CN106924229B - 根皮素在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及根皮素在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，并通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、生物被膜形成抑制试验以及雏鸡坏死性肠炎模型试验证根皮素对产气荚膜梭菌感染所致的鸡坏死性肠炎具有保护作用。由于传统抗生素的滥用和细菌耐药性的不断加强，根皮素具有治愈率高，无耐药性及药物残留的特点，因此根皮素用于治疗鸡坏死性肠炎可以增加使用药物的选择性,对开发新药和有着重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及根皮素在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，属于医药领域。
背景技术
产气荚膜梭菌是一种厌氧性革兰氏阳性芽孢杆菌，广泛存在于自然界的土壤、水体、食物、人畜粪便、家畜饲料及动物肠道中，是人和动物的正常肠道菌群，属条件致病菌。目前根据其分泌的外毒素不同，将其分为A-E共个5血清型，家禽主要感染A型及C型产气荚膜梭菌，尤以A型为主。产气荚膜梭菌感染家禽后，主要引起坏死性肠炎，其症状表现为鸡只精神委靡、羽毛松乱、食欲减少或废绝，排血便，生产性能严重下降。病变主要集中在小肠部位，表现为肠壁变薄，有局灶性或成片的肠粘膜坏死脱落。据有关研究统计，全球家禽行业因坏死性肠炎造成的经济损失高达六十亿美元，严重危害了家禽养殖业的健康发展。
产气荚膜梭菌在肠道内的粘附定植主要是通过其四型菌毛(Type IV pili，TFP)介导的。TFP是一种存在于细菌细胞膜上的一种运动器官，TFP使得产气荚膜梭菌具有在其自然生境和软硬琼脂等半固体的介质表面运动的能力，这种特殊的运动方式被称作滑动运动(Gliding motility)。据研究表明，包括产气荚膜梭菌在肠道的粘附定植、滑动运动、生物被膜的形成等细菌功能都与TFP具有一定的联系。通过抑制产气荚膜梭菌TFP的功能，能够干扰细菌在肠道内的粘附定植，从而达到抗产气荚膜梭菌感染的目的。
通过在饲料中添加抗生素是预防并治疗家禽感染坏死性肠炎的主要手段，然而，由于抗生素大量使用所致的细菌耐药性问题及抗生素残留问题对公众健康造成了严重威胁，因此，开发安全有效的抗生素替代物正日益成为研究的热点。天然化合物具有毒性较低、来源丰富、安全范围广等优点，是筛选抗生素替代物的重要资源。根皮素是自然界中一种较为稀有的二氢查尔酮类化合物，主要存在于苹果的根、茎、叶及果实中。目前的研究表明，根皮素具有很强的抗氧化作用，同时也是一种新开发的天然皮肤美白剂。近年来，根皮素在医学、营养学及食品工业中得到了广泛关注。但是，截至目前国内外尚无根皮素用于治疗产气荚膜梭菌所致鸡坏死性肠炎的相关研究。本发明研究表明了根皮素对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的治疗效果。
发明内容
根皮素的分子结构见附图1。
本发明通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、生物被膜形成抑制试验以及雏鸡坏死性肠炎模型试验证根皮素对产气荚膜梭菌感染所致的鸡坏死性肠炎具有保护作用。
附图说明
图1是根皮素分子结构图
图2是滑动运动抑制试验图
图3是生物被膜形成抑制试验图
图4是肠道病变评分试验图
具体实施方式
滑动运动抑制试验
产气荚膜梭菌标准株ATCC13124于液体BHI培养基37℃厌氧培养12h，之后取300μl该培养物继续培养于液体BHI中，37℃厌氧培养5h。取1ml培养物，10000g离心弃上清，菌体重悬于500μl BHI液体培养基中，使之二倍浓缩。之后取5μl浓缩的菌液分别滴加于预先制备并于37℃烘箱干燥1h的含4μg/ml、16μg/ml根皮素的0.7％BHIA的平板上，37℃厌氧培养48h，采集图像(附图2)。结果表明，4μg/ml及16μg/ml根皮素均能显著抑制产气荚膜梭菌在BHIA上的滑动运动，且16μg/ml根皮素作用效果更为明显。
生物被膜形成抑制试验
产气荚膜梭菌于液体BHI中37℃厌氧培养12h，离心弃上清，用灭菌PBS洗涤一次，之后用TSB液体培养基重悬并调整至OD600nm＝0.1，取400μl调整后的细菌培养物，加至24孔板中，24孔板外围用灭菌PBS封板以防止液体蒸发。之后与细菌培养物内分别加入0.4μl浓度为8mg/ml或32mg/ml的根皮素，使得24孔板内根皮素的终浓度分别为8μg/ml及32μg/ml，另设立加入0.4μl过滤灭菌的DMSO(不加入根皮素)的阳性对照组以及400μl液体TSB培养基的阴性对照组，24孔板置于30℃厌氧培养5d。之后轻轻吸弃上清，灭菌PBS洗涤24孔板内固着的生物被膜两次，室温干燥30min，加入过滤灭菌的1％结晶紫400μl，室温孵育30min，吸弃结晶紫，再次用灭菌PBS洗涤两次。向每孔中加入400μl的33％乙酸溶解结晶紫，吹打混匀后取300μl分别加入96孔板的3个独立孔中，每孔100μl，于酶标仪570nm测定吸光值，计算生物被膜形成的抑制率。结果表明，根皮素能够有效抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成(附图3)。
雏鸡坏死性肠炎模型试验的治疗学研究
雏鸡坏死性肠炎模型
取20日龄的雄性爱拔益加(Arbor Acre)肉仔鸡经口给予0.1ml(5×108CFUs)重悬于灭菌PBS的产气荚膜梭菌ATCC13124培养物，次日(21日龄)再次给予相同菌量的菌液以攻菌，建立雏鸡坏死性肠炎模型，健康组鸡只经口给予0.1ml灭菌PBS作为对照。
肠道病变评分试验
雏鸡经口攻菌感染前8h(20日龄)按鸡只体重经口给予50mg/kg的根皮素(溶解于灭菌PBS)，每12h给药一次。另设立不给药治疗的阳性对照组及不攻菌感染的健康对照组，阳性对照组与健康对照组鸡只同样称重并按体重经口给予相应体积的灭菌PBS。上述三组每组10只鸡，治疗组共给药治疗5天(治疗至24日龄)。25日龄颈椎脱臼处死全部鸡只，剖检，取十二指肠至空肠，肉眼观察肠道病理变化，根据肠道损伤程度进行肠道损伤评分(附图4)。肠道损伤评分采用0-6分制：0分(没有明显损伤)、1分(肠壁变薄、变脆)、2分(出现1-5个坏死灶)、3分(出现6-15个坏死灶)、4分(出现16个或16个以上坏死灶)、5分(出现2-3cm长的片状坏死)、6分(出现大片的弥漫性坏死)。结果表明，经根皮素治疗后，显著降低坏死性肠炎鸡只肠道的病理变化程度，说明根皮素对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的保护作用。
Claims (1)
1.根皮素在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，其特征在于：所述的鸡坏死性肠炎指由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎，根皮素通过抑制产气荚膜梭菌的滑动运动以及生物被膜的形成，进而抗产气荚膜梭菌感染。
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| Apple Flavonoid Phloretin Inhibits Escherichia coli O157:H7 Biofilm Formation and Ameliorates Colon Inflammation in Rats;Jin-Hyung Lee等;《INFECTION AND IMMUNITY》;20111231;第79卷(第12期);4819-4827 * |
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