CN1838947A - 用于治疗或预防严重急性呼吸道综合征(sars)的甘草皂苷或其衍生物 - Google Patents

用于治疗或预防严重急性呼吸道综合征(sars)的甘草皂苷或其衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染特别是严重急性呼吸道综合征(SARS)的方法。更具体的说，本发明提供了通过施用甘草皂苷和/或其衍生物来预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法。本发明还提供了通过施用甘草皂苷和/或其衍生物并联合甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂来预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法。

Description

用于治疗或预防严重急性呼吸道综合征(SARS) 的甘草皂苷或其衍生物
                      相关申请
本申请要求2003年6月6日提交的美国临时申请号60/476,908的权益，并将其全部公开内容完整收入本文作为参考。
                      1.引言
本发明提供了用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染特别是严重急性呼吸道综合征(SARS)的方法。更具体的说，本发明提供了通过施用甘草皂苷和/或其衍生物来预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法。本发明还提供了通过施用甘草皂苷和/或其衍生物并联合甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂来预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法。
                    2.发明背景
          2.1.严重急性呼吸道综合征(SARS)
在严重急性呼吸道综合征(SARS)患者中发现了一种新的冠状病毒，经鉴定它可能是SARS的病因(SARS；Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.348：1967-76)。SARS是极其可能通过亲密接触传播的传染病。SARS的症状包括发烧(＞38℃)、干咳、呼吸短促或呼吸困难、和指示肺炎的胸部X射线变化。其它症状包括头痛、肌肉僵硬、丧失食欲、不适、精神错乱、皮疹、和腹泻。目前尚无用于预防或治疗SARS相关冠状病毒感染的特效疗法。考虑到SARS相关冠状病毒的传播能力和SARS的致命性，需要用于预防、治疗、和/或改善SARS相关冠状病毒感染的预防性和治疗性疗法。
                    2.2.甘草皂苷
在欧亚甘草(Glycyhrrhizza glabra)中发现的最突出的化合物甘草皂苷是三萜糖苷。欧亚甘草原产于土耳其、伊朗、西班牙、希腊、和中国北部。使用欧亚甘草和甘草皂苷作为食品中的甜味剂和调味剂以及治疗多种健康问题已有数千年历史。
甘草皂苷的结构包括一个三萜部分(甘草亭酸)和两个艾杜糖醛酸残基。用于治疗诸如胃溃疡(甘草皂苷抑制15-羟基-前列腺素脱氢酶和δ-13-前列腺素还原酶)、感冒和其它病毒感染(甘草皂苷可刺激干扰素生成并据报道有化痰/抑制咳嗽的特性)、微生物和寄生虫感染(甘草皂苷可刺激免疫系统)、癌症(可能也涉及免疫系统功能)等疾病已有较长历史。综述参阅Wendell，1998年，U.S.Pharmacist23(4)，“草药：欧亚甘草”Herbal Pharmacy：Licorice。甘草皂苷抑制分解皮甾醇的酶，这延长了天然产生的皮甾醇在体内的作用，导致抗炎效果以及由糖皮质激素引起的钠保持、水保持、和钾流失。
甘草皂苷的其它名称包括甘草酸(Glycyrrhizic acid)、甘草亭酸糖苷、和(3-β，20-β)-20-羧基-11-氧-30-正齐墩果-12-烯-3-基2-O-β-D-葡糖吡喃糖基糖醛基-α-D-葡糖吡喃糖苷糖醛酸。
本申请书第二部分或任何其它部分中对任何参考文献的引用并非承认该文献是本申请的现有技术。
                    3.发明概述
本发明提供了以甘草皂苷为基础的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染)。具体而言，本发明提供了以甘草皂苷为基础的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状。更具体的说，本发明提供了预防和治疗方案，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状，包括对有所需要的受试者施用预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物，以及任选的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂。除了甘草皂苷及其衍生物以外可用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂的实例包括但不局限于抗病毒剂、抗生素、免疫调控剂、抗炎剂、和与病毒抗原(例如SARS相关冠状病毒抗原)免疫特异结合的抗体。
在一个具体实施方案中，本发明提供了用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括对有所需要的受试者(优选人类受试者)施用预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括对有所需要的受试者(优选人类受试者)施用预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物以及预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂。依照这些实施方案，甘草皂苷或其衍生物优选纯化的。
本发明包括用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的组合物。在一个具体实施方案中，组合物包含甘草皂苷或其衍生物。在另一个实施方案中，组合物包含下文通式I的化合物。在另一个实施方案中，组合物包含甘草皂苷或其衍生物以及一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂。在还有一个实施方案中，组合物包含下文通式I的化合物以及一种或多种预防剂或治疗剂。依照这些实施方案，组合物还可包含载体。预防剂或治疗剂的非限制性实例包括免疫调控剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗生素、以及与SARS相关冠状病毒抗原免疫特异性结合的抗体、蛋白质、多肽、或肽。
在一个具体实施方案中，药物组合物包含药用可接受载体、有效量的甘草皂苷或其衍生物、以及任选的有效量的一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂。依照该实施方案，药物组合物优选无菌的，且采取适合待施用方法的形式。
本发明提供了对有所需要的受试者单独施用有效量的甘草皂苷或其衍生物或是与有效量的一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的治疗剂联合施用的流程，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状。本发明联合疗法的疗法(例如预防性或治疗性试剂)可同时或顺序施用于受试者。本发明联合疗法的疗法(例如预防性或治疗性试剂)也可循环施用。循环施用包括施用第一种疗法(例如第一种预防性或治疗性试剂)一段时间，然后施用第二种治疗剂(例如第二种预防性或治疗性试剂)一段时间，并重复此顺序进行施用即循环施用，以减少对某种疗法(例如预防性或治疗性试剂)的抗性，从而避免或减少某种疗法(例如预防性或治疗性试剂)的副作用和/或提高功效。
本发明联合疗法的疗法(例如预防性或治疗性试剂)可同时施用于受试者。术语“同时”并不局限于严格的在同一时间施用疗法(例如预防性或治疗性试剂)，更意味着甘草皂苷或其衍生物和另一种(或多种)疗法以某一顺序且在某一时间间隔内施用于受试者，从而使甘草皂苷或其衍生物可与其它疗法一起发挥作用，以获得高于其它方式施用的效率。例如，各种疗法可以在同一时间或在不同时间点以任何次序顺序施用于受试者，然而，如果不在同一时间施用，它们应在足够近的时间内施用以便达到预期的治疗或预防效果。各种疗法可以以任何合适形式或任何合适途径分开施用于受试者。在多个实施方案中，各种疗法(例如预防性或治疗性试剂)施用于受试者的时间间隔少于15分钟、间隔少于30分钟、间隔少于1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔24小时、间隔48小时、间隔72小时、或间隔1周。在优选实施方案中，在同一次患者就诊时对患者施用两种或多种疗法例如预防性或治疗性试剂)。
联合疗法的预防性或治疗性试剂可以在同一药用组合物中施用于受试者。或者，联合疗法的预防性或治疗性试剂可以在分开的药用组合物中同时施用于受试者。预防性或治疗性试剂可以以相同或不同的施用路径施用于受试者。
可以以本领域技术人员众所周知的任何施用方法施用本发明的预防剂或治疗剂(例如甘草皂苷或其衍生物)、组合物、或联合疗法，包括但不限于肠胃外施用(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、和皮下施用)、硬膜外施用、局部施用、肺部施用、和粘膜施用(例如鼻内和口服路径)。在一个具体实施方案中，将预防性或治疗性试剂或是药用组合物皮下、肌肉内、局部、或静脉内施用于受试者。在一个优选实施方案中，口服、鼻内、或通过肺部施用将预防性或治疗性试剂或是药用组合物施用于受试者。预防性或治疗性试剂或是药用组合物可以全身或局部施用。
在一个实施方案中，本发明的预防性或治疗性试剂(例如甘草皂苷或其衍生物)、组合物、或是联合疗法可以局部施用于受试者有待治疗的区域，这可以通过例如但不限于局部输液、注射、或植入的手段来实现，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝胶材料，包括诸如硅胶膜等膜或纤维。在另一个实施方案中，在介质中将本发明的预防性或治疗性试剂(例如甘草皂苷或其衍生物)、组合物、或联合疗法投递至受试者。在另一个实施方案中，在受控释放或缓释系统中将本发明的预防性或治疗性试剂(例如甘草皂苷或其衍生物)、组合物、或联合疗法投递至受试者。
本发明提供了抑制或减少病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的方法，所述方法包括用甘草皂苷或其衍生物接触细胞。本发明还提供了抑制或破坏病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)一个或多个阶段的方法。所述病毒感染阶段包括但不局限于进入细胞、病毒复制、病毒基因产物的表达、病毒颗粒的产生、以及病毒颗粒的释放。
本发明还提供了抑制或破坏病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)复制的方法，所述方法包括使细胞接触甘草皂苷或其衍生物。本发明还提供了抑制或破坏病毒颗粒(例如冠状病毒颗粒、丙型肝炎病毒颗粒、流感病毒颗粒、和西尼罗河病毒颗粒，优选SARS相关冠状病毒颗粒)产生和/或释放的方法，所述方法包括使细胞接触甘草皂苷或其衍生物。
在一个具体实施方案中，相对于诸如PBS等对照而言，在本文所述或本领域技术人员众所周知的体外和/或体内测定法中，甘草皂苷或其衍生物将病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)抑制或破坏了至少25％、优选至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％。在另一个实施方案中，相对于诸如PBS等对照而言，在本文所述或本领域技术人员众所周知的体外和/或体内测定法中，甘草皂苷或其衍生物将病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)复制抑制或破坏了至少25％、优选至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％。在另一个实施方案中，相对于诸如PBS等对照而言，在本文所述或本领域技术人员众所周知的体外和/或体内测定法中，甘草皂苷或其衍生物将病毒颗粒(例如冠状病毒颗粒、丙型肝炎病毒颗粒、流感病毒颗粒、和西尼罗河病毒颗粒，优选SARS相关冠状病毒颗粒)产生和/或释放抑制或破坏了至少25％、优选至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％。
本发明还提供了在容器中装有预防性或治疗性试剂(例如甘草皂苷或其衍生物)以及任选在同一容器或不同容器中装有甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂的商品，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状。所述商品还可包括说明书。
在某些实施方案中，本发明提供了通式I的甘草皂苷衍生物：
Figure A20048001903100151
或其药用可接受盐，其中R1、R2、和R3是N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R4不是噻唑、尿嘧啶或
Figure A20048001903100161
在某些实施方案中，本发明提供了通式I的化合物：
Figure A20048001903100162
或其药用可接受盐，其中R1和R2中的一个是：
且R3及R1和R2中的另一个是独立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、氨基酸、肽、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
在某些实施方案中，本发明提供了通式I的甘草皂苷衍生物：
或其药用可接受盐，其中R1、R2、和R3中的一个是氨基酸或肽，而R1、R2、和R3中的另两个是独立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
在某些实施方案中，本发明提供了通式I的甘草皂苷衍生物：
Figure A20048001903100181
或其药用可接受盐，其中R1、R2和R3是：
在某些实施方案中，本发明提供了通式I的甘草皂苷衍生物：
Figure A20048001903100191
或其药用可接受盐，其中R1、R2、和R3是独立的5，6或7元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R1、R2和R3不全是脯氨酸。
通式I的甘草皂苷衍生物可用于治疗或预防病毒感染，例如诸如SARS相关冠状病毒等冠状病毒的感染。
                  3.1.术语和缩写
附加的：在用于本文时，术语“附加的”和“联合的”可与“结合的”或“组合的”可互换使用。
抗体：在用于本文时，术语“抗体”指单克隆抗体、多特异性抗体、人源抗体、人源化抗体、camelised抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab)片段、二硫键连接Fv(sdFv)、和抗独特型(抗Id)抗体以及任何上述分子的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含抗原结合位点的分子。
免疫球蛋白分子可以是任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、和IgY)、类型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAI、和IgA2)或亚型。
抗病毒化合物：在用于本文时，术语“抗病毒化合物”和“抗病毒剂”可互换使用。
有效量：在用于本文时，术语“有效量”指足以降低或减轻病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的严重程度和/或持续时间，预防病毒(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)感染发展，预防与病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)有关的一种或多种症状的复发、发展、或发作，预防或减少病毒(例如，冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)的复制或增殖，预防或减少病毒颗粒(例如，冠状病毒颗粒、丙型肝炎病毒颗粒、流感病毒颗粒、和西尼罗河病毒颗粒，优选SARS相关冠状病毒颗粒)的产生和/或释放，或是增强或改进另一种疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果。在一个具体实施方案中，有效量的治疗剂或预防剂将病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)生活周期中以下步骤中的一步或多步：病毒颗粒停靠在细胞上，病毒的遗传信息引入细胞，病毒蛋白质的表达，新病毒颗粒的产生、以及病毒颗粒从细胞中释放减少了至少5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在另一具体实施方案中，有效量的治疗剂或预防剂使病毒的复制、增殖、或传播减少了至少5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。下文描述了甘草皂苷有效量的非限制性实例。
老年人：在用于本文时，术语“老年人”指65岁或65岁以上的人，优选70岁或更老的人。
孩子：在用于本文时，术语“孩子”指年龄在24个月至18岁之间的人。
婴儿：在用于本文时，术语“婴儿”指小于24个月的人，优选小于16个月、小于6个月、小于3个月、小于2个月、或小于1个月。
核酸序列的同一性：为了测定两个核酸序列的同一性百分率，将这些序列进行比对以达到最理想的比较效果(例如，可以在第一种氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以便与第二种氨基酸序列或核酸序列进行最理想的序列比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的核苷酸。当第一个序列中的某个位点被与第二个序列中相应位置处核苷酸相同的核苷酸所占据时，则认为这两个分子在该位置是同样的。两个序列之间的同一性百分率是这两个序列之间共有的相同位点数目的函数(即％同一性＝相同重叠位点数目/位点总数×100％)。在一个实施方案中，两个序列的长度是相同的。
两个序列之间同一性百分率的测定也可利用数学运算法则完成。用于比较两个序列的数学运算法则的优选非限制性实例是Karlin和Altschul运算法则，1990年，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264-2268，Karlin和Altschul对其进行了修改，1993年，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5877。将所述运算法则掺入Altschul等，1990年，J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST核苷酸程序参数设置来进行BLAST核苷酸搜索，例如得分＝100，词长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。为了获得有缺口的比对以进行比较，可以采用Altschul等，1997年，NucleicAcids Res.25：3389-3402中描述的带缺口BLAST。或者，可以采用PSI-BLAST进行重复搜寻以探测分子间较远的相互关系。在采用BLAST、带缺口BLAST、和PSI-Blast程序时，可以采用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参阅例如NCBI网址)。用于序列比较的数学运算法则的另一个优选非限制性实例是Myers和Miller的运算法则，1988年，CABIOS 4：11-17。该运算法掺入了ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG序列比对软件包的一部分。在采用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表、缺口长度补偿12、和缺口补偿4。
与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)免疫特异结合：在用于本文时，术语“与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)免疫特异结合”和类似术语指与病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)特异结合且与其它多肽不特异结合的肽、多肽、蛋白质、融合蛋白、和抗体或其片段。根据例如免疫测定法、BIAcore、或本领域知道的其它测定法的测定，与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)免疫特异结合的肽、多肽、蛋白质、或抗体可能以低亲和力与其它肽、多肽、或蛋白质结合。与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)免疫特异结合的抗体或片段可能与相关抗原有交叉反应性。优选的是，与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)免疫特异结合的抗体或片段不与其它抗原发生交叉反应。可以通过例如免疫测定法、BIAcore、或本领域技术人员知道的其它技术来鉴定与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)免疫特异结合的抗体或片段。若根据使用诸如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等实验技术的测定，在抗体或其片段以高于任何反应性抗原的亲和力与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)结合，则它与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原)特异结合。关于抗体特异性的讨论参阅例如Paul编，1989年，《基础免疫学》Fundamental Immunology，第2版，Raven出版社，纽约，第332-336页。
联合：在用于本文时，术语“联合”指使用超过一种疗法(例如超过一种预防剂和/或治疗剂)。术语“联合”的使用并不约束对携带病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)的受试者施加各种疗法(例如预防性和/或治疗性试剂)的顺序。可以在对携带病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)的受试者施用第二种疗法(例如第二种预防性或治疗性试剂)之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同时、或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)施用第一种疗法。
感染：在用于本文时，术语“感染”包括细胞或身体组织中病毒的入侵和/或繁殖，以及由病毒入侵和繁殖导致的病理状态。病毒生活周期中的入侵和繁殖步骤包括但不限于下列步骤：病毒颗粒停靠在细胞上，病毒的遗传信息进入细胞，病毒蛋白质的表达，新病毒颗粒的产生，以及由细胞释放病毒颗粒。
处理：在用于本文时，术语“处理”指受试者由某种疗法(例如预防性或治疗性试剂)获得的有益效果，但它不导致病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的治愈。在某些实施方案中，对受试者施用一种或多种疗法(例如一种或多种预防性或治疗性试剂)以“处理”疾病，从而预防病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的发展或恶化。
非响应性的：在用于本文时，术语“非响应性的”和“难治的”描述用目前可用的疗法(例如预防性或治疗性试剂)治疗患者的病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)在临床上不足以减轻与感染有关的一种或多种症状。通常，这些患者患有严重的、持久活性感染，而且需要额外疗法来改善与感染有关的症状。
预防：在用于本文时，术语“预防”指通过施用疗法(例如预防性或治疗性试剂)或施用联合疗法(例如预防性或治疗性试剂的组合)实现的对受试者中病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的一种或多种症状复发、发作或发展的预防。
预防剂：在用于本文时，术语“预防剂”指可用于预防病毒感染的任何试剂。在某些实施方案中，术语“预防剂”指甘草皂苷或其衍生物。在另一些实施方案中，术语“预防剂”不指甘草皂苷或其衍生物。
预防有效量：在用于本文时，术语“预防有效量”指足以导致对病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)发展、复发、或发作或其一种或多种症状的预防或者导致另一种疗法(例如预防剂)的预防效果增强或改进的疗法(例如预防剂，诸如甘草皂苷或其衍生物)数量。在一个具体实施方案中，预防剂的预防有效量将病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)生活周期的一个或多个下列步骤：病毒颗粒停靠在细胞上，病毒的遗传信息进入细胞，病毒蛋白质的表达，新病毒颗粒的产生，以及由细胞释放病毒颗粒，减少了至少5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在另一个具体实施方案中，预防剂的预防有效量将病毒的复制、繁殖、或传播减少了至少5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。下文描述了甘草皂苷预防有效量的非限制性实例。
纯化的：在用于本文时，术语“纯化的”指预防性或治疗性试剂(例如甘草皂苷或其衍生物)基本上不含不同的预防性或治疗性试剂。优选的是，预防性或治疗性试剂至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％不含第二种、不同的预防性或治疗性试剂。在一个优选实施方案中，甘草皂苷或其衍生物是纯化的。
预防方案：在用于本文时，“预防方案”指施用一种或多种预防剂的剂量和时间的摄生法。
方案：在用于本文时，“方案”包括剂量日程和剂量摄生法。此处的方案是使用方法，而且包括预防性和治疗性方案。
呼吸道：在用于本文时，术语“呼吸道”指通向肺泡的所有器官和身体开口区域(例如鼻、口、眼(包括泪管)、和耳)。
副作用：在用于本文时，术语“副作用”涵盖预防性或治疗性试剂的不希望的和不利的作用。不利的作用总是不希望的，而不希望的作用并非必定是不利的。来自预防性或治疗性试剂的不利作用可能是有害的、或不舒服的、或危险的。
受试者：在用于本文时，术语“受试者”和“患者”可互换使用。在用于本文时，术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，包括非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠、和小鼠)和灵长类(例如猴，诸如猕猴、黑猩猩、和人类)，更优选人类。在一个实施方案中，受试者是患有SARS相关冠状病毒感染的哺乳动物，优选人类。在另一个实施方案中，受试者是患有SARS相关冠状病毒感染的家畜(例如马、猪、或牛)或宠物(例如狗或猫)。在另一个实施方案中，受试者是有风险发生SARS相关冠状病毒感染的哺乳动物，优选人类。在另一个实施方案中，受试者是人类婴幼儿。在另一个实施方案中，受试者是人类儿童或成年人。在另一个实施方案中，受试者是公共机构或教养院诸如但不限于疗养院中的人。在还有一个实施方案中，受试者对目前用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的疗法是难治的或非响应性的。
协同的：在用于本文时，术语“协同的”指甘草皂苷或其衍生物与另一种疗法(例如预防性或治疗性试剂)的联合，它比任何两种或多种单一疗法(例如一种或多种预防性或治疗性试剂)的加和效果更加有效。联合疗法(例如预防性或治疗性试剂联合)的协同作用允许对患有病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的受试者使用较低剂量的一种或多种疗法(例如一种或多种预防性或治疗性试剂)和/或较低频率的施用所述疗法。采用较低剂量疗法(例如预防性或治疗性试剂)和/或较低频率施用所述疗法的能力降低了与对受试者施用所述疗法有关的毒性而不降低所述疗法对预防或治疗病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的功效。另外，协同作用可以导致疗法(例如预防性或治疗性试剂)在预防或治疗病毒感染(例如，冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)中的功效得以改进。最后，联合疗法(例如预防性或治疗性试剂)的协同作用可以避免或减少与使用单一疗法有关的不利或不希望的副作用。
治疗剂：在用于本文时，术语“治疗剂”和“治疗性试剂”指可以用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染的一种或多种症状的任何试剂。在某些实施方案中，术语“治疗剂”指甘草皂苷或其衍生物。在其它实施方案中，术语“治疗剂”不指甘草皂苷或其衍生物。
治疗有效量：在用于本文时，术语“治疗有效量”指该数量的治疗剂足以降低病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的严重程度、缩短病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的持续时间、改善SARS相关冠状病毒感染的一种或多种症状、预防病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的发展、引起病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的衰退、或者增强或改进另一种治疗剂的治疗效果。对于病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的治疗，治疗有效量指治疗剂的数量足以减少或抑制病毒的复制、抑制或减少病毒感染细胞、抑制或减少病毒颗粒的产生、抑制或减少病毒颗粒的释放、抑制或减少病毒传播至其它组织或受试者、或者改善与感染有关的一种或多种症状。在一个具体实施方案中，治疗有效量的治疗剂将病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)生活周期中以下步骤中的一步或多步：病毒颗粒停靠在细胞上，病毒的遗传信息引入细胞，病毒蛋白质的表达，新病毒颗粒的产生、以及病毒颗粒从细胞中释放减少了至少5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在另一个具体实施方案中，治疗有效量的治疗剂使病毒的复制、增殖、或传播减少了至少5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。下文描述了甘草皂苷治疗有效量的非限制性实例。
治疗方案：在用于本文时，术语“治疗方案”指施用一种或多种治疗剂的剂量和时间的摄生法。
疗法：在用于本文时，术语“疗法”指可用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的任何方案、方法、和/或试剂。在某些实施方案中，术语“疗法”指熟练医学从业人员知道的可用于治疗、处理、预防、或改善呼吸状况或其一种或多种症状的抗病毒疗法、抗生素疗法、生物学疗法、支持疗法、和/或其它疗法。
治疗：在用于本文时，术语“治疗”指由于施用一种或多种疗法(包括但不限于施用一种或多种预防性或治疗性试剂)引起的病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)进行程度、严重程度、和/或持续时间的降低或改善或其一种或多种症状的改善。在具体实施方案中，该术语指减少或抑制病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)复制、抑制或减少病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)传播至其它组织或受试者、抑制或减少病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)感染细胞、或者改善与病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)有关的一种或多种症状。
在用于本文时，“5至7元杂环”指5至7个成员的碳原子和1至3个选自氧、氮、和硫的杂原子的芳族或非芳族环。5至7元杂环的实例包括但不限于四氢呋喃基、二氧戊环基、吡咯烷基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮、和2，3-二氢-2-硫氧嘧啶-4(1H)-酮。
在用于本文时，术语“氨基酸”指任何天然存在氨基酸和非天然存在氨基酸，诸如D-氨基酸。氨基酸可以是用保护基团取代的。适于氨基的保护基团包括乙酰基、叔丁氧基-C(O)-、苄氧基-C(O)-、诸如此类。适于羟基的保护基团包括苄基等。适于羧基模块的保护基团包括苄基、叔丁基、诸如此类。其它合适的保护基团对于本领域普通技术人员而言是众所周知的，而且包括那些在T.W.Greene，《有机合成中的保护基团》Protecting Groups in Organic Synthesis，JohnWiley & Sons公司，1981年中找到的。
在用于本文时，术语“肽”指两个至六个氨基酸的序列。在某些实施方案中，肽指长度为两个、三个、四个、五个、或六个氨基酸。
在说本文所述基团是“取代或未取代的”时，若取代，则它们可以用不会对化合物的期望活性产生不利影响的任何期望取代基取代。优选取代基的实例是那些在本文所公开的例示性化合物和实施方案中找到的取代基，以及卤素(氯、碘、溴、或氟)；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；羟基；C1-6烷氧基；氨基；硝基；巯基；硫醚；亚胺；氰；氨基(amido)；膦酸基；磷化氢；羧基；硫代羰基；磺酰基；磺酰胺；酮；醛；酯；氧(＝O)；卤代烷基(例如，三氟甲基)；碳环环烷基，可以是单环或者稠合的或非稠合的多环(例如，环丙基、环丁基、环戊基、或环己基)、或杂环烷基，可以是单环或者稠合的或非稠合的多环(例如，吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、或噻嗪基)；碳环或杂环、单环或者融合或非融合的多环芳基(例如，苯基、萘基、吡咯基、吲哚基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、吖啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、苯甲酰亚胺基、苯并硫苯基、或苯并呋喃基)；苄氧基；(伯、仲、或叔)氨基；-N(CH3)2；O-低级烷基；O-芳基、芳基；芳基-低级烷基；CO2CH3；-OCH2CH3；甲氧基；CONH2；OCH2CONH2；NH2；SO2NH2；OCHF2；CF3；OCF3；而且这些模块也可以任选用稠合环结构或桥例如-OCH2O-取代。
这些取代基可以任选用选自这些基团的取代基进一步取代。
应当注意，若所示结构与给该结构指定的名称之间存在矛盾，则以所示结构为准。另外，如果结构或结构的一部分的立体化学未以例如粗线或虚线指示，那么解释为结构或结构的一部分涵盖它的所有立体异构体。
                   4.附图简述
图1。甘草皂苷在Vero细胞中对SARS相关冠状病毒复制的影响。细胞在感染后72小时用60份甲醇和40份丙酮固定。通过过氧化物酶染色检测来自SARS患者的血清中的病毒。(A)伪受感染细胞；(B)未处理的受感染细胞；(C)用4,000mg/L甘草皂苷处理的受感染细胞；(D)用1,000mg/L甘草皂苷处理的受感染细胞。
图2。甘草皂苷和利巴韦林在Vero细胞中对SARS相关冠状病毒复制的影响。(A)未处理的受感染细胞；(B)用50mg/L利巴韦林处理的受感染细胞；(C)用100mg/L甘草皂苷处理的受感染细胞；和(D)用50mg/L利巴韦林和100mg/L甘草皂苷处理的受感染细胞。
                    5.发明详述
本发明提供了以甘草皂苷为基础的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状。具体而言，本发明提供了用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的预防和治疗方案，包括对有所需要的受试者施用预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物，以及任选的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂。
本发明提供了用于抑制或减少病毒感染(例如如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的方法，所述方法包括使细胞接触甘草皂苷或其衍生物。本发明还提供了用于抑制或减少病毒(例如冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒，优选SARS相关冠状病毒)复制的方法，所述方法包括使细胞接触甘草皂苷或其衍生物。本发明还提供了抑制或减少病毒颗粒(例如冠状病毒颗粒、丙型肝炎病毒颗粒、流感病毒颗粒、和西尼罗河病毒颗粒，优选SARS相关冠状病毒颗粒)产生和/或释放的方法，所述方法包括使细胞接触甘草皂苷或其衍生物。
本发明提供了包含甘草皂苷或其衍生物的药用组合物和商品，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状。本发明还提供了包含甘草皂苷或其衍生物以及一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂的药用组合物和商品，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状。
              5.1.甘草皂苷及其衍生物
本发明涉及使用具有下文所示结构的甘草皂苷(“化合物1”)。
化合物1
Figure A20048001903100321
甘草皂苷的衍生物包括这样的任何化合物或其药用可接受盐、游离碱、溶剂化物、水化物、立体异构体、包合物、或前药，其中甘草皂苷的一个或多个羧酸基或羟基得到修饰(即进行过合成转化)。在一个实施方案中，甘草皂苷的衍生物是这样的化合物或其药用可接受盐、游离碱、溶剂化物、水化物、立体异构体、包合物、或前药，其中甘草皂苷的一个、两个、或三个羧酸基得到修饰。在另一个实施方案中，甘草皂苷的衍生物是通式I的化合物，包括它的其它实施方案或其药用可接受盐、游离碱、溶剂化物、水化物、立体异构体、包合物、或前药。在另一个实施方案中，甘草皂苷的衍生物包括化合物2-8或其药用可接受盐、游离碱、溶剂化物、水化物、立体异构体、包合物、或前药。
在某些实施方案中，甘草皂苷或其衍生物是纯化的以用于本发明的方法。
在一个具体实施方案中，甘草皂苷的衍生物是18β-甘草亭酸。不受理论限制，18β-甘草亭酸是由肠中葡萄糖苷酸酶催化化合物I水解的产物。在另一个实施方案中，甘草皂苷的衍生物是硫酸甘草皂苷。
甘草皂苷或其衍生物可以是其药用可接受盐、游离碱、溶剂化物、水化物、立体异构体、包合物、或前药的形式。
在某些实施方案中，甘草皂苷的衍生物是甘草皂苷的药用可接受盐。甘草皂苷的药用可接受盐可以通过标准方法获得。例如，将酸和甘草皂苷溶于两种反应物(即甘草皂苷的自由基和各种酸)在其中充分可溶的溶剂系统。在一种方法中，为了实现结晶或沉淀，使用产生的盐在其中只是略微可溶或完全不溶的溶剂或溶剂混合物。或者，可以使用期望的盐在其中非常可溶的溶剂，然后向溶液中添加抗溶剂(或产生的盐在其中溶解欠佳的溶剂)。盐形成或结晶的其它变量包括浓缩盐溶液(例如如果需要通过在减压下加热，或者通过缓慢蒸发溶剂，例如在室温)，或播种以添加种子晶体，或建立形成水合物所需要的水活度。
在用于本文时，术语“药用可接受盐”指由药用可接受无毒酸或碱制备的盐，包括无机酸和碱以及有机酸和碱。适于本发明化合物的的药用可接受碱加成盐包括但不限于由铝、钙、锂、镁、钾、钠、和锌制成的金属盐或由赖氨酸、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)、和葡鲁卡因制成的有机盐。合适的无毒酸包括但不限于无机和有机酸，诸如乙酸、褐藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、樟脑磺酸、乙烯磺酸、反丁烯二酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、氢氯酸、羟乙磺酸、乳酸、顺丁烯二酸、羟基丁二酸、苯基乙醇酸、甲基磺酸、粘酸、硝酸、pamoic、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、硫酸、酒石酸、和对甲苯磺酸。特效的无毒酸包括氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲基磺酸、和丁酸。特效盐的其它实例包括氢氯化物和mesylate盐。其它盐在本领域是众所周知的，参阅例如《雷明顿氏制药科学》Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Publishing，伊斯顿，宾夕法尼亚，1990年；或《雷明顿：制药科学和实践》Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第19版，Mack Publishing，伊斯顿，宾夕法尼亚，1995年。
甘草皂苷的药用可接受盐还包括但不限于甘草皂苷的单或二铵盐、甘草皂苷的单或二钠盐、甘草皂苷的单或二钾盐。
在某些实施方案中，甘草皂苷的衍生物是甘草皂苷或甘草皂苷衍生物的外消旋物和/或对映体。
在某些实施方案中，可以以多形体的形式使用甘草皂苷或其衍生物。在用于本文时，除非另有说明，术语“多晶型物”意味着甘草皂苷或其衍生物的特定晶体排列。可以通过使用不同的工作条件和/或溶剂来获得晶型物。具体而言，可以通过甘草皂苷或其衍生物在特定溶剂中的再结晶来制备多晶型物。
在用于本文时，除非另有说明，术语“前药”指在生物学条件下(在体外或在体内)能够进行水解、氧化、或其它反应以提供活性化合物，具体说就是甘草皂苷或其衍生物的甘草皂苷衍生物。前药的实例包括但不限于包含生物可水解模块的甘草皂苷的衍生物和代谢物或其衍生物，诸如生物可水解酰胺、生物可水解酯、生物可水解氨基甲酸酯、生物可水解碳酸盐、生物可水解酰脲、和生物可水解磷酸盐类似物。优选的是，甘草皂苷或其衍生物的前药基团是羧酸的低级烷基酯。可以方便的通过分子上存在的任何羧酸模块的酯化来形成羧酸酯。通常可以使用众所周知的方法制备前药，诸如《Burger氏医学化学和药物发现》Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第6版(Donald J.Abraham编，2001年，Wiley)和《前药的设计和应用》Design and Application of Prodrugs(H.Bundgaard编，1985年，Harwood Academic Publishers GmfH)中所述。
在某些实施方案中，甘草皂苷或其衍生物是光学纯的。在用于本文时，除非另有说明，术语“光学纯的”或“立体异构体纯的”意味着化合物的一种立体异构体基本上不含化合物的其它立体异构体。例如，立体异构体纯的具有一个手性中心的化合物将基本上不含化合物的相对对映体。立体异构体纯的具有两个手性中心的化合物将基本上不含化合物的其它非对映体。典型的立体异构体纯的化合物含有超过大约80％(以质量计)的化合物的一种立体异构体和低于大约20％(以质量计)的化合物的其它立体异构体，更优选超过大约90％(以质量计)的化合物的一种立体异构体和低于大约10％(以质量计)的化合物的其它立体异构体，甚至更优选超过大约95％(以质量计)的化合物的一种立体异构体和低于大约5％(以质量计)的化合物的其它立体异构体，且最优选超过大约97％(以质量计)的化合物的一种立体异构体和低于大约3％(以质量计)的化合物的其它立体异构体。
在某些实施方案中，为了获得甘草皂苷的衍生物，可以将化合物I的至少一个-COOH基团修饰成酯，例如但不限于甲酯、乙酯、正丙酯、异丙酯。
在某些实施方案中，为了获得甘草皂苷的衍生物，化合物I三萜部分的至少一个六元环含有一个或多个杂原子。杂原子可以是但不限于N、O、或P。在某些实施方案中，A环、B环、C环、D环、或E环是杂环。在某些实施方案中，三萜部分中至少两个、至少三个、至少四个、或所有五个六元环是杂环。
在某些实施方案中，为了获得甘草皂苷的衍生物，将额外双键引入三萜部分的环系统。在某些实施方案中，三萜部分的环系统是芳香族的。
在某些实施方案中，为了获得甘草皂苷的衍生物，可以将化合物I的一个或多个-OH基修饰成酰化的。
在某些实施方案中，为了获得甘草皂苷的衍生物，化合物I中的至少一个氧用硫替换。
在某些实施方案中，甘草皂苷的药用可接受盐是甘草皂苷的单铵盐：
在某些实施方案中，甘草皂苷衍生物是通式I的化合物：
Figure A20048001903100371
其中R1、R2、和R3是独立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、氨基酸、肽、或-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。在通式I的另一个实施方案中，R1、R2、和R3是独立的-OH、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-甘氨酸-亮氨酸、或-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是-N(H)R4，其中每次出现的R4是独立的5，6或7元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R4不是噻唑、尿嘧啶或
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是-N(H)R4，其中每次出现的R4是独立的5元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R4不是噻唑。
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是-N(H)R4，其中每次出现的R4是独立的6元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R4不是尿嘧啶或
Figure A20048001903100382
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1和R2中的一个是：
且R3及R1和R2中的另一个是独立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、氨基酸、肽、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。在还有一个实施方案中，R3及R1和R2中的另一个是独立的-OH、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-甘氨酸-亮氨酸、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3中的一个是氨基酸或肽，而R1、R2、和R3中的另两个是独立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。在还有一个实施方案中，R1、R2、和R3中的另两个是独立的-OH、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3中的一个是-甘氨酸-亮氨酸，而R1、R2、和R3中的另两个是独立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。在还有一个实施方案中，R1、R2、和R3中的另两个是独立的-OH、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3中的两个是-甘氨酸-亮氨酸，而R1、R2、和R3中的另一个是-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。在还有一个实施方案中，R1、R2、和R3中的另一个是-OH、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是：
在另一个实施方案中，本发明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是独立的5，6或7元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R1、R2、和R3不全是脯氨酸。
在某些更加具体的实施方案中，本发明提供了具有如下结构的甘草皂苷衍生物或其药用可接受盐：
化合物2：R1、R2、和R3各自是
化合物3：R3是-OH；且R1和R2各自是-甘氨酸-亮氨酸。
化合物4：R3是
Figure A20048001903100402
且R1和R2各自是OH；
化合物5：R3是OH，且R1和R2各自是
化合物6：R1、R2、和R3各自是：
化合物7：
Figure A20048001903100411
化合物8：
Figure A20048001903100421
在某些实施方案中，本发明的甘草皂苷衍生物的EC50低于3,000mg/L、低于1,500mg/L、低于500mg/L、低于250mg/L、低于100mg/L、低于50mg/L、低于10mg/L、或低于1mg/L。EC50可以如下文6.1节所述测定。
在某些实施方案中，可用于本发明方法的甘草皂苷衍生物的EC50低于3,000mg/L、低于1,500mg/L、低于500mg/L、低于250mg/L、低于100mg/L、低于50mg/L、低于10mg/L、或低于1mg/L。EC50可以如下文6.1节所述测定。
5.1.1甘草皂苷衍生物的合成
甘草皂苷衍生物可以通过标准的、众所周知的合成方法学获得，参阅例如March，J.，《高级有机化学：反应，机制，和结构》AdvancedOrganic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，第4版，1992年。可用于制备本发明化合物及其中间物的起始材料可以通过商业途径获得，或者可以使用已知的合成方法和试剂由商品化材料制备得到。
用于合成甘草皂苷衍生物的例示性方法描述于Baltina，2003年，Current Medicinal Chemistry 10(2)：155-171，将其完整收入本文作为参考。
               5.2.可用于与甘草皂苷联合的试剂
可用于与甘草皂苷或其衍生物联合以预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)的治疗性或预防性试剂包括但不限于小分子、合成药物、肽(包括环肽)、多肽、蛋白质、磺酸(例如DNA和RNA核苷酸，包括但不限于反义核苷酸序列、三链螺旋、RNAi、和编码生物学活性蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、合成或天然的无机分子、模仿试剂、和合成或天然的有机分子。这些试剂的具体实例包括但不限于免疫调控剂(例如干扰素)、抗炎剂(例如肾上腺类皮质激素、皮质类固醇(例如氯地米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、曲安西龙、甲泼尼龙、波尼松龙、波尼松、氢化可的松)、糖皮质激素类、类固醇、和非类固醇抗炎药物(例如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、和COX-2抑制剂)、镇痛剂、白三烯拮抗剂(例如孟鲁司特、甲基黄嘌呤、扎鲁司特、和奇留通)、β2-激动剂(例如沙丁胺醇、biterol、非诺特罗、isoetharie、metaproterenol、吡布特罗、沙丁胺醇、特布他林、福莫特罗、沙美特罗、和沙丁胺醇特布他林)、抗胆碱能试剂(例如异丙托溴胺和氧托溴铵)、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、氨苯砜、抗组胺剂、抗疟剂(例如羟氯喹)、抗病毒剂(例如核苷类似物(例如奇多夫定、阿昔洛韦、甘昔洛韦(gangcyclovir)、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、和利巴韦林)、膦甲酸、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、印地那韦、利托那韦、和AZT)、以及抗生素(例如更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、红霉素、青霉素、光辉霉素、和氨曲霉素(AMC))。
在一个具体实施方案中，一种或多种下列试剂或是下列试剂组合可用于与甘草皂苷或其衍生物联合以预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染)或其症状：金刚烷胺、利巴韦林、金刚乙胺、阿昔洛韦、泛昔洛韦、膦甲酸、更昔洛韦、三氟尿苷、阿糖腺苷、地达诺新、司他夫定、扎西他宾、奇多夫定、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β、和/或干扰素-γ)、和抗生素、免疫调控剂、和与病毒抗原(例如冠状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼罗河病毒抗原，优选SARS相关冠状病毒抗原；诸如例如非结构蛋白、血凝素-酯酶糖蛋白、刺突糖蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白、和核蛋白)免疫特异结合的抗体或其片段(例如人源的、嵌和的、人源化的、camelized抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、sFv、Fab片段、和F(ab′)片段)。
已知有用或曾经使用或目前用于预防、处理、治疗、或改善病毒感染或呼吸状况特别是病毒呼吸状况或其一种或多种症状的任何疗法可以依照本文所述发明用于与甘草皂苷或其衍生物联合。关于曾经或目前用于预防、治疗、处理、或改善呼吸状况或其一种或多种症状的疗法(例如预防性或治疗性试剂)的信息参阅例如Gilman等，《Goodman和Gilman：治疗学的药理学基础》Goodman and Gilman′s：ThePharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill，纽约，2001年；《诊断和治疗的Merck指南》The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，Berkow，M.D.等编，第17版，Merck Sharp& Dohme Research Laboratories，罗韦，新泽西，1999年；《Cecil医学课本》Cecil Textbook of Medicine，第20版，Bennett和Plum编，W.B.Saunders，费城，1996年。
为了测试甘草皂苷或其衍生物与第二种化合物之间针对SARS相关冠状病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、或西尼罗河病毒的协同作用，可以使用针对各种病毒的任何细胞培养系统和/或动物模型系统(见5.6节和6.1节)。对照包括未处理的细胞/动物，而且可以包括用单个化合物处理的细胞/动物。
                    5.3.目标感染
本发明提供了基于甘草皂苷的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染，经鉴定该病毒是严重急性呼吸道综合征的病原体。具体而言，本发明还提供了基于甘草皂苷的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染。在一个具体实施方案中，基于甘草皂苷的疗法用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染，所述病毒具有表1中病毒株的核酸序列。在一个具体实施方案中，基于甘草皂苷的疗法用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒的感染，所述病毒在核酸水平与表1中参考的SARS相关冠状病毒一个隔离群的核酸序列50-65％、优选65-80％、更优选75-85％、且最优选85-99％相同。在另一个实施方案中，基于甘草皂苷的疗法用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒的感染，所述病毒在核酸水平与Drosten等，2003年，N Engl J Med 348：1967-1976中所述牛冠状病毒50-65％、优选65-80％相同。
在某些实施方案中，基于甘草皂苷的疗法用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染，其基因组或其片段在高严谨条件下与Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.348：1967-1976中描述的牛冠状病毒的基因组或其片段发生杂交。作为例示而非限制，使用这些高严谨条件的流程如下：含DNA滤膜的杂交在由6X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲科尔、0.02％BSA、和500pg/ml变性鲑鱼精DNA组成的缓冲液中于65℃进行8小时至过夜。将滤膜在含有100μg/ml变性鲑鱼精DNA和5-20×106cpm 32P标记探针的预杂交混合液中于65℃杂交48小时。滤膜的清洗在含有2X SSC、0.01％PVP、0.01％菲科尔、和0.01％BSA的溶液中于37℃进行1小时。随后在放射自显影前在0.1X SSC中于50℃清洗45分钟。可以使用的其它高严谨条件在本领域是众所周知的。
在某些实施方案中，基于甘草皂苷的疗法用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染，其基因组或其片段在中等严谨条件下与Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.348：1967-1976中描述的牛冠状病毒的基因组或其片段发生杂交。作为例示而非限制，使用这些中等严谨条件的流程如下：将含有DNA的滤膜在含有6X SSC、5XDenhart氏溶液、0.5％SDS、和100μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中于55℃预处理6小时。在相同溶液中进行杂交，并且使用5-20×106cpm 32P标记探针。将滤膜在杂交混合液中于55℃保温18-20小时，然后在含有1X SSC和0.1％SDS的溶液中于60℃清洗两次各30分钟。将滤膜吸干，并曝光即放射自显影。可以使用的其它中等严谨条件在本领域是众所周知的。滤膜的清洗在含有2X SSC、0.1％SDS的溶液中于37℃进行1小时。
在某些实施方案中，基于甘草皂苷的疗法用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染，其基因组或其片段在低严谨条件下与Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.348：1967-1976中描述的牛冠状病毒的基因组或其片段发生杂交。作为例示而非限制，使用这些低严谨条件的流程如下(还可参阅Shilo和Weinberg，1981年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6789-6792)：将含有DNA的滤膜在含有35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％菲科尔、1％BSA、和500μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中于40℃预处理6小时。在如下修改的相同溶液中进行杂交：0.02％PVP、0.02％菲科尔、0.2％BSA、100μg/ml鲑鱼精DNA、10％(wt/vol)硫酸右旋糖苷，并且使用5-20×106cpm 32P标记探针。将滤膜在杂交混合液中于40℃保温18-20小时，然后在含有2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA、和0.1％SDS的溶液中于55℃清洗1.5小时。用新鲜溶液更换清洗液，并于60℃再保温1.5小时。将滤膜吸干，并曝光即放射自显影。如果需要，将滤膜于65-68℃清洗第三次并对胶片再次曝光。可以使用的其它低严谨条件在本领域是众所周知的。
依照这些实施方案，SARS相关冠状病毒更多引起淋巴细胞减少，而且适度提高转氨酶水平。
表1.SARS相关冠状病毒不同株的GenBank登录
  SARS相关冠状病毒分离株/序列类型   登录号
  SARS冠状病毒，完整基因组   NC_004718
  SARS冠状病毒CUHK-W1，完整基因组   AY278554
  SARS冠状病毒ZJ01，完整基因组   AY297028
  SARS冠状病毒Taiwan JC-2003，RNA指导的RNA聚合酶，部分编码序列   AY286402
  SARS冠状病毒TOR2，完整基因组   AY274119
  SARS冠状病毒TW1，完整基因组   AY291451
  SARS冠状病毒Tor2 RNA聚合酶lb mRNA   AY271716
  SARS冠状病毒分离株SIN2774，完整基因组   AY283798
  SARS冠状病毒分离株SIN2748，完整基因组   AY283797
  SARS冠状病毒分离株SIN2679，完整基因组   AY28796
  SARS冠状病毒分离株SIN2677，完整基因组   AY283795
  SARS冠状病毒分离株SIN2500，完整基因组   AY283794
  SARS冠状病毒CUHK-Su10，完整基因组   AY282752
  SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003RNA-指导的RNA聚合酶基因   AY268070
  SARS冠状病毒BJ01，完整基因组   AY278488
  SARS冠状病毒BJ04，部分基因组   AY279。54
  SARS冠状病毒Urbani，完整基因组   AY278741
  SARS冠状病毒BJ03，部分基因组   AY278490
  SARS冠状病毒GZ01，部分基因组   AY278489
  SARS冠状病毒BJ02，部分基因组   AY278487
  SARS冠状病毒Taiwan RNA-指导的RNA聚合酶基因(pol)   AY268049
  SARS冠状病毒HKU-39849，完整基因组   AY278491
  SARS冠状病毒Vietnam株200300592聚合酶基因，部分编码序列   AY269391
本发明提供了基于甘草皂苷的疗法，用于保护受试者免于感染SARS相关冠状病毒或在出现任何SARS症状前治疗受到SARS相关冠状病毒感染的受试者。本发明还提供了基于甘草皂苷的疗法，用于曾经或正在接触受到SARS相关冠状病毒感染的另一位受试者的受试者预防形成SARS相关冠状病毒感染。本发明还提供了基于甘草皂苷的疗法，用于暴露于SARS相关冠状病毒的受试者预防SARS。熟练技术人员知道的任何方法都可用于检测SARS相关冠状病毒(见下文5.5节)。
在某些实施方案中，依照本发明有待预防、治疗、处理、或改善的SARS相关冠状病毒感染在人类受试者中引起一种或多种下列症状或与其有关：高烧(＞38℃)、干咳、呼吸短促或呼吸困难、以及指示肺炎的胸部X射线变化。依照这些实施方案，SARS相关冠状病毒感染可能引起一种或多种下列额外症状或与其有关：头痛、肌肉僵硬、丧失食欲、不适、精神错乱、皮疹、和腹泻。
本发明还提供了基于甘草皂苷的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染以外的病毒感染。在某些更加具体的实施方案中，本发明提供了基于甘草皂苷的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染，诸如但不限于DNA病毒，诸如乙型肝炎和丙型肝炎病毒；细小病毒，诸如腺伴随病毒和细胞巨化病毒；乳多空病毒，诸如乳头瘤病毒、多瘤病毒、和SV40；腺病毒；疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒I型(HSV-I)、单纯疱疹病毒II型(HSV-II)、和埃巴二氏病毒；痘病毒，诸如痘疹(天花)和牛痘病毒；以及RNA病毒，诸如人类免疫缺陷病毒I型(HIV-I)、人类免疫缺陷病毒II型(HIV-II)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)、流感病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、仙台病毒；小核糖核酸病毒，诸如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒；囊膜病毒，诸如风诊病毒(德国麻疹)和Semliki森林病毒、虫媒病毒、和甲型肝炎病毒。在某些甚至更加特殊的实施方案中，本发明提供了基于甘草皂苷的疗法，用于预防、治疗、处理、或改善冠状病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染和西尼罗河病毒感染，优选SARS相关冠状病毒感染。
               5.4.治疗和预防方法
5.4.1 SARS相关冠状病毒感染
本发明提供了预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法，所述方法包括对有所需要的受试者施用甘草皂苷或其衍生物。在一个具体实施方案中，本发明提供了预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法，所述方法包括对有所需要的受试者施用一个剂量的预防或有效量的甘草皂苷或其衍生物。SARS相关冠状病毒感染可以通过熟练技术人员知道的任何方法来诊断。例示方法见下文5.5节。
本发明提供了预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法，所述方法包括对有所需要的受试者施用甘草皂苷或其衍生物以及一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的预防性或治疗性试剂。在一个具体实施方案中，本发明提供了预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的方法，所述方法包括对有所需要的受试者施用一个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物以及一个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷以外的预防性或治疗性试剂。
本发明提供了预防SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括对有风险感染SARS相关冠状病毒的受试者施用甘草皂苷或其衍生物。在一个具体实施方案中，本发明提供了预防SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括对有风险感染SARS相关冠状病毒的受试者施用一个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物。
本发明提供了预防SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括对有风险感染SARS相关冠状病毒的受试者施用甘草皂苷或其衍生物以及一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的预防性或治疗性试剂。在一个具体实施方案中，本发明提供了预防SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括对有风险感染SARS相关冠状病毒的受试者施用一个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物以及一个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷以外的预防性或治疗性试剂。
本发明联合疗法的成分(例如预防性或治疗性试剂)可以顺序或同时施用。在一个具体实施方案中，本发明的联合疗法包含甘草皂苷或其衍生物和至少一种与甘草皂苷或其衍生物具有不同作用机制的其它疗法(例如至少一种其它预防性或治疗性试剂)。在另一个实施方案中，本发明的联合疗法包含甘草皂苷或其衍生物和至少一种与甘草皂苷或其衍生物具有相同作用机制的其它疗法(例如至少一种其它预防性或治疗性试剂)。在某些实施方案中，本发明的联合疗法通过与甘草皂苷或其衍生物一起发生作用以具有加和或协同作用而改善了甘草皂苷或其衍生物的预防或治疗作用。在某些实施方案中，本发明的联合疗法降低了与预防性或治疗性试剂有关的副作用。
可以在相同药用组合物中对受试者优选人类受试者施用联合疗法的预防性或治疗性试剂。在备选实施方案中，可以在分开的药用组合物中对受试者顺序或同时施用联合疗法的预防性或治疗性试剂。可以通过相同或不同的施用路径对受试者施用预防性或治疗性试剂。
在一个实施方案中，对受试者优选人施用包含的甘草皂苷或其衍生物的药用组合物以预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状。在另一个实施方案中，对受试者优选人施用包含甘草皂苷或其衍生物及其一种或多种衍生物以及甘草皂苷或其衍生物以外的预防性或治疗性试剂的药用组合物以预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状。
在某些实施方案中，在SARS或SARS相关冠状病毒感染显现之前或之后、或者在诊断为SARS相关冠状病毒感染之前或之后，对受试者施用甘草皂苷或其衍生物。在具体实施方案中，例如，在受试者感染SARS相关冠状病毒的风险增加时，诸如在受试者无免疫应答或免疫受抑制时，或者在SARS相关冠状病毒感染流行时，或者在受试者旅行或处于有较大风险感染SARS相关冠状病毒的地区时，对受试者预防性施用甘草皂苷或其衍生物。在其它实施方案中，在SARS相关冠状病毒感染的早期对受试者施用本发明的药用组合物。在另一些实施方案中，在SARS相关冠状病毒感染的晚期对受试者施用本发明的药用组合物，例如用于预防进行性SARS相关冠状病毒感染在受影响受试者中的后果，或者预防病毒传播至其他人。
5.4.2其它病毒感染
本发明还提供了用于治疗、预防、处理、或改善病毒感染的方法，包括对需要治疗的患者施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。在其它实施方案中，本发明还提供了治疗、处理、改善、或预防病毒感染的方法，包括对需要治疗的患者联合另一种疗法(例如抗病毒剂；见5.2节)施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。在其它实施方案中，本发明还提供了治疗、处理、改善、或预防病毒感染的方法，包括对需要治疗的患者联合利巴韦林施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。
本发明还提供了用于治疗、预防、处理、或改善SARS相关冠状病毒以外的病毒感染的方法，诸如其它冠状病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒。在某些实施方案中，本发明还提供了治疗、处理、改善、和预防丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒感染的方法，包括对需要治疗的患者施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。在其它实施方案中，本发明还提供了治疗、处理、改善、或预防丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒感染的方法，包括对需要治疗的患者联合利巴韦林施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。
可以使用熟练技术人员知道的任何动物细胞模型系统来测试甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林)联合的甘草皂苷或其衍生物针对丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒的功效。在某些更加具体的实施方案中，可以通过用不同浓度的甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林)联合的甘草皂苷或其衍生物处理受感染细胞来测试甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林)联合的甘草皂苷或其衍生物针对丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒的功效。在存在或缺乏甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林；见例如5.6节和6.1节)联合的甘草皂苷或其衍生物时，测量病毒感染的细胞病变效应。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗、预防、处理、或改善病毒感染的方法，其中病毒感染对其它处理没有响应。
可以使用熟练技术人员知道的任何动物模型系统来测试甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林)联合的甘草皂苷或其衍生物针对丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒的功效。在某些更加具体的实施方案中，可以通过用不同浓度的甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林)联合的甘草皂苷或其衍生物处理受感染小鼠来测试甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林)联合的甘草皂苷或其衍生物针对丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼罗河病毒的功效。在存在或缺乏甘草皂苷或其衍生物或者与另一种疗法(如利巴韦林；见例如5.6节和6.1节)联合的甘草皂苷或其衍生物时，测量动物中病毒的繁殖。在更加具体的实施方案中，对BALB/c小鼠鼻内接种10(4)组织培养物50％感染剂量(TCID50)。两天后，切下肺和鼻甲并保存于-70℃。将冷冻组织在细胞培养培养基中匀浆，并使用Vero细胞单层测定病毒滴度。
在某些实施方案中，本发明还提供了用于治疗、预防、改善、或处理SARS相关冠状病毒以外的冠状病毒感染的方法，其中这些方法包括对感染这种冠状病毒的患者施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。
在某些更加具体的实施方案中，本发明的方法可用于治疗、预防、改善、或处理可传染肠胃炎病毒(TGEV)、猪呼吸道和生殖病毒、传染性支气管炎病毒、猫冠状病毒(FECV)、和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)感染。
5.4.3.目标患者
在某些实施方案中，对正在或曾经密切接触诊断为SARS的受试者的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。在某些实施方案中，对最近10天内、最近15天内、最近30天内、最近50天内、最近75天内、或最近100天内旅行经过报告SARS病例的地区的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。在世界卫生组织的网站上可以找到这些地区的更新列表。
在某些实施方案中，对具有一种或多种作为SARS特征的症状的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。这些症状包括但不限于：高烧(＞38℃)、干咳、呼吸短促或呼吸困难、和指示肺炎的胸部X射线变化。与SARS有关或为其特征的其它症状包括但不限于：头痛、肌肉僵硬、丧失食欲、不适、精神错乱、皮疹、和腹泻。
在某些实施方案中，对老年人受试者或是无免疫应答或免疫受抑制的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。在其它实施方案中，对婴幼儿受试者或是教养院或公共机构中的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。在另一些实施方案中，对年龄在0-10岁、10-20岁、30-40岁、40-50岁、50-60岁、60-70岁、70-80岁、80-90岁、90-100岁、100-120岁的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。
在某些实施方案中，对受到另一种病毒优选呼吸道病毒感染的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。在其它实施方案中，对以前感染过另一种呼吸道病毒的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。在另一些实施方案中，对目前或以前患有肺炎的受试者施用本发明的甘草皂苷或其衍生物或联合疗法。
                5.5.病毒感染的诊断
可以由患者获取样品(例如唾液、粘液、血清、鼻吸样、喉咙拭样、支气管-肺泡洗液、或其它类型体液)并检测病毒(例如SARS相关冠状病毒)的存在以诊断病毒感染(例如SARS相关冠状病毒感染)。在某些实施方案中，可以直接处理含完整细胞的样品，而无完整细胞的分离物应当首先在允许的细胞系中进行培养。在示例性实施方案中，培养细胞悬浮液应当例如以300xg于室温离心5分钟以澄清，然后在同一条件下用PBS pH7.4漂洗。将细胞沉淀重悬于小体积PBS中待分析。将含完整细胞的临床分离物与PBS混合并于室温以300xg离心5分钟。用无菌吸管从分界面去除粘液并在同样条件下用PBS漂洗细胞沉淀。然后将沉淀重悬于小体积PBS中待分析。
可以通过熟练技术人员知道的任何方法来诊断病毒感染。用于诊断病毒感染(例如SARS相关冠状病毒感染)的示例性方法有但不限于检测病毒(例如SARS相关冠状病毒)的核苷酸序列，检测病毒的抗原、以及与病毒(例如SARS相关冠状病毒)免疫特异性结合的抗体或其片段。
SARS相关冠状病毒的核苷酸序列的实例如Drosten等所述(2003年，N.Engl.J.Med.348：1967-1976；参阅例如图1)，将其完整收入全文作为参考。SARS相关冠状病毒的基因组序列可以公开获得，SARS相关冠状病毒的不同分离株的GenBank编号参阅例如表1。这些序列可以由国家生物技术信息中心(NCBI)的网页获得。可以通过熟练技术人员知道的任何方法来检测这些核苷酸序列，诸如但不限于用对SARS相关冠状病毒核苷酸序列特异的探针进行PCR、RT-PCR、或Northern印迹分析。用于检测SARS相关冠状病毒的特异引物和方法参阅世界卫生组织的网页和德国汉堡Bernhard Nocht热带医学研究所的网页。
可以表达病毒(例如SARS相关冠状病毒)的编码序列以产生病毒(例如SARS相关冠状病毒)的蛋白质、多肽、或肽，它们可用于产生检测病毒(例如SARS相关冠状病毒)的抗体。与病毒(例如SARS相关冠状病毒)免疫特异性结合的抗体可用于检测病毒(例如SARS相关冠状病毒)，可以使用诸如免疫测定法(例如免疫沉淀、Western印迹、ELISA、和流式细胞计数)等本领域技术人员众所周知的技术。
免疫沉淀的方案通常包括在诸如添加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、159 aprotinin、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠pH7.2、1％Trasylol)等裂解缓冲液中裂解细胞群，将目的抗体加入细胞裂解物中，于4℃保温一段时间，向细胞裂解物中添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，于4℃保温大约1小时或1小时以上，在裂解缓冲液中漂洗珠子并将珠子重悬于SDS/样品缓冲液。目的抗体与特定抗原免疫沉淀的能力可通过例如Westem印迹分析进行评估。本领域技术人员应认识到，可以修改有关参数以提高抗体与抗原的结合并降低背景(例如用琼脂糖珠子预清除细胞裂解物)。有关免疫沉淀方案的进一步讨论参阅例如Ausubel等编，1994编，《分子生物学通用方法》Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，10.16.1部分。
Western印迹分析通常包括制备蛋白质样品、将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶(例如8％-20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)进行电泳，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶上转移到诸如硝酸纤维素、PVDF、或尼龙膜等膜上，在封闭液(例如含3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭膜，用漂洗缓冲液(例如PBSTween20)洗膜，将膜与稀释于封闭缓冲液中的一抗(目的抗体)保温，在漂洗缓冲液中洗膜，将膜与缀合了酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如12P或121I)并稀释于封闭缓冲液中的二抗一起保温，在漂洗缓冲液中洗膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员应认识到，可以对参数进行修改以增强被检测的信号并降低噪音背景。有关Western印迹方案的进一步讨论参阅例如Ausubel等编，1994编，《分子生物学通用方法》CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，10.8.1部分。
ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的每个孔，洗去未与孔结合的抗原，将缀合了诸如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物的目的抗体加入孔中并保温一段时间，洗去未结合的抗体或非特异性结合的抗体，并探测与包被孔的抗原特异结合的抗体的存在。在ELISA中目的抗体并非一定要与可检测化合物缀合；换而言之，可将缀合了可检测化合物的二抗加入孔中。此外，可以用抗体包被孔，而不是用抗原包被孔。在此情况下，可检测分子可以是缀合了酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物的抗原。可修改参数以增强被检测的信号，而有关ELISA的其它变化方案是本领域技术人员众所周知的。有关ELISA的进一步讨论参阅例如Ausubel等编，1994年，《分子生物学通用方法》Current Protocolsin Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，第11.2.1页。
抗体(包括scFv或是含有抗体片段或其变体或由其组成的其它分子)对抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的解离速率可通过竞争结合测定法测定。竞争结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，包括将标记(例如3H或121I)抗原与抗体在未标记抗原量渐增的情况下一起保温，检测与标记抗原结合的抗体。
可以检测受试者中与病毒(例如SARS相关冠状病毒)免疫特异性结合的抗体的存在以诊断受试者中病毒(例如SARS相关冠状病毒)的存在。熟练技术人员知道的任何方法都可用于检测与病毒抗原免疫特异性结合的抗体的存在(例如SARS-相关性冠状病毒抗原；包括诸如ELISA等免疫测定法)。
在一个示例性实施方案中，将SARS相关冠状病毒抗原与固相支持物连接。随后，将等待检测其中是否存在与SARS相关冠状病毒抗原免疫特异性结合抗体的材料与固相支持物在有益于抗体与SARS相关冠状病毒抗原结合的条件下一起保温。随后，在去除任何非特异结合抗体的条件下清洗固相支持物。清洗后，可以使用熟练技术人员知道的任何技术来检测被结合抗体的存在。在一个具体实施方案中，将SARS相关冠状病毒抗原-抗体复合物与识别受试者物种所产生抗体的可检测标记抗体一起保温，例如，如果受试者是人，所述可检测标记抗体是针对人的抗体，保温条件是有益于可检测标记抗体与SARS相关冠状病毒抗原所结合抗体结合的条件。在一个具体实施方案中，可检测的标记抗体是与酶活性相结合的。在另一个实施方案中，可检测标记抗体是放射性标记的。然后将SARS相关冠状病毒抗原-抗体-可检测标记抗体的复合物进行漂洗，随后通过熟练技术人员知道的任何技术对可检测标记抗体的存在进行定量，其中所用技术取决于可检测标记抗体的标记物类型。
可以通过本领域众所周知的任何方法来测定感染的频率，例如但不限于可通过免疫荧光测定法(IFA)利用抗病毒抗原抗体(例如抗SARS相关冠状病毒抗原抗体)检测临床样品(例如鼻拭样)中病毒(例如SARS相关冠状病毒)的存在。在其它实施方案中，可以通过本领域知道的任何方法检测病毒特异的(例如SARS相关冠状病毒特异的)核苷酸序列。这些方法包括但不限于PCR、RT-PCR、和Northern印迹杂交。
                        5.6.生物学测定法
在用于人类之前，优选在体外、在细胞培养系统、和在动物模型生物体中测试本发明疗法(例如预防性或治疗性试剂)的几个方面，诸如在啮齿类动物模型系统中测试期望的治疗活性。例如，可用于测定施用甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物与另一种抗病毒化合物的特定组合是否需要的测定法包括细胞培养系统，其中将患者组织样品进行培养，暴露或以其它方式接触甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物与另一种抗病毒化合物，并观察这种/这些试剂对组织样品的作用。组织样品可以通过活组织检查由患者获得。这种测试能够鉴定具有最大治疗效果的甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物与另一种抗病毒化合物的组合。在多个具体实施方案中，可以用特定病毒感染所涉及的细胞类型的典型细胞进行体外测定法，诸如例如由肺组织得到的细胞。
可以使用本领域众所周知的方法对预防性或治疗性试剂评估它们在体外在培养细胞中改变病毒复制(通过例如噬斑形成来测定)或病毒蛋白生成(通过例如Western印迹分析、RT-PCR、或Northern印迹分析来测定)的能力。熟练技术人员知道的任何方法都可用于对甘草皂苷及其衍生物测试它们对病毒(例如SARS-相关冠状病毒)感染细胞、在细胞中复制、或在细胞中繁殖的能力的影响。
可以通过熟练技术人员知道的任何技术来测定受到病毒(例如SARS相关冠状病毒)感染的细胞的生存力。在某些实施方案中，测量受病毒感染细胞的增殖来测定受病毒感染细胞的生存力。不同细胞类型(包括患者细胞和细胞系)都可用于该测定法，诸如但不限于Vero细胞、HeLa细胞、HeLa、16HBE140、HMEC-1、1301、和MOLT-4。这些细胞可以被SARS冠状病毒感染。
在某些实施方案中，通过测量由受病毒感染细胞生成的感染性病毒颗粒来测定甘草皂苷及其衍生物对受病毒感染细胞的作用。在某些实施方案中，在感染后不同时间点采集受感染细胞在其中培养的培养基样品，诸如感染后4小时、12小时、24小时、48小时、和72小时，并且使用TCID50测试法测定上清液中的病毒滴度。
在某些其它实施方案中，测定由受感染细胞生成的病毒蛋白质。可以通过SDS-PAGE及后续的使用针对病毒蛋白质特异的抗体的Western印迹分析来测定病毒蛋白质的水平。病毒蛋白质包括例如非结构蛋白、血凝素-酯酶糖蛋白、刺突糖蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白、和核蛋白。
本文所述测定法可用于测定病毒滴度随时间的变化以测定病毒在存在或缺乏甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物与另一种抗病毒化合物的组合时的生长特性。在具体实施方案中，如下测定病毒滴度，由受感染细胞或受感染受试者获得样品，将样品进行连续稀释，并以能够显现单斑的病毒稀释度感染易受病毒感染的细胞单层。然后可以对噬斑计数并将病毒滴度表述成噬斑形成单位每毫升样品。在本发明的具体实施方案中，通过受试者中针对病毒的抗体的滴度来估算受试者中本发明病毒的生长速率。可以通过熟练技术人员知道的任何方法由受试者获得样品。在某些实施方案中，样品包括鼻吸样、咽喉拭样、唾液、或支气管-肺泡洗液。
在某些实施方案中，受到病毒(例如SARS相关冠状病毒)感染的细胞的存活率是甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物与另一种抗病毒化合物的组合效力的指征。本领域众所周知的许多测定法可用于评估细胞存活和/或生长；例如，可以通过测量溴脱氧尿苷(BRDU)掺入(参阅例如Hoshino等，1986年，Int.J.Cancer 38：369；Campana等，1988年，J.Immunol.Meth.107：79)或(3H)-胸苷掺入(参阅例如Chen，J.，1996年，Oncogene 13：1395-403；Jeoung，J.，1995年，J.Biol.Chem.270：18367-73)，通过直接细胞计数，通过检测已知基因诸如原癌基因(例如fos、myc)或细胞周期标记(Rb、cdc2、cyclin A、D1、D2、D3、E、等)的转录、翻译、或活性变化来测定细胞增殖。可以通过本领域众所周知的任何方法来测定这些蛋白质和mRNA的水平和活性。例如，可以通过已知的免疫诊断方法诸如使用商品化抗体的Western印迹或免疫沉淀来对蛋白质定量。可以使用本领域众所周知的常规方法，例如使用Northern分析、RNA酶保护、连同逆转录的聚合酶链式反应对mRNA定量。可以通过使用本领域已知的锥虫蓝染色或其它细胞死亡或存活标记来评估细胞生存能力。在具体实施方案，测量细胞ATP水平以测定细胞生存能力。可以例如在视觉上根据形态变化评估分化。
在用于人类之前可以在合适的动物模型系统中测试本发明的疗法(特别是预防性和/或治疗性试剂的联合)。这些动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔、等。可以使用本领域众所周知的任何动物系统。这些模型系统对于熟练技术人员而言是广泛使用且众所周知的。可以反复施用预防性和/或治疗学试剂。流程的几个方面可以改变。所述方面包括施用预防性和/或治疗性试剂的时间摄生法，以及是分开还是作为混合物施用这些试剂。
Utsunomiya等，1996年，Antimicrobial Agents and Chemotherapy41(3)：551-556(如材料和方法部分)描述了用于测试甘草皂苷的抗病毒左右的例示性动物模型系统，将其完整收入本文。可以根据诸如等参数来测定化合物在动物模型系统中的抗病毒作用存活率、来自受感染动物的样品的病毒滴度、病毒感染对动物中细胞、组织、和/或器官的病理作用。对照包括未受病毒感染的动物和/或未用甘草皂苷或其衍生物处理的动物。
可以对疗法(例如预防性或治疗性试剂)评估它们在体内抑制或减少病毒感染(例如SARS相关冠状病毒感染)的能力。例如，可以对测试动物优选暴露于SARS相关冠状病毒的测试动物施用预防性或治疗性试剂，随后对测试病毒检查病毒滴度、针对病毒的抗体、病毒的蛋白质或核酸、或任何SARS相关症状。
可以通过标准药学流程在细胞培养物或实验动物中测定本发明预防性和/或治疗学方案的毒性和/或功效，例如用于测定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率即治疗性指数，它可以表述成LD50/ED50比率。
由细胞培养物测定法和动物研究获得的数据可用于设定在人体中使用的预防性或治疗性试剂的剂量范围。这些试剂的剂量优选处于包括具有少许毒性或没有毒性的ED50在内的循环浓度的范围内。剂量可以根据所采用的剂量形式和施用路径在该范围内变化。对于本发明方法中所使用的任何试剂，最初可以由细胞培养物测定法估算治疗有效剂量。可以在动物模型中设定一个剂量以达到包括在细胞培养物中测定的IC50(即达到最大症状抑制效果一半的测试化合物浓度)在内的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更精确的确定在人体中的有用剂量。可以通过例如高效液相层析(HPLC)和放射免疫测定法(RIA)来测量血浆水平。可以通过例如测量诸如峰值血浆水平(Cmax)、曲线下的面积(AUC，通过绘制试剂的血浆浓度对时间的曲线来测量，反映生物利用度)、化合物半衰期(t1/2)、和达到最大浓度的时间等参数来测定预防性或治疗性试剂的药动学。
另外，本领域熟练技术人员知道的任何测定法都可用于评估本发明疗法对于针对本文公开的病毒感染(例如SARS相关冠状病毒感染)的预防性和/或治疗性效用。
                    5.7.施用方法
本发明提供了用于预防、治疗、处理、和改善病毒感染(例如SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的方法。在一个具体实施方案中，组合物包含甘草皂苷或其衍生物。在另一个实施方案中，组合物包含甘草皂苷或其衍生物以及一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的预防性或治疗性试剂。在另一个实施方案中，组合物包含甘草皂苷或其衍生物以及一种或多种抗病毒试剂。在另一个实施方案中，组合物包含甘草皂苷或其衍生物以及利巴韦林。依照这些实施方案，组合物还可以包含载体。
本发明的组合物包括但不限于可用于制造药用组合物的散装药物组合物(例如不纯的或未灭菌的组合物)和可用于制备单位剂量形式的药用组合物(即适于施用于受试者或患者的组合物)。这些组合物包含预防或治疗有效量的本文公开的预防性和/或治疗性试剂或是那些试剂与药用可接受载体的组合。优选的是，本发明的组合物是药用组合物，且包含有效量的甘草皂苷或其衍生物、药用可接受载体、以及任选的有效量的另一种预防性或治疗性试剂。
在一个具体实施方案中，术语“药用可接受的”意味着得到联邦或州政府管理机构的批准或是在美国药典、欧洲药典、或其它公认药典中列出可用于动物，更特别的是可用于人。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介质。这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果需要，组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂或是pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。
一般而言，或是分开或是在单位剂量形式中混合在一起供应本发明组合物的成分，例如诸如指示活性剂数量的安瓿或sachette等密封容器中的冻干粉或无水浓缩物。在通过输液施用组合物时，可以将它与装有无菌药用级水或盐水的输液瓶一起发放。在通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿无菌注射用水或盐水，从而可以在施用前混合成分。
本发明的组合物可以配制成中性或盐形式。药用可接受盐包括与由氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、丁酸、等衍生的阴离子形成的盐和与由氢氧化钠、钾、铵、钙、铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨乙醇、组氨酸、葡鲁卡因、等衍生的阳离子形成的盐。
已知多种投递系统，可用于施用甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物与甘草皂苷或其衍生物以外的预防剂或治疗剂的组合，用于预防、处理、治疗、或改善呼吸状况(优选病毒呼吸状况且最优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状，例如包装成脂质体、微粒、微囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、由受体介导的胞吞作用(参阅例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432，1987年)、作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸的构建、等。施用部分预防性或治疗性试剂的方法包括但不限于肠胃外施用(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、和皮下)、硬膜外施用、肿瘤内施用、和粘膜施用(例如鼻内和口腔路径)。另外，可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及用雾化剂配制。参阅例如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT发布号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，将它们完整收入本文作为参考。在一个实施方案中，使用Alkermes AIRTM肺部药物投递技术(Alkermes公司，剑桥，马萨诸塞)施用本发明的甘草皂苷或其衍生物、联合疗法、和组合物。在一个具体实施方案中，肌肉内、静脉内、肿瘤内、口腔、鼻内、肺部、或皮下施用本发明的预防性或治疗性试剂。可以通过任何方便的路径施用预防性或治疗性试剂，例如通过输液或推注、通过经由上皮或粘膜和皮肤层的吸收(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜、等)，而且可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
在一个具体实施方案中，可能希望将本发明的预防性或治疗性试剂局部施用至需要治疗的部位；这可以通过例如但不限于局部输液、注射、或植入来实现，所述植入物指多孔或非多孔材料，包括膜和基体，诸如硅胶膜、聚合物、纤维基体(例如Tissuel)、或胶原基体。在一个实施方案中，将有效量的甘草皂苷或其衍生物局部施用至受试者的患病部位以预防、治疗、处理、和/或改善SARS相关冠状病毒感染或其症状。在另一个实施方案中，将有效量的甘草皂苷或其衍生物连同有效量的一种或多种甘草皂苷或其衍生物以外的疗法(例如一种或多种预防性或治疗性试剂)局部施用至受试者的患病部位以预防、治疗、处理、和/或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状。
可以在受控释放或缓释系统中施用预防性或治疗性试剂。受控释放药物产品的目的是在将药物用量和治疗或控制状况的时间最小化的同时将药物疗法的益处最大化。受控释放配方的优点包括延长药物活性、降低用药频率、和改善接受治疗的受试者的顺从性。另外，受控释放配方影响发起作用所需要的时间和其它特征，诸如药物的血液水平，由此提供对发生副作用的一些控制。
大多数受控释放配方的设计是为了最初以迅速产生期望效果的数量释放药剂，然后以在较长时间里足以延续期望效果的数量逐渐且持续释放其它成分。为了维持持续的治疗性和预防性效果，必须以能够补偿由身体代谢和排泄的数量的速率由剂量形式释放药物。药剂的受控释放可能受到多种条件的激发，包括但不限于pH、温度、酶、水、或其它生理学条件或化合物。
在一个实施方案中，可以使用泵来实现受控或持续释放(参阅Langer，见上文；Sefton，1987年，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等，1980年，Surgery 88：507；Saudek等，1989年，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料来实现本发明疗法的受控或持续释放(参阅例如《受控释放的医学应用》Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise编，CRC出版社，伯克莱屯，佛罗里达，1974年；《受控药物生物利用度、药物产品设计、和性能》Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball编，Wiley出版社，纽约，1984；Ranger和Peppas，1983年，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还可参阅Levy等，1985年，Science 228：190；During等，1989年，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989年，J.Neurosurg.71：105；美国专利号5,679,377、美国专利号5,916,597、美国专利号5,912,015、美国专利号5,989,463、美国专利号5,128,326、PCT发布号WO 99/15154、和PCT发布号WO 99/20253)。可用于缓释配方的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯共乙烯乙酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)、和聚原酸酯。在一个优选实施方案中，缓释配方中所使用的聚合物是惰性、不含可滤去杂质、贮存稳定、无菌、且生物可降解的。在另一个实施方案中，可以将受控或缓释系统置于预防或治疗目标附近，由此只需要全身剂量的一部分(参阅例如Goodson，《受控释放的医学应用》Medical Applications of ControlledRelease，见上文，第2卷，第115-138页，1984页)。
Langer(1990年，Science 249：1527-1533)在综述中讨论了受控释放系统。本领域技术人员知道的任何技术都可用于生成包含一种或多种本发明治疗剂的缓释配方。参阅例如美国专利号4,526,938、PCT发布号WO 91/05548、PCT发布号WO 96/20698。Ning等人，1996年，“使用缓释凝胶的人结肠癌异种移植物的肿瘤内放射免疫疗法”，Radiotherapy & Oncology 39：179-189；Song等，1995年，“由抗体介导的肺循环乳液的肺靶向”，PDA Journal of PharmaceuticalScience & Technology 50：372-397；Cleek等，1997年，“用于心血管应用的bFGF抗体的生物可降解聚合载体”，Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等，1997年，“用于局部投递的重组人源化单克隆抗体的微囊化”Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，将它们完整收入本文作为参考。
在一个具体实施方案中，当本发明的组合物是编码预防性或治疗性试剂的核酸时，通过将核酸构建成合适核酸表达载体的一部分，并例如通过使用逆转录病毒载体(参阅美国专利号4,980,286)、或通过直接注射、或通过使用微粒轰击(例如基因枪，Biolistic，Dupont)、或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被、或将它与已知进入细胞核的同源框样肽连锁施用(参阅例如Joliot等，1991年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)进行施用使之进入细胞内，可以在体内施用核酸以促进由它编码的预防性或治疗性试剂的表达。或者，可以将核酸导入细胞内并通过同源重组掺入宿主细胞DNA以进行表达。
将本发明的药用组合物配制成与其意向施用路径相容。施用路径的实例包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔、鼻内(例如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜、和直肠施用。在一个具体实施方案中，依照常规流程将组合物配制成适合静脉内、皮下、肌肉内、口腔、鼻内、或局部施用于人类的药用组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如麦角胺以减轻注射部位的疼痛。
若要局部施用本发明的组合物，则可以将组合物配制成软膏、乳膏、皮肤贴、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液的形式或是本领域技术人员众所周知的其它形式。参阅例如《雷明顿氏药物科学和药物剂量形式导论》Remington′s PharmaceuticalSciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚，1995年。对于非可喷雾局部剂量形式，通常采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂且具有优选大于水的动态粘滞度的粘性至半固体或固体形式。合适的配方包括但不限于溶液、悬浮液、乳状液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、药膏、诸如此类，如果需要，是无菌的或与辅助试剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂缓冲剂、或盐)混和以改变各种特性，诸如例如渗透压。其它合适的局部剂量形式包括可喷雾气雾剂制剂，其中优选联合固相或液相惰性载体的活性成分包装在含有增压挥发物(例如压缩气体，诸如氟利昂)的混合物或是挤瓶中。如果需要，还可以向药物组合物和剂量形式中添加增湿剂或湿润剂。这些额外成分的实例在本领域是众所周知的。
若本发明的方法包括组合物的鼻内施用，则组合物可以配制成气雾剂、喷雾剂、轻雾剂、或滴剂的形式。具体而言，依照本发明使用的预防性或治疗性试剂可以使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯单氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合适其它)以气雾剂喷雾呈现的形式由增压包装或喷雾器进行方便的投递。在增压气雾剂的情况中，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以投递计量数量。吸入器或吹入器中所使用的胶囊和药筒(由例如明胶构成)可以配制成含有化合物及合适粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
若本发明的方法包括口服施用，则组合物可以配制成片剂、胶囊、药包、软胶囊、溶液、悬浮液、诸如此类的形式。可以通过常规手段用药用可接受赋形剂诸如粘合剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、或硅石)；分解质(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如月桂醇硫酸钠)片剂或胶囊。可以通过本领域众所周知的方法包被片剂。用于口腔施用的液体制剂可以采取但不限于溶液、糖浆、或悬浮液的形式，或者它们可以以干燥产品的形式存在，使用前用水或其它合适介质溶解。可以通过常规手段用药用可接受添加剂，诸如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇、或分馏植物油)；以及防腐剂(例如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)制备这些液体制剂。制剂还可以适当包含缓冲盐、芳香剂、着色剂、和甜味剂。可以适当配制用于口腔施用的制剂以缓慢释放、受控释放、或持续释放预防性或治疗性试剂。
本发明的方法可以包括用雾化剂配制的组合物的肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器。参阅例如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT发布号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，将它们完整收入本文作为参考。在一个具体实施方案中，使用Alkermes AIRTM肺部药物投递技术(Alkermes公司，剑桥，马萨诸塞)施用本发明的甘草皂苷或其衍生物、联合疗法、和/或组合物。
本发明的方法还包括配制用于通过注射(例如通过推注或连续输液)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的配方可以以含有额外防腐剂的单位剂量形式(例如在安瓿中或在多剂量容器中)存在。组合物可以采取诸如油性或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳状液等形式，而且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂、和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适介质(例如无菌、无热原水)溶解。
可用于提供本发明肠胃外剂量形式的合适介质对于本领域技术人员而言是众所周知的。在某些实施方案中，适于肠胃外剂量形式的介质包括但不限于注射用水USP；水性介质包括但不限于氯化钠注射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、以及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介质包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及非水性介质包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、和苯甲酸苯甲酯。
在其它实施方案中，将增加预防性或治疗性试剂溶解度的化合物掺入肠胃外剂量形式。例如，可以使用环糊精及其衍生物来增加撒利多胺类似物及其衍生物的溶解度。参阅例如美国专利号5,134,127，将其收入本文作为参考。本发明的方法还额外包含配制成仓储制剂的组合物的施用。可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用这些长期作用配方。由此，例如，可以与合适的聚合或疏水材料(例如在可接受油中配制成乳状液)或离子交换树脂一起配制组合物，或是配制成少量可溶衍生物(例如少量可溶盐)。
本发明的方法涵盖配制成中性或盐形式的组合物的施用。药用可接受盐包括与由氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、丁酸、等衍生的阴离子形成的盐和与由氢氧化钠、钾、铵、钙、铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨乙醇、组氨酸、普鲁卡因、等衍生的阳离子形成的盐。
一般而言，或是分开或是在单位剂量形式中混合在一起供应组合物的成分，例如诸如指示活性剂数量的安瓿或小瓶(sachette)等密封容器中的冻干粉或无水浓缩物。施用模式是输液时，可以将组合物与装有无菌药用级水或盐水的输液瓶一起发放。施用模式是注射时，可以提供一安瓿无菌注射用水或盐水，从而可以在施用前混合成分。
具体而言，本发明还提供将本发明的一种或多种预防性或治疗性试剂或是药物组合物包装在密封容器中，诸如指示试剂数量的安瓿或小瓶中。在一个实施方案中，作为密封容器中的冻干粉或无水浓缩物供应本发明的一种或多种预防性或治疗性试剂或是药用组合物，并且可以还原(例如用水或盐水)至合适浓度以施用于受试者。
如果需要，组合物可以存在于包装或分发装置中，它可以装有一个或多个含有活性成分的单位剂量形式。包装可以包括例如金属或塑料薄片，诸如透明塑料浮泡包装。包装或分发装置可以附有施用说明。
一般而言，本发明组合物的成分衍生自与这些组合物的受众具有相同物种起源或物种反应性的受试者。由此，在一个优选实施方案中，出于治疗或预防目的对人类患者施用人源或人源化抗体。
                 5.8.施用剂量和频率
可以通过标准临床技术测定在预防、治疗、处理、或改善病毒感染(例如SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状中将是有效的甘草皂苷或其衍生物的预防或治疗有效量。剂量、服药频率、或二者将取决于患者的年龄、患者的体重、患者的响应、患者状况的严重程度、患者过去的医学病历、以及预防性或治疗性试剂的施用路径、药动学、和药效学效果，而且应当根据从业人员的判断和每名患者的情况做出决定。可以由衍生自体外或动物模型测试系统(见上文5.6节)的剂量-响应曲线来推断有效剂量。
甘草皂苷或其衍生物的例示剂量包括每千克受试者或样品体重的甘草皂苷或其衍生物的毫克或微克量(例如大约1微克每千克-大约500毫克每千克、大约100微克每千克-大约5毫克每千克、或大约1微克每千克-大约50微克每千克)。在具体实施方案中，甘草皂苷或其衍生物的日常剂量是至少50mg、75mg、100mg、150mg、250mg、500mg、750mg、或至少1g。
在一个实施方案中，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的组合物的剂量是0.01-5000mM、1-300mM、10-100mM、和10mM-1M的浓度。在另一个实施方案中，用于预防、治疗、处理、或改善病毒感染或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的组合物的剂量是至少5μM、至少10μM、至少50μM、至少100μM、至少500μM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少50mM、至少100mM、或至少500mM的浓度。
在一个实施方案中，用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的组合物的剂量是0.01-5000mM、1-300mM、10-100mM、和10mM-1M的浓度。在另一个实施方案中，用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的组合物的剂量是至少5μM、至少10μM、至少50μM、至少100μM、至少500μM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少50mM、至少100mM、或至少500mM的浓度。
在一个具体实施方案中，用于预防、治疗、处理、或改善患者中的SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的组合物的剂量是0.25μg/kg或更多、优选0.5μg/kg或更多、1μg/kg或更多、2μg/kg或更多、3μg/kg或更多、4μg/kg或更多、5μg/kg或更多、6μg/kg或更多、7μg/kg或更多、8μg/kg或更多、9μg/kg或更多、10μg/kg、25μg/kg或更多、优选50μg/kg或更多、100μg/kg或更多、250μg/kg或更多、500μg/kg或更多、1mg/kg或更多、5mg/kg或更多、6mg/kg或更多、7mg/kg或更多、8mg/kg或更多、9mg/kg或更多、或10mg/kg或更多患者体重。在另一个具体实施方案中，用于预防、治疗、处理、或改善患者中的SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的组合物的剂量是5mg、优选10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg或更多的单位剂量。在另一个具体实施方案中，用于预防、治疗、处理、或改善患者中的SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的组合物的剂量是范围为大约5mg-大约100mg、优选大约100mg-200mg、大约150mg-大约300mg、大约150mg-大约400mg、大约250mg-大约500mg、大约500mg-大约800mg、大约500mg-大约1000mg、或大约5mg-大约1000mg的剂量单位。
可以使用临床医生能够得到的参考文献诸如例如《医生的案头参考资料》Physicians′Desk Reference，第55版，2001年来测定曾经或目前用于预防、治疗、或改善病毒感染(优选SARS相关冠状病毒感染)或其症状的甘草皂苷或其衍生物以外的预防性或治疗性试剂的剂量。优选的是，联合甘草皂苷或其衍生物使用低于曾经或目前用于预防、治疗、或改善病毒感染(优选SARS相关冠状病毒感染)的剂量的剂量。
在另一个实施方案中，对受试者施用一个或多个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中每次服用的预防或治疗有效量并非相同的。在另一个实施方案中，对受试者施用一个或多个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中对所述受试者施用的甘草皂苷或其衍生物的预防或治疗有效量的剂量增加了例如0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、或50μg/kg作为治疗进度。在另一个实施方案中，对受试者施用一个或多个剂量的预防或治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中对所述受试者施用的甘草皂苷或其衍生物的预防或治疗有效量的剂量减少了例如0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、或50μg/kg作为治疗进度。
在某些实施方案中，对受试者施用一个或多个剂量的有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中所述甘草皂苷或其衍生物的有效量的一个剂量将SARS相关冠状病毒的复制抑制或降低了至少20％-25％、优选至少25％-30％、至少30％-35％、至少35％-40％、至少40％-45％、至少45％-50％、至少50％-55％、至少55％-60％、至少60％-65％、至少65％-70％、至少70％-75％、至少75％-80％、或可高达至少85％。在其它实施方案中，对受试者施用一个或多个剂量的有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中所述甘草皂苷或其衍生物的有效量的一个剂量将SARS相关冠状病毒颗粒的生成抑制或减少了至少20％-25％、优选至少25％-30％、至少30％-35％、至少35％-40％、至少40％-45％、至少45％-50％、至少50％-55％、至少55％-60％、至少60％-65％、至少65％-70％、至少70％-75％、至少75％-80％、或可高达至少85％。在其它实施方案中，对受试者施用一个或多个剂量的有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中所述甘草皂苷或其衍生物的有效量的一个剂量将SARS相关冠状病毒颗粒的释放抑制或减少了至少20％-25％、优选至少25％-30％、至少30％-35％、至少35％-40％、至少40％-45％、至少45％-50％、至少50％-55％、至少55％-60％、至少60％-65％、至少65％-70％、至少70％-75％、至少75％-80％、或可高达至少35％。
在一个具体实施方案中，本发明提供了预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括在一段时间内每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每7天一次、每8天一次、每10天一次、每2周一次、或每3周一次对有所需要的受试者施用至少5mg、优选10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、或更多甘草皂苷或其衍生物的一个剂量。
提供上文所述施用方案仅是处于例示目的而不应答理解为限制。本领域普通技术人员将容易理解，甘草皂苷或其衍生物的所有剂量属于本发明的范围之内。
可以依照本发明的方法联合甘草皂苷或其衍生物施用曾经或目前用于预防、治疗、处理、或改善状况(优选病毒状况)或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物以外的疗法(例如预防性或治疗性试剂)以治疗、处理、预防、或改善病毒感染或其一种或多种症状。
可以依照本发明的方法联合甘草皂苷或其衍生物施用曾经或目前用于预防、治疗、处理、或改善呼吸状况(优选病毒性呼吸状况且最优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的甘草皂苷或其衍生物以外的疗法(例如预防性或治疗性试剂)以治疗、处理、预防、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状。优选的是，本发明联合疗法中所使用的预防性或治疗性试剂的剂量低于曾经或目前用于预防、治疗、处理、或改善呼吸状况(优选病毒性呼吸状况且最优选SARS相关冠状病毒感染)或其一种或多种症状的剂量。可以由本领域的任何参考文献获得目前用于预防、治疗、处理、或改善呼吸状况(优选病毒性呼吸状况)或其一种或多种症状的试剂的推荐剂量，包括但不限于Hardman等编，2001年，Goodman & Gilman′s ThePharmacological Basis Of Therapeutics，第10版，Mc-Graw-Hill，纽约；Physician′s Desk Reference(PDR)，第57版，2003年，MedicalEconomics Co.，Inc.，Montvale，NJ，将其完整收入本文作为参考。
在多个实施方案中，相距少于5分钟、相距少于30分钟、相距少于1小时、相距少于大约1小时、相距少于大约1-大约2小时、相距少于大约2小时-大约3小时、相距大约3小时-大约4小时、相距大约4小时-大约5小时、相距大约5小时-大约6小时、相距大约6小时-大约7小时、相距大约7小时-大约8小时、相距大约8小时-大约9小时、相距大约9小时-大约10小时、相距大约10小时-大约11小时、相距大约11小时-大约12小时、相距大约12小时-18小时小时、相距大约18小时-24小时、相距大约24小时-36小时、相距大约36小时-48小时、相距大约48小时-52小时、相距大约52小时-60小时、相距大约60小时-72小时、相距大约72小时-84小时、相距大约84小时-96小时、或相距大约96小时-120小时施用疗法(例如预防性或治疗性试剂)。在一个优选实施方案中，在同一次患者就诊时施用两个或多个疗法。
在某些实施方案中，循环施用甘草皂苷或其衍生物和一种或多种其它疗法(例如预防性或治疗性试剂)。循环疗法包括施用第一种疗法(例如第一种预防性或治疗性试剂)一段时间，然后施用第二种疗法(例如第二种预防性或治疗性试剂)一段时间，任选随后施用第三种疗法(例如预防性或治疗性试剂)一段时间等等，并且顺序重复该顺序施用即循环，从而降低针对某一种疗法的抗性的发展以避免或降低某一种疗法的副作用，和/或改善疗法的功效。
在某些实施方案中，可以反复施用相同的甘草皂苷衍生物，而且每次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、或30天。在其它实施方案中，可以反复施用甘草皂苷或其衍生物以外的相同疗法(例如预防性或治疗性试剂)，而且每次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、或30天。
                      5.9.商品
本发明还涵盖完成包装和标记的药品。所述商品包括在诸如玻璃瓶或其它密封容器等适当器皿或容器中的合适单位剂量。在剂量形式适于肠胃外施用的情况中，例如甘草皂苷或其衍生物等活性成分是无菌的且适于作为不含微粒溶液施用。换言之，本发明包括肠胃外溶液和冻干粉，它们都是无菌的，且后者适于在注射前重溶。或者，单位剂量形式可以是适于口服、经皮、鼻内、肺部、或局部投递的固体。
在某些实施方案中，单位剂量形式适于静脉内、肌肉内、鼻内、口服、局部、肺部、或皮下投递。因此，本发明涵盖溶液，优选无菌的、适于各种投递路径的溶液。
对于任一种药品而言，包装材料和容器都设计成在贮存和运输期间保持产品的稳定性。此外，本发明的产品包括使用说明书或建议医师、技术人员、或患者如何正确预防或治疗所述呼吸疾病的其它信息资料。换言之，商品包括指示或建议剂量摄生法以及监测信息的说明书，包括但不限于实际剂量、监测步骤、总淋巴细胞计数、肥大细胞计数、肥大细胞脱粒、红细胞计数、T细胞计数、IgE抗体产量、以及其它监测信息。
具体而言，本发明提供了这样的商品，它包括包装材料，诸如盒子、瓶子、管、小瓶、罐、喷雾器、吹药器、静脉内(i.v.)包、封套、等等；而且，在所述包装材料中包含至少一个单位剂量形式的药剂，其中所述药剂包含甘草皂苷或其衍生物且其中所述包装材料包括指明所述甘草皂苷或其衍生物通过施用特定剂量且使用本文所述特定剂量摄生法可用于治疗、预防、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的说明书。
本发明还提供了这样的商品，它包括包装材料，诸如盒子、瓶子、管、小瓶、罐、喷雾器、吹药器、静脉内(i.v.)包、封套、等等；而且，在所述包装材料中包含至少各一个单位剂量形式的药剂，其中第一种药剂包含甘草皂苷或其衍生物而第二种药剂包含甘草皂苷或其衍生物以外的预防性或治疗性试剂，且其中所述包装材料包括指明所述甘草皂苷或其衍生物通过施用特定剂量且使用本文特定剂量摄生法可用于治疗、预防、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的说明书。
本发明还提供了这样的商品，它包括包装材料，诸如盒子、瓶子、管、小瓶、罐、喷雾器、吹药器、静脉内(i.v.)包、封套、等等；而且，在所述包装材料中包含至少一个单位剂量形式的药剂，其中一种药剂包含甘草皂苷或其衍生物以及甘草皂苷或其衍生物以外的预防性或治疗性试剂，且其中所述包装材料包括指明所述甘草皂苷或其衍生物通过施用特定剂量且使用本文所述特定剂量摄生法可用于治疗、预防、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的说明书。
本发明规定，在商品所含的信息资料中指出了用于预防、治疗、处理、或改善SARS相关冠状病毒感染或其一种或多种症状的本发明方法可以减少或避免的副作用。可以通过本发明方法减少或避免的副作用包括但不限于重大症状异常(发热、心动过速、心动过缓、高血压、低血压)、血液病(贫血、淋巴细胞减少症、白血球减少症、血小板减少症)、头痛、寒战、头晕、恶心、衰弱、背痛、胸痛(胸压)、腹泻、肌痛、疼痛、搔痒、牛皮癣、鼻炎、发汗、注射部位反应、和血管舒张。
6.1.实施例1：甘草皂苷(甘草根的活性成分)和SARS相关冠状病毒的复制
SARS的爆发需要研究用于治疗疾病的抗病毒化合物。目前，尚未鉴定针对SARS相关冠状病毒感染的特效治疗。评估了利巴韦林、6-氮尿苷、吡唑呋喃菌素、霉酚酸、和甘草皂苷针对来自收入德国法兰克福大学临床中心的SARS患者的两种冠状病毒临床分离物(FFM-1和FFM-2)的抗病毒能力。所有化合物都可以通过商业途径获得，而且已经由于它们的抗病毒、抗肿瘤、和免疫抑制活性而用于患者。在所有化合物中，甘草皂苷在抑制SARS相关冠状病毒复制方面是最有活性的。这些结果指示甘草皂苷的预防性和治疗性功效。
对在96孔板中感染72-96小时后由病毒诱导的对Vero细胞汇合层的细胞病原性进行视觉评分。选择性指数确定为使细胞生存力降低50％(CC50)的某化合物浓度与抑制细胞病变效应达对照值的50％(EC50)所需的该化合物浓度的比例。用MMT细胞增殖试剂盒I(Roche，曼海姆，德国)测定药物的细胞毒性。
利巴韦林和霉酚酸，作为肌苷单磷酸盐脱氢酶的抑制剂，不会影响SARS相关冠状病毒(SARS-CV)的复制(见表2)。乳清酸核苷单磷酸盐脱羧酶的抑制剂，6-氮尿苷和吡唑呋喃菌素，分别以选择性指数5和12将SARS-CV的复制抑制在非毒性剂量。在Vero细胞中SARS-CV复制的最强抑制剂是甘草皂苷，它的选择性指数为67。
表2：化合物在Vero细胞培养物中针对SARS相关冠状病毒的活性
  EC50*(mg/L)   CC50*(mg/L)   选择性指数
  化合物
  6-氮尿苷   16-8   104   6
  吡唑呋喃菌素   4-2   52   12
  霉酚酸   ＞50   ＞50   NC
  利巴韦林   ＞1000   ＞1000   NC
  甘草皂苷
  病毒吸附后   600   ＞20,000   ＞33
  病毒吸附期间和之后   300   ＞20,000   ＞67
  病毒吸附期间   2400   ＞20,000   ＞8-3
EC50＝抑制细胞致病效应达对照值50％所需的化合物有效浓度。
CC50＝使细胞生存力降低50％的化合物的细胞毒性浓度。
NC＝不可计算。
*8次试验的平均值(SD)。
Figure A20048001903100761
在所使用的最大浓度(200，mg/L)处记录到细胞生存力降低了20-30％。
除了抑制病毒复制以外，甘草皂苷还抑制病毒复制周期的早期步骤-病毒的吸附和侵入。甘草皂苷在吸附期间加入比在病毒吸附后加入效率要低(分别为EC50 600对2400mg/L)。甘草皂苷在吸附过程中以及吸附之后加入都是最有效的的(EC50 300mg/L)。
图1显示了甘草皂苷对Vero细胞中SARS-CV复制的影响。利用SARS患者的血清样品测定了SARS-CV的复制。在用1000mg/L甘草皂苷处理的培养基中病毒抗原的表达比任何其它培养基中的都要低得多；高浓度甘草皂苷(4000mg/L)完全阻断了病毒的复制(图1)。
甘草皂苷影响诸如蛋白酶C、酪蛋白激酶II等细胞信号途径以及诸如激活剂蛋白1和核因子кB等转录因子。此外，甘草皂苷及其糖苷配基代谢物18β-甘草酸上调可诱导性一氧化二氮合酶的表达以及一氧化二氮在最大值相位(macrophases)中的产量(Jeong HG，Kim JY.最大值相位中18(3-甘草酸对可诱导性一氧化氮合酶表达的诱导。FEBSLett 2002；513：208-12)。一氧化二氮抑制若干种病毒的复制，例如日本脑炎病毒(Flavivirate家族的成员)，它也可被甘草皂苷所抑制。不受理论限制，甘草皂苷诱导一氧化氮合酶且该一氧化氮合酶抑制SARS相关冠状病毒的复制。在此处未出示的结果中，甘草皂苷在Vero细胞中诱导一氧化氮合酶且当培养基中加入一氧化氮供体(DETANONOate)时SARS相关冠状病毒复制受到抑制。
        6.2实施例2：甘草皂苷衍生物的抗SARS活性
甘草皂苷衍生物的合成
甘草皂苷的氨基酸衍生物(例如化合物6和化合物3)如文献所报导通过利用活化的N-羟琥珀酰亚胺酯来合成：L.A.Baltina等，甘草酸的转换。VIII.用氨基酸的叔丁基醚合成免疫调控糖肽；Russian J.Bioorg.Chem.，1994年，20(12)，778-784；Baltina L.A.等，甘草酸的转换。VII.含L型氨基酸烷基醚的三萜糖肽的合成，Khim.Prir.Soedin.，1994年，(20)，261-268；和R.M.Kondratenko等，含半胱氨酸的甘草酸衍生物的合成及免疫调控活性，Russian J.Bioorg.Chem.，2004，年，30(1)，61-67。
通过利用Gly-L-Val的叔丁基醚氢氧化物作为四氢呋喃的氨基组分在0℃在存在N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)-N-羟琥珀酰亚胺且碱(三乙胺)稍微过量(1mmol)的条件下进行化合物3的选择性合成。用CF3COOH解离叔丁基醚基团并用柱层析(CC)以50-53％的产量分离具有游离30-COOH功能的目的产物。
在R1和R2处含S-苯甲基-L-半胱氨酸的甘草皂苷氨基酸衍生物的选择性合成是通过利用L-Cys的叔丁基醚(SBn)氢氧化物作为四氢呋喃的氨基组分在0℃在存在N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)-N-羟琥珀酰亚胺且碱(三乙胺)稍微过量(1mmol)的条件下进行的。用CF3COOH解离叔丁基醚基团并用柱层析(CC)以50-53％的产量分离具有游离30-COOH功能的目的产物。
化合物7是通过甘草皂苷三甲基醚(L.A.Baltina等，甘草酸的转换。X.新的酯的合成，Zh.Org.Khim.，1994年，30(11)，1622-1626)与肼水合物在沸腾状态甲醇中的反应产生的，产量77％。
杂环酰胺化合物2和化合物4是通过甘草皂苷与5-氨基尿嘧啶(aminouracyl)和6-氨基-2-硫-尿嘧啶(uracyl)在存在DCC时反应而制备的。
β-甘草亭酸甲酯的β-D-吡喃基葡糖-(1→2)-β-D-吡喃葡糖苷是通过在文献所述的温和条件下在含NaBH4的甲醇中还原甘草皂苷三甲基醚而合成的：Baltina L.A.等，甘草酸的转换：3-O-[β-6′-脱氢-6′-氨基-D-吡喃基葡糖(1-2)-β-6″脱氢-6″-氨基-D-吡喃葡糖苷]-(3β，20β)-11-氧代-20-甲基羰基-18β-齐墩果-12-烯-3-醇的合成，Mendeleev Comm.，1995年，(5)，178-179。
化合物5是通过在温和条件下以DCC方式在DMF-吡啶混合物中偶联甘草皂苷和N-乙酰-β-D-吡喃糖胺而合成的。产物化合物5是通过产量为42％柱层析以均一(TLC)状态获得的。当将DCC和N-羟苯并三唑用于偶联反应时化合物5的产量较高(R.M.Kondratenko等，Russian J.Bioorg.Chem.，2004年，30(3)，1-8)。
所合成化合物的结构通过IR，UV，NMR 1H和13C光谱证实。
如上文实施例1所述检测不同甘草皂苷衍生物在Vero细胞中抗SARS相关冠状病毒的活性。不同甘草皂苷衍生物的活性如下表3中所示。
表3：化合物在Vero细胞培养中抗SARS相关冠状病毒的活性。
  衍生物   EC50μM   CC50μM   治疗指数I
  化合物6   35   1462   41
  化合物7   16   66   4
  化合物8   8   44   6
  化合物2   5   15   3
  甘草皂苷单铵盐   327   625   2
  化合物3   139   250   2
  化合物4   50   250   5
  化合物5   47   ＞2000   ＞43
6.3实施例3：甘草皂苷和利巴韦林的联合对SARS相关冠状病毒的协同作用
为了检测甘草皂苷和利巴韦林的联合对SARS相关冠状病毒的作用，用SARS相关冠状病毒B感染Vero细胞并分别用甘草皂苷、利巴韦林、以及甘草皂苷和利巴韦林的联合进行处理。如文献所述从感染了SARS相关冠状病毒的患者样品中获取SARS相关冠状病毒：Drosten等，2003年，New England Journal of Medicine 348(20)：1967-1976，将其完整收入本文作为参考。未处理的细胞用作对照。随后，在感染72小时后用60份甲醇和40份丙酮固定细胞。用过氧化物酶染色探测SARS患者血清中的病毒。结果如图2所示。图2(A)显示未处理的受感染细胞；图2(B)显示用50mg/L利巴韦林处理的受感染细胞；图2(C)显示用100mg/L甘草皂苷处理的受感染细胞；而图2(D)显示用50mg/L利巴韦林和100mg/L甘草皂苷处理的受感染细胞。
利巴韦林和甘草皂苷之间的协同作用使得所使用的两种化合物的浓度均较低。使用较低浓度的利巴韦林尤其有利，因为已知利巴韦林在较高浓度时是有毒的。
6.4实施例4：甘草皂苷衍生物的抗猫传染性腹膜炎病毒和抗可传染肠胃炎病毒活性
介绍
冠状病毒和动脉炎病毒感染包括人在内的哺乳动物的多个种属，所引起的疾病范围包括从脑炎到肠炎(Perlman S.，冠状病毒所诱发传染病的发病机理。病理学和免疫学综述。Adv Exp Med Biol.1998；440：503-13)。这些病毒中有些感染家畜并造成明显的发病率和死亡率，导致重大的经济损失。诸如可传染肠胃炎病毒(TGEV)、猪呼吸道和生殖道病毒、以及传染性支气管炎病毒等病原体都包括在此范围内。猫冠状病毒(FECV)通常不会引起高死亡率的感染，但在个别情况下，病毒突变成毒性更高的状态。猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)在年轻的猫中引起严重疾病。此疾病大多属于免疫病理学且被认为是冠状病毒研究的主要目标。
材料和方法
所有冠状病毒和猫肾细胞系均由维也纳兽医大学的Unger博士惠赠。将1×106个CRFK细胞(ATCC CCL-94)接种于装有MEM(+10％FCS，+1％非基本AS，+AB)的96孔板中。24小时后，当细胞汇合时用无FCS的MEM中的50ul FipV(猫传染性腹膜炎病毒)和TGEV(可传染胃肠炎病毒)感染细胞。在施加甘草皂苷衍生物之前将细胞于室温放置30分钟。
加入未感染的细胞以及用对照物质处理的细胞作为参照。将所述物质以1000uM起始的不同浓度稀释于96孔板中并将50ul转移至检测平板中。将细胞于37℃保温过夜。48小时后通过显微镜观察确定CPE(细胞病变效应)。用标准测定法检测细胞的增殖活性，例如细胞滴定96Aqueous增殖测定法(Promega)。
结果
甘草皂苷单铵盐和甘草皂苷衍生化合物5的FipV和TFEV EC50值分别如表4中所示。在低于指定浓度的浓度观察到部分抑制。此外，用标准的TCID50测定法滴定用GA或GA+M-21-1(met)处理的受感染细胞的上清液。对于FipV和TGEV而言，化合物5在100μM至500μM范围内的所有检测浓度均观察到将病毒复制显著减少了超过一个数量级。对于FipV和TGEV而言，当甘草皂苷浓度500μM时病毒复制均显著减少。
表4
  甘草皂苷衍生物   EC50μM，FipV   EC50μM，TGEV   Tox，CRFK cells
  甘草皂苷单铵盐   ＜500μM   ＜500μM   ＞1mM
  化合物5   ＜100μM   ＜100μM   ＞1mM
结论
甘草皂苷单铵盐和甘草皂苷衍生化合物5不仅以剂量依赖的形式保护细胞免于病毒诱发的死亡，还抑制了FipV和TGEV在CRFK细胞中的病毒复制。因此，甘草皂苷单铵基盐和甘草皂苷衍生化合物5对于生产针对由所述冠状病毒引起的疾病的兽医用药是有用的。
等同物
本发明并不限于实施例中所公布的具体实施方案的范围，这些实施例只是用于说明本发明的一些方面，而且任何实施方案在本发明范围内所起的作用都是同等的。确实，除了本文的显示和描述以外，还有多种有关本发明的修改方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且也认为属于所附权利要求的范围内。
本文引用了一些参考文献，将它们完整公开书全文收入本文作为参考。

Claims (20)

1.治疗SARS相关冠状病毒感染或改善其一种或多种症状的方法，所述方法包括对感染了SARS相关冠状病毒的人施用治疗有效量的甘草皂苷或其衍生物。
2.权利要求1的方法，其中甘草皂苷的衍生物是通式I的化合物：
其中R1、R2、和R3独立地是-OH、5，6或7元杂环、-甘氨酸-亮氨酸、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环。
3.权利要求2的方法，其中R1、R2、和R3各自是：
Figure A2004800190310003C1
4.抑制或减少SARS相关冠状病毒复制的方法，所述方法包括使细胞接触有效量的甘草皂苷或其衍生物。
5.抑制或减少SARS相关冠状病毒粒子产生的方法，所述方法包括使细胞接触有效量的甘草皂苷或其衍生物。
6.权利要求1、2、3、4、或5的方法，其中甘草皂苷或其衍生物是纯化的。
7.权利要求1、4、或5的方法，其中甘草皂苷衍生物是18β-甘草酸。
8.权利要求1的方法，其中感染了SARS相关冠状病毒的人是老年人、婴幼儿、或无免疫应答的人。
9.权利要求1的方法，还包括施用治疗有效量的不同于甘草皂苷或其衍生物的抗病毒剂。
10.权利要求9的方法，其中不同于甘草皂苷的抗病毒剂是利巴韦林。
11.预防SARS相关冠状病毒感染的方法，所述方法包括对有需要的人施用预防有效量的甘草皂苷或其衍生物。
12.权利要求11的方法，其中甘草皂苷或其衍生物是纯化的。
13.权利要求11的方法，其中受试者曾经暴露于SARS相关冠状病毒感染。
14.权利要求11的方法，其中甘草皂苷衍生物是18β-甘草酸。
15.通式I的化合物：
Figure A2004800190310004C1
或其药用可接受盐，其中R1、R2、和R3是N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R4不是噻唑、尿嘧啶或
16.通式I的化合物：
或其药用可接受盐，其中R1和R2中的一个是：
Figure A2004800190310005C2
而R3及R1和R2中的另一个独立地是-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、氨基酸、肽、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
17.通式I的化合物：
或其药用可接受盐，其中R1、R2、和R3中的一个是氨基酸或肽，而R1、R2、和R3中的另两个独立地是-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元杂环(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元杂环(取代或未取代的)。
18.通式I的化合物：
或其药用可接受盐，其中R1、R2和R3是：
Figure A2004800190310007C2
19.通式I的化合物：
Figure A2004800190310008C1
或其药用可接受盐，其中R1、R2、和R3独立地是5，6或7元杂环(取代或未取代的)，附带条件是R1、R2和R3不全是脯氨酸。
20.治疗SARS相关冠状病毒感染或改善其一种或多种症状的方法，所述方法包括对感染了SARS相关冠状病毒的人施用治疗有效量的权利要求15-19任一项的化合物。
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