KR100194079B1 - Hiv 감염 예방 또는 치료용 제약학적 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
Hiv 감염 예방 또는 치료용 제약학적 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 새로운, 실질적으로 절단할 수 없는 형태의 gp160, 및 3-D Mp1로 보조된 gp160 또는 그의 유도체를 함유하는 백신에 관한 것이다. 이 조성물은 HIV 감염의 면역요법 및 면역예방 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 새로운 백신 및 제약학적 조성물 및 이들의 제조 및 AIDS의 치료시에 이들의 이용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 3-D 모노포스포릴 리피드 A로 보조된 백신 내 gp160의 새로운 형태를 포함하는 gp160 또는 이외 유도체의 이용에 관한 것이다.
레트로바이러스, 즉 레트로바이러스과 내의 바이러스는 핵 구조내에 나선형 뉴클레오캡시드를 갖고 유전 물질로서 RNA를 갖는 약 150nm의 엔벨로피오딘 아이코사헤드랄 바이러스의 큰 과이다. 이 과는 사코마 및 루케미아 바이러스같은 발암바이러스, 특정 면역결핍 바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
사람 면역 결핍 바이러스 유형1(HIV-1)은 AIDS로 잘 알려진 후천성 면역 결핍증의 병인제이다. 이 레트로바이러스는 장말단 반복물(LTRs), 즉 gag, pol, 및 env 유전자, 및 다른 유전자를 포함하는 복잡한 유전적 유기체이다. 이 레트로바이러스는 보호 면역 반응을 유발할 수 있는 백신제로서 단독으로 또는 합하여 효능있는 후보인 다수의 바이러스 항원을 운반한다.
HIV-1 엔벨로프 단백질은 감염된 세포내에서 순차적으로 글리코실화되어 다단백질 전구체로서 합성되어 160kDa의 몰중량을 갖는 당단백질을 제공하고, 이는 단백질분해에 의해 gp120 외부 당단백질 및 gp41 막투과 단백질로 프로세싱된다.
프로바이러스 HIV에 대한 DNA 암호화 영역은 문헌에 보고된 몇몇 면역결핍 바이러스 게놈 클론중 임의 것으로부터 제조할 수 있다. 참고, 예컨대, Shaw 일행, 사이언스 226 : 1165(1985); Kramer 일행, 사이언스 231 : 1580(1986). 대안적으로, 면역결핍 바이러스 게놈 클론은 표준 DNA 클로닝 기술에 의해 임상 표본으로부터 분리된 바이러스로부터 제조할 수 있다. 참고, 예컨대 Gallo 일행, 미합중국 특허 4,520 ,113; Montagnier 일행, 미합중국 특허 4,708,818.
HIV-BH10-2의 프로바이러스 DNA 서열은 Ratner 일행, 사람 레트로 바이러스 및 AIDS 1989, HIV 서열이 데이타베이스 편집 Gerald Meyers, 로스 알라모스 국립 연구소에 의해 서술되어 있다. 서열은 8932 bp 길이이고, env 유전자는 5580-8150에 위치하고 7088 및 7112의 그 안의 절단 부위는 아미노산 503 및 511에 상응한다(상기 잔기 이후로 절단)(로스 알라모스 데이타베이스에 따른 넘버링). 참고로, gp160의 아미노산 서열은 하기와 같으며, gp120의 아미노산 서열은 1번 위치부터 511번 위치까지이다.
본 발명에 의하면, 독립적으로 위치 502 및 510에서 리신 또는 아르기닌이 아닌 아미노산을 제공하도록 변형된 HIV gp160을 제공한다. 리신에 대한 적합한 대체물은 친수성 및 크기가 리신과 유사한 것들, 예컨대 히스티딘, 트레오닌, 세린, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민 및 글루탐산이다. 이들 중 바람직한 아미노산은 글루탐산이다. 바람직한 단백질은 도입된 돌연변이물로 인하여 절단될 수 없고 또한 교차 중화 항체를 유도할 수 있으며, 이는 단백질의 정확한 접힘에 좌우된다.
보다 바람직하게는 본 발명은 본 발명의 변형 단백질을 올리고머 형태로 제공한다. 특히 64kDa의 상대 분자량을 갖는다. gp160 단량체의 분자량을 기준으로 상기 형태의 사량체라고 생각된다. 이는, 바이러스 표면 단백질이 생체내에서 본래적으로 바이러스 표면으로부터 불쑥 나온 스파이크를 형성하는 올리고머로서 존재한다는 점에서 유리하다. 많은 중화 에피토프가 입체배위이므로, 천연으로 나타나는 바와 같은 항원의 형태를 가능한한 근접하게 모방하는 것이, 가장 적절한 면역 반응을 제공할 것이므로 명백히 중요하다.
바람직한 실시양태에서 본 발명은 올리고머 및 실질적으로 순수한 형태의, 본 발명의 변형된 단백질을 제공한다.
실질적으로 순수한 형태란 적어도 75% 순도, 보다 바람직하게는 90% 순도, 보다 바람직하게는 99% 순도를 의미한다.
부가적인 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 변형된 HIV gp160을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 재조합 진핵 숙주 세포에서 상기 변형된 단백질을 암호화하는 DNA를 발현하고 변형된 단백질 생성물을 회수하는 것으로 구성된다.
또한, 변형된 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 중합체도 본 발명의 일부를 형성한다.
본 발명의 재조합 DNA 분자는 본 발명에 따라 적합한 모노-, 디- 또는 올리고머 뉴클레오티드 단위의 축합에 의해 제조될 수 있다.
이 제조법은 적합하게 생테내 또는 생체외에서, 화학적으로, 효소적으로, 또는 두 방법의 조합에 의해 수행할 수 있다. 그러므로, DNA분자는 Biochemistry 1985, 24, 5090-5098에서 D.M. Roberts 일행에 의해 서술된 것들과 같은 통상적인 방법에 의해 적합한 DNA 단편의 효소적 결찰에 의해 제조될 수 있다.
DNA 단편은 화학적 합성에 의해, 효소적 중합에 의해, 또는 이들 방법의 조합에 의해 적합한 제한 효소로써 뉴클레오티드의 원하는 서열을 함유하는 DNA를 소화시켜 얻을 수 있다.
제한 효소에 의한 소화는 20℃-70℃의 온도에서 적합한 완충액내에서 0.1`10㎍ DNA를 갖는 일반적으로 50㎕ 이하의 부피로 수행할 수 있다.
DNA의 효소적 중합은 일반적으로 50㎕ 이하의 부피에서, 10℃-37℃의 온도에서 요구된 바의 뉴클레오티드 삼인산염 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 적합한 완충액에서 DNA 폴리머라제 I(Klenow 단편)같은 DNA 폴리머라제를 사용하여 생체외에서 수행될 수 있다. 단편은 Taq 폴리머라제를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 중합 및 증폭될 수 있다(참고, PCR 프로토콜 1989 - 방법 및 응용에 대한 안내, 편집 M.A. Innis 일행, 아카데믹 프레스).
DNA 단편의 효소 결찰은 일반적으로 50㎕ 이하의 부피에서, 4℃ 내지 주변 온도에서 적합한 완충액내에서 T4 DNA 리가제 같은 DNA 리가제를 사용하여 수행할 수 있다.
DNA 분자 또는 단편의 화학적 합성은 '유전자 단편의 화학적 및 효소적 합성 - 실험실 메뉴열'(편집, H.G. Gassen 및 A. Lang) 또는 다른 과학 출판물, 예컨대 M. J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Sin호, B.S. Sproat, 및 R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. sproat 및 W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci 및 M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci 및 M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, 및 H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; 및 H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801에서 서술된 것들과 같은 고체 상 기술을 사용하여 통상적인 포스포트리에스테르, 아인산염 또는 포스포라미디트 화학에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게 자동 DNA 합성기를 사용한다.
변형된 단백질을 암호화하는 DNA 중합체는 Nature 1982, 299 756-768에서 G. Winter 일행에 의하거나 Zoller 및 Smith 1982; Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500에 의해 서술된 것들과 같은 통상적인 방법에 의해 변형되지 않는 단백질을 암호화하는 cDNA를 fqndnl 지정 변이화(site directed mutagenesis)함으로써 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 함유하는 재조합 종두 바이러스까지 확장된다.
벡터는, 본 발명에 따라 벡터를 절단하여 무상 레플리콘을 갖는 선형 DNA 분절을 제공하고 상기 선형 분절 및 상기 선형 분절과 함께 본 발명의 재조합 DNA 분자를 완성하는 하나 이상의 DNA분자를 결찰시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 숙주 세포는 본 발명의 벡터로써 종두 바이러스를 형질전환시켜 제조될 수 있다.
변형된 단백질 생성물은 단백질 분리 및 정체의 표준 기술에 의해 조건 배지로부터 분리한다. 세포 용해를 수행하고 세포막 물질로부터 변형된 단백질을 제거하기 위해 세정제 예컨대 데실(Decyl) PEG-300, 도데실(DoDecyl) PEG 트리톤 × 100. 데지트 데옥시콜레이트(Thesit Deoxycholate)를 첨가할 수 있다. 이들 중 데실 PEG-300 및 데지트 데옥시콜레이트가 바람직하고 도데실 PEG 트리톤×100. 변형된 단백질은 일련의 초여과 단계, 초원심분리 단계, 예컨대 황산 암모늄 또는 PEG에 의한 선택적 침전, CsCl 또는 수크토스내에서 밀도 구배 원심분리 또는 메트리자미드 구배 및/또는 크로마토그래피단계, 예컨대 친화 크로마토그래피, 면역친화 크로마토그래피가 바람직하고, HPLC, 역상 HPLC, 양이온 및 음이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 예비 등전 포커싱에 의해 정제될 수 있다. 면역정제 크로마토그래피를 사용하는 정제가 바람직하다. 정제 중에 또는 이어서, 변형된 단백질을 예컨대 포름알데히드, 글루타르알데히드 또는 NAE로 처리하여 안정성 또는 면역원성을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 올리고머 형태의 제조를 위해 정제 단계중에 온화한 조건을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 환원제를 피해야 하고, 비이온성 세정제, 예컨대 데실 PEG-300(폴리에틸렌글리콜 300 모노데실에테르)가 크로마토그래피 단계 중에 세포 용해 및 용해성을 위해 이온성 세정제로 바람직하다. 바람직한 친화 크로마토그래피 배지는 렌틸 렉틴 세파로스이고 바람직한 면역친화 크로마토그래피 배지는 항-gp160 모노클로날 항체, 예컨대 글루타르알데히드-활성화 트리스아클리(IBF)같은 적당한 담체 상에 커플링된 178.1(WO 90/06358)이다.
벼형된 단백질은 투석에 의해 제거될 수 있는 세정제 옥틸 글루코피라노시드의 존재하에 모노클로날 항체로부터 흡착될 수 있다. 세정제는 바람직하게 그의 이론적 임계 마이셀 농도 이상의 농도로 사용한다.
본 발명에 따라 생산된 변형된 단백질은 HIV에 대한 노출 감지에 대한 진단제로서 유용하다. 또한 변형된 단백질은 감염의 방지를 위한 백신으로 또는 질병 진전의 억제 또는 방지를 위해서도 유용하다.
또한 본 발명은 본 발명의 변형된 단백질을 함유하는 백신 및 제약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 본 발명의 변형된 단백질의 면역보호량을 함유할 것이고 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 백신에서, 단백질의 수용액을 직접 사용할 수 있다. 대안적으로, 미리 동결건조되거나 되지 않은 단백질을 다양한 임의 공지, 어쥬번트로 혼합하거나 흡착시킬 수 있다. 상기 어쥬번트는 수산화 알루미늄, 뮤라밀 디펩티드 및 사포닌 예컨대 퀴일 A, 3D-MPL(3 데실화 모노포스포릴 리피드 A), 또는 TDM을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 부가적인 예시 대안으로서, 단백질을 리포좀 같은 미세입자내에 캡슐화할 수 있다. 또 다른 예시 대안으로, 단백질을 죽은 보르데텔라 또는 파상풍 독소같은 면역자극 거대분자상에 접합시킬 수 있다.
백신 제제는 일반적으로 Voller 일행, University Park Press, Baltimore, Mar yland, U.S.A. 1978에 의해 편집된 백신에서의 새로운 경향 및 개발에 서술되어 있다. 리포좀 내의 캡슐화는 예컨대 Fullerton의 미합중국 특허 4,235,877에 의해 서술된다. 거대 분자에로의 단백질의 접합은 예컨대 Likhite, 미합중국 특허 4,372,945에 의해 및 Armor 일행, 미합중국 특허 4,474,757에 의해 공개되어 있다.
각각의 백신 투여시에 본 발명의 변형된 단백질의 양은 전형적인 백신에서 유의한, 불리한 부작용이 없이 면역보호 반응을 유발하는 양만큼으로 선택한다. 상기 양은 어떤 면역원이 사용되고 백신이 보조되는냐 않느냐에 따라 좌우되어 변할 것이다. 일반적으로, 각 투여량은 변형된 단백질 1-1000㎍, 바람직하게는 10-200㎍을 함유할 것이라고 예상된다. 특정 백신에 대한 적정량은 항체 역가 및 피실험체에서의 다른 반응의 관찰을 포함하는 포준 연구에 의해 확증될 수 있다. 초기 백신 주사에 이어, 피실험체를 바람직하게 약 4주에 증강분을 주고, 이어서 감염의 위험이 존재하는 한 매 6개월마다 반복하여 증강분을 준다.
본 발명은 부가적으로 백신의 제조시에 본 발명의 변형된 단백질의 이용 및 숙주의 예방접종에서의 이용을 위한 본 발명의 변형된 단백질을 제공한다.
HIV에 감염되기 쉬운 사람의 백신주사 뿐만 아니라, 본 발명의 제약학적 조성물을 사용하여 HIV 감염으로 고통받는 환자를 면역 치료학적으로 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서 여기서 서술된 바와 같은 변형된 gp160의 유효량을 투여하므로써 HIV 감염으로 곤란을 겪거나 이에 민감한 사람의 치료 방법을 제공한다.
예컨대 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 서브 유니트 성분을 사용한다는 생각에 부합하여, 면역 반응의 양 아암(중화 항체 및 작동인자 세포 매개 면역(DTH)이 생산되도록 숙주 면역 시스템에 유효하게 면역원을 제공하는 어쥬번트 및/또는 담체가 필요하다. 본 발명에서, (즉, HIV 감염의 질병예방 또는 치료법 치료에서) 우리는 면역 자극 분량의 3D MPL이 면역시스템의 양아암을 자극할 수 있음을 발견했다.
따라서, 본 발명의 바람직한 측면에서 적절한 담체와 함께 gp160 또는 이의 면역학적 유도체 및 3D 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL)로 구성되는 제약학적 배합물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 gp160 또는 이의 면역학적 유도체 및 3D-MPL은 수중유(oil in water) 유탁액으로 존재한다. 이 시스템은 증진된 중화 활성을 제공한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서 수중유 담체내 gp160 또는 이의 면역학적 유도체 및 3D-MPL로 구성되는 제약학적 또는 백신 배합물이 제공되며, 상기 담체는 완충 살린 용액내 테트라폴리올 및 비독성 광유의 유탁액으로 구성된다.
바람직하게, 담체는 플루로닉(pluronic) L121같은 플루로닉 폴리올, 및 스쿠알란 또는 스쿠알렌 또는 다른 대사가능한 오일을 함유한다. 바람직하게 트윈 80 또는 트윈 28같은 유화제를, 유탁액을 안정화시키기 위해 제공한다.
바람직하게 담체는 100 내지 400nm의 서브미크론 입자만을 함유한다.
최종 배합물내 항원의 농도는 바람직하게 10㎍ 내지 150㎍/ml, 보다 바람직하게 20㎍ 내지 100㎍/ml이다.
백신내 어쥬번트, 3D-MPL의 농도 범위는 바람직하게 10㎍ 내지 100㎍/ml, 보다 바람직하게 25 내지 50㎍/ml이다.
본 발명은 부가적으로 약물에서 사용하기 위해, 보다 상세히 AIDS 또는 AIDS 관련 복합체(ARC) 같은 HIV-1 감염의 면역요법 및 질병 예방 치료에 의한 치료에 사용하기 위해 서술된 바와 같은 백신 배합물을 제공한다.
본 발명의 부가적인 측면에서, 적합한 담체와 함께 gp160 또는 이의 면역학적 유도체, 3D 모노포스포릴 리피드 A로 구성되는 백신의 생산방법을 제공하며, 이 방법은 gp160 또는 면역학적 유도체를 상기 담체와 및 3D 모노포스포릴 리피드 A와 혼합하는 것으로 구성된다.
실시양태에서, 수중유 담체내에서 여기서 서술된 바와 같은 백신의 생산 방법을 제공하며, 이때 수중유 유탁액은 미소유동화되어 상기 유탁액내에 서브 미크론 입자를 제공하며 gp160 또는 이의 면역학적 유도체 및 3D MPL과 혼합된다.
전형적으로, 3D-MPL을 유탁액과 미리 혼합한 후에 항원을 결과의 조성물내로 혼합한다.
3D-MPL은 영국 특허 2211502에 공개된 방법에 의해 얻을 수 있다.
상기에서 적합한 담체는 수중유 유탁액으로 구성된다. 본 발명의 배합물은 어쥬번트로 명반 단독으로(사람 용도에 있어 유일한 허가 어쥬번트)구성되는 통상적인 백신 배합물과 비교할 때 증진된 중화 역가를 제공한다.
여기서 사용하는 용어 면역학적 유도체는 3D 모노포스포릴 리피드 A로써 보조할 때 HIV-1에 대항하는 항체 중화를 일으킬 수 있는 gp160의 면역원 단편을 포함한다. 그 자체로 이것은 천연적으로 발생하는 분리된 gp160뿐만 아니라 여기서 서술된 바와 같이 예컨대 HIV-1 외부 막 당단백질 gp120, 변형된 gp160을 포함할 것이다. 또한 DTH 반응을 일으킬 수 있는 유도체가 특히 바람직하다.
그러므로, 가장 바람직하게 본 발명은 온화한, 비-환원 조건하에서 정제할 때 600-700kDa 사이의 겉보기 분자량을 갖는 것으로 보이는 (이 중 640kDa는 사량체라고 여겨진다) 올리고머 형태의 단백질의 변형된 형태를 제공한다. 이 사량체는 비-환원 조건하에서 SDS 겔 상의 단백질 런닝에 의해 탈안정화되고, 이어서 이는 330kd의 이량체 및 단량체를 제공한다. 이량체를 부가적으로 표준 환원 조건 하에서 환원시켜 단량체를 산출할 수 있다.
상기 모든 형태의 gp160을 본 발명의 배합물에서 사용할 수 있다.
gp160 또는 그의 유도체의 생산은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로 이는 적합한 숙주에서 P160에 대해 암호화하는 유전자의 클로닝 및 발현을 수반할 것이다. 상기 방식으로 재조합 gp160(rgp160)의 생산은 Maniatis 일행; 분자 클로닝-실험실 매뉴얼; Cold Spring Harbour 1982에 서술된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
재조합 DNA 분자의 발현을 위해 다양한 진핵 세포 및 발현 시스템을 이용할 수 있다. 이들 중에 가장 널리 사용되는 것은 효모, 곤충 및 포유동물 시스템이나, 본 발명은 이들의 이용에 제한되지 않는다. 상기 시스템은 본 발명의 재조합 DNA 분자, 임의로 선택 마커(marker) 및, 몇몇 경우에 복제 오리진과 같은 유지 기능물을 사용한다.
본 발명에 사용할 수 있는 곤충 세포는 초파리(Drosophila) 세포 및 인시류(Lepidoptera)세포를 포함한다. 초파리 세포는 S1, S2, S3, KC-O 및 디.히데이(D. hydei) 세포를 포함한다. 참고, 예컨대, Schneider 일행, J. Embryol. Exp. Morph. 27:353 (1972); Schulz 일행, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:9428(1986); Sinclair 일행, Mol. Cell. Biol. 5:3208(1985).
초파리 세포를 인산 칼슘 침전, 세포 융합, 일렉트로포레이션 및 바이러스 트랜스펙선을 포함하는 표준 기술에 의해 트랜스펙션한다. 세포를 예컨대 필수 아미노산 및 나머지의 염으로 구성되는 M3 배지를 포함하는 다양한 영양 배지에서 표준 세포 배양 절차에 따라 배양한다. 참고, Lindquist, DIS 58:163(1982).
초파리에 유용하다고 공지된 프로모터는 초파리 프로모터뿐만 아니라 SV40같은 포유동물 세포 프로모터를 포함하며, 전자가 바람직하다. 유용한 초파리 프로모터의 실례는 초파리 메탈로티오네인 프로모터, 70 킬로달톤 열쇼크 단백질 프로모터(HSP 70) 및 COPIA LTR을 포함한다. 참고, 예컨대, DiNocera 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7095(1983); McGarry 일행, Cell 42:903(1985).
유용한 인시류 세포는 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni), 스포도프테라 플루기페르다(Spodoptera frugiperda), 헬리오티스 제아(Heliothis zea), 오토그라피카 칼리포르니카(Autographica californica), 라치플루시스 우(Rachiplusis ou), 갈레리아 멜로넬라(Galleria melonella), 만두카 세스타(Manduca sexta)로부터의 세포이거나, 또는 핵다면성 바이러스중 바이러tm(NPV), 단일 뉴클레오캡시드 바이러스(SNPV) 및 다중 뉴클레오캡시드 바이러스(MNPV)를 포함하는 배큘로바이러스로 감염시킬 수 있는 다른 세포를 포함한다. 바람직한 배큘로바이러스는 NPV 또는 MNPV 배큘로바이러스가 감염된 세포에서 높게 발현하는 다면성 유전자 프로모터를 함유하므로 이들이 바람직하다. 구체적으로 여기에 예시된 것을 오토그라피카 칼리 포르니카로부터의 NMPV 바이러스(AcMNPV)이다. 그러나, 다른 MNPV 및 NPV 바이러스는 또한 비단벌레 바이러스, 봄비스 모리(Bombyx mori)를 사용할 수 있다. 인시류 세포를 본 발명의 재조합 DNA 분자와 감염성 배큘로바이러스의 DNA를 함유하는 DNA로 및 상기 논의된 바와 같은 표준 트랜스팩션 기술에 의해 동시-트랜스펙션시킨다. 세포는, 예컨대 10% 태아 송아지 혈청(FCS)로 보충된 TC100(Gibco Europe; ardiner 일행, J. inverteb. Pathol. 25: 363(1975)을 포함하는 다양한 영양 배지에서 표준 세포 배양 기술에 따라 배양된다. 참고, Miller 일행, Setlow 일행, 편집. 유전공합 : 원리 및 방법, 8권, New York, Plenum, 1986, pages 277-298.
인시류 세포에서의 이용을 위한 프로모터는 배큘로바이러스 게놈으로부터의 프로모터를 포함한다. 다면성 유전자의 프로모터는 다면성 단백질이 천연적으로 다른 배큘로바이러스 단백질에 비해 능가하게 발현하므로 바람직하다. AcMNPV 바이러스로부터의 다면성 유전자 프로모터가 바람직하다. 참고, Summers 일행, TAES Bull, NR 1555; May 1987; Smith 일행, EP-A-127,839; Smith 일행, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82:8404(1985); 및 Cochran, EP-A-228,036.
포유동물 세포내에서의 발현의 경우에, 재조합 DNA 분자는 클로닝 벡터내에 클로닝되고 그 다음 포유동물 세포에 트랜스펙션하는데 사용된다. 바람직하게 벡터는 유전자 증폭을 위한 부가적인 DNA 기능물, 예컨대 DHFR 발현 카셋트를 포함하고 또한 선택 및/또는 증폭을 위한 부가적인 기능물, 예컨대 G418 선택을 위한 네오마이신 저항성 카셋트를 포함할 수 있다. 또한, 전사증진을 위한 것 같은 다른 기능물을 사용할 수 있다. 원한다면, 소 파필로마 바이러스의 유지 기능물 같은 다른 기능물을 적당한 에피좀 유지를 위해 벡터내에 함유할 수 있다. 대안적으로 및 바람직하게 클로닝 벡터는 종두 바이러스같은 재조합 포유동물 바이러스이다.
종두 바이러스는 재조합체가 종두 DNA의 불필수 영역에서 외래 유전자의 합체에 의해 용이하게 성립되어 감염성을 보유할 수 있으므로 특히 유용한 벡터이다. 적당히 처리된 단백질은 합성되고 프로세싱되어 감염된 세포의 막에 이동된다. 종두 바이러스 감염은 세포를 죽게 하기는 하나, 거의 용해가 없어 세포의 대부분이 보존되므로 감염된 세포로부터의 원하는 단백질을 쉽게 추출할 수 있다. 종두 발현 시스템은 Barrett 일행, Research and Human Retroviruses 1989; 5: 159-171에 의해 개발되었다.
유용한 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO), NIH3T3 COS-7, CV-I, BHK-21, 생쥐 또는 생쥐 마이엘로마, HAK, Vero, HeLa, 사람 이배체 세포 예컨대 MRC-5 및 W138, 또는 닭 임파종 세포계로부터의 세포를 포함하며, 이중 CV-1 및 BHK-21이 바람직하다.
트랜스펙션 및 세포 배양을 표준 기술에 의해 수행한다. 포유동물 세포에서의 생산은 또한 트랜스제닉 동물에서의 발현에 의해 수행될 수 있다.
포유동물 세포계 또는 포유동물 일차 세포에서의 유전자 발현을 유발하는데 유용한 표준 서열은 SV40 초기(early) 및 말렵(late) 유전자 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 바이러스 LTR's 예컨대 라우스 사코마 LTR, 몰로니 사코마 바이러스(MSV) LTR 또는 생쥐 유방 종양 바이러스(MMTV) LTR, 또는 아데노바이러스 주요 말렵 프로모터 및 혼성 프로모터 예컨대 혼성 BK 바이러스 및 아데노바이러스 주요 말렵 프로모터를 포함한다. 또한 조절 요소 영역은 폴리아데닐화를 위한 영역과 같은 다운스트림 기능물, 또는 전사 인핸서 서열같은 다른 기능물을 포함할 수 있다.
본 발명의 실행시에 사용할 수 있는 효모는 하넨술라(Hanensula), 피치아(Pichia), 클루비로마이세스(Kluveromyces), 시조사카로마이세스(Schizosaocharomyces), 칸디다(Candida) 및 사카로마이세스(Sacchoromyces) 속의 것들을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애(Sacchoromyces cerevisiae)는 바람직한 효소 숙주이다. 유용한 프로모터는 구리 유도가능한 (CUP1) 프로모터, 해당 유전자 프로모터, 예컨대 TDH3, PGK 및 ADH, 및 PHO5 및 ARG3 프로모터를 포함한다. 참고, 예컨대 Miyanohara 일행, Proc. Nqa시. Acad. Sci. USA 80:1(1983); Mellor 일행, Gene 24: 1(1983); Hitzeman 일행, Science 219: 620(1983); Cabezon 일행 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6594(1984).
(i) CV-I 세포에서 변형된 gp160의 발현
BH10 분자 클론의 HIV env 유전자를 돌연변이 유발시켜 전구체 절단을 없앤다.
이를 위하여 상기 서열에 존재하는 절단서열 lys ala lys arg 및 arg glu arg는 lys/arg x glu arg에 대한 돌연변이를 유발하는 부위에 의해 변형하였다.
완전히 돌연변이된 env 유전자(뉴클레오티드 5802-8478)을 종두 플라스미드 전이 벡터 pGS20[Mackett M. G., Smith L. 및 Moss B. (1984) J. Virolory 49 : 857-864] 내로 클로닝시키고, 재조합에 의해 감염성 종두 바이러스내로 전이시켰다. 재조합 종두 플라크를 CV-1 세포상에서 두 번 재클로닝된 포획물 EIA 및 양성 플라크에 의해 env 발현을 위해 스크리닝했다. 상기 세포계에서 절단되지 않은 gp160의 생산은 부가적으로 재조합 종두로써 감염된 세포의 대사적 라벨링 후에 RIPA에 의해 확인되었다. 세포 표면 발현은 항-gp120 항체를 사용하는 무상 세포 표면의 형광성 라벨링에 의해 확인되었다.
(ii) 고정(Anchorage) 의존 세포로부터 변형된 gp160의 정제
(i)로부터의 HIV gp160 엔벨로프 단백질을 삼단계 프로토콜로 정제시켰다: 숙주 세포의 용해 및 세정제의 도움으로 항원 추출에 이어서 두 번의 친화 크로마토그래피 단계. 모든 정제 단계는 4℃에서 수행했다.
[단계 1]
CV-1 세포의 용해 및 항원 gp160의 추출
해동시킨 후에, 배양물의 20L에 상응하는 미소담체비이드 및 세포 gsxkrdor을 15분동안 2,200×g으로 원심분리하고 상등액을 따라 버렸다. 침전물을 150mM NaCl, 1% 폴리에틸렌글리콜 300 모노데실에테르(데실 PEG) 및 20mcg/ml 아프로티닌 1L에 재현탁시켰다. 세포를 손으로 가끔씩 진탕시키면서 얼음 상에서 1시간동안 용해시키고 20분동안 11,300×g에서 원심분리시켰다. 상등액의 분리 후에, 펠릿을 용해 완충액 40ml로 세척하고 20분동안 11,300×g로 원심분리시켰다. 세포 부스러기 및 미소담체 비이드를 따라 버리고 합해진 상등액을 부가적인 정제에 사용했다.
[단계 2]
렌틸 렉틴 세파로스 4B상 친화 크로마토그래피
용해질을 150mM NaCl 및 0.1% 데실 PEG로 보충된 30mM 트리스/HCl 완충액(pH8)과 평형된 렌틸 렉틴 세파로스 4B(Phamacia-LKB) 컬럼 (2.5cm×20cm)상에서 크로마토그래핑시켰다. 1ml/분의 유량으로 용해질을 적하한 후에, 컬럼으 1M NaCl 및 0.1% 데실 PEG로 보충된 pH 8의 30mM 트리스/HCl 완충액으로 세척했다. 순차적으로, 항원을 평형 완충액내 0.5M 메틸 α-D-만노피라노시드로 컬럼으로부터 용리시키고 gp160 양성분획을 모았다. 세척 및 용리 단계는 5.5ml/분의 유량으로 수행했다.
[단계 3]
178.1-트리아크릴상 면역친화 크로마토그래피
항-gp160 모노클로날 항체 178.1(특허 공개 번호 WO/90/06358)을 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia-LKB) 상에서 복수(腹水) 유동액으로부터 정제하고 이어서 제조입자의 안내에 따라 글루타르알데히드-활성화 트리스 아크릴(IBF) 상에서 결합시켰다. 항원(V3루프)의 gp120 부분 상의 에피토프에로 향하는 항체를 1.5mg/ml 겔의 밀도로 결합시켰다.
수지를 컬럼(2.5cm×10cm)내에 채우고 150mM NaCl 및 0.1% 데실 PEG로 보충된 pH 8의 30mM트리스/HCl 완충액에서 평형을 이루었다.
렌틸 렉틴 세파로스 4B 용리물을 1ml/분으로 밤새도록 재순환하므로써 컬럼상에 적하시켰다. 이어서 컬럼을 1M NaCl 및 1% 노르말 옥틸 β-D-글루코피라노시드(OGP)로 보충된 완충액 pH8의 30mM 트리스/HCl 완충액의 20 컬럼 부피로써 3.3ml/분의 유량으로 세척했다. 마지막으로, 항원을 1% OGP로 보충된 pH3.3의 0.1 M 구연산 완충액으로 동렘나 유량으로 용리시켰다. 용리 분획을 즉시 pH 0.8의 1M 트리스/HCl로 중화시키고 항원 양성 분획을 모았다.
(iii) 단백질 측정
단백질 농도를 표준으로 소 혈청 알부민을 사용하여 브래드포드법(브래드포드, 1976)으로 측정했다.
(iv) 항원 측정
gp160 항원의 양은, 모노클로날 항체를 포획하는 것으로서 양(sheep) 항-gp41 및 모노클로날 항체 지시자로서 쥐 항-gp120을 사용하여 하우스내에서 개발된 샌드위치 ELISA에 의해 측정했다. 부가적으로 전통적인 비오티닐화된 항-쥐 항체, 스트렙타비딘 및 퍼옥시다제 시스템으로 감지했다.
(v) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅
SDS-슬라브 겔 전기 영동을 라엠리(라엠리, 1970)의 방법에 따라 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 수행했다. 이동 후에, 단백질을 퍼요오드 산 산화후에 은 염색에 의해 가시화했다(Pas 염색)(Dubray 일행, 1982).
전기영동 실행은 환원제 존재하에 및 부재하에 수행했다. 부가적으로 단백질 띠를 Towbin(Towbin 일행, 1979)에 따른 니트로셀룰로스 상에 웨스턴 블로팅에 의해 확인했고, gp160 항원에 대한 항체 또는 숙주 세포(CV-1) 또는 종두 단백질을 대한 항체로 표식했다.
(vi) 178.1 모노클로날 항체의 누출
정제된 gp160 항테내 모노클로날 항체 178.1의 존재는 ELISA에 의해 측정했다. 항체는 염소-항-쥐 항체에 의해 포획되고 비오틴기화된 항-쥐 항체로써 감지된다. 스트렙타비딘-퍼옥시다제 시스템을 사용하여 부가적으로 감지했다.
(vii) 순수한 env gp160의 크기 배제 크로마토그래피
정제된 gp160을 1% OGP로 보충된 pH 7의 0.2M 인산 완충액에서 평형을 이룬 TSK 4000SW HPLC 컬럼(7.5mm×300mm)상에서 크로마토그래핑시켰다. 유량은 0.75ml/분이었고 컬럼분획을 ELISA에 의해 항원에 대해 분석했다.
(viii) 순도 측정
환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 각 정제단계 후에 순도를 평가했다. 단백질 띠를 PAS 염색에 의해 가시화하고 부가적으로 웨스턴 블로팅으로 확인했다.
결과는 명백히 항원이 면역친화 컬럼 상 크로마토그래피 후, 감지될 수 있는 오염된 단백질이 없음을 보였다. 그러나, 최종 생성물은 면역친화 컬럼으로부터 누출되는 소량의 모노클로날 항체로 오염될 수 있다. 그러므로, 순수한 gp160 내 178.1 항체의 양은 ELISA에 의해 측정되었고 표본에 존재하는 단백질의 총량은 0.004% 내지 0.02% 범위였다.
정제된 항원의 gp160의 올리고머 형태의 존재에 대해 분석했다. 올리고머의 형성은 엔벨로프 단백질이 비리온의 표면에 나사상으로 배열된 바이러스내 gp160의 구조를 반영할 수 있었다. 항원의 일차 서열내 시스테인의 존재는 이황화물 결합에 의해 연결된(호모-) 올리고머를 형성시켰다. 이는 β-메르캅토에틴올의 존재시에 및 부재시에 SDS-폴리아클릴아미드 겔 전기영동에 의해 증명되었다. 환원제없이, 항원은 심지어 세정제(SDS)의 존재 하에 160,000Da보다 더 큰 분자량의 단백질 띠를 나타냈다. 반면에, 항원을 환원제의 존재하에 비등시킬 때, 160kDa의 단일 단백질 띠를 발견했다. 올리고머 구조의 크기를 측정하기 위하여, 항원을 HPLC 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석했다. 공지된 분자량의 표준으로써 컬럽 조정으로 gp160 분자의 대부분이 640,000 Da의 분자량에 상응하는 보유 시간에서 당연히 용리된다. 그러므로, 세정제는 존재하나 환원제 없이, 대부분의 HIV gp160 env 단백질은 사량체 구조로 모인다는 결론이었다.
(ix) 분석
최종 생성물은 용해물(배양물 리터 당 ELISA에 의해 0.8-1.4mg 항원)의 ELISA 함량에 들어맞는 약 2의 항원/단백질 비를 나타낸다.
[실시예 2]
BHK-21내 변형된 gp160의 발현 및 현탁액에서 배양된 세포로부터 env. gp160의 정제
HIV gp160 엔벨로프 단백질은, 용해 단계에서의 몇몇 작은 변형을 제외하고는 실시예 1 (ii)에 윤곽이 제시된 도식에 따라 정제된 재조합 종두 바이러스에 의해 실시예 1 (i)에 서술된 것과 유사한 방법으로 BHK-21 세포에서 발현했다.
[단계 1]
BHK-21 세포의 용해 및 항원 gp160의 추출
해동시킨 후에, 세포 현탁액(109세포)을 2,200×g에서 15분동안 원심분리시키고 상등액을 따라 버렸다. 세포 펠릿을 150mM NaCl, 1% 폴리에틸렌 글리콜 300 모노데실에테르(데실 PEG) 및 20 mcg/ml 아프로티닌으로 보충된 pH8의 30mM 트리스/HCl 완충액 50ml에 재현탁시켰다. 세포를 손으로 가끔 진탕하면서 얼음 상에서 1시간동안 용해시키고 11,300×g에서 15분동안 원심분리시켰다. 상등액의 분리 후에, 펠릿을 용해 완충액 20ml로 세척하고 11,300×g에서 15분동안 세척했다. 펠릿을 따라 버리고 합해진 상등액을 부가적인 정제에 사용했다.
단계 2 및 3 및 순차적인 분석을 실시예 1 (ii)-(ix)에 서술된 바대로 수행했다.
[실시예 3]
gp160-3D-MPL 백신 배합물의 제조
(a) rgp160-수산화알루미늄과 3D-MPL
종두로부터의 정제 rgp160(투여량 당 각각 100㎍ 또는 20㎍)(실시예 1)을 1ml의 150mM NaCl, 10mM 인산염 완충액 pH 6.8에서 0.5㎍ 당량 Al3+에 상응하는 수산화 알루미늄(alum; 명반)상에서 4℃에서 밤새도록 흡착시켰다. 밤새도록 항온 처리한 후에, 어쥬번트 제제를 원심분리시키고 상등액을 제거했다. 그다음 100㎍ 3D-MPL을 함유하는 동일 부피의 흡착 완충액을 명반-결합 rgp160에 첨가했다. 95% 이상의 rgp160이 수산화알루미늄 상에 흡착된 것이 발견되었다.
(b) 물 유탁액내 rgp160-3D-MPL 오일
하기와 같이 비히클을 제조했다. 플루로닉 L121 5%(BASF Wyandotte, New Jersey)(v/v) 및 10% 스쿠알란(Aldrich)를 0.4%(v/v) Tween 80을 함유하는 인산염-완충 살란(PBS)에 첨가했다. 그다음 이 혼합물을 미소 유동화시켰다. 미소유동화를 위하여, 유탁액을 미소유동화기(모델 M110 Microfluidics Corp., Newton, Mass)를 통하여 10번 순환시켰다. 결과 생성된 유탁액은 단지 서브미크론 입자들로 구성되었다. 상기 윤탁액의 1부피를 두배 농축된 rgp160(20㎍ 또는 100㎍중의 하나)의 동일한 부피와 혼합하고 간단히 볼텍싱시켜 성분들을 완전히 혼합시켰다. 그 다음 100㎍/ml 3D-MPL을 상기 rgp160 유탁액에 첨가했다. 최종 제재는 1ml 주사 투여량으로 0.2% 트윈 80, 2.5% 플루로닉 L121, 5% 스쿠알란, 100㎍ 3D-MPL 및 rgp160(100㎍ 또는 20㎍)으로 구성되었다.
[실시예 4]
기나아 돼지에서의 면역원성
ELISA 및 중화 역가
다섯 마리의 기니아 돼지를 한달 간격으로 SAF-1(Syntex 어쥬번트 배합물-1) Byars Ne 및 Nllison A.C(1987) 백신 5 : 223-227내 변형된 gp160 50㎍(실시예 1)을 3번 주사하여 면역화시켰다. 기니아 돼지를 혈청을 이차 면역화 후 2주 및 1개월째, 그리고, 삼차 면역화 후 2주째 시험하였다. 결과는 표 2에 서술된다.
HIV-1(IIIB)로 감염된 세포의 용해질을 기재로 한 포획 효소에 면역검정법(EIA)를 사용하여 첫 번째 및 두 번째 증강분 후에 항혈청 ELISA 역가를 측정했다. 사용된 시험은 Moore 일행 [Moore J.P. 일행, 1989, AIDS 3:155(63)]에 의해 공개된 것과 매우 유사하다.
미소평판 중화 검정은 감지자 세포내 HIV gag 항원의 감지에 근거한다. 간단히, SupT1 세포(Hecht 일행, 1984, Science 226:1445)를 감지자 세포로 사용한다. 바이러스 접종물은 림프 세포계를 생산하는 HIV-1(IIIB)의 세포가 없는 상등물로 구성된다. 상등물을 고속으로 원심분리시켜 세포 및 세포 부스러기를 제거하고, 1ml병에 분취하고 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다. 시험할 혈청을 시험하기 전에 56℃에서 30분동안 불활성화시켰다. 음성 대조표준은 예비면역 또는 어쥬번트만으로 접종한 동물로부터의 혈청(시험할 혈청과 동일한 혈청)의 풀로 구성된다. 중화를 위하여, 750 TCID50을 37℃에서 1시간동안 혈청의 일련의 두배 희석물로써 항온 처리했다. SupT1 세포를 첨가하고(4·104세포/웰) 37℃에서 4일 항온처리했다. 현미경으로 세포 변성 효과를 감시하고 트리톤 X-100(1 최종농도)을 각 세포에 첨가하고 평판을 동결시킨다. 샌드위치 ELISA를 사용하여 배양물내에 생산된 바이러스 항원의 상대량을 감시한다. 평판을 항 p55모노클로날 항체로 피복한다. 상기 트리톤 X-100으로 처리한 표본을 평판에서 항온처리하고 gag 항원의 존재는 비오틴기화 HIV-1 + 사람 1gGs에 의해 이어서 스트렙타비딘 퍼옥시다제 단계에 의해 가시화된다. 그다음 대조표준에 비례하여 HIV-1 항원 생산의 감소 퍼센트를 모든 시험할 혈청 희석물에 대해 평가한다. 비직선 최소 시작 분석에 의한 데이타 포인트에 적합한 곡선을 사용하여 대조표준과 비교하여 항원 생산이 50% 감소한 혈청 희석물(임의로)을 외삽한다.
표 2는 삼차 면역화 후의 중화 항체 역가를 나타낸다.
두 번째 증강 후에 관찰된 중화 역가는 감염된 사람으로부터 혈청내에서 발견된 것들을 초과한다. 보다 엄밀히, HIV IIIB 분리물에 대한 항혈청의 중화 역가는 5개 혈청양성 WHO 기준 혈청의 군에 대해 조사된 것보다 평균 4배 더 높다(McKeating 일행, 1989, J. Gen, Virol. 70:3326-3333). 낮은 감지도 및 역가를 산출하는 더 엄중한 중화 시험을 사용하여 Dr. Weiss 연구소(Chester Beatty 연구소, 영국)에 의해 일련의 HIV-1 분리물의 중화(교차 중화)를 시험했다. 표 3에 서술된 결과는 2개의 상이한 혈액으로 세가지 경우에 재현되었고 아프리칸 균주(CBL-4)를 포함하는 다양한 HIV-1의 우수한 교차중화를 보인다(참고 표 3).
종두 gp160(실시예 1)로 면역화된 기니아 돼지로부터의 혈청(01-05)은 삼차 면역후에 우수한 교차 중화 역가를 보인다.
세 번의 투여 후에 관찰된 강한 교차 중화 반응 때문에, 본 발명의 종두 gp160은 HIV-1 백신화를 위한 효능있는 용도가 있다고 여겨진다.
[실시예 5]
레수스(Rhesus) 원숭이에서 정제된 HIV 종두 재조합 gp160(IIIB 분리물)의 면역원성에 대한 상이한 백신 배합물의 효과 연구
이 연구에서, 정제된 종두 재조합 gp160(rgp160)의 면역원성을 향상시키는 상이한 백신 배합물의 능력을 레수스 원숭이(Macaca mulatta)에서 평가했다. 시험된 어쥬번트는 3D-MPL과 함께(실시예 2b)(3D 모노포스포릴 리피드 A, Ribi) 수산화 알루미늄; 수중유 유탁액내 3D-MPL(실시예 2a)이었다.
3.5 내지 5kg 중량의 레수스 원숭이(Macaca mulatta)를 무작위로 그룹당 3 또는 4마리의 동물을 갖는 7개 군으로 배당했다.
그룹을 하기와 같이 3개 어쥬번트 배합물로 배합된 상이한 투여량의 rgp160으로 면역화했다:
그룹 1 (4마리 원숭이) : 수산화 알루미늄과 3D-MPL 상에 흡착된 100㎍ rgp160
그룹 2 (4마리 원숭이) : 수산화 알루미늄과 3D-MPL 상에 흡착된 20㎍ rgp160
그룹 3(4마리 원숭이) : o/w 유탁액내 3D-MPL과 100㎍ rgp160
그룹 4(4마리 원숭이) : o/w 유탁액내 3D-MPL과 20㎍ rgp160
[5.1. 항원-어쥬번트 제제]
모든 rgp160 배합물을 사용하기 직전에 제조했다. 각 주사 투여량은 1ml 부피로 투여했다.
레수스 원숭이 그룹들을 0일 및 35일에 다양한 gp160 배합물의 1ml 투여량으로써 팔 삼두근에 근육내로 주사했다. 두 번째 면역화후 2주째에, 항체 측정을 위해 동물을 피를 내었다.
[5.2. 리드-아웃(Read-out)]
두 번째 주사후 2주된 상기 동물들로부터 취한 혈청을 ELISA 및 중화 검정에서 시험했다.
[5.3. ELISA]
Thiriart 일행(Thiriart 일행, 1989, J. Immunol 148 6: 832-1936)에서 서술된 일반적인 프로토콜의 포획 면역 검정의 변형을 사용했다. 이 검정은 Biochrom으로부터 상업적인 모노특이적 항 gp41 시약을 사용한다.
[5.4. 중화 검정]
미소평판 중화 검정은 감지자 세포내 HIV gag 항원의 감지에 근거한다. 간단히, SupT1 세포(Hecht 일행, 1984, Science 226:1445)을 감지지 세포로서 사용한다. 바이러스 접종원은 림프 세포계를 생산하는 HIV-1(IIIB)의 세포가 없는 상등물로 구성된다. 상등물을 고속으로 원심분리시켜 세포 및 세포 부스러기를 제거하고, 1ml병에 분취하고 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다. 시험할 혈청을 시험하기 전에 56℃에서 30분동안 불활성화시켰다. 음성 대조표준은 예비면역 동물로부터의 혈청의 풀로 구성된다. 중화를 위하여, 750 TCID50을 37℃에서 1시간동안 혈청의 일련의 두배 희석물로써 항온 처리했다. SupT1 세포를 첨가하고(4·104세포/웰) 37℃에서 4일 항온처리했다. 현미경으로 세포 변성 효과를 감시하고 트리톤 X-100(1 최종농도)을 각 세포에 첨가하고 평판을 동결시킨다. 샌드위치 ELISA를 사용하여 배양물내에 생산된 바이러스 항원의 상대량을 감시한다. 평판을 항 p55 모노클로날 항체로 피복한다. 상기 트리톤 X-100으로 처리한 표본을 평판에서 항온처리하고 gag 항원의 존재는 비오틴기화 HIV-1 + 사람 1gGs에 의해 이어서 스트렙타비딘 퍼옥시다제 단계에 의해 가시화된다. 그다음 대조표준에 비례하여 HIV-1 항원 생산의 감소 퍼센트를 모든 시험한 혈청 희석물에 대해 평가한다. 선형 회귀 분석에 의한 데이타 포인트에 적합한 곡선을 사용하여 대조표준과 비교하여 항원 생산이 50% 감소한 혈청 희석물을 외삽한다.
[5.5. 결과]
표 4는 두 번째 면역화 후의 ELISA 및 중화 항체 역가를 나타낸다. 3D-MPL o/w so HIV rgp160의 일반 면역원성은 매우 우수하다. gp160의 20㎍을 동물에 투여할 때, 관찰된 중화 역가(NT) 및 ELISA 역가는 3D-MPL o/w so rgp160을 투여한 동물의 그룹(그룹 4)에서 극히 우수했다. 이들 자료는 3D-MPL o/w 유탁액의 우수한 어쥬번트 효과를 시사한다. 3D-MPL의 존재하에 명반상에 흡착된 gp160으로 면역화된 동물의 면역반응은 약간의, 중화 항체가 생산됨에도 불구하고 불량하다. HIV gp160은 소수성 부분을 함유하는데 이는 아마도 분자에 리피드에 대한 고친화력을 제공한다. HIV gp160은 3D-MPL을 함유하는 배합물을 기재로 한 수중유를 사용하므로써 면역 시스템에 최상으로 존재한다.
[실시예 6]
[6.1. 실험 설계]
두 마리의 침팬지(번호 1, 번호 2)를 실시예 1로부터 정제된 종두 재조합 gp160(100㎍/투여)(rgp160)으로 면역화시켰다.
두 마리 침팬지(번호 3, 번호 4)를 초파리 시나이더(Drosophila Schneider) 세포(rgp120)(Culp 일행, Biotechnology, 9:173-177, 1991)에서 발현된 정제 재조합 gp120(100㎍/투여)으로 면역화했다.
재조합 단백질을 o/w 유탁액내 3D-MPL(100㎍/투여)과 배합했다. 배합물은 1ml 주사 부피에서 0.2% 트윈 80, 2.5% 플루로닉 L121, 5% 스쿠알란, 100㎍ 3D-MPL 및 재조합 항원 투여(rgp160 또는 rgp120에 대해 100㎍)로 구성됐다.
동물은 0.1 및 2개월에 다리에 근육내로 면역화했다.
동물은 ELISA 및 중화 검정에 의해 항체 측정을 매 2주마다 피를 뽑고(참조 엘리사 방법론); HIV 중화 분석을 하기 서술된 바와 같이 약간 변형했다. 또한 연기된(delayed) 유형의 과민 반응(DTH)을 하기와 같이 평가했다.
[6.2. 체액 면역의 유발]
표 5에 제시된 바와 같이, 3D-MPL o/w 유탁액내 유래된 rgp160 또는 rgp1 20으로써 백신 주사된 침팬지는 3 면역화 후에 높은 ELISA 및 중황역가를 생산했다. 중화 활성은 2번 주사 후에 4개중 3개 혈청에서 및 부가적인 증강분 후에 4개중 4개에서 감지할 수 있었다. 중화 역가의 증가는 세 번째 면역화에 이어 관찰되었다. 상기 증강분 후에 측정된 ELISA 및 중화 역가는 동일한 rgp160 배합물로써 3번 면역화된 레수스 원숭이에서 얻어진 것과 매우 유사하다.
[6.3. DTH의 유발]
DTH 시험은 세 번째 면역화후에 2주째 수행했다. 모든 주사는 주사당 100㎕ 부피로 배에 투여했다.
두 마리의 rgp160으로 면역화된 침팬지 및 두 마리의 rgp120으로 처리된 동물을 3개의 상이한 항원(rgp160, rgD26, 파상풍 독소) 및 2개의 대조표준 완충액(rgD2t 대조표준 완충액(PBS) 및 rgp160 대조표준 완충액)으로 피부 처리했다. 상이한 재조합 항원 투여는 rgp160의 경우에 40, 20 또는 10㎍ 및 rgD2t의 경우에 20, 10 또는 5㎍으로 처리했다.
DTH 반응을 피부 두께 측정에 의해 24시간 후에 관찰하였다. 결과는 제1-3도에 예시된다.
파상풍 독소 및 rgp160에 대한 특이적 DTH 반응을 rgp160(제1도)로써 또는 rgp120(제2도)로써 백신 주사된 동물들에서 관찰했다.
상기 결과는 o/w 유탁액 내 3D-MPL을 함유하는 배합물이 특이적 T 세포 반응을 유발할 수 있음을 나타낸다(참고 표 6).
결론적으로, 침팬지에서 얻어진 결과는 수중유 유탁액내 3D-MPL을 함유하는 어쥬번트 배합물이 체액의(중화 항체) 및 영장류에서 작동인자 세포로 매개된(DTH) 면역 반응을 개선시킴을 명백히 나타낸다.
[중화 검정]
미소평판 중화 검정은 감지자 세포내 HIV gag 항원의 감지에 근거한다. 간단히, SupT1 세포(Hecht 일행, 1984, Science 226:1445)를 감지자 세포로서 사용한다. 바이러스 접종원은 림프 세포계를 생산하는 HIV-1(IIIB)의 세포가 없는 상등물로 구성된다. 상등물을 고속으로 원심분리시켜 세포 및 세포 부스러기를 제거하고, 1ml병에 분취하고 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다. 시험할 혈청을 시험하기 전에 56℃에서 30분동안 불활성화시켰다. 우리의 음성 대조표준은 예비면역 동물로부터의 혈청의 풀로 구성된다. 중화를 위하여, 750 TCID50을 37℃에서 1시간동안 혈청의 일련의 두배 희석물로써 항온 처리했다. SupT1 세포를 첨가하고(2·104세포/웰) 37℃에서 4일 항온처리했다. 현미경으로 세포 변성 효과를 4일째에 감시하고 중화역가를 육안으로 측정한다. 주어진 중화 역가는 예비면역의 대조표분에 비교하여 신시티움(syncytia) 형성의 80% 감소를 제공하는 혈청의 희석물의 역에 상응한다. 육안으로 측정된 역가는 부가적으로 Pauwels 일행(J. Virol. 방법 20:309-321, 1988)에 의해 서술된 MTT 검정을 사용하여 각 웰에서 세포 생존 능력을 측정하므로써 7일째 날에 객관화한다. 상기 검정에서 측정된 역가는 비감염 세포에 비하여 CPE에 대해 80% 보호를 제공하는 혈청 희석물의 역수를 나타낸다. 육안으로 및 MTT로 측정된 역가는 한 검정으로부터 또 다른 것으로 복사가능하고 MTT로 측정된 역가(제시되지 않음)는 육안으로 측정된 것보다 2 내지 4배 낮다.
* 대조표준과 비교하여 항원생성물 50% 감소시키는 혈청 희석물의 역수에 상응한다.
** 흡수도를 최대 흡수치(중간점 역가)의 50%와 동일하게 하는 혈청 희석물의 역수에 상응한다.
GMT = 기하 평균 역가
Claims (11)
- gp160 또는 이의 면역원 유도체, 3D 모노포스포릴 리피드 A 및 적절한 담체를 포함하는, HIV 감염 예방 또는 치료용 제약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, gp160 단백질이 독립적으로 위치 502 및 510에서 리신 또는 아르기닌이 아닌 아미노산을 제공하도록 변형된 조성물.
- 제2항에 있어서, 위치 502 및 510의 아미노산이 히스티딘, 트레오닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민 및 글루탐산 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제3항에 있어서, 위치 502 및 510의 아미노산이 글루탐산인 조성물.
- 제1항에 있어서, gp160 단백질이 올리고머 또는 이량체로 존재하는 조성물.
- 제5항에 있어서, 단백질이 640kDa의 상대분자량을 갖는 조성물.
- 제1항에 있어서, 면역원 유도체가 gp120인 조성물.
- 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 담체가 수중유 유탁액인 조성물.
- 제8항에 있어서, gp160 또는 이의 면역원 유도체가 10 내지 150㎍/ml인 조성물.
- gp160 또는 이의 면역원 유도체, 3D 모노포스포릴 리피드 A 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 것으로 이루어지는, gp160 또는 이의 면역원 유도체, 3D 모노포스포릴 리피드 A 및 담체를 포함하는 백신을 제조하는 방법.
- 제10항에 있어서, 면역원 유도체가 gp20인 방법.
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