CN108524514A - 利血平在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利血平在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途，所述利血平的质量百分比含量不低于99.40％，其应用剂量为1‑10μM/L；利血平用于抗猪流行性腹泻病毒效果非常显著，安全、毒副作用少，药物残留低且无污染。

Description

利血平在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途
技术领域
本发明属于抗病毒应用领域，具体涉及利血平在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的疾病，临床以呕吐、严重腹泻和脱水为特征，该病常在冬季呈爆发式流行，各年龄阶段猪均可感染。其中，哺乳仔猪最为易感，发病率可达100％，病死率达80％-100％，后备猪、母猪或育肥猪呈一过性腹泻，发病率较低。PEDV于上世纪七十年代在欧洲首次出现，然而自2010年以来，PEDV变异病毒株的爆发对中国、日本、韩国、泰国、菲律宾等亚洲国家养猪业造成巨大的经济损失，2013年又分别在美国、德国和葡萄牙等国家大流行，PEDV变异毒株的流行已对全球生猪产业特别是哺乳仔猪造成严重影响，而目前已有的防控措施已经不能应对新的流态势。
猪流行性腹泻病毒常和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)混合感染，引起呕吐、严重腹泻及脱水等临床症状，从2012-2017年中国部分地区的猪场病毒性腹泻流行病学调查结果可知，各猪场分离出PEDV阳性率最高。猪流行性病毒为尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronaviridae)成员，为单股正链RNA病毒，外观呈球形，直径约为95-190nm，病毒粒子外有囊膜包裹，囊膜表面为12-24nm纤突，纤突末端呈球状，并且纤突有序排列为皇冠状。PEDV病毒粒子对热较不敏感，4℃pH5.0-9.0和37℃pH6.5-7.5之间均可稳定存活，但其在60℃情况下30min即可失活。此外，PEDV对脂溶性液体敏感，且该病毒粒子不具备血凝性。
PEDV病毒基因组全长28kb，包含5’帽子结构和3’腺苷尾巴结构，包含至少7个开放阅读框(ORF)，编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b以及ORF3)和4个结构蛋白分别为：150-220kDa糖基化的刺突(S)蛋白、20-30kDa膜(M)蛋白、7kDa包膜(E)蛋白和58kDa核衣壳(N)蛋白。研究表明，病毒通过蛋白受体氨基肽酶N-乙酰胆碱神经氨酸入侵细胞，这些受体同样存在于人、猴、蝙蝠等物种，PEDV存在跨物种感染的潜在风险，因此研究抗PEDV药物具有重要作用。
发明内容
利血平(Reserpine)，也称为利舍平、蛇根碱，是一种吲哚型生物碱，存在于萝芙木属多种植物中，在催吐萝芙木中含量最高可达1％，能降低血压和减慢心率，作用缓慢、温和而持久，对中枢神经系统有持久的安定作用，作为抗高血压、安定精神疾病药物使用有报道指出利血平可促进柯萨基病毒Coxsackievirus(cox.)B-3在断奶小鼠以及成熟小鼠体内的复制，利血平可以废止鼠乳腺瘤病毒的传染性，抑制狂犬病的感染，目前还没有关于利血平抑制抗猪流行性腹泻病毒的研究报道，本发明的目的在于提供一种利血平在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面，利血平在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
本发明的第二方面，一种抗猪流行性腹泻病毒药物包括利血平，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
优选的，上述抗猪流行性腹泻病毒药物中，所述利血平的质量百分比含量不低于99.40％，其应用剂量为1-10μM/L，即608.68μg/L-6.086mg/L。
在一些优选的实施方式中，所述抗猪流行性腹泻病毒药物可以为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
一、利血平用于抗猪流行性腹泻病毒效果非常显著；实验证明利血平在细胞实验中展现出明显的抗病毒活性，在10μM的浓度下即可展现出极强的抗猪流行性腹泻病毒(MOI＝0.01)感染作用。
二、利血平用于抗猪流行性腹泻病毒安全、毒副作用少；利血平为中草药中提取成分，不同于激素、抗生素、化学合成药物等，对机体无明显毒副作用。
三、利血平用于抗猪流行性腹泻病毒药物残留低、无污染；利血平属于有机分子化合物，容易被动物机体吸收，生物代谢率高，且排泄无污染。
附图说明
图1为MTT方法检测利血平对Vero-E6细胞的毒性；1-10μM利血平处理Vero-E6细胞72h后使用MTT染色4h，并在490nm测细胞吸光值检测细胞活性；
图2为Western Blot测定利血平在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性；1-10μM利血平预处理Vero-E6细胞2h后感染猪流行性腹泻病毒，之后利血平一直存在，24h后收取细胞进行Western Blot测定细胞中PEDV病毒蛋白含量；
图3为荧光定量PCR测定利血平在Vero-E6细胞上抑制PEDV感染；1-10μM利血平预处理Vero-E6细胞2h后感染猪流行性腹泻病毒，之后利血平一直存在，24h后收取细胞提取总RNA，进行荧光定量PCR测定；
图4为噬斑形成实验测定利血平在Vero-E6细胞上抑制PEDV感染；10μM利血平预处理Vero-E6细胞2h后感染猪流行性腹泻病毒，之后利血平一直存在，24h后收取上清用噬斑形成实验测定病毒滴度。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
试验材料
猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株为发明人实验室所有；
Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞)受赠于南京农业大学免疫研究所；
MTT检测试剂盒购自索莱宝公司；
实时定量PCR(Real time PCR)AceQGreen Master Mix试剂盒购自诺唯赞公司；
引物订自金斯瑞公司；
利血平(Reserpine)购于Selleck公司。
实施例1利血平在Vero-E6细胞上细胞毒性的测定
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以1.5×104/孔的浓度加于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约18-20h)后，用DMEM营养液将利血平稀释至：1μM、2μM、5μM、10μM，每个浓度设置3组重复。在96孔细胞培养板上将DMSO对照以及稀释的利血平样品以100μl/孔处理Vero-E6细胞72h后，移除上清，加入90μl新鲜培养液，再加入10μlMTT溶液，继续培养4h；吸除上清，每孔加入110μlFormazan溶解液，置于摇床低速震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，结果如附图1所示。
由附图1可见，经不同浓度的利血平处理细胞与未经利血平处理细胞中相比，线粒体脱氢酶的量并无明显差别，说明该浓度的利血平在Vero-E6细胞上不具有明显细胞毒性。
实施例2 Western Blot测定利血平在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染 的活性
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以7×105/孔的浓度加于6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层并长至70-80％的密度(约18-20h)后，用DMEM营养液将利血平稀释至：1μM、2μM、5μM、10μM。将DMSO对照以及不同浓度利血平于37℃预先处理Vero-E6细胞2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.01)感染，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含2％胎牛血清(FBS)的DMEM维持液1ml并含有利血平存在，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，用2×SDS samplebuffer收取细胞样品，金属浴煮样10min，进行Western Blot检测，结果如附图2所示，显示利血平能够显著抑制猪流行性腹泻病毒的感染，并具有明显的剂量依赖性。
实施例3荧光定量检测利血平在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活 性
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以7×105/孔的浓度加于6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层并长至70-80％的密度(约18-20h)后，用DMEM营养液将利血平稀释至10μM。将DMSO对照以及利血平于37℃预先处理Vero-E6细胞2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.01)感染，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含2％胎牛血清(FBS)的DMEM维持液1ml并含有利血平存在，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，用Trizon收集细胞样品，提取RNA。将提取的RNA溶于20μl超纯水中，反转成cDNA，使用Actin基因作为内参，实时荧光定量PCR检测PEDV-M蛋白mRNA水平的变化。其中，引物信息如下：
Actin-F 5’CTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCA’3’；
Actin-R 5’GGATAGCACAGCCTGGATAGCAACG’3’；
PEDV-M-F 5’CCCGTTGATGAGGTGATTG 3’；
PEDV-M-R 5’CGAAAAAGACCCAGTTGACC 3’。
20μlPCR反应体系包含10μl AceQGreen Master Mix，0.4μl上、下游引(10μM)，2μl模板DNA，0.4μl ROX Reference Dye1以及6.8μl灭菌蒸馏水。扩增参数为：95℃10s、60℃30s共40个循环，反应结束后溶解曲线测定，反应条件为：95℃15s、60℃60s、95℃15s。本实验通过2-ΔΔCt法进行PEDV-M基因的相对定量，结果如附图3所示，显示利血平在Vero-E6细胞上明显抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性。
实施例4噬斑形成实验测定利血平在Vero-E6细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染 的活性
Vero-E6细胞计数后用8％胎牛血清(FBS)的DMEM营养液稀释到适当密度后以7×105/孔的浓度加于6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层并长至70％-80％的密度(约18-20h)后，用DMEM营养液将利血平稀释至：1μM、2μM、5μM、10μM。将DMSO对照以及不同浓度利血平于37℃预先处理Vero-E6细胞2h后，接猪流行性腹泻病毒HLJBY毒株(MOI＝0.01)感染，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含2％胎牛血清(FBS)的DMEM维持液1ml并含有利血平存在，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，收取上清，进行倍比稀释后接种到铺有单层细胞的6孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中1h，用PBS洗三遍，加入含有4％胎牛血清(FBS)的2×DMEM及2％低熔点琼脂糖1：1混合液2ml，37℃、5％CO2培养箱中培养2-3天，并观察噬斑的形成，出现明显可见斑时加入1％结晶紫染色，结果如附图4所示，显示利血平可明显抑制猪流行性腹泻病毒的感染，并具有明显的剂量依赖性。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (4)

1.利血平在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的用途。
2.一种抗猪流行性腹泻病毒药物，包括利血平，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
3.如权利要求2所述抗猪流行性腹泻病毒药物，其特征在于，所述利血平的质量百分比含量不低于99.40％，其应用剂量为1-10μM/L。
4.如权利要求2或3所述抗猪流行性腹泻病毒药物，其特征在于，所述抗猪流行性腹泻病毒药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。
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