcineepidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种高度接触性猪肠道传染病，对哺乳仔猪致死率高达80～100％，PEDV已然成为我国哺乳仔猪腹泻的主要病原微生物。自2010年以来，多种PEDV毒株大规模暴发，给养猪业造成巨大经济损失。PEDV是一种有囊膜的单股正链的RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirale)、冠状病毒科(Coronaviridae)和冠状病毒属(Coronavirus)。因其基因组和病毒复制等特性易出现变异，导致由于现有疫苗毒株与流行毒株不匹配而出现的疫苗效果不佳，外加流行毒株疫苗研发或疫苗毒株更新滞后，导致猪流行性腹泻病频繁发生，已经成为临床防控中一个瓶颈问题，基于非疫苗策略的PEDV新型防控技术亟需建立。
抗病毒药物是该类疾病防控的最后一道防线，是替代和补充疫苗效果不佳最有效的途径之一。近年来，抗PEDV药物的研究快速发展，大量的生物类药物、化学合成药物以及天然药物被报道具有抗PEDV作用，然而由于冠状病毒易变异特性，导致因病毒的药物靶点突变而降低了抗病毒药物效果，限制了抗病毒药物的临床应用。另外，有些抗病毒药物能够有效抑制病毒感染，但具有严重的副作用，因此尚没有一种针对PEDV的抗病毒药物在临床应用，开发一种新型、安全、高效的抗PEDV药物成为了一个亟待解决的问题之一。
异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)是一种存在于甘草等植物中含有查尔酮结构的黄酮类化合物，具有提取方便、价格低廉、绿色安全等特点。在医学研究中是一种重要的药用活性成分，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、心脏保护、神经保护、抑制细菌生长、抗血小板聚合等作用，也被用作食品添加剂和化妆品添加剂。目前，异甘草素作为先导化合物尚未被用于抗冠状病毒药物研究，是否具有抗PEDV活性尚未清楚，本研究通过体内外试验探讨异甘草素作为一种抗PEDV药物的应用前景，开发异甘草素的一种新用途。
发明内容
本公开的目的在于提供异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的作用及一种抗猪流行性腹泻病毒的药物，利用该药物能够在Vero E6细胞上有效抑制PEDV病毒的复制。该药物在仔猪体内具有抗PEDV感染的作用，能够有效保护感染PEDV仔猪、降低仔猪死亡率、减轻仔猪临床病理损伤以及抑制PEDV在仔猪体内的复制。
为了实现上述目的，一方面，本公开提供了异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。
根据本公开，其中，所述药物中还包括药学上可接受的载体。
根据本公开，其中，所述药学上可接受的载体包括卵磷脂和聚乙二醇中的至少一种。
另一方面，本公开提供了一种抗猪流行性腹泻病毒的药物，其中，所述药物中包括有效量的异甘草素和药学上可接受的载体。
根据本公开，其中，所述药学上可接受的载体包括卵磷脂和聚乙二醇中的至少一种。
根据本公开，其中，所述药物的剂型包括混悬剂和口服溶液中的至少一种。
根据本公开，其中，所述药物中，所述异甘草素的含量为1-50μM。
通过上述技术方案，本公开提供了异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用及一种抗猪流行性腹泻病毒的药物，利用该药物能够在Vero E6细胞上有效抑制PEDV病毒的复制，能够在仔猪体内抑制PEDV感染、降低仔猪死亡率、减轻临床病理损伤以及抑制PEDV在仔猪体内的复制。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1为MTT法检测异甘草素对Vero E6细胞的毒性。
图2为Western blot检测异甘草素在Vero E6细胞上抑制PEDV病毒的复制。
图3为TCID50检测异甘草素在Vero E6细胞上抑制PEDV病毒的复制。
图4为异甘草素对感染PEDV仔猪存活率的影响。
图5为感染PEDV仔猪口服异甘草素的病理检测结果。
图6为荧光定量PCR检测异甘草素在仔猪体内抑制PEDV的感染。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
一方面，本公开提供了异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。
可选地，其中，所述药物中还包括药学上可接受的载体。
可选地，其中，所述药学上可接受的载体包括卵磷脂和聚乙二醇中的至少一种。
另一方面，本公开提供一种抗猪流行性腹泻病毒的药物，其中，所述药物中包括有效量的异甘草素和药学上可接受的载体。
可选地，其中，所述药学上可接受的载体包括卵磷脂和聚乙二醇中的至少一种。
可选地，其中，所述药物的剂型包括混悬剂和口服溶液中的至少一种。
可选地，其中，所述药物中，所述异甘草素的含量为1-50μM。
以下通过实施例进一步详细说明本公开。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。
病毒、细胞、血清及蛋白：PEDV HM2017毒株(GenBank：MK690502)由本实验室保存于-80℃；PEDV N蛋白单克隆抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；非洲绿猴肾细胞(Vero E6)由本实验保存于液氮。
主要试剂：MTT试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、胶体金快速检测试剂盒购自于天根生化科技有限公司；高糖DMEM培养基购自于海克隆生物制品有限公司；1×PBS缓冲液、细胞裂解液购自碧云天生物技术有限公司；异甘草素购自于上海鼎瑞化工(生物)有限公司，CAS号：961-29-5，结构式如下式所示：
Figure BDA0003630231350000051
实施例1
异甘草素在Vero E6细胞上的细胞毒性测定：Vero E6细胞计数后用10％胎牛血清的DMEM营养液稀释到适当密度后以1×105个/mL后接入96孔细胞培养板，每孔200μL细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞长满单层后吸取培养液，用DMEM营养液将异甘草素稀释至：0μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，每个浓度设置3组重复。在96孔细胞培养板上将DMSO对照以及稀释的异甘草素样品以100μL/孔处理Vero-E6细胞48h后，移除上清，加入90μL新鲜培养液，再加入10μL的MTT溶液，继续培养4h，吸除上清，每孔加入110μL的Formazan溶解液，置于摇床低速震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，实验结果如图1所示。
由图1可见，异甘草素浓度在0～12.5μg/mL对Vero E6细胞无毒性作用(P>0.05)，说明12.5μg/mL是异甘草素对Vero E6细胞的最大无毒剂量。
实施例2
Western blot测定异甘草素在Vero E6细胞上对PEDV复制的影响：将Vero E6细胞悬液稀释至1×105个/mL后接入6孔细胞培养板，每孔2mL细胞悬液，细胞长满单层后吸弃培养液，接种PEDV HM2017病毒，于5％CO2，37℃细胞培养箱作用2h后，轻轻吸除液体，加入含有12.5μg/mL异甘草素的病毒维持液，同时设置病毒对照组。置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中培养24h，48h。将样品收集至EP管中，收集的样品用适量的蛋白酶裂解液在4℃条件下裂解30min。随后，将收集的细胞裂解物以10,000×g离心5min，收集上清液并加入适量的5×蛋白上样缓冲液，充分混匀后在煮沸15min。将制备的蛋白样本进行SDS-PAGE后进行转膜，再加入5％的脱脂乳室温条件下封闭2h。随后，利用PBST润洗3次，每次10min，加入相应抗体37℃条件下孵育2h，加入PBST洗膜5次，每次10min，再加入相应二抗在室温条件下避光孵育1h。孵育后，加入PBST洗膜5次，每次10min。最后，利用LI-COR Odyssey红外影像扫描系统进行扫膜。
Western blot试验结果如图2所示，在PEDV感染24h(图2A)和48h(图2B)，异甘草素组(ISL)的PEDV HM2017毒株N蛋白表达水平均显著低于PEDV感染对照组(DMEM)(P<0.01)。该结果表明，在蛋白水平上ISL能抑制PEDV HM2017毒株的复制。
实施例3
TCID50检测异甘草素在Vero E6细胞上对PEDV复制的影响：将细胞铺于6孔板，待细胞密度达到100％时，弃上清液，用PBS润洗3次，加入500μL含有0.25％胰酶DMEM病毒维持液，再以0.1MOI接种PEDV HM2017在细胞培养箱中作用2h，PBS润洗3次，再加入2mL含有12.5μg/mL的异甘草素的病毒维持液，同时设置病毒对照组，病毒滴度的检测参照Reed-Muench的方法。将细胞铺于96孔板后，细胞密度达到100％时，弃上清液，用PBS润洗3次。取100μL倍比稀释(10-1～10-10)的待测病毒样本加入细胞中。在感染后60～72h，观察细胞病变情况，并计算病毒滴度。
结果如图3所示，异甘草素预处理组中PEDV病毒滴度显著低于对照组(p<0.05)。该结果表明，在细胞水平上ISL能降低PEDV HM2017毒株病毒粒子的增殖。
实施例4
本实施例通过仔猪体内验证异甘草素抗PEDV作用。
动物实验：12头7日龄杂交常规新生仔猪随机分为三组(4头仔猪/组)，分别为健康对照组(第1组CTRL)、攻毒组(第2组DEME)以及给药组(第3组ISL)，分别饲养在三个单独的房间内，并通过胶体金快速检测试剂盒(BioNote)确认仔猪对PEDV、传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒呈阴性。给药组仔猪在攻毒前6h口服异甘草素(250mg/kg)。第1组和第2组仔猪同时口服相同量的DMEM。试验开始后第2组和第3组的仔猪口服含有1.33×106TCID50 PEDVHM2017毒株的3mL的DMEM。试验开始后，每6h采集一次仔猪粪便，利用RT-PCR方法监测各组仔猪排毒情况，同时记录PEDV组死亡的仔猪，并立即进行尸检和取样。感染后48h处死所有仔猪，统计异甘草素对仔猪的保护率，并对所有仔猪进行剖检并收集仔猪空肠组织，进行组织病理学检查和免疫组织化学检查，通过实时荧光定量PCR检测各组仔猪粪便、空肠和回肠中的病毒载量。
仔猪生活状态及死亡率统计验证异甘草素仔猪体内抗PEDV感染的作用：为验证异甘草素对仔猪存活率的影响，记录每组仔猪存活率。结果如图4所示，病毒对照组仔猪24hpi内所有仔猪出现严重水样腹泻(4/4)，36hpi时1只仔猪死亡(1/4)，48hpi仔猪全部死亡(4/4)。预口服异甘草素的仔猪生理状态和精神状态没有明显的变化，与健康对照组没有明显差异，36hpi时1只仔猪出现腹泻并死亡(1/4)，其余仔猪无明显病理变化。异甘草素对PEDV感染仔猪保护率高达75％。
临床剖检验证异甘草素减轻PEDV对仔猪腹腔病理损伤的作用：对各组仔猪进行病理剖检，结果显示，健康对照组(图5A)仔猪腹腔无明显的病变。病毒对照组(图5B)腹腔内胃因未消化的凝乳而膨大，小肠扩张，透明并充满黄色液体，肠管有明显的病理变化。而预口服异甘草素的仔猪腹腔(图5C)无明显的病变，与健康对照组的仔猪腹腔无明显差异。该结果表明，异甘草素能够有效减轻PEDV对仔猪腹腔的病理损伤。
H,E染色验证异甘草素减轻PEDV对仔猪小肠组织病理损伤的作用：通过H,E染色检查各组仔猪空肠的组织损伤。结果显示，病毒对照组(图5E)组织损伤严重，小肠黏膜上皮细胞绒毛脱落。而健康对照组(图5D)和预口服异甘草素的仔猪(图5F)无明显的病理变化，细胞结构完整、轮廓清晰，无明显的组织损伤。说明异甘草素能够有效地保护仔猪，降低PEDV感染而导致的仔猪肠道的组织损伤。该结果表明，异甘草素能够有效减轻PEDV对仔猪小肠组织的病理损伤。
免疫组织化学验证异甘草素在仔猪体内抑制PEDV的感染：通过免疫组化检查各组仔猪空肠内的病毒载量，结果显示，与病毒对照组(图5H)相比，预口服异甘草素的仔猪(图5I)的空肠内N蛋白明显减少，健康对照组(图5G)的仔猪空肠段并未检测出PEDV N蛋白。说明异甘草素能够有效地抑制PEDV在仔猪体内的复制，降低PEDV对仔猪的感染。该结果表明，异甘草素能够降低PEDV在仔猪肠段内的分布。
荧光定量PCR测定异甘草素在仔猪体内抑制PEDV的感染：通过RT-PCR检测异甘草素对仔猪排毒以及回肠、空肠病毒含量的影响。将收集的粪便和组织样品置于EP管中，利用总RNA提取试剂盒从收集的样品中提取总RNA，随后使用反转录试剂盒将其反转录成cDNA。用
Figure BDA0003630231350000082
SYBR qPCR SuperMix Plus法通过实时荧光定量检测系统进行qPCR。所用引物见表1，反应体系见表2。将上述体系加于0.1mL的八联管内，混匀后瞬离上机。反应程序为：95℃30s；95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环；92℃5s，60℃1min，95℃continues；50℃30s。反应结束后，读取Ct值，运用ΔΔCt法对数据进行分析。
表1荧光定量PCR引物
Figure BDA0003630231350000081
Figure BDA0003630231350000091
表2荧光定量反应体系
Figure BDA0003630231350000092
该结果显示，与PEDV感染对照组相比，异甘草素也能够显著抑制患病猪的排毒(P<0.05)、以及抑制病毒在小肠组织(空肠和回肠)中复制(P<0.05)(图6)。该结果表明，异甘草素能够抑制PEDV在仔猪体内的复制。
体内试验说明，异甘草素在仔猪体内具有抗PEDV感染作用，保护率高达75％，减轻感染PEDV仔猪的病理损伤以及抑制PEDV在体内的复制。表明异甘草素作为抗PEDV药物在临床上具有应用前景。
以上所有试验均进行3次独立重复试验，利用GraphPad Prism 8.0软件(GraphPadSoftware,Inc.,La Jolla,CA,USA)对数据进行统计学分析，P>0.05表示无显著性差异(ns)；0.01<P<0.05表示显著性差异，以*标记；P<0.01表示极显著性差异，以**标记。
本公开提供的异甘草素在体内外均具有抗PEDV作用，有效保护感染仔猪，保护率高达75％，减轻仔猪病理损伤。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用
<130> 24470HLAU
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacttattg gcaggctttg t 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattgagaa aagaaagtgt cgtag 25

Claims (3)

1.异甘草素在制备抗PEDV的药物中的应用，其中，所述药物中异甘草素的含量为12.5μg/mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物中还包括药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述药学上可接受的载体包括卵磷脂和聚乙二醇中的至少一种。
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