CN109718227A - 补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮的新用途。本发明发现补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮对艰难梭菌(Clostridium difficile)具有显著抑制活性，可用于制备抗艰难梭菌药物，或者用于制备治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻、结肠炎和/或假膜性结肠炎，包括人和动物的药物。

Description

补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮的新用途。

背景技术

艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)是指由艰难梭菌感染人和动物而导致的一类疾病的统称，其临床症状以不同程度的腹泻为主。艰难梭菌(Clostridium difficile)属于革兰氏阳性芽孢杆菌，专性厌氧，部分菌株可以分泌毒素。该菌广泛存在于人和动物的肠道中，其主要定植场所为结肠，是一种人畜共患的条件致病菌。在过去，艰难梭菌被认为是一种与人类共生的细菌，最早于1935年从新生儿肠道中被分离发现。随着认识的不断深入，艰难梭菌被认为与长期使用抗生素引起的肠道疾病相关，对人类的公共卫生安全产生巨大威胁。据美国疾病预防控制中心估计，2011年全美国约有45.3万人感染艰难梭菌，其中有2.9万人死于与艰难梭菌感染相关的疾病，是报道最为频繁的医院致病菌之一。同时，研究发现在这些CDI患者中，大约有1/4为医院内感染，从而使病人的住院费用增加约4倍，在全美范围内增加了大约15亿美元的医疗支出。在兽医领域，从猪、牛、羊、鸡等主要食品动物以及犬、猫等伴侣动物的体内或粪便样本中均分离到了艰难梭菌，与新生幼畜的腹泻、肠炎等疾病存在紧密的联系。

查尔酮类化合物广泛存在于自然界中，是一类广泛存在于药用植物中的天然有机化合物，其基本骨架结构为1，3-二苯基丙烯酮。由于查尔酮类化合物分子具有较大的柔性，能与不同的受体结合，显示出广泛的生物学活性，如：抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗寄生虫等。补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮是从中药补骨脂中分离得到的查尔酮类化合物。现代研究发现，中药补骨脂具有保肝、免疫调节、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用。

补骨脂查尔酮(Bavachalcone)是蔷薇目豆科中药补骨脂的主要活性成分之一，最早于2005年由Ming Hong Lee等从补骨脂中分离得到。补骨脂查尔酮的CAS号为28488-85-3，分子式为C₂₀H₂₀O₄，分子量为324.4，化学结构式为报道显示，补骨脂查尔酮具有多种生物活性，包括抑制骨细胞分化、抑菌、诱导细胞凋亡和抗癌活性。

异补骨脂查尔酮(Isobavachalcone)又名补骨脂乙素，是由中国台湾学者Tsai WJ等于1996 年从补骨脂种子中分离得到的，并发现其具有抗血小板活性。异补骨脂查尔酮的CAS号为20784-50-3，分子式为C₂₀H₂₀O₄，分子量为324.4，化学结构式为研究报道发现，异补骨脂查尔酮具有抑制白介素-4活性、抑制苹果腐烂病病菌活性、抗病毒及抗癌活性。

尽管对补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮的生物活性进行了广泛研究，但未见补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮抗艰难梭菌活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于根据上述背景技术的现状，提供了一种补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮的新医药用途，以拓宽补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮的应用范围。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明发现补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮对艰难梭菌(Clostridiumdifficile)具有显著抑制活性，可用于制备抗艰难梭菌药物，或者用于制备治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻、结肠炎和/或假膜性结肠炎，包括人和动物的药物。

补骨脂查尔酮作为所述抗艰难梭菌药物或治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻、结肠炎和 /或假膜性结肠炎药物的主要或唯一的药物活性成分。

异补骨脂查尔酮作为所述抗艰难梭菌药物或治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻、结肠炎和/或假膜性结肠炎药物的主要或唯一的药物活性成分。

所述抗艰难梭菌药物或治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻、结肠炎和/或假膜性结肠炎药物还包括药学上可接受的药用辅料。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是不同药物治疗感染产毒艰难梭菌小鼠的存活率。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1补骨脂查尔酮与异补骨脂查尔酮体外抑菌活性试验

1.1实验材料和设备

菌株：艰难梭菌(ATCC43255)，购自美国ATCC公司；艰难梭菌(CICC22951)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

试剂：厌氧液体培养基，北京路桥技术股份有限公司；血平板、琼脂购自广东环凯生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特购自sigma公司；补骨脂查尔酮、异补骨脂查尔酮购自上海源叶生物科技有限公司。

试验仪器：超净工作台，高压灭菌锅，厌氧培养箱，电子分析天平，细胞密度计，移液器，Direct-Q3超纯水系统。

1.2试验方法

1.2.1将补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮用DMSO配成浓度为1mg/mL的药液，用PBS稀释至256μg/mL，待用。

1.2.2用接种环挑取艰难梭菌单菌落，接种到含有约5mL厌氧液体培养基的灭菌试管中，厌氧培养箱中37℃培养18～24h。用细菌密度测试仪测试菌液的浓度，用液体培养基稀释至0.1麦氏浓度标准，再稀释10倍，使菌液的浓度大约为1～2×10⁵CFU/mL，作为菌悬液以备用。

1.2.3最小抑菌浓度(MIC)测定在96孔板中，每孔加入液体培养基100μL，第1 孔加入256μg/mL的药液100μL，吹打混匀后吸出100μL至第2孔中，依次类推。稀释完毕后，在每孔中加入上述浓度为1～2×10⁶CFU/mL菌悬液100μL，吹打混匀，使每孔中药物浓度依次为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03μg/mL。同时设空白对照组、DMSO对照组、阳性药物对照组(甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特).

将96孔板放入厌氧培养箱中，37℃培养18～24h后观察结果，在黑暗背景下肉眼观察混合物清亮，孔底无菌落形成的最低浓度即为化合物的MIC值。上述试验重复2次。

1.2.4琼脂稀释法确认MIC值将补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮按照MIC值附近浓度，稀释到厌氧琼脂培养基中，倒板。加入10μL菌悬液，涂板后置厌氧培养箱中，37℃培养18～24h，目测有无菌落生长，以无菌落生长的最小浓度为MIC值。微量液体稀释法和琼脂稀释法测得的MIC值不同时，以琼脂稀释法为准。

1.2.5最小杀菌浓度(MBC)测定用移液器从1.2.3项下已观察MIC结果的微孔板上吸取培养液，接种于血平板上，37℃厌氧培养48h，观察结果。以无细菌生长的最低浓度为细菌的MBC值。

1.3.试验结果

补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮对艰难梭菌具有显著的体外抑制活性，MIC均为4μg/mL，MBC为8μg/mL。对照药物甲硝唑、万古霉素和硝唑尼特具有显著的体外抑制艰难梭菌活性，但万古霉素对艰难梭菌无杀菌效果。具体结果见表1。

表1补骨脂查尔酮和异补骨脂查尔酮体外抗艰难梭菌活性

实施例2补骨脂查尔酮与异补骨脂查尔酮体内抑菌活性试验

2.1试验材料

6周龄昆明种小鼠，体重(22±2)g，雌雄各半，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。卡那霉素、庆大霉素、粘菌素、头孢哌酮钠，购自sigma公司。

2.2试验方法

将小鼠50只分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为正常组、感染组、补骨脂查尔酮组、异补骨脂查尔酮组、万古霉素组。适应饲养一周后，饮用水中添加卡那霉素0.4 mg/mL、庆大霉素0.035mg/mL、粘菌素850U/mL、甲硝唑0.215mg/mL、万古霉素0.045 mg/mL、头孢哌酮钠0.5mg/mL、蔗糖5％，自由饮水饲养5天。然后饮水换为灭菌水饲喂3天。感染前1天，一次性腹腔注射10mg/kg的克林霉素。

将艰难梭菌ATCC43255接种至液体培养基厌氧培养18h，用生理盐水稀释至菌液浓度约1×10⁵CFU/mL。除正常组外，其余各组每只小鼠灌胃0.5mL菌液，建立艰难梭菌感染小鼠试验模型。感染后，药物组灌服给予50mg/kg的补骨脂查尔酮、异补骨脂查尔酮和万古霉素，正常组和感染组灌服等体积的生理水，每天2次，连续5天。感染后继续饲养7天，期间观察小鼠腹泻、姿态及死亡状况，7天后小鼠全部脱臼处死。

2.3试验结果

小鼠感染产毒艰难梭菌后4天，感染组全部死亡，说明试验模型建立成功。补骨脂查尔酮与异补骨脂查尔酮对感染艰难梭菌的小鼠具有显著的治疗作用，7天存活率为50％，与感染组相比差异显著。但补骨脂查尔酮组与异补骨脂查尔酮组的7天存活率低于对照药物万古霉素(80％)，差异显著，说明其治疗效果较万古霉素低。具体实验结果见图1。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.补骨脂查尔酮的用途，其特征在于：所述补骨脂查尔酮在制备抗艰难梭菌药物中的应用，

所述补骨脂查尔酮的化学结构式：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述补骨脂查尔酮在制备治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻、结肠炎和/或假膜性结肠炎药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述补骨脂查尔酮为主要药物活性成分。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述补骨脂查尔酮为唯一药物活性成分。

5.异补骨脂查尔酮的用途，其特征在于：所述异补骨脂查尔酮在制备抗艰难梭菌药物中的应用，

所述异补骨脂查尔酮的化学结构式：

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述异补骨脂查尔酮在制备治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻、结肠炎和/或假膜性结肠炎药物中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述异补骨脂查尔酮为主要药物活性成分。

8.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述异补骨脂查尔酮为唯一药物活性成分。