CN108836956A - 甘草查耳酮a在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘草查耳酮A在治疗鸡坏死性肠炎中的用途，通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、生物被膜形成抑制试验以及雏鸡坏死性肠炎模型试验证甘草查耳酮A对产气荚膜梭菌感染所致的鸡坏死性肠炎具有保护作用。由于传统抗生素的滥用和细菌耐药性的不断加强，甘草查耳酮A具有治愈率高，无耐药性及药物残留的特点，因此甘草查耳酮A用于治疗鸡坏死性肠炎可以增加使用药物的选择性,对开发新药和有着重要意义。

Description

甘草查耳酮A在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的用途

技术领域

本发明公开了甘草查耳酮 A在治疗鸡坏死性肠炎中的用途，涉及甘草查耳酮 A在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

产气荚膜梭菌是一种厌氧性革兰氏阳性芽孢杆菌，广泛存在于自然界的土壤、水体、食物、人畜粪便、家畜饲料及动物肠道中，是人和动物的正常肠道菌群，属条件致病菌。目前根据其分泌的外毒素不同，将其分为A-E 共个5血清型，家禽主要感染A型及C型产气荚膜梭菌，尤以A型为主。产气荚膜梭菌感染家禽后，主要引起坏死性肠炎，其症状表现为鸡只精神委靡、羽毛松乱、食欲减少或废绝，排血便，生产性能严重下降。病变主要集中在小肠部位，表现为肠壁变薄，有局灶性或成片的肠粘膜坏死脱落。据有关研究统计，全球家禽行业因坏死性肠炎造成的经济损失高达数十亿美元，严重危害了家禽养殖业的发展。

产气荚膜梭菌在肠道内的粘附定植主要是通过其四型菌毛（Type IV pili，TFP)介导的。TFP是一种存在于细菌细胞膜上的一种运动器官，TFP使得产气荚膜梭菌具有在其自然生境和软硬琼脂等半固体的介质表面运动的能力，这种特殊的运动方式被称作滑动运动（Gliding motility）。据研究表明，包括产气荚膜梭菌在肠道的粘附定植、滑动运动、生物被膜的形成等细菌功能都与TFP具有一定的联系。通过抑制产气荚膜梭菌TFP的功能，能够干扰细菌在肠道内的粘附定植，从而达到抗产气荚膜梭菌感染的目的。

通过在饲料中添加抗生素是预防并治疗家禽感染坏死性肠炎的主要手段，然而，由于抗生素大量使用所致的细菌耐药性问题及抗生素残留问题对公众健康造成了严重威胁，因此，开发安全有效的抗生素替代物正日益成为研究的热点。天然化合物具有毒性较低、来源丰富、安全范围广等优点，是筛选抗生素替代物的重要资源。

甘草查尔酮 A是从中药甘草中提取得到的一种查尔酮类化合物，主要存在于豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根茎。目前的研究表明，甘草查耳酮 A具有包括抗炎、抗菌、抗肿瘤及抗寄生虫等多种生物学活性。然而，截至目前国内外尚无甘草查耳酮 A用于治疗产气荚膜梭菌所致鸡坏死性肠炎的相关研究。

发明内容

本发明提供了甘草查耳酮 A在治疗鸡坏死性肠炎中的医用用途，对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的治疗效果。

本发明所述的甘草查耳酮 A的分子结构如下所示：

分子式为：C₂₁H₂₂O₄ ；分子量：338.39698。

本发明通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、生物被膜形成抑制试验以及雏鸡坏死性肠炎模型试验证甘草查耳酮 A对产气荚膜梭菌感染所致的鸡坏死性肠炎具有保护作用：

一、滑动运动抑制试验：

产气荚膜梭菌标准株ATCC13124于液体BHI培养基37 ℃厌氧培养12 h，之后取300 μl该培养物继续培养于液体BHI中，37 ℃厌氧培养5 h。取1 ml培养物，10000 g离心弃上清，菌体重悬于500 μl BHI液体培养基中，使之二倍浓缩。之后取5 μl浓缩的菌液分别滴加于预先制备并于37 ℃烘箱干燥1 h的含8 μg/ml、32 μg/ml甘草查耳酮 A的0.7% BHIA的平板上，37 ℃厌氧培养48 h，采集图像(参见图1)。结果表明，8μg/ml及32μg/ml甘草查耳酮 A均能显著抑制产气荚膜梭菌在BHIA上的滑动运动，且32μg/ml甘草查耳酮 A作用效果更为明显。

二、生物被膜形成抑制试验

产气荚膜梭菌于液体BHI中37℃厌氧培养12h，离心弃上清，用灭菌PBS洗涤一次，之后用TSB液体培养基重悬并调整至OD_600nm=0.1，取400μl调整后的细菌培养物，加至24孔板中,之后与细菌培养物内分别加入不同浓度的甘草查耳酮 A，使得24孔板内甘草查耳酮 A的终浓度分别为4 μg/ml、8 μg/ml、/16μg/ml及32μg/ml，另设立加入0.4μl过滤灭菌的DMSO（不加入甘草查耳酮 A）的阳性对照组以及400 μl液体TSB培养基的阴性对照组，24孔板置于30℃厌氧培养5d。之后吸弃上清，灭菌PBS洗两次，室温干燥30 min，加入过滤灭菌的1%结晶紫400μl，室温孵育30min，弃结晶紫，再次用灭菌PBS洗两次。向每孔中加入33%乙酸溶解结晶紫，吹打混匀后取300 μl分别加入96孔板的3个独立孔中，每孔100μl，于酶标仪570 nm测定吸光值，根据结晶紫吸光值计算生物被膜形成率。结果表明，甘草查耳酮 A能够有效抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成（参见图2）。

三、雏鸡坏死性肠炎模型试验的治疗学研究

1、雏鸡坏死性肠炎模型

取17日龄的雄性爱拔益加(Arbor Acre)肉仔鸡经口给予0.5 ml（1×10⁹CFUs）重悬于灭菌PBS的产气荚膜梭菌ATCC13124培养物，次日（18日龄）再次给予相同菌量的菌液以攻菌，建立雏鸡坏死性肠炎模型，健康组鸡只经口给予0.5 ml灭菌PBS作为对照。

2、肠道病变评分试验

雏鸡经口攻菌感染前4 h（17日龄）按鸡只体重经口给予25 mg/kg的甘草查耳酮 A（溶解于灭菌PBS），每12h给药一次。另设立不给药治疗的阳性对照组及不攻菌感染的健康对照组，阳性对照组与健康对照组鸡只同样称重并按体重经口给予相应体积的灭菌PBS。上述三组每组10只鸡，治疗组共给药治疗5天（治疗至21日龄）。21日龄颈椎脱臼处死全部鸡只，剖检，取十二指肠至空肠，肉眼观察肠道病理变化，根据肠道损伤程度进行肠道损伤评分（参见图3）。肠道损伤评分采用0-6分制：0分（没有明显损伤）、1分（肠壁变薄、变脆）、2分(出现1-5个坏死灶)、3分（出现6-15个坏死灶）、4分（出现16个或16个以上坏死灶）、5分（出现2-3cm长的片状坏死）、6分（出现大片的弥漫性坏死）。另将上述小肠采集病料，HE染色制作病理切片，镜下观察病理组织学变化（参见图4）。

攻菌期间每日对全部肉鸡称重，计算平均体重及日增重，以考察甘草查耳酮 A治疗后对患坏死性肠炎肉鸡日增重的影响（参见图5）。

肠道病变评分结果表明，经甘草查耳酮 A治疗后，显著降低了坏死性肠炎鸡只肠道的病理变化程度。病理组织学观察结果表明，健康组肉鸡小肠肠绒毛结构完整，无出血及炎性渗出；对照组肉鸡小肠绒毛坏死溶解，结构不完整，伴有大量出血；经甘草查耳酮 A治疗后，上述病理组织学损伤明显缓解。日增重结果表明，治疗组肉鸡日增重与健康组肉鸡相近，显著高于感染组肉鸡。

综合以上结果，说明甘草查耳酮 A对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的保护作用。

本发明的积极效果在于：提供了甘草查耳酮 A的一种新医用用途，用于治疗鸡坏死性肠炎，可显著降低坏死性肠炎鸡只肠道的病理变化程度，对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的治疗效果。

附图说明

图1为甘草查耳酮 A均能显著抑制产气荚膜梭菌在BHIA上的滑动运动图片；

图2为甘草查耳酮 A能够有效抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成图；

图3为根据肠道损伤程度进行肠道损伤评分图；

图4为镜下观察病理组织学变化照片；

图5为甘草查耳酮 A治疗后对患坏死性肠炎肉鸡日增重的影响图。

具体实施方式

实施例1

甘草查耳酮 A在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，以甘草查耳酮 A为活性制成药学上可接受任何剂型。

实施例2

甘草查耳酮 A所述的治疗鸡坏死性肠炎指由细菌引起的坏死性肠炎。

实施例3

甘草查耳酮 A所述的治疗鸡坏死性肠炎是指由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎。

Claims (4)

1.甘草查耳酮 A在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的医用用途。

2. 权利要求1所述甘草查耳酮 A在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的医用用途中涉及的鸡坏死性肠炎指由细菌引起的坏死性肠炎。

3. 权利要求1所述甘草查耳酮 A在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的医用用途中涉及的鸡坏死性肠炎指由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎。

4. 以甘草查耳酮 A为活性成分制成药学上可接受任何剂型。