CN106420695A - 甘草素抗猪流行性腹泻病毒感染的应用 - Google Patents

甘草素抗猪流行性腹泻病毒感染的应用 Download PDF

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Abstract

本发明主要涉及一个具有抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)活性药物甘草素在抗猪流行性腹泻病毒HLJBY株感染宿主细胞的活性，属于抗病毒应用领域。该药物甘草素是中药甘草的提取物，可有效的抑制猪流行性腹泻病毒的入胞和复制，从而有效地抑制PEDV的感染。在Vero细胞上证实甘草素主要通过抑制病毒的入胞和复制而起到抗病毒效果。

Description

甘草素抗猪流行性腹泻病毒感染的应用
一、技术领域
本发明属于抗病毒应用领域，涉及抗猪流行性腹泻病毒药物甘草素的应用。
二、背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种以水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征的猪传染性疾病。该病常在冬季爆发大流行，各年龄段的猪都可感染PEDV，但哺乳期的仔猪最易感，发病率高达100％，死亡率为80％-100％。在临床上其与猪传染性胃肠炎，猪轮状病毒腹泻共存混合感染。虽然PED首次在欧洲发生，但是目前已经成为包括中国，日本，韩国，泰国以及菲律宾等亚洲国家养猪业中严重的传染性疾病，造成了巨大的经济损失。虽然有一定的措施可防止PED的流行，但效果不理想。自从2013年，PED分别在美国、德国、葡萄牙等出现大流行，造成了严重的经济损失。最近几年中国各地也出现不同程度的流行，给养猪业带来巨大的经济损失。
PEDV是一种有囊膜的正股单链RNA病毒，属于尼多病毒目(idovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)。现有的冠状病毒约有15种，分三个亚型，PEDV、TGEV和PRCoV等属于亚型I，MHV、HEV和SARS-CoV等属于亚型II，而IBV、PhCoV和TCoV属于亚型III。
PEDV病毒粒子外包裹着囊膜，具有多种形态，其中多为球形。病毒粒子的直径为95-190nm(平均130nm)。PEDV表面有纤突，呈花瓣状，由核心向四周呈放射状分布，长约18-23nm。PEDV病毒粒子对热不是很敏感，在4℃pH 5.0-9.0和37℃pH 6.5-7.5之间均能稳定存在，但病毒粒子在60℃条件下30min就能失去感染能力。此外，PEDV对脂溶性液体敏感。PEDV不具备血凝活性。
PEDV是不分节段的具有感染性的RNA病毒，其基因组大小不一，全长约为27-33kb，包含5′帽子结构和3′poly A尾。目前已测定了PEDV-CV777、PEDV-DR13 PEDV-CH/FJND-3/2011、PEDV-CH/S等的全基因组序列。PEDV全基因组包括至少7个开放阅读框(ORF)，编码3个非结构蛋白(复制酶1a和1b，及ORF3)和4个结构蛋白：纤突蛋白(S，150-220kDa)，小包膜糖蛋白(E，7kDa)，糖基化膜蛋白(M，20-30kDa)，核衣壳蛋白(N，58kDa)；5’-非翻译区(UTR)和3′-非翻译区(UTR)。研究发现，病毒通过蛋白受体氨基肽酶N和N-乙酰神经氨酸入侵细胞。值得注意的是，这些受体也存在于人、猴和蝙蝠等物种。因而，PEDV存在跨物种感染的潜在风险。因此，研究抗PEDV的药物有重要作用。
甘草素(GLYcyrrhizin，GLY)是传统中药甘草提取物的主要成分，主要由甘草次酸组成。甘草素是甘草中研究最多的具有生物活性的化合物。甘草素是个糖基化的皂苷，包括一个结构类似于氢化可的松的甘草次酸和两个分子的葡糖醛酸。甘草素具有抗炎症的性质，可以用来治疗肝炎。数千年以来，甘草素被广泛的用作天然的甜味剂和佐料。甘草素具有多个有益的药理作用，包括祛痰、抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗氧化、抗病毒活性和抗肿瘤活性。但是甘草素如何产生这些效应的机制有待进一步研究。先前有许报道称甘草素有抑制多种病毒感染的效应，这些病毒包括人巨细胞病毒、流感病毒、严重呼吸综合征病毒(SARS)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、甲型肝炎和乙型肝炎病毒。然而甘草素抑制PEDV的感染没有报道过。因此我们验证甘草素在抑制猪流行性腹泻病毒感染宿主细胞而发挥抗病毒作用的效果。
三、发明内容
本发明的目的是针对猪流行性腹泻病毒流行的问题，提供一种具有抗猪流行性腹泻病毒感染药物的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
本发明所述的抗病毒药物在抗猪流行性腹泻病毒感染的效果及应用。
有益效果：
本发明采用药物甘草素进行抗猪流行性腹泻病毒感染的研究，该药物作为潜在的抗病毒药物与传统的抗病毒化学药物相比有以下几个优点：
A安全、副作用少：甘草素作为中成药，主要成分是皂苷类，不同于激素、抗生素、化学合成药等，对机体生理功能无明显损伤等毒副作用。
B药物残留低、无污染：该药物容易被动物机体所代谢和吸收，动物排泄物对坏境无污染。
C抗病毒作用明显：该药物具有抗炎、抗氧化等活性，同时能激发机体抗感染的免疫功能。该药物具有较好的抗病毒活性，在0.4mM浓度下，其在Vero细胞上具有半数抵抗猪流行性腹泻病毒(MOI＝0.1)感染的作用。
D具有潜在的临床应用价值：此抗病毒药物具备较好的潜在抗猪流行性腹泻病毒感染的活性，因此为该病毒引起疾病的治疗和防制提供可靠的依据。
四、附图说明
图1甘草素在Vero细胞上细胞毒性的测定结果。
图2 Western blot测定甘草素在Vero细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性。
0.1mM-0.8mM甘草素预处理Vero细胞2h后，感染猪流行性腹泻病毒且甘草素一直存在，24h后收取细胞进行Western blot。
图3荧光定量PCR测定甘草素在Vero细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性。
0.2mM与0.8mM甘草素预处理Vero细胞2h后，感染猪流行性腹泻病毒且甘草素一直存在，24小时后收取细胞样品，并提取RNA，进行荧光定量PCR测定。
图4噬斑形成试验测定甘草素在Vero细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性。
0.2mM与0.8mM甘草素预处理Vero细胞2h后，感染猪流行性腹泻病毒(MOI＝0.1)且甘草素一直存在，24h后取上清用噬斑形成试验测定病毒滴度。
图5 Western blot测定甘草素对猪流行性腹泻病毒入胞的影响
用0.1mM-0.8mM甘草素预处理细胞2h后，感染猪流行性腹泻病毒1h且有甘草素存在，然后收取细胞进行Western blot。
图6 Western blot测定甘草素对猪流行性腹泻病毒复制的影响
猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞1h后，加入0.4mM甘草素处理细胞。感染4h、8h、12h收样，通过Western blot检测病毒蛋白的变化。
图7 Western blot测定甘草素对猪流行性腹泻病毒组装和释放的影响。
猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞1h后，加入0.2mM和0.8mM的甘草素处理细胞。感染24h后收取上清与细胞，进行荧光定量PCR检测上清与细胞中病毒RNA的比值，进行噬斑形成试验检测上清与细胞中病毒滴度的比值。
五、具体实施方式
试验材料
猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株为任晓峰实验室分离，由本人完成测序。Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)购自上海然泰生物科技有限公司。CytoToxNon-RadioactiveCytotoxicity Assay试剂盒购自promega公司，其他所用化学试剂、实时定量PCR(Realtime PCR)引物及试剂盒均购自Takara公司。甘草素(Glycyrrhizin)购于sigma公司。
实施例1甘草素在Vero细胞上细胞毒性的测定结果
Vero细胞记数后用含10％胎牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以2×103/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)后，用DMEM营养液对甘草素进行稀释：0.1mM、0.2mM、0.4mM和0.8mM，每个浓度做六个重复，在96孔细胞培养板上将稀释的甘草素样品以100μl/孔处理Vero细胞24h后，分别取50μl上清，离心5min(250×g)，然后转移到酶标板孔中，然后用CytoToxNon-RadioactiveCytotoxicity Assay试剂盒(promega公司)进行检测，在OD490nm，读取数据(图1)，由图1可见经不同浓度甘草素处理的细胞释放到上清中的LDH(乳酸脱氢酶)的量与未经甘草素处理的细胞释放到上清中的量相比，两者没有明显的差别，说明该浓度甘草素在Vero细胞上不具有明显的细胞毒性，因此甘草素对Vero细胞的最大无毒性浓度为0.8mM。
实施例2甘草素在Vero细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性(Western blot和荧光定量PCR，噬斑形成试验)
(1)Western blot测定甘草素在Vero细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性
Vero细胞记数后用含10％小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。甘草素用无血清DMEM稀释到特定浓度后：0.1mM-0.8mM，预先与Vero细胞37℃孵育2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero细胞，37℃，5％CO2培养箱孵育1小时并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM维持夜2ml并有甘草素存在，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，收集细胞样品，进行Western blot检测。结果显示甘草素能够显著抑制猪流行性腹泻病毒的感染，并且具有明显的计量依赖性(图2)
(2)荧光定量测定甘草素在Vero细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性
Vero细胞记数后用含10％小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。甘草素用无血清DMEM稀释到特定浓度后：0.2mM和0.8mM，预先与Vero细胞37℃孵育2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero细胞，37℃，5％CO2培养箱孵育1h并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM维持夜2ml并有甘草素存在，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，用Trizon收集细胞样品，提取RNA。溶于20μl超纯水中，反转成cDNA，用于实时荧光定量PCR检测。在ABI公司7300型全自动实时荧光定量PCR仪上扩增并检测荧光。同时采用GAPDH基因作为内参。所用的PCR引物：
GAPDH-F：5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′；
GAPDH-R：5′-TAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3′；
PEDV-ORF3-F：5′-TTTGCACTGTTTAAAGCGTCT-3′；
PEDV-ORF3-R：5′-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3′；
25μl PCR反应体系中含2×PCR MasterMix 12.5μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，cDNA 2μl，2.5mM dNTP 2μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，超纯水6.25μl。扩增参数为：95℃30s、95℃10s、72℃31s共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定，反应条件为：95℃15s、60℃1min、95℃15s、60℃15s。反应结束后通过ABI PRISM7300SDS software(AppliedBiosystems)软件分析数据。本实验中采用2-ΔΔCt法进行PEDV ORF3基因的相对定量。结果显示甘草素在Vero细胞能产生明显抑制PEDV感染，并且具有明显的计量依赖性(图3)。
(3)噬斑形成试验测定甘草素在Vero细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性
Vero细胞记数后用含10％小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。甘草素用无血清DMEM稀释到特定浓度后：0.2mM和0.8mM，预先与Vero细胞37℃孵育2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero细胞，37℃，5％CO2培养箱孵育1h并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM维持夜2ml并有甘草素存在，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，取上清，进行10倍比稀释后，接种到铺有单层Vero细胞的6孔板中，37℃，5％CO2培养箱孵育1h，用PBS洗三遍，加入含有4％小牛血清的2×DMEM与2.5％低熔点琼脂糖的1∶1混合液2ml，37℃，5％CO2培养箱培养2-3天，观察细胞是否出现噬斑，然后用1％的结晶紫染色。结果显示甘草素能明显抑制猪流行性腹泻病毒的感染，并且具有明显的计量依赖性(图4)。
实施例3甘草素对猪流行性腹泻病毒感染过程的影响(Western blot，荧光定量PCR和噬斑形成试验)
(1)甘草素对猪流行性腹泻病毒入胞和复制的影响(Western blot)
Vero细胞记数后用含10％小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。甘草素用无血清DMEM稀释到特定浓度后：0.1mM-0.8mM，预先与Vero细胞37℃孵育2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero细胞，37℃，5％CO2培养箱孵育1h并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM维持夜2ml，置于37℃，5％CO2培养箱中培养1小时后，收取细胞样品进行Western blot检测。结果显示甘草素抑制猪流行性腹泻病毒的入胞(图5)。猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞1h后，加入0.4mM的甘草素处理，分别在感染后4h、8h、12h后收样进行Western blot检测。结果显示甘草素抑制PEDV的复制(图6)。
(2)甘草素对猪流行性腹泻病毒组装和释放的影响(荧光定量PCR和噬斑形成试验)
Vero细胞记数后用含10％小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。接种猪流行性腹泻病毒(MOI＝0.1)1小时。甘草素用无血清DMEM稀释到特定浓度后：0.2mM和0.8mM，与感染病毒的Vero细胞孵育，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，收取上清寺和细胞，进行荧光定量PCR和噬斑形成试验。荧光定量PCR结果显示甘草素不影响猪流行性腹泻病毒的组装(图7A)，噬斑形成试验结果显示甘草素不影响猪流行性腹泻病毒的释放(图7B)。

Claims (1)

1.抗病毒药物甘草素在抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用。
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