CN117122693A - 经酸酐修饰的蛋白质抑制痘病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在体外抑制痘病毒生长、预防或控制痘病毒感染的方法。本发明还提供了经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在药物制备中的用途。蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3‑羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。经酸酐修饰的蛋白质可以在体内或体外有效抑制痘病毒，且对细胞无毒，提供了有效控制痘病毒感染，特别是阻断近期猴痘病毒新毒株流行的新方法。

Description

经酸酐修饰的蛋白质抑制痘病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及酸酐修饰的蛋白质预防和控制痘病毒的方法。
背景技术
痘病毒是一类结构较为复杂的DNA病毒，其基因组是线性双链的dsDNA，具有高传染性和感染性，感染后会出现发热、出疹、咳嗽等症状。痘病毒科的多个种属都可以感染人类，历史上痘病毒对人类的危害包括导致天花、水痘、猴痘等传染病，其中天花已经被全球消灭，而猴痘仍在非洲和美洲流行，并在2022年出现世界范围内的疫情大爆发。此外，痘病毒还会感染动物，如牛、羊、猪等家畜，其中羊痘和猪痘等动物疾病也是严重的流行病。因此，对痘病毒监测与防控对于维护人类公共卫生安全至关重要。
在2022年，大约70个国家和地区先后报告了猴痘病例的出现，其中部分包括欧洲国家和美国，而此前持续性猴痘传播主要发生在非洲。这种跨域传播的新情况引起了世界卫生组织(WHO)的高度重视，紧急宣布2022年猴痘的爆发是国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)，时隔数年的痘病毒大流行再次引发人们的关注。调查研究表明，猴痘会引起类似于天花的症状，但表现通常比天花更温和——其前期症状表现为身体多处乏力、发热、肿痛，而淋巴结肿大是猴痘而非天花的典型表现；前期过后，即出现典型皮疹，并会迅速从面部蔓延至全身；同时，猴痘会使人更容易患上其他感染，某些患有猴痘的人会在皮肤和肺部发生细菌感染。尽管症状较为温和，但据研究表明，猴痘的死亡率仍接近10％。推测可能由于猴痘病例的聚集性与猴痘病毒的传播方式都相对独立，监测难度较大，由此带来的病毒突变与进化也无法准确预知。虽然猴痘自1958年发现至今已流行将近70年，但由于疏于防控，仍不可避免地造成了当下的大流行。
研究结果表明，2022年至今引发猴痘大流行的猴痘病毒，相较于之前的毒株已发生了不同程度的核苷酸突变及基因缺失，本次疫情的流行株属于猴痘病毒新毒株，其进化速度快于正常的进化速度，意味着持续突变的可能性。因此，亟需积极有效的针对性预防与治疗措施。目前有两种获得许可的曾用于预防天花的疫苗可用于预防猴痘：ACAM2000和JYNNEOS，ACAM2000是一种活牛痘病毒，可以在体内复制，容易引起严重的副作用；JYNNEOS是一种减毒的非复制型牛痘疫苗，安全系数相对较高。相较于预防措施，猴痘的治疗措施却十分有限，抗病毒药物替韦立马、西多福韦或布林西多福韦可能有利于缓解猴痘症状，但尚未作为猴痘的针对性治疗药物用于临床。
从历史上的防控手段中可以得知，针对目前流行的猴痘病毒与未来可能引发大流行的其他痘病毒，均以预防为主，暂无针对痘病毒的特效药物。因此，亟需研发一种安全、有效的针对痘病毒的治疗性药物，这对于控制未来可能再次出现的痘病毒大流行具有深远意义。
发明内容
2022年至今引发猴痘大流行的猴痘病毒，相较于之前的毒株已发生了不同程度的核苷酸突变及基因缺失，本次疫情的流行株属于猴痘病毒新毒株，其进化速度快于正常的进化速度，意味着持续突变的可能性。目前对于这种猴痘病毒新毒株的研究还处于起步阶段。本发明部分基于发明人的如下发现，经酸酐修饰的蛋白质可以有效抑制猴痘病毒新毒株和痘病毒。
在本发明之前，发明人和其他科技工作者发现经酸酐修饰的蛋白质具有较好的抗HPV、HIV、HSV以及冠状病毒等病毒的活性，具备开发成为抗病毒药物的巨大潜力。
CN105031623A公开了生物制剂及在制备预防和控制埃博拉病毒的药物中的应用。该专利公开了一系列生物制剂对埃博拉病毒的治疗效果，表明酸酐修饰的HSA、OVA、BSA、MAS、β-LG对Zaire型和Sudan型假病毒具有抑制效果，其中HSA衍生物具有最佳的抑制效果，表明了不同类型的酸酐修饰的蛋白质对不同埃博拉病毒毒株具有差异的抑制效果。
CN112316152B公开了经酸酐修饰的蛋白质抑制冠状病毒的方法。该专利表明经酸酐修饰的蛋白质抑制新型冠状病毒，但是也证明了对中东呼吸综合征的MERS-CoV活性很弱，且不同修饰策略和不同蛋白的酸酐修饰都具有较大效果差异。
Chen Hua等人(Chen Hua等人，Front Microbiol.2019；10:2188)先前证明了3-羟基邻苯二甲酸酐(3HP)修饰的牛β-乳球蛋白(3HP-β-LG)在抑制高风险和低风险人HPV的假病毒进入靶细胞方面非常有效。阴道内应用含3HP-β-LG的阴道凝胶可显著抑制HPV感染，降低宫颈区域的病毒载量。发现3HP-β-LG与HPV L1蛋白中的带正电区域结合，表明3HP-β-LG通过1HP-β-LG中带负电荷的区域与HPV L3蛋白中的带正电区域之间的相互作用与HPVL1蛋白结合，从而竞争性地阻断HPV与阴道粘膜基底膜受体的结合。该文献证明了3HP修饰的鸡卵清蛋白(3HP-OVA)也带有高净负电荷，但没有表现出抗HPV活性。该文献指出3HP修饰的蛋白与HPV L1蛋白之间的相互作用依赖于两种蛋白质中结合位点的静电和可匹配构象。
先前还证明了3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的牛β-乳球蛋白(3HP-β-LG)有效抑制不同甲型和乙型流感病毒感染，认为3HP-β-LG可能通过其带负电荷的残基与流感病毒HA的血凝素1(HA1)亚基中的受体结合结构域结合，从而抑制HA与宿主细胞上唾液酸的附着(Yuhong Fu等人，Viruses.2022Sep；14(9):2055)。鼻内给药3HP-β-LG可保护小鼠免受甲型H1N1流感/PR8、甲型H3N2和甲型H7N9流感病毒的攻击。牛乳铁蛋白(bLf)已被证明可以通过其C叶与病毒HA中含有高度保守区域的融合肽相互作用来抑制流感病毒H1N1和H3N2的感染，从而阻断病毒与宿主细胞的融合并防止流感病毒诱导的致病作用。通过亲核取代化学反应对3HP进行β-LG修饰，能够使β-LG中带正电荷的碱性氨基酸成为3HP-β-LG中带负电荷的酸性氨基酸，导致净负电荷显著增加，可以增强3HP-β-LG与病毒HA的结合亲和力。发明人认为流感病毒的HA中可以与3HP-β-LG相互作用的区域对于3HP-β-LG的作用机制至关重要。
先前还证明了3HP-β-LG可以预防和治疗SARS-CoV-2感染(Chen Hua等人，SignalTransduction and Targeted Therapy volume 6,Article number:318(2021))。发明人认为3HP-β-LG和SARS-CoV-2刺突蛋白RBD之间的结合竞争性地阻断了RBD和细胞上ACE2受体之间的相互作用，来实现预防和治疗的效果。
发明人先前发现3HP-β-LG在甲流病毒和乙流病毒，以及不同甲流病毒株之间的效果差异(见CN109675042A)。
猴痘病毒与先前验证的HPV、HIV、HSV以及冠状病毒没有共同的表面蛋白，如HPVL1蛋白、刺突蛋白RBD或血凝素1(HA1)亚基等。
发明人先前还发现不同修饰策略和不同蛋白的酸酐修饰对不同病毒种或病毒株都具有较大效果差异。特别地，发明人先前发现酸酐修饰的蛋白对中东呼吸综合征的MERS-CoV活性很弱。尚未报道酸酐修饰的蛋白是否可阻断病毒进入细胞。因此，发明人在本发明前预测酸酐修饰的蛋白对猴痘病毒可能不具备抑制活性，或者至少不能与先前验证的病毒一样有效地抑制猴痘病毒。基于此，在猴痘疫情大规模爆发后，发明人便开展了酸酐修饰的蛋白质对猴痘病毒抑制活性的相关研究。与发明人的最初设想不同，发明人在实验过程中发现经酸酐修饰的蛋白质(3HP-β-LG)具有优良的抗猴痘病毒与痘苗病毒天坛株的活性并将相关结果在本发明中进行展示。
由于本次猴痘的流行株属于猴痘病毒的新毒株，研究学者对其诸多特征仍然未知，特效药物的研发速度也相对较缓，且目前尚未出现酸酐修饰的蛋白质在痘病毒层面的应用，因此本发明的相关研究具有前瞻性与创新性。基于发明人团队丰富的药物研发经验，本发明首次鉴定了经酸酐修饰的蛋白质对猴痘病毒新毒株及痘苗病毒天坛株具有优良的抗病毒活性，相关修饰策略及抗病毒活性结果也为相关药物开发提供了科学依据。
本发明的目的是针对痘病毒特异性药物的缺乏和不足状况，提供一种新型的预防和控制痘病毒感染的生物药物制剂。本发明的研究结果表明，经酸酐修饰的蛋白质(3HP-β-LG)具有优良的抗猴痘病毒与痘苗病毒天坛株的活性，为后续药物开发奠定了夯实的研究基础。
具体而言，本发明通过以下实施方案解决了领域内预防和控制痘病毒感染的关键科学问题：
在一方面，提供了经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在体外抑制痘病毒生长、预防或控制痘病毒感染的方法，所述方法包括使所述经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物与含有、疑似含有或有风险含有痘病毒的物品或样品接触的步骤；
其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。
在一个实施方案中，根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。
在一个实施方案中，样品选自痘病毒感染者呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、尿液、粪便、体液或培养液。
在一个实施方案中，物品选自痘病毒感染者个人物品、痘病毒感染者接触过的公共物品、痘病毒感染者所用润滑剂与避孕套。
在一个实施方案中，痘病毒是任一痘病毒。
在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。
在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。优选地，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。
在一个实施方案中，β乳球蛋白是牛β乳球蛋白。在一个实施方案中，白蛋白选自血清白蛋白或卵清蛋白，优选人血清白蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白。在一个实施方案中，纤维蛋白原是牛纤维蛋白原。在一个实施方案中，胶原蛋白选自胶原蛋白Ⅰ-III型。在一个实施方案中，RNA酶选自RNA酶1或RNA酶7。
在一个实施方案中，组合物为溶液、酊剂、醑剂、粉末剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、凝胶或气雾剂的形式。
在一个实施方案中，经酸酐修饰的蛋白质通过使所述酸酐与所述蛋白质混合制备。
在另一方面，提供了经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防受试者中的痘病毒感染或由痘病毒感染引起的疾病。还提供了治疗或预防受试者中的痘病毒感染或由痘病毒感染引起的疾病的方法，其包括施用酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物。在一个实施方案中，该用途或方法通过阻断或封闭包括A29L的表面蛋白实现。组合物还可以包含抗痘病毒(例如猴痘病毒)药物，例如替韦立马、西多福韦或布林西多福韦。
在一个实施方案中蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。
在一个实施方案中根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。
在一个实施方案中，痘病毒是任一痘病毒。
在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。
在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。优选地，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。
在一个实施方案中，β乳球蛋白是牛β乳球蛋白。在一个实施方案中，白蛋白选自血清白蛋白或卵清蛋白，优选人血清白蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白。在一个实施方案中，纤维蛋白原是牛纤维蛋白原。在一个实施方案中，胶原蛋白选自胶原蛋白Ⅰ-III型。在一个实施方案中，RNA酶选自RNA酶1或RNA酶7。
在一个实施方案中，药物是片剂、胶囊、粉剂、滴鼻剂或气雾剂的形式，或者溶液、酊剂、醑剂、粉末剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、凝胶或气雾剂的形式。
在一个实施方案中，经酸酐修饰的蛋白质通过使所述酸酐与所述蛋白质混合制备。
在又一个方面，提供了封闭痘病毒的表面蛋白的方法，所述方法包括使所述经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物与痘病毒接触的步骤，所述表面蛋白包括A29L或A27蛋白。A29L可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。在一个实施方案中，根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。在一个实施方案中，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。
在又一个方面，提供了经酸酐修饰的蛋白质作为痘病毒A29L、A27蛋白或其同源物的结合剂的用途，其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。在一个实施方案中，根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。在一个实施方案中，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。相对于痘病毒的其他膜蛋白，经酸酐修饰的蛋白质可以选择性结合痘病毒A29L、A27蛋白或其同源物。结合剂可以为选择性结合剂。
本发明的优点包括：
1.发明人首次发现了酸酐修饰的蛋白质可用于预防猴痘病毒和/或痘苗病毒感染和/或治疗猴痘病毒和/或痘苗病毒感染或其相关的疾病。
2.发明人首次发现了酸酐修饰的蛋白质可以阻断或封闭猴痘病毒和/或痘苗病毒的表面蛋白A29L或A27蛋白。
3.发明人发现酸酐修饰的蛋白质可以以高效(IC50低于100μg/ml)抑制猴痘病毒和/或痘苗病毒，优于一些先前已经验证的病毒株的抑制效果(例如CN109675042A中的乙型流感，如B/Florida/2006；CN 111053892 A中的肠道病毒，如CV-A16病毒)。
4.与无明显抑制效果的Su-β-LG和ML-β-LG相比，3HP-β-LG和3HP-FG可以高效(IC50低于100μg/ml)抑制猴痘病毒和/或痘苗病毒。
附图说明
图1表示3HP-β-LG和β-LG针对猴痘病毒48h时的感染抑制曲线(qPCR法)。
图2表示3HP-β-LG和β-LG针对猴痘病毒96h时的感染抑制曲线(qPCR法)。
图3表示3HP-β-LG和β-LG针对猴痘病毒96h时的感染抑制空斑图。
图4表示3HP-β-LG和β-LG针对猴痘病毒96h时的感染抑制曲线(空斑法)。
图5表示3HP-β-LG、3HP-FG和β-LG针对天坛痘苗病毒的感染抑制空斑图。
图6表示3HP-β-LG、3HP-FG和β-LG针对天坛痘苗病毒的感染抑制曲线(空斑法)。
图7表示Su-β-LG和ML-β-LG针对天坛痘苗病毒的感染抑制曲线。
图8表示3HP-β-LG和β-LG的细胞毒性实验结果。
图9表示3HP-β-LG、β-LG和猴痘病毒蛋白A29L的结合曲线(ELISA法)。
图10表示3HP-β-LG、β-LG和猴痘病毒蛋白A35R的结合曲线(ELISA法)。
图11表示3HP-β-LG、β-LG和猴痘病毒蛋白L1R的结合曲线(ELISA法)。
图12表示3HP-β-LG、β-LG和猴痘病毒蛋白M1R的结合曲线(ELISA法)。
图13表示3HP-β-LG、β-LG和猴痘病毒蛋白H3L的结合曲线(ELISA法)。
图14表示3HP-β-LG、β-LG和猴痘病毒蛋白A29L的结合曲线(BLI法)。
具体实施方式
本发明的一个或多个实施方案的细节在本文中阐述。本发明的其他特征、目的和优势将通过发明详述、实施例和实施方案变得明显。提供以下描述以帮助理解本发明。
如本文中使用，“经酸酐修饰的蛋白质”指酸酐衍生化/修饰的蛋白质，蛋白质可以选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶。酸酐可以选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。蛋白质的酸酐修饰程度可以通过对蛋白质的精氨酸和/或赖氨酸修饰比率测定。经酸酐修饰的蛋白质制备以及酸酐修饰程度对于本领域技术人员是已知的。例如参见中国专利申请CN201210066696.9和CN201810691093.5。在本文中，通过蛋白质的精氨酸和/或赖氨酸修饰比率测得的蛋白质的酸酐修饰程度可以独立为100％，99％，95％，93％，92％，90％，85％，80％等等。本领域技术人员可以根据酸酐修饰/衍生化比率适当调节各组分的比率。优选地，蛋白质的酸酐修饰程度可以为100％。在本文中，可以如下制备经酸酐修饰的蛋白质，优选3-羟基-邻苯二甲酸酸酐修饰的牛β乳球蛋白：(1)配制0.1M的磷酸氢二钠，调节pH为8.5，过0.2μm的滤膜过滤除菌；(2)将牛β乳球蛋白(β-LG)粉末溶解在配好的磷酸氢二钠溶液中，使浓度为20mg/ml；(3)将3-羟基-邻苯二甲酸酸酐(3HP)溶解在DMSO中，使浓度为1M；(4)将终浓度为12mM的酸酐加入到牛β乳球蛋白溶液中；立即混匀；(5)利用5M的氢氧化钠溶液调节pH，使pH为8.5-9之间；(6)室温静置20min；(7)重复步骤4-6四次，使酸酐的最终加入浓度为60mM；(8)最后一次加入酸酐后，在室温静置2h，使酸酐充分反应；(9)将修饰好的酸酐化蛋白装入透析袋(7.5kDa)，置于PBS中进行透析48h，期间置换PBS缓冲液三次；(10)利用10kDa的超滤管对透析后的蛋白进行超滤浓缩。
如本文中使用，猴痘病毒(MPXV)与痘苗病毒天坛株(VTT)均属于痘病毒科正痘病毒属成员，前者是引起近期流行的传染性和皮疹性疾病——猴痘的病原体，后者曾在天花运动时期被广泛用作天花预防疫苗的抗原。以MPXV为详细示例，MPXV属于正痘病毒属脊索痘病毒亚科，是具有细胞外包膜病毒粒子(EV)、基因组为线性双链DNA的病毒，与痘病毒科(POXV)的其他成员一样呈桶状，直径约为250nm，比大多数其他已知病毒大。根据世界卫生组织(WHO)的描述，猴痘有两个不同分支：分支I和分支II。在2022-2023年发生的全球猴痘疫情是由一种名为IIb分支的病毒株引起的。在本文中，猴痘病毒可以为分支I和分支II的猴痘病毒株，特别可以是IIb分支的猴痘病毒株或MPXV-B.1猴痘病毒株(例如MPXV-B.1.-China-CDC-Tan-CQ01)。
可以采用常规的药物实践来提供合适的配制剂或组合物，以施用于患有痘病毒感染的受试者。可以采用任何合适的施用途径，例如，胃肠外的、静脉内的、皮下的、肌肉内的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、囊内的、脊柱内的、鞘内的、脑池内的、腹膜内的、鼻内的、气雾、表面的或口服施用。治疗用配制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服施用，配制剂可以是片剂或胶囊的形式；对于鼻内的配制剂，可以是粉剂、滴鼻剂或气雾剂的形式。
本领域公知的制备配制剂的方法可以见例如“Remington’sPharmaceuticalSciences”(第19版)，A.Gennaro编，1995，Mack Publishing Company，Easton，Pa。胃肠外施用的配制剂可以例如含有赋形剂、无菌水或盐水、聚(亚烃基)二醇诸如聚乙烯乙二醇、植物油或氢化的萘。生物相容的、生物可降解的丙交脂聚合物、丙交脂/乙交脂共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。其它潜在有用的胃肠外投递系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统、和脂质体。吸入施用的配制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是以滴鼻剂形式或作为胶体施用的油性溶液。
在本文中，经酸酐修饰的蛋白质可以制备为组合物，例如溶液、酊剂、醑剂、粉末剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、凝胶或气雾剂的形式；例如溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉。
本发明提供了预防或控制痘病毒感染的组合物，优选是生物制剂，其含有经酸酐修饰的蛋白。酸酐修饰过的蛋白是酸酐和蛋白的混合物。本文中使用的蛋白质是牛β乳球蛋白(bovine beta-lactoglobulinβ-LG)。生物制剂可以使用3-羟基-邻苯二甲酸酸酐(3-hydroxyphthalic anhydride,3HP)制备。
在本文中，酸酐溶液为将酸酐粉末溶解在DMSO中，浓度可为0.5-10M，优选1M。
上述蛋白溶液可以为将蛋白溶解在磷酸盐缓冲液中制备。磷酸盐缓冲液包括但不限于磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠等。优选磷酸氢二钠。磷酸盐缓冲液pH可以是7-10，优选8.5。蛋白浓度可以是5mg/ml-100mg/ml，优选20mg/ml。酸酐处理后的蛋白的pH应大于7，优选8.5，从而可以充分让酸酐修饰。
组合物剂型可以选自：溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉。
本文提供了在体外使用酸酐化蛋白抑制痘病毒的感染的方法，其中所选蛋白为乳球蛋白，优选牛β乳球蛋白。
痘病毒可在痘病毒感染者呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、尿液、粪便以及其它体液等分离。
在本文中，酸酐为3-羟基-邻苯二甲酸酸酐。酸酐溶液可以为将酸酐粉末溶解在DMSO中制备，浓度可为0.5-10M，优选1M。磷酸盐缓冲液可以包括但不限于磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠等。优选磷酸氢二钠。磷酸盐缓冲液pH可以是7-10，优选8.5。
在本发明中，通过对精氨酸和赖氨酸修饰率的测定，所用的酸酐化蛋白是完全被酸酐化的。
关于本发明的方法或用途
猴痘病毒为砖型双膜结构，可呈现2种形态，分别为胞内成熟病毒体IMV(intracellular mature virion)和胞外包膜病毒体EEV(extracellular envelopedvirus)，具有不同的表面膜蛋白表达谱。猴痘病毒具有不同表面蛋白，包括痘苗病毒L1R(猴痘病毒同源蛋白为M1R)、A27L(猴痘病毒同源蛋白为A29L)、A33R(猴痘病毒同源蛋白为A35R)、B5R(猴痘病毒同源蛋白为B6R)、H3L(猴痘病毒同源蛋白为H3L)、D8L(猴痘病毒同源蛋白为E8L)等，其中M1R、A29L、H3L、D8L为IMV的表面蛋白，A35R、B6R为EEV表面蛋白。
猴痘病毒或痘苗病毒与发明人先前验证的HPV、HIV、HSV以及冠状病毒等具备不同的形态，并且也具备不同的表面蛋白。发明人在酸酐修饰的蛋白质的长期研究中发现对于不同的病毒属，酸酐修饰的蛋白质通过不同的作用机制发挥抑制效果，因此具有不同的抑制效果。根据对某种病毒属的抑制效果，难以确认对另一种病毒属的抑制效果。例如，3HP修饰的鸡卵清蛋白(3HP-OVA)也带有高净负电荷，但没有表现出抗HPV活性(Yuhong Fu等人，Viruses.2022Sep；14(9):2055)。相反，在CN105031623A中，3HP-OVA对埃博拉病毒株具有抑制活性。同样，发明人发现3HP-β-LG对不同冠状病毒具有不同效果：对MERS-CoV无抑制效果，而对SARS-CoV-2具有抑制效果。此外，不同酸酐修饰的蛋白质种类对病毒也具备不同的效果。因此，酸酐修饰的蛋白质对某种病毒是否具备抑制效果的预测具有一定的难度。由于猴痘病毒或痘苗病毒的独特形态和表面蛋白表达，本领域技术人员根据现有技术可能会倾向于认为酸酐修饰的蛋白质对猴痘病毒或痘苗病毒无有效的抑制活性。
本发明人在酸酐修饰的蛋白质中发现3HP-β-LG可以高效抑制猴痘病毒或痘苗病毒。
实施例
提供以下实施例来阐述本发明。本领域技术人员应当理解实施例仅仅是例示性的，而非限制性的。本发明仅仅由所附权利要求书的范围限定。
实施例1：酸酐修饰的蛋白质的制备
1.1酸酐修饰的蛋白质的制备
(1)将3-羟基-邻苯二甲酸酐(3HP)用二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为1M的母液；
(2)配制浓度为0.1M的磷酸氢二钠溶液(pH8.5)，加入牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，缩写为β-LG)或其他蛋白(如牛纤维蛋白原FG)制成β-LG(或者FG)溶液，蛋白溶液浓度为20mg/ml；
(3)将步骤(1)中制备的酸酐溶液加入待修饰的蛋白溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用4M NaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；
(4)重复进行步骤(3)共五次，每次酸酐终浓度分别为12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即最终使溶液中酸酐的终浓度为60mM，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；
(5)将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液(4℃)，共透析48h，中间更换透析外液一次，将完成溶液置换的酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
β-LG蛋白是否完全修饰可通过分子量大小判断。经酸酐HP修饰后的β-LG，其分子量会增加，修饰完全后的β-LG分子量增到最大，不再增加，可在SDS-PAGE显示。类似地，用马来酸酐(maleic anhydride,ML)或琥珀酸酐(succinic anhydride,SU)(购自Sigma，货号分别为603902和63200)替换步骤(1)中3-羟基-邻苯二甲酸酐，和/或用人血清白蛋白(humanserum albumin,HSA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)或RNA酶I(RNaseI)(购自Sigma，货号分别是A9731，A1933，A5378和R4875)替换步骤(2)中的β-LG。制备出多种经酸酐化修饰后的蛋白：3HP-β-LG,3HP-HSA,3HP-OVA,ML-β-LG,ML-HSA,ML-OVA,SU-β-LG,3HP-BSA,SU-HSA,SU-OVA及3HP-RNaseI，除透析所用透析袋及浓缩选用超滤管的大小不同外，其制备条件与3HP-β-LG制备条件相同。其中，β-LG、ML-β-LG和SU-β-LG所用透析袋为3.5KD，超滤管为3KD；OVA、3HP-OVA、ML-OVA、SU-OVA、RNaseI和3HP-RNaseI所用透析袋为8KD，浓缩所用离心管为10KD；HSA、3HP-HSA、ML-HSA和SU-HSA所用透析袋为8KD，浓缩所用离心管为30KD。
1.2经酸酐修饰的蛋白质浓度测定
将上述制备得到的酸酐化蛋白样品按照BCA蛋白浓度分析试剂盒的操作步骤测定浓度，具体方法如下：
(1)使用PBS溶液稀释蛋白标准品(BSA)，使BSA终浓度为0、0.1、0.2、0.4、1、2mg/mL；
(2)分别将20μl各浓度标准品和20μl待测样品(使用PBS进行稀释)加入96孔板中；
(3)制备BCA工作液，将A液与B液按1：50比例混匀；
(4)每孔加入200μl工作液，轻柔混匀，37℃孵育20min；
(5)待冷却至室温后，使用酶标仪在562nm处读取各孔吸光度；
(6)根据蛋白标准品OD读数，使用Excel和GraphPad Prism 8软件绘制蛋白浓度标准曲线，根据标准曲线及对应公式计算酸酐化蛋白样品浓度。
本实施例中使用的经酸酐修饰的蛋白质为发明人先前制备并且测定为完全酸酐化的(可见例如中国专利申请CN201210066696.9、CN201810691093.5和CN109675042A)。
实施例2：经酸酐修饰的蛋白质对痘病毒活病毒的抑制效果
2.1活病毒的扩增
猴痘病毒MPXV-B.1.-China-CDC-Tan-CQ01(由中国疾病预防控制中心从临床病例体内分离得到)和天坛痘苗病毒VTT(受赠于深圳湾传染病研究所太万博老师实验室)的扩增方法具体如下：将靶细胞Vero(MPXV)或BHK-21(VTT)传代至细胞培养瓶，待细胞密度达到90％以上时弃掉细胞上清，加入病毒原液，之后在37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育1h，再加入10ml含2％ FBS的DMEM继续培养至细胞完全病变，回收上清，过滤后分装保存至-80℃冰箱备用。
2.2酸酐化蛋白的抗病毒活性
2.2.1酸酐化蛋白对猴痘病毒的抑制效果
q-PCR法：
提前一天将Vero细胞按2×104个/孔的密度铺入96孔板，在37℃，5％CO2细胞培养箱中过夜培养。用无血清的DMEM将完全酸酐化的3HP-β-LG和β-LG稀释至预定的浓度梯度，与稀释到100PFU/100μL的猴痘病毒混合，在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育1h后，加入预先铺好的靶细胞96孔板中，继续培养48-96h后，记录细胞病变(CPE)的情况，之后将细胞板密封后放入-80℃冰箱中反复冻融3次。冻融完成后提取总DNA(TIANGEN，#DP304)，采用猴痘病毒F3L特异性引物探针进行qPCR检测，根据标准曲线计算病毒拷贝数，药物抑制率＝(病毒阳性对照孔拷贝数-实验孔拷贝数)/病毒阳性对照孔拷贝数×100％，使用GraphPad Prism计算50％抑制效果对应的药物浓度即为药物的IC50。
猴痘病毒F3L特异性引物探针：
正向5'-CATCTATTATAGCATCAGCATCAGA-3'
反向5'-GATACTCCCTCGTTGGTCTAC-3'
探针5'-FAM/TGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATT/BHQ1-3'。
qPCR检测条件：50℃扩增2分钟，95℃孵育15分钟，在94℃孵育1分钟和60℃孵育1分钟之间循环45次。
结果参见图1和图2。如图1和图2中所示，在Vero细胞中，利用qPCR法检测的3HP-β-LG在感染48h时IC50是60.40μg/ml，在感染96h时IC50是57.36μg/ml，而β-LG在感染48h和96h时的IC50都大于200μg/ml。qPCR法显著地说明相比于β-LG，3HP-β-LG具有显著的抑制猴痘病毒感染的作用。
空斑法：
提前一天将Vero细胞按2×105个/孔的密度铺入12孔板，在37℃，5％CO2细胞培养箱中过夜培养。用无血清的DMEM将3HP-β-LG和β-LG稀释至预定的浓度梯度，与稀释到100PFU/100μL的猴痘病毒混合，在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育1h后，加入预先铺好的靶细胞12孔板中，继续培养72-96h后，加入0.1％结晶紫-固定液，室温静置30min后弃固定-染色液，每孔加入1ml ddH2O洗涤1遍，使用4％PFA多聚甲醛充分浸泡后取出P3实验室。晾干后拍照计数空斑，计算抑制率，药物抑制率＝(病毒对照孔空斑数-实验孔空斑数)/病毒阳性对照孔空斑数×100％，运用GraphPad Prism计算空斑减少50％时对应的药物浓度即为药物的IC50。
结果参见图3和图4。如图3和图4中所示，在Vero细胞中，利用空斑法检测的3HP-β-LG在感染96h时的IC50是22.67μg/ml，而β-LG的IC50大于200μg/ml。空斑法也显著地说明相比于β-LG，3HP-β-LG具有显著的抑制猴痘病毒感染的作用。MPXV-B.1猴痘病毒株是相较于之前的毒株已发生了不同程度的核苷酸突变及基因缺失，本次疫情的流行株属于猴痘病毒新毒株，其进化速度快于正常的进化速度，意味着持续突变的可能性。本实施例的结果表明3HP-β-LG可以有效抑制该新猴痘病毒株，是出乎意料的效果。
2.2.2酸酐化蛋白对天坛痘苗病毒的抑制效果
提前一天将BHK-21细胞(来自中国科学院细胞库，保藏目录号GNHa10)按2×105个/孔的密度铺入24孔板，在37℃，5％CO2细胞培养箱中过夜培养。用无血清的DMEM将3HP-β-LG、3HP-FG和β-LG、Su-β-LG和ML-β-LG稀释至预定的浓度梯度，与稀释到100PFU/100μL的天坛疫苗病毒(VTT)病毒混合，在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育1h后，加入预先铺好靶细胞的24孔板中继续培养，在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育2h后，弃上清，加入含2％ FBS的DMEM继续培养。换液之后48h弃上清，加入4％PFA多聚甲醛，在37℃固定2h后弃上清，加入1％结晶紫溶液，室温静置2h。晾干后拍照计数空斑，计算抑制率，药物抑制率＝(病毒阳性对照孔空斑数-实验孔空斑数)/病毒阳性对照孔空斑数×100％，运用GraphPad Prism计算空斑减少50％时对应的药物浓度即为药物的IC50。
结果参见图5-图7。如图5和图6中所示，在BHK-21细胞中，利用空斑法检测的3HP-β-LG在感染48h时的IC50是1.29μg/ml，3HP-FG在感染48h时的IC50是2.51μg/ml，而β-LG的IC50大于200μg/ml。该结果显著地说明相比于β-LG，3HP-β-LG、3HP-FG具有显著的抑制VTT病毒感染的作用。如图7所示，在BHK-21细胞中，利用空斑法检测的Su-β-LG和ML-β-LG的IC50均大于200μg/ml。该结果说明存在不具备抑制VTT病毒感染作用的酸酐蛋白，3HP-β-LG、3HP-FG的抗病毒作用是意料不到的收获。
2.3酸酐化蛋白的细胞毒性检测
根据靶细胞形态大小将其预铺于96孔板中(1×105/孔左右)，待细胞长满后，弃上清。用无血清的DMEM将药物稀释至预定的浓度梯度，加入预先铺好的靶细胞96孔板中，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养过夜后换液(含2％FBS的DMEM)，加入药物72h后弃上清，用PBS清洗一次后加入用DMEM稀释好的CCK8工作液(将原液进行20倍稀释)，50μL/孔，37℃孵育30min后使用酶标仪读数(OD450nm，参比600nm)。计算公式为：细胞存活率＝(无药物孔-细胞孔)×100/(无药物孔-空白孔)。运用GraphPad Prism计算细胞存活率50％时对应的药物浓度即为药物的CC50。
结果参见图8。如图8中所示，使用CCK8测定药物的细胞毒性，结果显示：3HP-β-LG、β-LG在Vero细胞中的CC50均大于200μg/ml，在BHK-21细胞中的CC50均大于1,200μg/ml，表明3HP-β-LG、β-LG对细胞没有毒性。
2.4酸酐化蛋白与猴痘病毒A29L蛋白的结合
猴痘病毒A29蛋白是细胞内成熟病毒(IMV)表面包膜蛋白，与牛痘病毒(VAVC)A27同源，在痘病毒科中广泛保守。对牛痘病毒的研究发现：A27蛋白在病毒生命周期中发挥多种作用如：与细胞表面硫酸乙酰肝素结合、调节膜融合以及介导成熟病毒(IMV)转运形成包膜病毒(IEV)。除了上述作用外，A27蛋白还可以促进包膜病毒的释放。受感染细胞中的一部分MV后代通过A27依赖性机制通过微管从病毒工厂转运到高尔基网络，并获得第二层膜成为细胞外包膜病毒(IEV)，IEV通过胞吐作用释放。发明人认为猴痘病毒A29蛋白在病毒感染细胞过程中发挥重要的作用。
酶联免疫吸附试验(ELISA)法：
将稀释在PBS中的3HP-β-LG和β-LG(4ng/μl)包被在96孔聚苯乙烯板中，4℃包被过夜。弃包被液，使用1％明胶作为封闭液，37℃封闭2h，将带有His-tag的猴痘包膜蛋白A29L(STKAAKNPETKREAIVKAYGDDNEETLKQRLTNLEKKITNITTKFEQIE KCCKRNDEVLFRLENHAETLRAAMISLAKKIDVQTGRHPYEGSSGLNDIF EAQKIEWHEGSSHHHHHHHHHH，SEQ ID NO:1)、A35R(STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKS DVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTGSSGL NDIFEAQKIEWHEGSSHHHHHHHHHH，SEQ ID NO:2)、M1R(MGAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGC NITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGTGVQGSSGLNDIFEAQKIEWHEGSSHHHHHHHHHH，SEQ ID NO:3)(受赠于复旦大学王乔老师课题组)、L1R(MGAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGC NITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGTGVQFYMIVIGVIILAALFMYYAKRMLFTSTNDKIKLILANKENVHWTTYMDTFFRTSPMIIATTDIQN，SEQ ID NO:4)、H3L(MAAVKTPVIVVPVIDRPPSETFPNVHEHINDQKFDDVKDNEVMQEKRD VVIVNDDPDHYKDYVFIQWTGGNIRDDDKYTHFFSGFCNTMCTEETKRNIARHLALWDSKFFTELENKNVEYVVIIENDNVIEDITFLRPVLKAIHDKKIDILQMREIITGNKVKTELVIDKDHAIFTYTGGYDVSLSAYIIRVTTALNIVDEIIKSGGLSSGFYFEIARIENEMKINRQIMDNSAKYVEHDPRLVAEHRFETMKPNFWSRIGTVAAKRYPGVMYTFTTPGSSGLNDIFEAQKIEWHEGSSHHHHHHHHHH，SEQ ID NO:5)(自行表达纯化)进行梯度稀释后加入封闭好的96孔板中，37℃孵育1h。用PBST洗涤三次后，以1:3,000的稀释度加入His-tag-HRP抗体。37℃孵育1h，用PBST洗三遍，并加入TMB-ELISA显色液，5分钟之后使用硫酸终止，使用酶标仪于450nm处测量吸光度值。
结果参见图9-图13。如图9所示，随着A29L浓度的提高，与3HP-β-LG的结合强度(用OD450表示)逐渐提高至1.3左右，而与β-LG的结合强度只能达到0.2左右，这说明3HP-β-LG与A29L的结合强度显著高于β-LG。如图10-13所示，随着猴痘其他蛋白浓度的提高，与3HP-β-LG、β-LG的结合强度都只能维持在0.1左右，这说明酸酐蛋白并不结合猴痘病毒上的这些蛋白，进一步说明A29L是3HP-β-LG的结合靶标。
生物膜层干涉测量(BLI)法：
所有BLI检测均在Octet RED96仪器上进行。所有运行均采用1000rpm的摇动速度和30℃的板温。含0.02％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)用作动力学缓冲液。Ni-NTA探针和4μg/mL A29L-His蛋白结合测定。对于结合动力学测定，预先于离心管中制备一定稀释浓度的3HP-β-LG和β-LG后分别加入黑色聚丙烯96孔微孔板中，PBST填充其余孔。留下一行作为PBST阴性对照。每个孔的总体积为200μL。测定循环包括在PBST中基线孵育120秒，然后在3HP-β-LG中结合120-180秒，然后在PBS中解离120-180秒，并且对每种浓度重复。BLI结果的分析使用FortéBio数据分析软件9.0版进行。
结果参见图14。如图14所示，随着3HP-β-LG浓度的提高，3HP-β-LG与A29L的亲和力逐渐提高，亲和力Kd为2.41nM，而随着β-LG浓度的提高，β-LG与A29L的亲和力没有提高，亲和力Kd大于666.7nM。综上，ELISA和BLI结果均表明，相较于β-LG，3HP-β-LG与A29L的结合能力显著较强。本发明认为酸酐修饰的蛋白质可能通过封闭猴痘病毒上的表面蛋白A29L来发挥抑制猴痘病毒的效果。

Claims (15)

1.经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在体外抑制痘病毒生长、预防或控制痘病毒感染的方法，所述方法包括使所述经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物与含有、疑似含有或有风险含有痘病毒的物品或样品接触的步骤；
其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐；
优选地，其中根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的；
优选地，其中所述样品选自痘病毒感染者呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、尿液、粪便、体液或培养液；
优选地，其中所述物品选自痘病毒感染者个人物品、痘病毒感染者接触过的公共物品、痘病毒感染者所用润滑剂与避孕套。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经酸酐修饰的蛋白质是3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的β乳球蛋白或3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的纤维蛋白原。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述痘病毒属于正痘病毒属，优选地，所述痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒；优选地，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述β乳球蛋白是牛β乳球蛋白；所述白蛋白选自血清白蛋白或卵清蛋白，优选人血清白蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白；所述纤维蛋白原是牛纤维蛋白原；所述胶原蛋白选自胶原蛋白Ⅰ-Ⅲ型；所述RNA酶选自RNA酶1或RNA酶7。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述组合物为溶液、酊剂、醑剂、粉末剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂、凝胶或气雾剂的形式。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述经酸酐修饰的蛋白质通过使所述酸酐与所述蛋白质混合制备。
7.经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防受试者中的痘病毒感染或由痘病毒感染引起的疾病，优选地组合物包含抗病毒药物，优选是替韦立马、西多福韦或布林西多福韦；
其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐；
优选地，其中根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。
8.根据权利要求7所述的用途，其中经酸酐修饰的蛋白质是3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的β乳球蛋白或3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的纤维蛋白原。
9.根据权利要求7-8中任一项所述的用途，其中所述痘病毒属于正痘病毒属。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒；优选地，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的用途，其中所述β乳球蛋白是牛β乳球蛋白；所述白蛋白选自血清白蛋白或卵清蛋白，优选人血清白蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白；所述纤维蛋白原是牛纤维蛋白原；所述胶原蛋白选自胶原蛋白Ⅰ-Ⅲ型；所述RNA酶选自RNA酶1或RNA酶7。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的用途，其中所述药物是片剂、胶囊、粉剂、滴鼻剂或气雾剂的形式，或者溶液、酊剂、醑剂、粉末剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、凝胶或气雾剂、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂的形式。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的用途，其中所述经酸酐修饰的蛋白质通过使所述酸酐与所述蛋白质混合制备。
14.封闭痘病毒的表面蛋白的方法，所述方法包括使所述经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物与痘病毒接触的步骤，所述表面蛋白包括A29L或A27蛋白；其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐；优选地，其中根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的；优选地，其中所述痘病毒属于正痘病毒属；优选地所述痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒；优选地，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。
15.经酸酐修饰的蛋白质作为痘病毒A29L、A27蛋白或其同源物的结合剂的用途，其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和RNA酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐；优选地，其中根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的；优选地，其中所述痘病毒属于正痘病毒属；优选地所述痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒；优选地，猴痘病毒是分支I和/或分支II的猴痘病毒株，优选是MPXV-B.1猴痘病毒株。
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