CN108514556A - 甘草查尔酮a在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了甘草查尔酮A在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途，所述甘草查尔酮A的质量百分比含量不低于97.65％，其应用剂量为1‑10μM/L；甘草查尔酮A用于抗猪流行性腹泻病毒效果非常显著，安全、毒副作用少，药物残留低且无污染。

Description

甘草查尔酮A在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途
技术领域
本发明属于抗病毒应用领域，具体涉及甘草查尔酮A在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的疾病，临床以呕吐、严重腹泻和脱水为特征，该病常在冬季呈爆发式流行，各年龄阶段猪均可感染。其中，哺乳仔猪最为易感，发病率可达100％，病死率达80％-100％，后备猪、母猪或育肥猪呈一过性腹泻，发病率较低。PEDV于上世纪七十年代在欧洲首次出现，然而自2010年以来，PEDV变异病毒株的爆发对中国、日本、韩国、泰国、菲律宾等亚洲国家养猪业造成巨大的经济损失，2013年又分别在美国、德国和葡萄牙等国家大流行，PEDV变异毒株的流行已对全球生猪产业特别是哺乳仔猪造成严重影响，而目前已有的防控措施已经不能应对新的流态势。
猪流行性腹泻病毒常和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)混合感染，引起呕吐、严重腹泻及脱水等临床症状，从2012-2017年中国部分地区的猪场病毒性腹泻流行病学调查结果可知，各猪场分离出PEDV阳性率最高。猪流行性病毒为尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronaviridae)成员，为单股正链RNA病毒，外观呈球形，直径约为95-190nm，病毒粒子外有囊膜包裹，囊膜表面为12-24nm纤突，纤突末端呈球状，并且纤突有序排列为皇冠状。PEDV病毒粒子对热较不敏感，4℃pH5.0-9.0和37℃pH6.5-7.5之间均可稳定存活，但其在60℃情况下30min即可失活。此外，PEDV对脂溶性液体敏感，且该病毒粒子不具备血凝性。
PEDV病毒基因组全长28kb，包含5’帽子结构和3’腺苷尾巴结构，包含至少7个开放阅读框(ORF)，编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b以及ORF3)和4个结构蛋白分别为：150-220kDa糖基化的刺突(S)蛋白、20-30kDa膜(M)蛋白、7kDa包膜(E)蛋白和58kDa核衣壳(N)蛋白。研究表明，病毒通过蛋白受体氨基肽酶N-乙酰胆碱神经氨酸入侵细胞，这些受体同样存在于人、猴、蝙蝠等物种，PEDV存在跨物种感染的潜在风险，因此研究抗PEDV药物具有重要作用。
发明内容
甘草查尔酮A(Licochalcone A)是从豆科植物甘草中主要的酚类查尔酮化合物，是胀果甘草的种属特异性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗菌、抗寄生虫、免疫促进等作用，其所具备的多种生物活性使之在食品医药工业中广泛使用，目前还没有关于甘草查尔酮A抑制抗猪流行性腹泻病毒的研究报道，本发明的目的在于提供一种甘草查尔酮A在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面，甘草查尔酮A在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
本发明的第二方面，一种抗猪流行性腹泻病毒药物包括甘草查尔酮A，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
优选的，上述抗猪流行性腹泻病毒药物中，所述甘草查尔酮A的质量百分比含量不低于97.65％，其应用剂量为1-10μM/L，即338.4μg/L-3.384mg/L。
在一些优选的实施方式中，所述抗猪流行性腹泻病毒药物可以为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
一、甘草查尔酮A用于抗猪流行性腹泻病毒效果非常显著；实验证明甘草查尔酮A在细胞实验中展现出明显的抗病毒活性，在10μM的浓度下即可展现出极强的抗猪流行性腹泻病毒(MOI＝0.01)感染作用。
二、甘草查尔酮A用于抗猪流行性腹泻病毒安全、毒副作用少；甘草查尔酮A为中草药中提取成分，不同于激素、抗生素、化学合成药物等，对机体无明显毒副作用。
三、甘草查尔酮A用于抗猪流行性腹泻病毒药物残留低、无污染；甘草查尔酮A属于有机分子化合物，容易被动物机体吸收，生物代谢率高，且排泄无污染。
附图说明
图1为MTT方法检测甘草查尔酮A对Vero-E6细胞的毒性；1-10μM甘草查尔酮A处理Vero-E6细胞72h后使用MTT染色4h，并在490nm测细胞吸光值检测细胞活性；
图2为Western Blot测定甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性；1-10μM甘草查尔酮A预处理Vero-E6细胞2h后感染猪流行性腹泻病毒，之后甘草查尔酮A一直存在，24h后收取细胞进行Western Blot测定细胞中PEDV病毒蛋白含量；
图3为荧光定量PCR测定甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上抑制PEDV感染；1-10μM甘草查尔酮A预处理Vero-E6细胞2h后感染猪流行性腹泻病毒，之后甘草查尔酮A一直存在，24h后收取细胞提取总RNA，进行荧光定量PCR测定；
图4为噬斑形成实验测定甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上抑制PEDV感染；10μM甘草查尔酮A预处理Vero-E6细胞2h后感染猪流行性腹泻病毒，之后甘草查尔酮A一直存在，24h后收取上清用噬斑形成实验测定病毒滴度。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
试验材料
猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株为发明人实验室所有；
Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞)受赠于南京农业大学免疫研究所；
MTT检测试剂盒购自索莱宝公司；
实时定量PCR(Real time PCR)AceQGreen Master Mix试剂盒购自诺唯赞公司；
引物订自金斯瑞公司；
甘草查尔酮A(Licochalcone A)购于Selleck公司。
实施例1甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上细胞毒性的测定
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以1.5×104/孔的浓度加于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约18-20h)后，用DMEM营养液将甘草查尔酮A稀释至：1μM、2μM、5μM、10μM，每个浓度设置3组重复。在96孔细胞培养板上将DMSO对照以及稀释的甘草查尔酮A样品以100μl/孔处理Vero-E6细胞72h后，移除上清，加入90μl新鲜培养液，再加入10μlMTT溶液，继续培养4h；吸除上清，每孔加入110μl Formazan溶解液，置于摇床低速震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，结果如附图1所示。
由附图1可见，经不同浓度的甘草查尔酮A处理细胞与未经甘草查尔酮A处理细胞中相比，线粒体脱氢酶的量并无明显差别，说明该浓度的甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上不具有明显细胞毒性。
实施例2 Western Blot测定甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病 毒感染的活性
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以7×105/孔的浓度加于6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层并长至70-80％的密度(约18-20h)后，用DMEM营养液将甘草查尔酮A稀释至：1μM、2μM、5μM、10μM。将DMSO对照以及不同浓度甘草查尔酮A于37℃预先处理Vero-E6细胞2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.01)感染，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含2％胎牛血清(FBS)的DMEM维持液1ml并含有甘草查尔酮A存在，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，用2×SDS sample buffer收取细胞样品，金属浴煮样10min，进行Western Blot检测，结果如附图2所示，显示甘草查尔酮A能够显著抑制猪流行性腹泻病毒的感染，并具有明显的剂量依赖性。
实施例3荧光定量检测甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染 的活性
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以7×105/孔的浓度加于6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层并长至70-80％的密度(约18-20h)后，用DMEM营养液将甘草查尔酮A稀释至10μM。将DMSO对照以及甘草查尔酮A于37℃预先处理Vero-E6细胞2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.01)感染，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含2％胎牛血清(FBS)的DMEM维持液1ml并含有甘草查尔酮A存在，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，用Trizon收集细胞样品，提取RNA。将提取的RNA溶于20μl超纯水中，反转成cDNA，使用Actin基因作为内参，实时荧光定量PCR检测PEDV-M蛋白mRNA水平的变化。其中，引物信息如下：
Actin-F 5’CTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCA’3’；
Actin-R 5’GGATAGCACAGCCTGGATAGCAACG’3’；
PEDV-M-F 5’CCCGTTGATGAGGTGATTG 3’；
PEDV-M-R 5’CGAAAAAGACCCAGTTGACC 3’。
20μlPCR反应体系包含10μl AceQ Green Master Mix，0.4μl上、下游引(10μM)，2μl模板DNA，0.4μl ROXReferenceDye1以及6.8μl灭菌蒸馏水。扩增参数为：95℃10s、60℃30s共40个循环，反应结束后溶解曲线测定，反应条件为：95℃15s、60℃60s、95℃15s。本实验通过2-ΔΔCt法进行PEDV-M基因的相对定量，结果如附图3所示，显示甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上明显抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性。
实施例4噬斑形成实验测定甘草查尔酮A在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病毒 感染的活性
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以7×105/孔的浓度加于6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层并长至70％-80％的密度(约18-20h)后，用DMEM营养液将甘草查尔酮A稀释至：1μM、2μM、5μM、10μM。将DMSO对照以及不同浓度甘草查尔酮A于37℃预先处理Vero-E6细胞2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.01)感染，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含2％胎牛血清(FBS)的DMEM维持液1ml并含有甘草查尔酮A存在，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，收取上清，进行倍比稀释后接种到铺有单层细胞的6孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含有4％胎牛血清(FBS)的2×DMEM及2％低熔点琼脂糖1：1混合液2ml，37℃、5％CO2培养箱中培养2-3天，并观察噬斑的形成，出现明显可见斑时加入1％结晶紫染色，结果如附图4所示，显示甘草查尔酮A可明显抑制猪流行性腹泻病毒的感染，并具有明显的剂量依赖性。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (4)

1.甘草查尔酮A在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
2.一种抗猪流行性腹泻病毒药物，包括甘草查尔酮A，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
3.如权利要求2所述抗猪流行性腹泻病毒药物，其特征在于，所述甘草查尔酮A的质量百分比含量不低于97.65％，其应用剂量为1-10μM/L。
4.如权利要求2或3所述抗猪流行性腹泻病毒药物，其特征在于，所述抗猪流行性腹泻病毒药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。
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