JPH06211683A

JPH06211683A - 分化促進剤

Info

Publication number: JPH06211683A
Application number: JP5246315A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiko Mikoshiba; 克彦御子柴; Kazuhiro Ikenaka; 一裕池中
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-09-04
Filing date: 1993-09-06
Publication date: 1994-08-02

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】オリゴデンドロサイト（希突起膠細胞）の分
化促進作用を有する蛋白質ＤＭ−２０を含有する分化促
進剤を提供する。【構成】この分化促進剤は、ミエリンプロテオリピド
蛋白質（myelin proteolipid protein）遺伝子の遺伝子
産物である蛋白質ＤＭ−２０を有効成分とする。蛋白質
ＤＭ−２０はオリゴデンドロサイトの分化を著しく促進
する作用を有する。従って、ヒトの脳疾患において、ミ
エリン形成障害の如き未分化の細胞を分化させることに
より、種々の疾患（ミエリン形成障害性疾患、脱髄性疾
患など）を本質的に治療する上で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はオリゴデンドロサイト
（希突起膠細胞）の分化促進剤に関する。より詳細に
は、ミエリンプロテオリピド蛋白質（myelin proteolip
id protein、以下、ＰＬＰという）遺伝子の遺伝子産物
である蛋白質ＤＭ−２０を有効成分とし、ミエリン形成
障害性疾患、脱髄性疾患等の治療に有用な分化促進剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ミエリンは、神経細胞の突起である軸索
ａｘｏｎのまわりを巻いて包んでいる膜であり、中枢神
経系では希突起膠細胞(oligodendrocyte)、末梢神経系
では、シュワン細胞(schwann cell)の突起が分化した膜
から形成されている。神経系内での存在部位は、主とし
て中枢神経系では白質であり、末梢神経系では、有髄線
維であることが知られている。一般的に、その役割とし
て、神経細胞の突起を被覆することにより、細胞相互間
の電気的な神経伝導のもれを防ぐと同時に、軸索の露出
部であるランビエ紋輪を興奮させて刺激の伝導をする跳
躍伝導の役割がよく知られている。また、上記ミエリン
が軸索のまわりをとり巻いていく過程をミエリン形成過
程といい、動物の種により形成速度のはやい時期が異な
り、ヒトにおいては、周産期に最もはやくなり、２歳の
終わり頃までには、ミエリン形成の大部分は終了する。

【０００３】中枢神経系ミエリンの主要な構成蛋白質と
して知られているものに、ミエリン塩基性蛋白質(myeli
n basic protein：ＭＢＰ)とミエリンプロテオリピド蛋
白質(ＰＬＰ)があり、ミエリン形成期に同調して、発現
が盛んになる。ＭＢＰは内膜間に局在し、細胞膜の内側
どうしを接着させていると考えられている。また、ＰＬ
Ｐはそのアミノ酸組成の疎水性から膜を貫通し、さらに
一部が隣接した脂質二重膜に入り込み、外膜どうしを接
着させ、周期間線の形成をはじめとしたミエリン膜の安
定化に関与していると考えられている。

【０００４】一方、本発明の分化促進剤の有効成分であ
る蛋白質ＤＭ−２０は、上記ＰＬＰの１１６〜１５０位
のアミノ酸残基が欠落したものに等しく、ＰＬＰの遺伝
子（ＤＮＡ）から転写されたｍＲＮＡが選択的スプライ
シングという機構により、つくられるアイソフォームで
ある。即ち、ＰＬＰの第３エクソンの一部がスプライシ
ングを受け、３５個のアミノ酸を欠失したアイソフォー
ムであり、膜貫通ドメインを含むその他の領域はＰＬＰ
と同一であるため、ＰＬＰと同様に中枢神経系ミエリン
に局在し、ミエリン膜の層構造の安定化に寄与している
と考えられてきた蛋白質である。これらは、例えば、Mo
l. Neurobiol., 2, 41-89, (1988)に詳述されている。
しかし、その発現は、オリゴデンドロサイトのみではな
く、アストロサイト（星条膠細胞）をはじめとする他の
グリア細胞にも広く認められており、神経系において、
ＰＬＰと異なる機能を有することが推察されていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述の如く、ミエリン
形成は神経細胞やそれをとり巻く神経膠細胞の分化、成
長につづいて起こり、急激な形成期を迎える。即ち、ゲ
ッ歯類のラット、マウスでは、生後１０日頃から２０
日、ヒトでは、胎生後期から生後６ケ月が急激な形成期
である。かかる形成期前後の期間に脳に侵襲が加えられ
ると、ミエリン形成障害を起こし、脳障害として後遺症
を残す可能性が十分考えられる。即ち、運動障害や行動
異常の原因となるであろう。また、先天性脂質代謝異常
症、フェニルケトン尿症、クレチン病、多発性硬化症等
は、ミエリン形成障害である可能性が高いといわれてい
る。即ち、本来、ミエリン形成障害は脱髄性疾患とは区
別されるものだが、上記の如くヒトの脳疾患では、ミエ
リン形成障害によるのか、脱髄によるのか、判別は現在
の科学では容易ではなく、脱髄疾患という範疇でまとめ
られる一群の疾患であり、通常、多発性硬化症や急性散
在性脳脊髄炎等が中核をなす。いずれにせよ、ミエリン
形成障害性疾患及び脱髄性疾患は重度の障害をもたらす
疾患であり、その治療法が切望されている。

【０００６】かかる疾患を研究する場合、ミエリン形成
障害のあるモデル動物を用いることがよく知られてい
る。例えば、1954年Phillipsによって発見されたジンピ
ー(jimpy)マウスは、伴性劣性の遺伝様式をとり、中枢
神経系に障害が限局しているなど重要なモデル動物とし
て広く知られている。このマウスにおいては、ＰＬＰ遺
伝子に種々の突然変異を持ち、ミエリン形成期以前にオ
リゴデンドロサイトが幼弱なまま分化異常を起し、変性
脱落してしまうことが知られている。本発明者等は、こ
のモデル動物を用いることにより、ミエリン形成不全に
おける主要蛋白質の検討を行ってきている。

【０００７】ＤＭ−２０は、前述のようにＰＬＰと同じ
局在を示し、ミエリン膜の層構造の形成に関与している
蛋白質と考えられていた。しかし、胎生期脳内にＤＭ−
２０が選択的に生産されていることや、ジンピーマウス
は、ミエリン形成以前の胎仔期においてＤＭ−２０のｍ
ＲＮＡが一過性に産生されること、及び正常なマウスの
アストロサイトの培養上清で培養するとジンピーマウス
のオリゴデンドロサイトが延命することから、ＤＭ−２
０の有するミエリン膜の層構造の形成以外の作用が本発
明者等により研究されていた。即ち、グリアの細胞分化
時にＰＬＰ遺伝子がアストロサイト等、オロゴデンドロ
サイト以外の細胞にも発現し、オロゴデンドロサイトの
生存維持又は分化促進に機能していることが研究されて
いる。これらの実験事実は、本発明者等により、J. Neu
rochem 58, 2248-2253 (1992)、第３３回日本神経化学
会 (1990)、第３４回日本神経化学会 (1991)、Glia 253
-259 (1988)などに発表されている。

【０００８】これらの事実に基づき、本発明者等は、さ
らに鋭意研究を行った結果、ＤＭ−２０がオリゴデンド
ロサイトの分化促進作用を有することを見出した。本発
明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明はオ
リゴデンドロサイトの分化を促進し、ミエリン形成障害
性疾患、脱髄性疾患などの治療に有用な薬剤を提供する
ことを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、ＰＬＰ遺伝子の遺伝子産物の一
種である蛋白質ＤＭ−２０を含有することからなり、グ
リア細胞の一種であるオリゴデンドロサイトの分化促進
剤である。即ち、本発明者等は、ＤＭ−２０のｍＲＮＡ
が豊富な神経系由来の培養細胞で、とりわけマウスオリ
ゴデンドログリオーマ系の株化細胞であるＧ２６細胞に
ＤＭ−２０のｍＲＮＡが強く発現していることを研究
し、このＧ２６細胞の培養上清の初代脳細胞培養系に対
する作用を検討した。その結果、Ｇ２６細胞の未精製の
培養上清は、初代脳細胞培養系においてオリゴデンドロ
サイトの分化を著しく促進する効果を持つことが明らか
になった。

【００１０】次に、同じくＧ２６細胞の培養上清を約５
倍に濃縮し、さらに、透析をした試料を用いて、オリゴ
デンドロサイトの分化促進作用の用量相関性を検討し
た。また、この際、同時に、対照として正常細胞ＮＩＨ
−３Ｔ３細胞の培養上清に関してもＧ２６細胞の培養上
清と同様の処理を行い、比較検討したところ、濃縮及び
透析を行ったＧ２６細胞の培養上清は、用量依存的にオ
リゴデンドロサイトの分化を促進することが明らかにな
った。しかし、ＤＭ−２０が産生されていない、正常な
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の培養上清から得られた試料には、
分化促進作用はみられなかった。同様に、多くのＤＭ−
２０を産生しているマウスメラノーマＢ１６、ラットニ
ューロブラストーマＢ１０４細胞の培養上清にもオロゴ
デンドロサイトの分化を促進する液性因子が放出されて
いることが明らかになった。

【００１１】更に、本発明者等は、この作用が遺伝子発
現に直接関連したものであるか否かの研究を行い、ＤＭ
−２０のｃＤＮＡを導入した正常なＮＩＨ−３Ｔ３細胞
の形質転換細胞の培養上清にオリゴデンドロサイトの分
化を著しく促進する作用を見出した。このように、ＤＭ
−２０は、中枢神経系細胞であるオリゴデンドロサイト
の分化促進作用を有することが明らかとなった。

【００１２】本発明で用いられるＤＭ−２０は前述のよ
うに公知物質であり、前記の文献等に記載の方法で得る
ことができ、例えば、オリゴデンドログリオーマ系株化
細胞Ｇ２６などのＤＭ−２０産生細胞を培養し、その培
養上清から得ることができる。また、透析、ゲル濾過、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー、電気泳動などの慣用の蛋白質精製法に付す
ことにより精製することができる。なお、本発明におい
て、ＤＭ−２０には、オリゴデンドロサイトの分化促進
作用を有する限り、そのＣ末端及び／又はＮ末端のアミ
ノ酸配列が、欠失若しくは置換されたもの又は他のアミ
ノ酸が付加されたものも包含されるものとする。本発明
は、中枢神経細胞の分化促進剤として有用であり、前述
のように、ヒトの脳疾患において、ミエリン形成障害の
如き未分化の細胞を分化させることにより、種々の疾患
（ミエリン形成障害性疾患、脱髄性疾患など）を本質的
に治療する上で有用である。

【００１３】本発明の促進剤は種々の製剤形態（例え
ば、液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうるが、一
般的には有効成分であるＤＭ−２０のみ又はそれらと慣
用の担体と共に注射剤とされる。当該注射剤は常法によ
り調製することができ、例えば、ＤＭ−２０を適切な溶
剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解し
た後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な
容器に充填することにより調製することができる。注射
剤中の有効成分含量は、適宜調整される。製剤化に際し
て、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤として
は、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マン
ニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコ
ールなどが挙げられる。さらに、製剤化に必要な添加
物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化
剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場
合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保
存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸
留水などを加え、再溶解して使用される。本発明の促進
剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により投与
され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮
下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、
患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整される。

【００１４】

【発明の効果】本発明の分化促進剤は、ＰＬＰの遺伝子
産物の一種であるＤＭ−２０を含有しており、ＤＭ−２
０はグリア細胞であるオリゴデンドロサイトの分化を著
しく促進する。従って、本発明の分化促進剤は、ヒト脳
疾患におけるミエリン形成障害に対して、未分化のグリ
ア細胞を分化させることによりミエリン形成を促進する
ことができるので、種々の疾患（即ち、ミエリン形成障
害性疾患、脱髄性疾患など）を本質的に治療する上で有
用である。

【００１５】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明は実施例に限定されるものではない。実施例１各種培養細胞におけるＰＬＰ及びＤＭ−２０遺伝子の発
現並びに細胞培養上清の取得各種培養細胞、即ち、オリゴデンドログリオーマ系株化
細胞であるＧ２６及び正常細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用
いて、それら培養細胞から抽出した０．２μｇの全ＲＮ
Ａを逆転写酵素と反応させた後、Ｔａｇポリメラーゼを
用いて４５回ＰＣＲを行った。次に、³²Ｐでラベルした
オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ハイブリダイゼ
ーションさせ、オートラジオグラフィーを行った。一
方、ＰＬＰ遺伝子及びＤＭ−２０クローンから増幅した
バンドをコントロールとして用いて、各種培養細胞での
ＰＬＰ及びＤＭ−２０遺伝子の発現の確認を行った。

【００１６】なお、上記方法については、公知の方法に
準拠しており、培養法に関しては、例えば、実験医学別
冊「神経生化学マニュアル」に詳しく記載がある(実験
医学別冊p106-128. 1992)。その結果を図１に示す。図
１に示されるように、オリゴデンドログリオーマ系株化
細胞であるＧ２６細胞においては、著しくＤＭ−２０の
遺伝子が発現されており、一方、正常な細胞であるＮＩ
Ｈ−３Ｔ３細胞ではＰＬＰ及びＤＭ−２０の発現は全く
ない。なお、図１に、ＰＬＰ（□）及びＤＭ−２０
（△）クローンから増幅したバンドをｃＤＮＡのライン
に示した。次に、Ｇ２６細胞及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞を
Bottensteinらの方法(J. Neurosci. Res. 20, 291-303,
1988)に準拠して、Ｎ４培地で２日間培養し、慣用の方
法に準拠して各々の細胞上清が得られた。

【００１７】実施例２初代脳細胞培養ＩＣＲ系マウスの胎生１７日の脳から公知の方法、即
ち、実験医学別冊「神経生化学マニュアルp129-135, 19
92年」に詳述されているプロトコールで初代脳細胞の培
養を行った。より詳細には、胎生期１７日のＩＣＲ系マ
ウスの脳を取り出し、大脳皮質から、トリプシン処理に
より細胞を分散させ、ポリエチレンイミン処理したカバ
ーグラス上、３×１０⁵の細胞密度で培養を開始し、１
０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２＝
１：１で３日間培養した後、BottensteinらのDefined m
edium(J. Neurosci. Res. 20, 291-303, 1988)、Ｎ４：
０３＝１：２又はconditioned medium：０３＝１：２で
更に４日間培養した。

【００１８】実施例３初代脳細胞におけるＧ２６細胞培養上清の効果上記の実施例２で得られた初代脳細胞において、オリゴ
デンドロサイトの免疫染色法を試みた。即ち、オリゴデ
ンドロサイトの染色は、一次抗体としてマウス抗ガラク
トセレブロシド（ＧａｌＣ）モノクローナル抗体（０１
抗体）を用いて、二次抗体としてＦＩＴＣ抗マウス抗体
を用いて生染色した後、パラホルムアルデヒドで固定
し、蛍光顕微鏡下で陽性細胞を数えることで可能であ
る。なお、上記染色法は公知の技術を用いれば容易に確
認できる。実施例２で、培養する際に、培養液に実施例
１で得られたＧ２６細胞培養上清を加えて上記と同様の
方法で免疫染色を行った。その結果、Ｇ２６細胞の未精
製の培養上清は初代脳細胞培養系においてオリゴデンド
ロサイトの分化を著しく促進する効果を持つことが明ら
かになった。

【００１９】実施例４Ｇ２６細胞培養上清中に含まれるオリゴデンドロサイト
分化促進因子、ＤＭ−２０の用量依存性の検討細胞培養は実施例２及び３と同様に行ったが、実施例１
で得られた細胞培養上清そのものの代りに、Ｇ２６細胞
又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞の培養上清を約５倍に濃縮し、
更に透析した試料を用いてその用量依存性を解析した。
即ち、実施例３で記載した免疫染色後、Ｇ２６細胞及び
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞とも図２で示す各濃度について２回
の培養を行い、それぞれ５視野（２００×）ずつ陽性細
胞を数え、その平均値を計算した。その結果を図２に示
した。図２において、●はＧ２６細胞培養上清の濃縮・
透析試料を、○はＮＩＨ−３Ｔ３細胞培養上清の濃縮・
透析試料（コントロール）を示す。図２に示されるよう
に、Ｇ２６細胞培養上清は用量依存的にオリゴデンドロ
サイトの分化を促進することが明らかになった。しか
し、ＤＭ−２０が産生されていないＮＩＨ−３Ｔ３細胞
上清ではこのような効果はなかった。

【００２０】実施例５レトロウイルスベクターを用いた形質転換細胞の作製
及び培養上清の調製マウス小脳のｃＤＮＡのライブラリーから得たＰＬＰと
ＤＭ−２０のクローンの蛋白質翻訳領域を、ｐＤＬ⁺レ
トロウイルスベクターに挿入した。このとき、ＰＬＰ又
はＤＭ−２０はＬＴＲから転写され、マーカーとしてｎ
ｅｏ耐性遺伝子を発現するように作製した。また、感染
効率を上げるためψ⁺の領域を挿入した（図３参照）。
次いで、このプラスミドを、慣用のリン酸カルシウム法
により、それぞれウイルスパッケージ細胞ψ２へ導入
し、得られたｐＤＬ⁺ＰＬＰウイルス及びｐＤＬ⁺ＤＭ−
２０ウイルスを、それぞれＮＩＨ−３Ｔ３細胞に感染さ
せて形質転換細胞を作製した（図４参照）。ＰＬＰ又は
ＤＭ−２０ｃＤＮＡを発現している形質転換細胞を、公
知のＮ４合成培地(J. Neurosci. Res., 20, 291-303, 1
988)で、１又は２日間培養し、培養上清を回収した。こ
の培養上清を、アミコン（ＹＭ−１０）濃縮機で１０分
の１容量に限外濾過した後、５ｍＭリン酸緩衝液、５０
ｍＭＮａＣｌ、１μｇ／ｍｌＰＭＳＦにて透析し濃縮
試料とした。

【００２１】初代脳細胞における培養上清の効果上記で得られた濃縮試料を用いて、実施例２で調製さ
れる胎仔マウスの初代培養細胞に対する効果を調べた。
より詳細には、胎生期１７日のＩＲＣマウスの脳を取り
出し、大脳皮質から、トリプシン処理により細胞を分散
させ、ポリエチレンイミン処理したカバーグラス上、３
×１０⁵の細胞密度で培養を開始し、１０％牛胎児血清
を含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２＝１：１で３日間
培養した後、上記で得られた濃縮試料を含むＮ４：Ｏ
３＝１：２で混合した無血清培地で更に４日間培養し
た。オリゴデンドロサイトの染色は、実施例３と同様に
して行い、螢光顕微鏡下で陽性細胞数を数えた。その結
果を図５に示す。同図において、△はＤＭ−２０ｃＤＮ
Ａを導入した形質転換細胞の培養上清を、●はＰＬＰｃ
ＤＮＡを導入した形質転換細胞の培養上清を、□は正常
なＮＩＨ−３Ｔ３細胞の培養上清（コントロール）を示
す。図５に示されるように、ＤＭ−２０ｃＤＮＡ又はＰ
ＬＰｃＤＮＡを導入した形質転換細胞の培養上清は、オ
リゴデンドロサイトのマーカーであるＧａｌＣ陽性細胞
数の増加を顕著に示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるオートラジオグラフィーの結
果を示す図である。

【図２】実施例４における蛋白質濃度と陽性細胞数との
関係を示す図である。図２において、●はＧ２６細胞培
養上清の濃縮・透析試料を、○はＮＩＨ−３Ｔ３細胞培
養上清の濃縮・透析試料（コントロール）を示す。

【図３】ＤＭ−２０ｃＤＮＡ又はＰＬＰｃＤＮＡを導入
したｐＤＬ⁺レトロウイルスベクターの構造の概要を示
す図である。

【図４】ＤＭ−２０ｃＤＮＡ又はＰＬＰｃＤＮＡを導入
した形質転換細胞の調製法の概要を示す図である。

【図５】実施例５における蛋白質濃度と陽性細胞数との
関係を示す図である。図５において、△はＤＭ−２０ｃ
ＤＮＡを導入した形質転換細胞の培養上清を、●はＰＬ
ＰｃＤＮＡを導入した形質転換細胞の培養上清を、□は
正常なＮＩＨ−３Ｔ３細胞の培養上清（コントロール）
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ミエリンプロテオリピド蛋白質（myel
in proteolipid protein）遺伝子の遺伝子産物である蛋
白質ＤＭ−２０を含有するオリゴデンドロサイトの分化
促進剤。
【請求項２】ミエリン形成障害性疾患治療剤又は脱
髄性疾患治療剤である請求項１記載の分化促進剤。