CN110037997A

CN110037997A - 甘草查尔酮a在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用

Info

Publication number: CN110037997A
Application number: CN201910362844.3A
Authority: CN
Inventors: 杨裕; 杨志强; 杨春雷; 贾永鑫
Original assignee: Feed And Veterinary Medicine Research Institute Of Shanxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed And Veterinary Medicine Research Institute Of Shanxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110037997B

Abstract

本发明公开了一种甘草查尔酮A在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用；一种抗副猪嗜血杆菌药物，它包括：甘草查尔酮A，以及药学上可接受的辅料和辅助性成分；实验结果表明，不同浓度甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌体外生长的抑制作用没有明显差异，同时对细菌生物被膜的形成也没有影响；体内实验结果发现甘草查尔酮A可适当增强小鼠免疫器官指数以及提高小鼠肠道菌群的丰度和菌群结构；可以提高小鼠清除副猪嗜血杆菌，同时增强保护感染作用的能力，可以延迟感染副猪嗜血杆菌小鼠的死亡时间。

Description

甘草查尔酮A在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用

技术领域

本发明属活性成分抗菌应用技术领域，具体涉及甘草查尔酮A在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是共栖于猪上呼吸道的一种革兰阴性小杆菌，引发猪副猪嗜血杆菌病或猪格拉斯病（Glasser’s disease），临床上以多发性浆膜炎、关节炎或败血症为典型症状的全身性病变。2周龄～4月龄猪群是副猪嗜血杆菌的主要感染对象，发病率和死亡率最高分别可达40%和50%。由于副猪嗜血杆菌存在多种血清型，副猪嗜血杆菌疫苗的交叉免疫效果并不理想，目前尚无有效的预防和控制副猪嗜血杆菌爆发与流行的最有效措施。

在新型抗菌药物和药物靶标开发中，植物是最主要的来源之一。现在，世界上大约60%人口仍然依靠植物药作为主要的健康保证，而传统中药是植物药宝库中的主要部分。所以，寻找有新作用机制的抗副猪嗜血杆菌中药提取化合物显得尤为重要。

甘草是一种多年生草本植物，被历代名医尊称为“众药之王”，素有“十方九草”之称，具有泻火解毒、健脾补气、润肺止咳、缓急止痛和缓和药性等功效。现代医学研究也表明，甘草除了可以作为甜味剂、抗氧化剂和美白剂外，还具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗高血脂以及增强细胞免疫等多种药理活性。甘草有效成分主要有黄酮类、三萜类和多糖类化合物。多糖是一种由糖苷键连接起来的醛糖或酮糖组成的天然大分子，天然植物活性多糖具有激活、增强、调节和修复机体免疫能力以及抵抗炎症抗炎、病毒和肿瘤等多种生理功能。甘草多糖是甘草中的一类α-D-吡喃多糖，研究证明其能够促进淋巴细胞增殖、增强吞噬细胞的吞噬功能。

甘草查尔酮A(licochalcone A)是一种甘草中的黄酮类化合物，大量分布于甘草根茎中；1975年，Saitoh T等首次从甘草中分离得到了甘草查尔酮A，并证明了它的结构，在随后的临床及药理研究中表明，甘草查尔酮A具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗利什曼原虫病（尤指黑热病）、抗肿瘤、免疫促进和雌激素样等多种生物活性，在食品和医药工业中有广泛的用途。由于甘草对多种疾病表现了良好的预防和治疗作用且毒副作用较小，近年来对甘草潜在的多种药理活性的研究和挖掘一直是国内外药理界的研究热点。甘草查尔酮A可通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞转移和侵袭、抑制肿瘤血管生成以及诱导肿瘤细胞自噬等多种机制发挥抗肿瘤活性。同时，甘草查尔酮A对恶性疟原虫、利什曼原虫和刚地弓形虫，白色念珠菌、革兰氏阳性球菌、杆菌和棒型菌具有一定的活性，研究表明甘草查尔酮A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株有很好的抵抗活性，对悬浮菌MICs值和MBCs值分别为1-8μg/mL和2-16μg/mL，而对生物被膜的MIBCs值和MBBCs值分别为8-64μg/mL和≥1024μg/mL。此外，甘草查耳酮A对微球菌、肠系膜串珠菌、结核分枝杆菌和幽门杆菌起到一定的杀菌作用。甘草查尔酮A对金黄色葡萄菌在内的细菌表现出一定的抗菌能力；国外研究还发现甘草查耳酮A体外具有抗幽门杆菌和MRSA的活性。但是国内外未见甘草查耳酮A抗副猪嗜血杆菌的相关研究报道，这严重阻碍了甘草查耳酮A作为细菌抑制剂的进一步开发和利用，所以对甘草查耳酮A抗副猪嗜血杆菌的研究和应用迫在眉睫。

发明内容

本发明目的是提供甘草查尔酮A在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用。

甘草查尔酮A在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用。

一种抗副猪嗜血杆菌药物，它包括：甘草查尔酮A，以及药学上可接受的辅料和辅助性成分。

本发明提供了甘草查尔酮A在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用；一种抗副猪嗜血杆菌药物，它包括：甘草查尔酮A，以及药学上可接受的辅料和辅助性成分；实验结果表明，不同浓度甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌体外生长的抑制作用没有明显差异，同时对细菌生物被膜的形成也没有影响；体内实验结果发现甘草查尔酮A可适当增强小鼠免疫器官指数以及提高小鼠肠道菌群的丰度和菌群结构；可以提高小鼠清除副猪嗜血杆菌，同时增强保护感染作用的能力，可以延迟感染副猪嗜血杆菌小鼠的死亡时间。

附图说明

图1 甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌生长速率的影响；

图2 分光光度法(A)和(B)平板法观察甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌生物被膜形成的影响；图中a、b、c、d、e和f分别代表10 μg/mL，10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200μg/mL甘草查尔酮A；

图3 甘草查尔酮A对小鼠肠道菌群组成(门水平)的影响；A、B、C和D分别代表对照组、低剂量、中剂量和高剂量组；

图4 甘草查尔酮A对小鼠肠道菌群组成(纲水平)的影响；A、B、C和D分别代表对照组、低剂量、中剂量和高剂量组。

具体实施方式

本发明实验材料来源：

1）副猪嗜血杆菌H12L1株，河南科技大学洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室；

2）清洁级6-8周龄昆明小鼠（18.0±2.0 g），郑州中原动物实验中心；

3）甘草查尔酮A（含量：20 mg，HPLC≥98%，货号：RS1011-20MG），北京酷来搏科技有限公司产品。

实施例1 甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌的体外抑制作用实验

1、甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌生长速度的影响

将活化好的副猪嗜血杆菌转接种于TSA液体培养基（含新生牛血清和NAD），于37°C 200r/min振荡培养过夜；然后将菌液（10⁶ CFU/mL）分别转接于终浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL甘草查尔酮A的新鲜液体培养基中，于37°C培养，每1 h取出100 μL菌液用无菌PBS连续10倍稀释，然后取100 μL菌液涂布于含新生牛血清和NAD TSB固体培养基，每个稀释度重复3次，培养过夜后计数，绘制生长曲线；

甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌生长速率的影响如图1所示，10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL的甘草查尔酮A在不同时间点与空白对照组相比对副猪嗜血杆菌的生长速率差异无统计学意义。

2、甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌生物被膜形成的影响

细菌生物被膜的形成采用96孔微孔板结晶紫染色法进行；挑取副猪嗜血杆菌单菌落接种于TSA液体培养基（含新生牛血清和NAD），37°C培养过夜，按1:20比例转接于96孔细胞培养板，分别加入终浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL的甘草查尔酮A，同时做空白对照孔，每孔重复3次。孵育48 h后，未附着的细菌用无菌PBS轻轻洗涤3次除去，甩干后加入1%结晶紫染色45 min，蒸馏水三次水洗以去除孔中的浮色重复，37°C放置10 min干燥，然后200 μL/孔乙醇溶解，在D590 nm波长下检测吸光度值。同时将单菌落培养的菌液转接到含有40 mg/L刚果红和20mg/L考马斯亮蓝的无NaCl的LB固体培养基上，37°C恒温倒置培养48 h，观察细菌的菌落形态。

分光光度法观察甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌生物被膜形成的影响，在同一时间点，与空白对照组相比，当添加不同浓度甘草查尔酮A后，并不会显著影响副猪嗜血杆菌在聚乙烯板孔内形成生物被膜的量（图2）。

实施例2 甘草查尔酮A对小鼠生长和肠道菌群的影响

1、甘草查尔酮A对小鼠生长的影响

72只小鼠随机平均分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组。低剂量组：按1 mg/kg剂量给予小鼠口服灌胃甘草查尔酮A，每次0.2 mL。中剂量组：按10 mg/kg剂量给予小鼠口服灌胃甘草查尔酮A，每次0.2 mL。高剂量组：按50 mg/kg剂量给予小鼠口服灌胃甘草查尔酮A，每次0.2 mL。对照组：正常饲养。每日灌胃给药一次，连续给药7天，观察小鼠的临床症状，分别于第3天、5天和7天测定小鼠体重，并分别处死6只小鼠，取出肺脏、心脏、肾脏、胸腺和脾脏，计算脏器指数，脏器指数=小鼠脏器重（g）/小鼠体重（g）。将肺组织于60°C干烤箱中放置72 h左右，计算肺组织湿/干质量比值；

口服灌胃给予不同浓度甘草查尔酮A 7d后与对照组相比，小鼠无死亡，精神状态、采食量、饮水量、活动量等一般临床状况均无明显变化，体重无明显变化，见表1；给予甘草查尔酮A后小鼠胸腺指数、脾脏指数、肺脏指数、心脏指数、肝脏指数和肾脏指数与对照组相比差异均无统计学意义，见表2。

2、甘草查尔酮A对小鼠肠道菌群的影响

收集第7天各组小鼠1g肠道内容物和1g肠组织的肠黏膜样本，经无菌PBS漂洗后采用细菌基因组提取试剂盒按说明书方法提取细菌基因组DNA，使用Nanodrop 2000测定浓度后用于PCR扩增和高通量测序。针对细菌V3-V4区域作为目标区域合成带有6bp barcode序列的扩增引物，引物如下：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，采用DNA Library Prep Kit for Illumina NEB NextUltra（NEB#e7370S/L）中的标准建库流程进行建库。使用Aglent2100和qPCR分别进行文库长度分布检测和浓度检测。将检测合格的文库使用Illumina Hiseq 2500（PE250）进行测序；使用NGS Tookit软件对测序得到原始序列进行质控得到Clean Data；对每个OTU进行物种注释，根据样品的OTU总数和OTU的相对丰度进行样品Alpha多样性分析及菌群构成分析，包括Chao1/ACE指数、Coverage指数、Simpson/Shannon指数等；

菌群多样性的结果：共得到原始reads约18.53M，质控过滤后剩余约18.47M cleanreads，供后期分析使用；计算alpha多样性时每样本随机抽样数为10万条；使用Mothur软件计算样品OUT数量结果显示，小鼠给予甘草查尔酮A后肠道菌群丰度逐渐增加，且高剂量组小鼠肠道菌群的丰度最高；Coverage指数可以反映样品的测序深度和覆盖率，4组样品的Coverage值均在0.99以上，说明样品中序列未被检测到的可能性较低；Alpha多样性分析也表明，给小鼠灌胃甘草查尔酮A后，其肠道菌群的多样性高于对照组，且在各剂量组中甘草查尔酮A高剂量组的肠道菌群丰度显著高于对照组，见表3；这说明甘草查尔酮A可增强小鼠肠道菌群的多样性，且高剂量甘草查尔酮A的效果较好。

从图3可以看出，所有组样品的菌群结构在门水平上主要以拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为主。总体上看，对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组样品的拟杆菌门分别占总菌群的86.2%、75.0%、75.6%和66.2%，厚壁菌门分别占总菌群的6.3%、17.7%、18.7%和22.6%，变形菌门分别占总菌群的5.9%、5.3%、4.1%和6.1%。Thaumarchaeota和Actinobacteria等其他菌群的比例无明显变化（图3）；

在纲水平上主要以拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）为主。其中，对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组样品的拟杆菌纲分别占总菌群的86.0%、75.0%、75.6%和66.0%，梭菌纲占5.7%、16.6%、17.8%和19.5%，而其他变化比例较大菌群的是Negativicutes纲，各组分别占总菌群的0.1%、0.3%、0.3%和2.3%（图4）。

实施例3 甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌在小鼠体内增殖的抑制作用

1、副猪嗜血杆菌对小鼠半数致死量(LD₅₀)的测定

将72只小鼠平均随机分为6组（5个实验组和1个空白组），无菌PBS连续5倍稀释新鲜培养的副猪嗜血杆菌，选取合适的稀释度，按200μL/只腹腔感染小鼠。观察小鼠状态，直至无出现小鼠死亡，记录死亡情况，根据Bliss法计算副猪嗜血杆菌对小鼠LD₅₀；结果显示，小鼠腹腔注射副猪嗜血杆菌后第3天即可出现死亡，连续观察记录小鼠死亡情况，直至5天内未出现死亡现象，根据Bliss法计算得到腹腔注射感染副猪嗜血杆菌H12L1对小鼠的LD50为8.72×10⁷CFU/mL。

2、甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌在小鼠体内增殖的影响

72只小鼠随机平均分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组；低剂量组：按1mg/kg剂量给予小鼠口服灌胃甘草查尔酮A，每次0.2 mL。中剂量组：按10 mg/kg剂量给予小鼠口服灌胃甘草查尔酮A，每次0.2 mL。高剂量组：按50 mg/kg剂量给予小鼠口服灌胃甘草查尔酮A，每次0.2 mL。对照组：正常饲养；每日灌胃给药一次，连续给药7天，然后将0.01×LD₅₀副猪嗜血杆菌分别感染各组小鼠，于感染后14d、28d和35d脱臼法剖杀小鼠，在无菌操作台取肝脏，剪一小块称重后利用组织研磨器研磨，无菌PBS稀释，取合适稀释度匀浆液均匀涂布于TSB固体培养基（含新生牛血清和NAD），37℃培养过夜后观察细菌生长情况；

小鼠感染0.01×LD₅₀副猪嗜血杆菌，于第14d、28d和35d剖杀小鼠，无菌操作台取肝脏经研磨稀释后涂板。结果显示，所有感染组小鼠在第14d均能分离到细菌，且细菌数量最多，而后各组小鼠肝脏细菌数量呈缓慢下降的趋势，35d时仍能分离出细菌。与对照组相比，给予各剂量的甘草查尔酮A后小鼠体内细菌量没有显著性差异，但随着甘草查尔酮A浓度增加小鼠体内细菌量逐渐减少。

3、甘草查尔酮A对感染副猪嗜血杆菌小鼠的保护力测定

将60只小鼠随机平均分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组和空白组；于给药5天后腹腔注射100×LD₅₀副猪嗜血杆菌；正常饲喂，每隔12h观察小鼠精神状态，饮食状况，连续观察直至无小鼠死亡，记录死亡情况。

小鼠给予不同浓度的甘草查尔酮A，在第5天腹腔感染100×LD₅₀的副猪嗜血杆菌，所有感染组小鼠均出现不同程度的精神萎靡、嗜睡、呆卧不动、食欲不振或降低等临床症状，感染后72小时出现死亡；对死亡小鼠进行解剖，腹腔有积液，肠壁变薄，充满气体，肠系膜充血、粘连，脾脏和淋巴结肿大，有出血点和出血斑，肝脏、肺脏和肾脏也有不同程度充血肿大。从死亡小鼠肺脏中可以分离到副猪嗜血杆菌；但高剂量组小鼠感染后第11天全部死亡，低剂量和中剂量组均是第9天全部死亡，而对照组则是在感染后第7天全部死亡，见表4，这提示甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染有一定的抵抗作用。

Claims

1.甘草查尔酮A在制备抗副猪嗜血杆菌药物中的应用。

2.一种抗副猪嗜血杆菌药物，它包括：甘草查尔酮A，以及药学上可接受的辅料和辅助性成分。