HU211505A9 - HIV-fertőzés kezelésére szolgáló vakcinakészítmény Az átmeneti oltalom az 1-15. igénypontokra vonatkozik. - Google Patents

Description

A leírás terjedelme: 54 oldal (ezen belül 39 lap ábra)

HU 211 505 A9

Az 1. típusú humán immunelégtelenség vírus (HIV-1) egy olyan retrovírus, amely az egész szervezetre kiterjedő, az immunrendszer nagyfokú károsodásával járó fertőzést okoz, és mint kórokozó (etiológiai ágens) a szerzett immunhiányos szindrómáért (Acquired Immuné Deficiency Syndrome = AIDS) felelős. [Barre-Sinoussi et al., Science, 220, 868-871 (1983); Popovic et al., Science, 224, 497-500 (1984)]. A klinikai esetekből izolált HIV-1-et limfadenopátiával kapcsolatos vírusnak [Lymphadenopathy-Associated Virus-LAV; Feorino et al., Science, 225, 69-72 (1984)] és AIDS-szel kapcsolatos vírusnak [AIDS-related Vírus; Levy et al., Science, 225, 840-842 (1984)] is nevezték.

Az AIDS világrészekre kiterjedő járvánnyá vált, és így a világ közegészségügye számára fő prioritást jelent egy vakcina kifejlesztése. A HIV-1-gyel fertőzött személyek nagy százalékában a T4 limfociták fogyása következtében fokozatosan megszűnnek az immunfunkciók. A T4 sejtek, mint bizonyos idegsejtek is, felületükön egy CD4 nevű molekulát hordoznak. A HIV-1 a vírusrészecskék burkán elhelyezkedő egyik receptor révén felismeri a CD4 molekulát, belép ezekbe a sejtekbe, ahol azután replikálódik, és elpusztítja a sejteket. Egy hatékony AIDS vakcinától az várható, hogy olyan antitesteket termel, mely a HIV-1 burkához kötődik, és ez megakadályozza, hogy megfertőződjenek a T4 limfociták és más érzékeny sejtek.

A vakcinákat általában egészséges egyéneknek adják immunprofilaktikumként, mielőtt még ki lennének téve egy kórokozó organizmus hatásának. Ésszerű lenne azonban egy hatékony AIDS vakcinával való immunizálást fontolóra venni a fertőzés után is, mint a betegség elleni immunterápiát [J. Salk, Natúré, 327, 4Ί3476(1987)].

Az a felfogás az uralkodó, hogy a HIV-1 burok („env”) a legígéretesebb jelölt egy AIDS vakcina kifejlesztésében. [Francis és Petricciani, New Engl. J. Med., 1586-1559 (1985); Vogt és Hirsch, Reviews of Infectious Disease, 8, 991-1000 (1986); Fauci, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 9278-9283 (1986)]. A HIV-1 burokprotein először mint egy 160 000 molekulatömegű glükoprotein (gpl60) szintetizálódik. A gpl20 prekurzor ezután elhasad, és egy 120 000 molekulatömegű külső glükoprotein (gp 120) és egy 41 000 molekulatömegű transzmembán glükoprotein (gp41) keletkezik belőle. Ezek a burok-proteinek a fő cél-antigének az AIDS betegekben termelődő antitestek számára [Barin et al., Science, 228, 1094-1096 (1985)]. A natív HIV-1 gpl20 immunogénnek bizonyult, és képes volt neutralizáló antitestek képződését megindítani rágcsálókban, kecskékben, Rhesus majmokban és csimpánzokban. [Robey et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 7023-7027 (1986)].

Tekintettel arra, hogy a fertőzött sejtek igen kevés natív HIV-1 burokproteint tartalmaznak, és hogy HIV-1 fertőzött sejtekből az AIDS vakcina készítése kockázatokkal jár, rekombináns DNS módszereket alkalmaztak HIV-1 burokantigének előállítására AIDS vakcinákként való felhasználás céljából. Úgy tűnik, hogy a rekombináns DNS technológia a legjobb választás AIDS alegység vakcina előállításához, mivel ez a technológia ártalmatlan immunogének nagy mennyiségben való gazdaságos termelését teszi lehetővé. A HIV-1 burokproteint genetikailag módosított rekombináns vakcinia vírusokban fejezték ki. [Chakrabarti et al., Natúré, 320, 535-537 (1986); Hu et al., Natúré, 320, 537-540, (1986); Kieny et al., Biotechnology, 4, 790-795 (1986)]. A burokproteint baktériumsejtekben [Putney et al., Science, 234, 1392-1395 (1986)], emlős sejtekben [Lasky et al., Science, 23, 209-212 (1986)] és rovarsejtekben is kifejezték. A HIV-1 gp41 aminosavszekvencia eredetű szintetikus peptideket szintén mint AIDS vakcina jelölteket vették számításba. [Kennedy et al., (1986)]. Mindazonáltal ezeknek az anyagoknak és módszereknek a felhasználásával eddig még nem termeltek hatásos AIDS vakcinát.

Egy bakulovírus - rovarsejt rendszer használata rekombináns HIV-1 burokproteinek termelésére a 920 197 számú nyilvánosságra hozott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1986. október 16-án; jelenlegi sorozatszáma: 585 266) egyik kiviteli alakja. (Lásd még a 151 976 sorszámot).

A HIV-1 proteinek és más proteinek termelésében általánosan használhatónak bizonyult a bakulovírus rendszer. Az Autographa californica nukleáris polihedrózis vírus (AcNPV) nevű bakulovírust vektorként használták például a teljes hosszúságú gpl60 és a HIV-1 burok-gén különböző részeinek a kifejezésére fertőzött Spodoptera frugiperda (fali armyworm = őszi sereghernyó) sejtekben (Sf9 sejtek). Az előzőleg említett szabadalmi bejelentésekben szintén szerepel a csonka gpl60 gén (a rekombináns vektor száma: Ac3046), a rekombináns Ac3046 vektor által termelt protein és az Ac3046 géntermékének tisztítására vonatkozó technikák, melyek magukba foglalják a lencselektin affinitás kromatográfiát és a gélszűréses kromatográfiát. Úgy találták, hogy az ilyen módon tisztított és részecskékké aggregálódott gpl60 protein nagymértékben immunogén rágcsálókban és főemlős fajokban.

Az ideális AIDS vakcinának, azon követelményeken kívül, hogy lényegében biológiailag tisztának és pirogénmentesnek kell lennie, élethosszig tartó védelmet kell biztosítania egyetlen vagy néhány injekció után a HIV-1 fertőzés ellen. Rendszerint ez a helyzet az élő, legyengített (attenuált) vakcináknál. Ha elölt baktériumokat vagy vírusokat vagy a belőlük izolált anyagokat - ilyenek a toxidok vagy proteinek - használunk vakcina készítésre, gyakran gyenge antitest választ és csak rövid ideig tartó immunitást kapunk. Annak érdekében, hogy egy vakcinánál legyőzzük vagy minimálisra szorítsuk ezeket a hiányosságokat, egy további komponenst, egy úgynevezett adjuvánst adhatunk hozzá. Az adjuvánsok olyan anyagok, amelyek segítik stimulálni az immunválaszt. A humán vakcinákban általánosan használt adjuvánsok alumíniumsókból készített gélek (alumínium-foszfát vagy alumíniumhidroxid), amelyeket rendszerint alumíniumsó adjuvánsoknak (alum adjuvants) neveznek. [Bomford et al.. „Adjuvants”, Animál Cell Biotech. 2. kötet, 235-250 old. Academic Press Inc. (London, 1985)].

HU 211 505 A9

A találmány humán immunelégtelenség vírus elleni vakcinára és kezelési módszerekre vonatkozik. A kezelés magában foglalja a rekombináns HÍV burokprotein alkalmazását fertőzött vagy fertőzésre fogékony egyénnél. Egy előnyös kiviteli alakban a vakcinában való felhasználás céljára a burok proteint tisztítjuk, aggregáljuk, és adjuvánssal (például alumínium-foszfáttal) kombináljuk.

Az alábbiakban a találmány részletes leírása és a csatolt ábrák magyarázata következik. Az

1. ábra a HIV-1 burok génnek (env) E. coli pNA2 plazmidból való izolálására használt klónozási stratégiát ábrázolja. A besatírozott szakaszok a HIV-1 DNS szekvenciákat és az üres szakaszok a klónozó vektorokból származó szakaszokat jelentik. A pl774 plazmidban lévő fekete szakaszt szintetikus oligonukleotidokból szerkesztettük, melyet mint SmalKpnl fragmentumot a pl614 plazmid SmalKpnl helyére vezettünk be. Bemutatjuk a szintetikus oligonukleotid szekvenciáját. A

2. ábra a rekombináns plazmid vektor (p3046) szerkesztéséhez használt stratégiát ábrázolja. A p3046 vektort ezután az Ac3046 bakulovírus expressziós vektor szerkesztéséhez használjuk. A pMGS3 plazmid az AcNPV bakulovírusból származó szekvenciákat tartalmaz (kereszt-satírozású terület) a 4.00 pozícióban lévő klónozó hely két oldalán. Ez az egyetlen hely a következő restrikciós endonukleázok számára: Smal, KpnI és BglII. Az AcNPV polihedrin promoter a 4.00 pozíciótól 5’ irányban helyezkedik el. Az 5'-TAATTAATTAA-3' szekvencia 3' irányban van, és mindhárom leolvasási keretben egy transzláció terminátor kodont tartalmaz. A pl 774 plazmidot és a szintetikus oligonukleotid szakasz szekvenciáját az 1. ábránál ismertettük. A p3046 plazmid a teljes pMGS3 plazmidot tartalmazza, kivéve a Smal és BglII hely között lévő szekvenciákat, ahová a pl774 HIV-1 burok gént építettük be. A

3. ábra az Ac3046 gplőO kódoló szekvenciákkal határos DNS nukleotid szekvenciáit mutatja be. A +1 és +2267 hely között lévő 3046 env DNS szekvencia a 4. ábrán látható. A

4a-4t a HIV-1 env gén-szegmentum tényleges ábrák DNS szekvenciáját mutatják be az Ac3046ban lévő env gén 5' végén elhelyezkedő szintetikus oligonukleotid szekvenciák mentén (+1 és +2267 között). A restrikciós endonukleáz helyeket a DNS szekvencia fölé írtuk fel, és az előrelátható aminosavszekvenciákat a

DNS szekvencia alatt jegyeztük fel. Az

5a-5h ábrákon összehasonlítjuk az Ac3046 expressziós vektorban lévő env gén DNS szekvenciáját egy LAV-l-ből származó env gén közölt szekvenciájával. Felül a LAV-1 szekvencia, alul az Ac3046 szekvencia látható. A LAV-1 szekvencia alatti vonalak (I) azt jelentik, hogy ezekben a pozíciókban az Ac3046 szekvencia vele azonos. A DNS szekvencia számozása megegyezik a Wain-Hobson és munkatársai által [Cell, 40, 9-17 (1985)] a LAV-1-re leírt számozással. A

6. ábra humán HIV-1 antitest-pozitív szérumok (felső rajz) és gpl60-nal (IJSS, KLSS) vagy gpl20-szal (ABSS, CDSS, GHSS) immunizált Rhesus majom szérumok (alsó rajz) ELISA végpont hígításos titereit mutatja be. Az ELISA titereket nagymértékben tisztított gpl20 és gpl60 proteinekkel szemben mértük. A specifikusan kötött antitestet egy kecske anti-humán IgG torma-peroxidáz (HRP) konjugátummal mértük. A szérum azon legnagyobb hígítása jelenti a titert, amely pozitív választ ad a vizsgálatban. A

7. ábra a vakcináit szeropozitív betegek gpl60 vakcina által indukált immunválaszait foglalja össze.A

8. ábra (A és B) a specifikus HÍV burok epitópok elleni vakcina-indukált antitest válaszokat mutatja be. A

9. ábra (a-d) vakcináit szeropozitív egyénekben a vakcina által indukált T-sejt proliferációs választ mutatja be. A

10. ábra (A-C) a vakcinálástól függő limfocita proliferációs választ mutatja be. A

11. ábra a CD4 sejtek változását ábrázolja válaszoló és nem-válaszoló egyénekben, százalékban, az idő függvényében.

Kiderítették, hogy a rekombináns HIV-1 gpl60 burok protein („rgpl60”), főként, ha alumíniumvegyület adjuvánsra adszorbeálják (például alumíniumfoszfátra), különösen jól használható AIDS vakcina gyanánt. A találmány tárgyát képezi egy, a HÍV burok gén egy részének kódoló szekvenciáját tartalmazó AcNPV expressziós vektor. Az említett gén a fentebb említett Wain-Hobson közleményben szereplő szekvencia 1-757. szakaszával ekvivalens aminosavakat határozza meg, amelyek a 3046 számú rekombináns kiónban talált 1-752. aminosavak. A találmány további tárgyát képezi a szóban forgó rekombináns HÍV burokprotein termelése rovarsejtekben (és maga a protein), különösen a 752 aminosavmaradékból álló (a 3046 számú rekombináns klón által kódolt), a Wain-Hobson-féle aminosavszekvencia 1-757. tagjai által meghatározott rgpl60 protein.

Vonatkozik még a találmány a rekombináns burokprotein partikuláknak a 3046 proteint termelő rekombináns bakulovírus géntermékéből való tisztítására és előállítására és 3046 partikuláknak alumínium-foszfát aggregátumokra való adszorbeálására.

A találmány magába foglalja az AIDS vagy HÍV fertőzések megelőzésére vagy kezelésére szolgáló vakcinákat és azokat a módszereket, amelyek az AIDS vagy HÍV fertőzések megelőzését vagy kezelését szolgálják.

Az alábbi példákkal ismertetjük a találmányt, anélkül azonban, hogy csak ezekre korlátoznánk a találmány oltalmi körét.

HU 211 505 A9

A HÍV burokprotein 1-757. aminosavak kódoló csonka HIV-1 gplóO gént tartalmazó rekombináns Autographa californica nukleáris polihedrózis vírust (AcNPV bakulovírus) (rekombináns Ac3046) a 920 197 sorszámú (jelenlegi sorszáma: 585 260) amerikai egyesült államokbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentés írja le. A HIV-1 eredetű géneket vagy gén-részeket tartalmazó rekombináns bakulovírus szerkesztéséhez használt klónozási lépéseket ez a szabadalmi leírás is tartalmazza referenciaképpen.

A következőkben részletesen leíijuk azokat a géntechnológiai lépéseket, amelyeket az Ac3046 expreszsziós vektor szerkesztésénél használtunk. Az alkalmazott anyagokat, beleértve az enzimeket és az immunológiai reagenseket a kereskedelemből szereztük be. Olyan példákat is közreadunk, amelyek a találmány kivitelezhetőségét és alkalmazhatóságát szemléltetik.

Más rekombináns proteinekkel, melyeket együttesen rgp 160-nak nevezünk, és amelyekben bennfoglaltatik a rekombináns gpl20 és gp41, szintén foglalkozunk. Az Ac3046 csupán példája egy találmány szerinti expressziós vektornak és rekombináns burokproteinnek.

1. példa

Az 1-757. aminosavakat kódoló HIV-1 szekvenciákat tartalmazó Ac3046 rekombináns bakulovírus szerkesztése

Idegen proteint kódoló szekvenciák bakulovírusba való klónozásához és a vírusban való kifejezéséhez az szükséges, hogy a kódoló szekvenciához az egyik oldalon a polihedrin promoter és az 5' szekvenciák és a másik oldalon a bakulovírus kódoló szekvenciák csatlakozzanak. Az illesztés olyan, hogy a bakulovírus genommal való homológ rekombináció az idegen kódoló szekvencia átvitelét eredményezi a polihedrin promoterrel és egy inaktív polihedrin génnel összekapcsolva.

Tehát különböző inszerciós vektorokat terveztünk a HÍV burokgén szerkezetekben való felhasználás céljára. Az alább leírt MGS3 inszerciós vektort úgy terveztük, hogy helyettesítse a transzlációt indító ATG kodont. Az idegen szekvenciák beépítését ebbe a vektorba úgy végezzük, hogy az indító kodon által létrehozott transzlációs keret hibátlanul fennmaradjon az idegen szekvenciák mentén.

Az MGS3 inszerciós vektort egy izolált és tisztított AcMNPV plakkból (WT-1) izolált DNS klón egy EcoRI restrikciós fragmentumából szerkesztjük. Az MGS3 vektor a következő szerkezeti elemeket tartalmazza: a) a polihedrin gén ATG iniciációs kodonjától 5' irányban lévő 4000 bp hosszú szekvenciát; b) egy helyre irányuló mutagenezissel beépített polilinkert, amely egy ATG iniciációs kodont tartalmaz a megfelelő polihedrin kodon pozíciójában, továbbá Smal, KpnI és BglII restrikciós helyeket és egy univerzális stop kodon szegmentumot; c) egy 1700 bp méretű szekvenciát, mely a KpnI restrikciós helytől (ez a polihedrin gén belsejében van) az EcoRI-Ι klón utolsó EcoRI restrikciós helyéig terjed (lásd a 2. ábrát).

2. példa

LAV env gén kódoló szekvenciákat hordozó rekombináns bakulovírusok szerkesztése A NA2 elnevezésű rekombináns plazmidot (1. ábra) használjuk, amely egy teljes HIV-1 provírus 218 kb méretű szegmentumát tartalmazza pUC 18-ba beépítve. A klónról azt állították, hogy fertőző, mivel vírust tudott termelni, amikor bizonyos humán sejteket ezzel transzfektáltak. [Adachi és munkatársai, J. Virol., 59, 284-291 (1986).] A NA2-ben lévő teljes burok gén szekvenciák a HÍV LAV törzséből származtak [BarreSinoussi (1983)].

A HÍV burok gént az alább leírtak szerint izoláltuk és manipuláltuk (lásd az 1. ábrát is). A burok gént először az NA2-ből egy 3846 bp méretű Eco Rl/SacI restrikciós fragmentum formájában izoláltuk, majd beklónoztuk a pUC19 EcoRI/SacI restrikciós helyére. A kapott plazmid p708 elnevezési kapott.

Ezt követően egy 2800 bp méretű KpnI fragmentum alakjában izoláltuk a burok gént, és a pUC18 KpnI restrikciós helyére klónoztuk be. A kapott kiónt pl614 jelzéssel láttuk el.

A pl614 kiónban a KpnI restrikciós fragmentum a HÍV burok gén egy kevéssé csonkított darabját tartalmazta: az N-terminális szekvenciának megfelelő 121 bp hosszú rész hiányzott. A génből hiányzó részt, amely a szignálpeptid szekvenciákat tartalmazta, egy kétszálú szintetikus oligomer beépítése révén helyettesítettük.

A beépített oligomert a LAV aminosav szekvenciája alapján, a polihedrin gén előnyös kodon szerkezetének felhasználásával szerkesztettük meg. Hogy megkönnyítsük a további manipulációt, segítségképpen egy új Smal restrikciós szekvenciát vezettünk be az ATG iniciációs kodon helyére. Az ATG iniciációs kodont a bakulovírus inszerciós vektor szolgáltatta. A kapott plazmid pl774 elnevezést kapott.

A HIV-1 burok különböző domémjei kódoló szekvenciát tartalmazó Pl774 restrikciós fragmentumokat (lásd a 2. ábrát) olyan módon klónoztuk be az MGS inszerciós vektorokba (például MGS3), hogy az inszerciós vektor AT iniciációs kodonja a burok gén kodonjához igazodjék. A p3046 szerkezetet úgy kaptuk, hogy a Pl774-ből izolált Smal/BamHI restrikciós fragmentumot beépítettük a pMGS3 plazmid vektor Smal/BglII helyére. Ez a klón tartalmazza a gpl60 1-757. aminosavait kódoló szekvenciákat, melyben a terminációs kodont az MGS3 vektor szolgáltatja.

3. példa

Rekombináns bakulovírus előállítása és szelektálása

A HÍV env gént tartalmazó p3046 rekombináns plazmidot és az AcMNPC DNS-t kalcium-foszfáttal koprecipitáltuk, és hozzáadtuk nem fertőzött Spodoptera frugiperda sejtekhez. A kimére gént ezután bevittük AcMNPV genomba homológ rekombinánció révén. A rekombináns vírusokat okklúzió-negatív plakk morfológiai segítségével azonosítják. Az ilyen plakkok mérhető citopátiás hatást fejteken ki, de nincsenek a sejt4

HU 211 505 A9 magban zárványtestek. Két további egymást követő plakk tisztítását végeztük el, hogy megkapjuk a tisztán rekombináns vírust. A rekombináns virális DNS analízisét, amely arra irányult, hogy helyspecifikus-e a HÍV env szekvenciák beépülése, úgy végeztük, hogy restrikciós és hibridizációs tulajdonságaikat a vad típusú virális DNS-éivel hasonlítottuk össze.

4. példa

A HÍV env gén kifejeződése fertőzött rovarsejtekben rekombináns bakulovírusokból A rovarsejtekben lévő rekombináns vírusokból a

HÍV en szekvenciák kifejeződése egy elsődleges transzlációs terméket eredményez. Ez az elsődleges termék a rekombináns vektorban rendelkezésre álló kodonok transzlációja révén keletkezett aminosavakból áll. Az eredmény egy olyan protein, melynek minden aminosavát a polihedrin promoterből 5' irányban lévő expressziós vektor ATG iniciációs kodonjától az expressziós vektor transzlációt lezáró szignáljáig tartó szekvencia kódol (például: rgplóO). Az Ac3046 első transzlációs termékek vége

Met-Pro-Gly-Arg-Val csoportokkal végződik, ahol az Arg (4-es pozíció) az eredeti LAV kiónban a 2-es pozícióban lévő Arg-nak felel meg. A Met-Pro-Gly-kodonokat a klónozó stratégia szolgáltatta.

5. példa

A gpl60 inszertum és a szomszédos DNS nukleotid szekvenciája

A gplóO inszertum nukleotid szekvenciáját és a szomszédos DNS-t az Ac3046 virális expressziós vektor DNS-éből izolált restrikciós fragmentumok alapján határoztuk meg. A szekvenálási stratégia a következő lépéseket tartalmazta. A 3,9 kb méretű Eco RV-BamHI fragmentumot az Ac3046 virális DNS-nek restrikciós emésztése révén tisztítottuk. Az Ac3046 virális DNS-t egy vakcina gyártási tételhez használt sejttenyészetben jelenlévő extracelluláris vírusból izoláltuk.

A 2. ábrán látható, hogy a 3,9 kb méretű ExoRVBamHI fragmentum a teljes gplóO génből, továbbá 3' irányban 100 bp és 5' irányban körülbelül 1000 bp méretű szomszédos DNS-ből áll. Ebből meghatároztuk a teljes gplóO gén nukleotid szekvenciáját, beleértve a 3' irányban lévő 100 bp hosszú és az 5' irányban lévő 100 bp hosszú határos DNS szekvenciákat.

Röviden összefoglalva, a szekvenálás egy kiméra szerkezetet mutatott ki, mely előrelátható volt a klónozó stratégia alapján. A gplóO szekvenciája lényegében a Wain-Hobson által (1985) ismertetett szekvenciával volt azonos. A feltételezett transzlációt indító és leállító kodonok közötti 2256 bázisból álló szekvenciából 752 aminosav és 28 potenciális N-glükozilációs hely várható. Ezen rgplóO glükopeptid becsült molekulatömege, beleértve a cukor-csoportokat, körülbelül 145 000.

A határoló DNS 200 bázisának szekvencia analízise kimutatta, hogy a beépítés helyes volt, amint ezt a 3., 4. és 5. ábra mutatja.

6. példa

A gpI60 aminosavszekvenciája

Standard automatizált Edman degradálással és

HPLC eljárással meghatároztuk a gpl60 N-terminális szekvencia első 15 csoportját, s ezek a DNS szekvenciából előrelátható csoportoknak bizonyultak. A gplóO proteinben nincs N-terminális metionin. Ez egybevág azzal a megfigyeléssel, hogy az AcNPV polihedrin protein is N-terminális metionin nélkül termelődik. Az

1. táblázatban összegezzük a tényleges DNS és N-terminális protein szekvenciákat az AcNPV 3046 DNS szekvencia és a tisztított gplóO analízise alapján.

7. táblázat

LRV env gén az AcNPV 3046 expressziós vektorban.

Csoport
2	3	4	5	6	7	8	9	10
Pro	Gly	Arg	Val	Lys	Glu	Lys	Tyr	Gin
11	12	13	14
His	Leu	Trp	Arg	Trp	Gly
ATG	CCC	GGG	CTG	GTG	AAG	GAG	AAG	TAC
CAA	CAC	CTG	TGG	CGT	TGG	GGC

Ezek az eredmények az eredeti LAV-1 kiónhoz hasonlítanak (lásd a 2. táblázatot).

2. táblázat

LAV env gén az eredeti LAV-J klánban Csoport

1	2	3	4	5	6	7	8	9
Met	Arg	Val	Lys	Glu	Lys	Tyr	Gin	His
10	11	12	13	14
Leu	Trp	Arg	Trp	Gly
ATG	CTG	GTG	AAG	GAG	AAG	TAC	CAA	CAC
CTG	TGG	CGT	TGG	GGC

7. példa

A rekombináns gpl60 tisztítása

A találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás, amelyet az Ac3046 expressziós vektor által kódolt rekombináns HIV-1 burok protein kivonásához és tisztítására használunk. A gplóO rekombináns HIV-1 burokproteint az Ac3046 vektorral megfertőzött S. frugiperda sejtekben termeljük. A sejteket 4-5 napig tenyésztjük a fertőzés után. Az rgplóO protein tisztítása a következő lépéseket foglalja magába:

1. Sejtek mosása

2. Sejtek lizálása

3. Gélszűrés kromatográfia

4. Lencse-lektin affinitás kromatográfia

5. Dialízis.

Ebben a példában a rekombináns gplóO tisztítását írjuk le körülbelül 2xl0⁹ Ac3046-tal fertőzött sejtből.

7. Sejtek mosása:

A fertőzött sejteket 50 mM trisz puffért (pH = 7,5), 1 mM EDTA-t és 1% Triton Χ-100-at tartalmazó pufferben mossuk. A sejteket ebben a pufferben reszuszpendáljuk, standard módszerekkel homogenizáljuk, és 5000 ford./perc mellett 20 percig centrifugáljuk. Az eljárást háromszor ismételjük.

HU 211 505 A9

2. Sejtek lizálása:

A mosott sejteket ultrahangos kezeléssel lizáljuk 50 mM trisz puffért (pH = 8,0-8,5), 4% dezoxikolátot és 1% béta-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban. Az ultrahangos kezelést standard módszerekkel végezzük. A kezelés után csak a magmembrán maradékok épek, ezeket 30 percig 5000 ford./perc melletti centrifugálással távolítjuk el. A felülúszóban, amely a kivont gplóOat tartalmazza, nincsenek ép sejtek fénymikroszkópos vizsgálat szerint.

3. Gélszűrés:

A gélszűrést a Pharmacia cégtől beszerzett 5,0x50 cm-es, Sephacryl gyantával (Pharmacia) töltött üvegoszlopban végezzük. Az ossz ágy-térfogat körülbelül 1750 ml. Az oszlop és a csőcsatlakozások pirogénmentesítése és tisztántartása céljából legalább 6 liter 0,1 M nátrium-hidroxid-oldatot eresztünk át az oszlopon 24 órán át. Az oszlopon átfolyó folyadékot UV cellához, monitorhoz és egy diagram regisztráló készülékhez (Pharmacia) kapcsoljuk. Ezután az oszlopot 4 liter gélszűréshez szolgáló pufferrel hozzuk egyensúlyba. A nyers gpl60-at fel visszük az oszlopra, és a gélszűréshez használt pufferrel eluáljuk.

Az oszlop a nyers keveréket három fő UV abszorbeáló frakcióra választja el. Az első csúcs körülbelül 500 és 700 ml puffer között jön le, a második 700 és 1400 ml között és a harmadik 1400 és 1900 ml között. Ugyanezt a képet kaptuk kis analitikai oszlopokon is, innen meghatároztuk az első csúcs anyagának molekulatömegét. amely >2 000 000-nak bizonyult.

Ez a csúcs a nagy molekulatömegű lipidek és lipidkomplexek koncentrációja miatt áttetsző, továbbá a fertőzött sejtekből kivont gplóO 10—20%-át is tartalmazza. Ezen gplóO frakció valószínűleg önmagával is és más sejtkomponensekkel is komplexet képez, és így keletkeznek a nagy molekulatömegű aggregátumok.

A második, széles csúcs tartalmazza a gplóO legnagyobb részét és a 18 000 és 200 000 közötti molekulatömegű proteineket.

A harmadik csúcs kevés proteint tartalmaz, az UV abszorpció nagy része a minta béla-merkapto-etanol tartalmától származik.

Amikor először észleljük a második csúcs megjelenését az UV abszorpció rajzából, az oszlopról kifolyó folyadékot közvetlenül rákötjük a lencse-lektin oszlopra. Mihelyt a második csúcs lejön az oszlopról, az eluátumot lekapcsoljuk a lencse-lektin oszlopról, és hagyjuk elfolyni.

4. Lencse-lektin ajfínitás kromatográfia:

A lencse-lektin affinitás gélt (Lentil Lektin-Sepharose 4B) a Pharmacia cégtől bulk-ban vásároltuk. A lencse-lektint Sephadexen végzett affinitás kromatográfiával tisztítottuk 98%-nál nagyobb tisztasági fok elérése céljából, majd úgy immobilizáltuk, hogy Sepharose 4B-hez kötöttük bróm-cián használatával. A mátrix körülbelül 2 mg ligandumot tartalmazott gél ml-enként. A lencse-lektin oszlop egy 5,0x30 cm-es üvegoszlop (Pharmacia) volt, mely 125 ml lencse-lektin Sepharose 4B gélt tartalmazott. Az affinitás mátrix újból használható alapos mosás és a gyártó által ajánlott regenerálási eljárás után. Használaton kívül a gélt az oszlopban a következő összetételű oldatban kell tartani: 0,9% nátrium-klorid, 1 mM mangán-klorid, 1 mM kalcium-klorid, és 0,01% tiomerzál. Használat előtt az oszlopot kimossuk, és 250 ml fent leírt lencselektin pufferrel hozzuk egyensúlyba.

A gélszűréses oszlopról eluálódott nyers gpl60-at közvetlenül visszük fel az oszlopra, ahogy fent leírtuk. Mihelyt a nyers gplóO az oszlophoz kötődött, az oszlopot 800 ml 0,1% dezoxikolátot tartalmazó lencse-lektin pufferrel mossuk. Ilyen feltételek mellett a gplóO teljes mennyisége az oszlophoz kötődik. A megkötött glükoproteineket lencse-lektin pufferrel és 0,3 M alfametil-mannoziddal eluáljuk. Az elúciót 280 nm hullámhossz mellett UV monitoron ellenőrizzük.

5. Dialízis:

A cukrokat és a dezoxikolátokat hagyományos dialízissel távolítjuk el.

A gplóO tisztítási lépéseit 1 liter fertőzött sejtből a

3. táblázatban mutatjuk be.

3. táblázat

Tisztítás (összefoglalás)

Tisztítási lépés	Összpro- tein (mg)1	gplóO protein (mg)	Össz gplóO (%)	Eltávolított szenynyezések
Sejt üledék	1-2000	20	1-2	Táptalaj
1., 2., 3. mosás	250	15	6	Szérumalbumin, nukleinsavak nagy része és oldható sejt proteinek
Gél- szűrés	120	12	12	Lipidek, nukleinsavak, nagy molekulatömegű aggregátumok
Len- cse- lektin	14	10	70	Nem glükolizált proteinek
Dialí- zis	13	9	70	Cukor, dezoxikolát, trisz puffer felesleg

¹ Az össz-proteinl a 280 nm-en mért abszorpcióból határoztuk meg.

A találmány egy másik kiviteli alakjában hagyományos ioncserélő kromatográfiát (anion- vagy kationcserélő) használhatunk a gélszűrés helyett. A lépések sorrendje sem meghatározó: például a gélszűrés vagy az ioncserélő kromatográfia a lencse-lektin tisztítási lépés után is következhet. Más reagensek is használhatók a találmány szerint. A dezoxikolát helyett például más detergenseket is használhatunk a rekombináns protein tisztításához. Ilyenek például a nem ionos detergensek, mint a Tween 20 (poliszorbál 20) a Tween 80, Lubrol és Triton X-100.

HU 211 505 A9

8. példa:

A. A gplóO partikulák összeszerelése

Kiderítettük, hogy a gpl60 antigén a tisztítás folyamán >2 000 000 molekulatömegű partikulákká szerelhető össze. Ezt a találmány egyik elemének tartjuk. A sejtekből extrahált protein 80-90%-a monomer (molekulatömeg: 160 000) és 10-20%-a polimer (partikulák). A gélszűrés eltávolítja a gpl60 aggregált formáit Megkíséreltük ebből a frakcióból (a gélszűréses oszlopról lejövő első csúcs) a gpl60 tisztítását, és a kísérletekből arra következtettünk, hogy a gpl60 más sejtproteinekkel - feltehetően membrán fragmentumokkal is - komplexet alkot. A gélszűrő oszlopról lejövő második csúcsban azonban a gpl60 antigén molekulatömege 160 000-300 000, azaz túlnyomó része monomer vagy dimer forma.

A gpl60 aggregátumok vagy polimerek a lencselektin oszlop kifejlesztése folyamán keletkeznek. Megállapítottuk, hogy az antigén aggregátumokat képez, akár 0,5%-os dezoxikoláttal - a dezoxikolátnál ez körülbelül a 0,2%-os kritikus micella koncentrációnak (CMC = critical micelle concentration) felel megoldjuk le a lektin oszlopról, vagy akár 0,1-os dezoxikoláttal oldjuk le a gpl60-at az oszlopról.

Az aggregátumok méretét egy nagy felbontóképességű FPLC Superose 12 oszlopon (Pharmacia) határoztuk meg. A tisztított gpl60 reprezentatív tételeinek mintáiban az aggregátum méretek 2 000 000 molekulatömeget vagy ennél nagyobb molekulatömeget képviselnek, blue-dextrán standardhoz viszonyítva.

Egy térhálós szerkezetre vonatkozó tanulmány [Schwaller et al., (1989)] kimutatta, hogy a rovarsejtekben termelt gpl60 egy olyan tetramer, mely azonos alegységekből áll. A tanulmány azt is kimutatta, hogy a HIV-fertőzött sejtekben és a vírus partikulákban a gpl60 tetramer. Tehát a rekombináns gpl60 partikuláknak olyan tercier és kvaterner szerkezete lehet, amely hasonló a natív HÍV gp 160-ban talált szerkezethez.

Egy megfelelő háromdimenziós szerkezet fontos lehet az epitópok képződése szempontjából, és ez a gplóO helyes felgombolyodását kívánja meg. Minthogy a nem-glükozilált proteineket a gpl60 antigénnel való kapcsolatból eltávolítjuk a lencse-lektin oszlophoz való kötés és az oszlop mosása folyamán, feltehető, hogy a gplóO hidrofób részei intermolekuláris kapcsolatok kialakítását kezdik meg. Valószínű, hogy a dezoxikolát nem kötődik a gpl60-hoz, minthogy koncentrációját a CMC felett lehet tartani, és az antigén még komplexeket fog képezni. Úgy tűnik, hogy ezen antigén aggregátumokká szerelődése - mihelyt a találmány szerint tisztítjuk - e protein belső tulajdonságává válik. Lehetséges, hogy a gplóO proteinben jelenlévő erősen hidrofób N-terminális szekvencia hozzájárul e protein azon természetes tulajdonságához, hogy partikulákat képez. Tisztítás után a gplóO komplexeket 0,2 mikronos cellulóz-acetát szűrőn sterilre szűrhetjük a protein jelentős vesztesége nélkül.

B. A partikula-képződés analízise:

A tisztított gp 160 partikulák elektronmikroszkópos analízise kimutatta, hogy ezek protein-szerű 30100 nm méretű gömbalakú partikulák.

A partikulák jelenlétének kiegészítő tesztje gyanánt tisztított gpl60-at vizsgáltunk gélszűréssel. Körülbelül 100 gg gpl60-at vittünk fel Superose 12 FPLC HR 10/30 gélszűrő oszlopra (Pharmacia, Inc.). Az oszlopot előzőleg protein molekulatömeg standardokkal kalibráltuk. Ennek az oszlopnak a protein profilja nagymértékben reprodukálható; az elúciós térfogat fordítva arányos a protein standardok molekulatömegével. Az oszlop elválasztja a monomer gpl60-at a polimer formától, és kizárja a ^xlO⁶ molekulatömegű globuláris proteineket. Ha kifejlesztjük az oszlopot, lényegében az ossz tisztított gpl60 eluálódik az elfolyó térfogatban, tehát molekulatömege nagyobb 2 milliónál (S2X10⁶).

9. példa:

A. A gplóO adszorpciója alumínium-foszfát gélre

Az oldhatatlan alumíniumvegyületeknek, mint immunológiai adjuvánsoknak a hatékonysága attól függ, hogy az antigén mennyire tökéletesen adszorbeálódik a szilárd fázison. A találmány részét képezi az a felfedezés, hogy olyan alumínium készítményeket lehet előállítani, melyek hatékonyan adszorbeálják a gpl60-at olyan pH-η, mely nem csökkenti a gpl60- alumíniumvegyület komplex immunogén hatását. Ezen alumínium készítmény (alumínium-foszfát gél) előállítása folyamán a következő faktorokat ellenőrizzük:

1. Az antigének alumínium-foszfátra való adszorpciójához szükséges optimális pH körülbelül 5,0. Megfigyeltük azonban, hogy a gplóO veszít immunogenitásából pH 6,5 mellett, összehasonlítva a pH 7,5 melletti értékkel, tehát az alumínium-foszfát pH-ját 7, l±0,l-re állítottuk be. Megállapítottuk, hogy a gplóO lényegében 100%-ban adszorbeálódik az alumínium-foszfáthoz ezen a pH-n.

2. A nátrium-klorid tartalomtól származó ionerősség viszonylag alacsony, kevesebb, mint 0,15 M.

3. Az alumíníum-klorid moláris feleslegben van a nátrium-foszfáthoz képest, nehogy szabad foszfátionok maradjanak a felülúszóban.

4. A gpl60-at a frissen képződő alumínium-foszfáthoz adjuk, hogy megakadályozzuk a kristály-növekedést, és minimalizáljuk a partikulák méretét.

Alább ismertetünk egy eljárást, amelyben 200 ml alumínium-foszfátot állítunk elő, s erre gpl60-at adszorbeálunk úgy, hogy az antigén végső koncentrációja 40 pg/ml legyen.

B. Reagensek előállítása (200 ml formázott készítményhez):

Az alábbi oldatokat készítjük el 100 ml-es steril, pirogénmentes palackokban vagy főzőpoharakban. Bemérjük a sókat az 1 -es és 2-es oldathoz, továbbá a nátriumhidroxidot a 3-as oldathoz, majd az elkészített oldatokat 0,2 pm pórusméretű cellulóz-acetát membránon 100 mles steril, pirogénmentes palackokba szűrjük.

-es oldat

Alumínium-klorid-víz (1/6) 0,895 g.

Nátrium-acetát-víz(l/3) 0,136 g.

HU 211 505 A9

Oldás 40 ml injekciós minőségű vízben.

0,2 gm szűrés.

2- es oldat

Trinátrium-foszfát-víz (1/12) 1,234 g.

Oldás 40 ml injekciós minőségű vízben.

0.2 gm szűrés.

3- as oldat

Nátrium-hidroxid 2,0 g

Oldás 100 ml injekciós minőségű vízben.

0,2 gm szűrés.

4- es oldat

Trisz 1,25 g.

Oldás 100 ml injekciós minőségű vízben, ebből 1 ml-t hozzáadunk 90 ml injekciós minőségű vízhez, a pH-t

7,5-re állítjuk 0,5 M sósavval, és az oldatot 100 ml-re egészítjük ki injekciós minőségű vízzel.

Az oldatokat 30 percig autoklávozzuk, lassú leeresztés, hűtés szobahőmérsékletre.

C. Alumínium-foszfát gél előállítása

1. Az 1-es oldatot (alumínium-klorid+nátrium-acetát) bemérjük a formázó edénybe 25 ml-es steril, eldobható pipetták használatával. Feljegyezzük az 1-es oldat mennyiségét, és elkezdjük kevertetni.

2. A 2-es oldatot (nátrium-foszfát) bemérjük az edénybe 25 ml-es steril, eldobható pipetták használatával, folytatjuk a keverést, amíg csapadék képződik, és feljegyezzük a 2-es oldat mennyiségét.

3. A 3-as oldatból (nátrium-hidroxid) 3 ml-t mérünk az edénybe, és folytatjuk a keverést 5 percig. pH méréshez 0.5 ml mintát veszünk. Ha a pH alacsonyabb 7,0-nél. újból bemérünk 0,5 ml nátrium-hidroxidot, újabb 5 percig folytatjuk a keverést, és megint pH-t mérünk. Addig folytatjuk a lúgadagolást, amíg a pH 7,0-7.2 között nem lesz.

4. Meghatározzuk az összmennyiséget (1-es oldat +

2-es oldat + 3-as oldat), majd 100 ml-re egészítjük ki steril injekciós minőségű vízzel

5. Rögtön ezután közvetlenül a formázó edénybe mérünk 8,000 gg tisztított gpl60-at 100 ml 1 mM trisz oldatban (pH = 7,5).

6. Folytatjuk a keverést legalább 20 percig, majd a vakcinát steril fiolákba osztjuk szét

10. példa:

Alumínium-foszfátra adszorbeált gp!60 immunogenitása (specifikus antitest válasz).

Egy antigén készítmény (vakcina) immunogenitásának meghatározására elfogadott módszer szerint úgy járunk el, hogy a specifikus antitest választ olyan egér-csoportokon mérjük, amelyek egyetlen antigén dózist kaptak. A negyedik hét végén az egereket kivéreztetjük, és a szérumok antitest szintjét egy meghatározott antigénnel szemben (rendszerint az állat immunizálásához használt antigénnel szemben) mérjük standard antitest vizsgáló módszerrel, például ELISA-val (enzyme linked immunosorbent assay = enzim immunoassay).

A 4. táblázat foglalja össze a tisztított gpl 60 immunogenitására egerekben kapott eredményeket. A tisztított gpl60 oltóanyagot adjuváns nélkül 6.0-os p H-n és pH 7,5 -ön alumínium-foszfátra adszorbeálva (a 9. példában leírt készítmény) vagy komplett Freund adjuvánssal keverve készítettük el.

4. táblázat

Csoportg pl 60	Adju- váns	gpl 60 száma	ELISA átlag OD'	Szérum (%)	konver- zió (p/N)2
1 gg	nélkül, pH 7,5	8702	0,140	57	4/6
nélkül, pH 6,0	8702	0,110	26	2/7
alum. foszf.	8702	1,000	90	9/10
alum. foszf.	8705	2,285	100	6/6
Freund	8604	1,108	83	5/6
Freund	8702	1,396	100	7/7
0.1 gg	Freund	8604	0,434	67	4/6
alum. foszf.	8705	1,003	67	4/6

¹ Az egereket az immunizáló oltás utáni 28. napon (elvéreztettük, és a szérumokat 1:10 hígításban ELISA módszerrel vizsgáltuk géitisztított gpl60-nal szemben. Hasonló eredményeket kaptunk egy kereskedelmi ELISA-val (Genetic Systems Inc., EIA^m ELISA) natív HIV-I proteinekkel szemben, 1:400-as szérumhígítás mellett.

^: Az ossz vizsgált egér számból (N) szérumkonverziót mutató egerek száma (P).

A gpl60-ból egyetlen 1,0 gg-os dózissal, adjuváns nélkül immunizált egerek antitest választ adtak gpl60 ellen (lásd a fenti táblázatot). Sokkal erősebb antitest válasz látható azonban annál az egér csoportnál, amelyeket alumínium-foszfátra adszorbeált gpl60 1,0 gg-jával immunizáltunk. A komplett Freund adjuvánssal kevert vagy alumínium-foszfáttal formázott gpl60 0,1 gg-jával immunizált egerek több mint 50%-ának a szérumában jelent meg antitest. A gpl60 antigén immunogénnek bizonyult egerekben formázás nélküli formában is - bár kevésbé pH 7,5 és pH 6,0 mellett, de alacsonyabb pH-η csökkent immunogenitást észleltünk.

//. példa

Alumínium-foszfátra adszorbeált gpl60 immunogenitása (szérum vizsgálat ELISA-val).

Egy vakcinának kiszemelt készítménynek igen fontos biológiai tulajdonsága, hogy immunválaszt képes kiváltani. Ennek bizonyítékát jelenti, hogy az alumínium-foszfáttal formázott gpl60 vakcina állatokban immunogén. Annak megerősítése végett, hogy az alumínium-foszfát, mint adjuváns, növeli az immunogenitást, a következő kísérletet végeztük.

A nulladik napon egereket (csoportonként 10 egér) oltottunk csak gpl60 antigénnel vagy alumínium-foszfátra adszorbeált gpl60-nal vagy komplett Freund adjuvánssal kevert gpl60-nal. Az immunizálást egyetlen oltással (0,5 gg, 1,0 gg, 5,0 gg) végeztük. A 28. napon kivéreztettük az egereket, és a szérumokat (1:10 hígításban ELISA-val vizsgáltuk gpl60 elleni antitestek jelenlétére.

HU 211 505 A9

A 28. napon levett szérumok vizsgálati eredményét az 5. táblázatban foglaljuk össze. Minden csoportban az egerek több, mint 50%-a mutatott szérumkonverziót. Mindegyik dózis esetén a szérumkonverziók száma és a szérum abszorpciós értékek (OD₄₅₀ nm 1:10 hígítás mellett ELISA vizsgálatban) átlaga nagyobb volt az alumínium-foszfátra adszorbeált gp 160-nal oltott egereknél, mint a csak gp 160-nal immunizált egereknél.

Ezek az eredmények mutatják, hogy az alumíniumfoszfát adjuváns szignifikánsan növeli a gpl60 antigén immunogenitását.

5. táblázat (Az oltás utáni 28. napon)

	Dózis
0,5 pg átlag	1,0 pg átlag	5,0 pg átlag
P/N1	OD2	P/N	OD	P/N	OD
gpl 60	9/10	0,407	7/10	0,699	7/10	0,430
gpl60(alum)*	0/10	0,547	8/10	0,797	10/10	1,347
gpl60 (FA)**	10/10	1,130	10/10	1,967	10/10	1,317

•alumínium-foszfát komplett Freund adjuváns ^! A szerokonvenziót mutató egerek száma (P) összehasonlítva az ossz vizsgált egér számmal <N). 0,5 pg, 1 pg és 5 pg VaxSyn'¹ HIV-1 vakcinával való immunizálás utáni 28 napon.

’ A szérum konverziót mutató egerek szérumának ELISA vizsgálatában (1:10 hígítású szérumok gplóO ellen) mért abszorpciók (ODiso) átlaga

12. példa:

Neutralizációs vizsgálatok

A HIV-1 neutralizációs vizsgálat egy elfogadott módszer annak megállapítására, hogy egy antitest készítmény képes-e gátolni a HIV-1 vírust abban, hogy megfertőzzön tenyésztett érzékeny humán limfocita sejteket. A gp 160-nal immunizált állatokból vett antiszérumokat teszteltük HIV-1 neutralizációs vizsgálattal, és az eredményeket a 6. táblázatban foglaljuk össze.

6. táblázat

Állat	Azono- sítás	Immunogén/adju- váns	Mikro- gramm1	Neutralizációs titer2
Rhesus	G55	gpl60/alum. foszf.	16/8/8	1:80- 1:160
Rhesus	H55	gpl60/alum. foszf.	16/8/8	1:80- 1:160
Rhesus	L55	gpl60/alum. foszf.	16/8/8	1:80
Egér	pool 3	gp!20/Freund	0,25/0,25 /0,25	1:40- 1:80
Egér	pool 8	gpl20/Freund	0,1/0,1/ 0,1	1:40- 1:80
Tgm	tiszt. IgG	gpl60/F reund	10/10/10	1:320

Az első/második/harmadik immunizáló oltáskor beadott gplóO vagy gpl20 mennyisége pg-ban.

‘ Az antiszérum legnagyobb hígítása, amely a nem immunizált állatoktól vett szérummal kezelt sejtekhez viszonyítva 50%-ban képes gátolni a HIV-1 fertőzést.

Tengerimalacokat, nyulakat és Rhesus majmokat ugyancsak immunizáltunk gpl 60-nal (adjuvánsként alumínium-foszfátot vagy Freund adjuvánst használva). Ezeknek az állatoknak az immunizálása általában jó antitest választ váltott ki HIV-1 burokproteinek ellen.

13. példa:

Immunogenitás csimpánzokban

A csimpánzok genetikailag az ember legközelebbi rokonai, és jelenleg az egyetlen állatmodellnek számítanak HIV-1 fertőzés szempontjából. Ártalmatlansági és immunogenitási vizsgálatot végeztünk három csimpánzon. Két csimpánzt immunizáltunk 40 pg vagy 80 g gpl60-nal alumínium-foszfáttal formázott vakcina formájában. A negyedik héten mindegyik állat 40 pg, illetve 80 pg gpl60-ai kapott emlékeztető oltás gyanánt. Egy kontroll állatot ugyanakkor 1 ml konyhasó oldattal vakcináltunk. A három csimpánzból hetenként vett szérummintákat gpl60 elleni és HIV-1 virális antigének elleni antitestekre vizsgáltuk. Háromféle immunológiai vizsgálatot végeztünk: ELISA vizsgálatot tisztított gpl60-nal szemben (a MicroGeneSys, Inc. fejlesztette ki), Western biot analízist és egy kereskedelemben beszerezhető HIV-1 ELISA-t. E vizsgálatok eredményét az alábbiakban ismertetjük.

A. ELISA (MGSearch HÍV 160)

Az MGSearch HÍV 160 [az MGSearch a Micro Gene Sys, Inc. (Meriden, Connecticut, USA) márkaneve] ELISA assay egy immunoszorbens assay gpl60-ra, amelynek leírása megtalálható a 920 197. számú (jelenleg No 585 266) amerikai egyesült államokbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben.

Az immunizálás előtt és az első immunizáló oltás után 11 héten át vett szérum-mintákat 1:10-től 1: 100 000ig hígítjuk, ezután olyan nitrocellulóz csíkokkal inkubáljuk, amely egy foltban 100 pg tisztított gpl60-at tartalmaz. A határhígításos titer az a legmagasabb hígítás, ahol a teszt anti-gp 160-nal szemben pozitívnak bizonyul kecske anti-humán IgG - alkalikus-foszfatáz konjugátum használatával történő kimutatással.

A kontroll állatokból vett és az immunizálás előtt vett szérum-minták negatívok voltak. Az a csimpánz, mely 80 pg dózist kapott 1:100 hígításban, 2 hét múlva pozitív volt, és az a csimpánz, amelyik 40 pg dózist kapott 1:10 hígításban, a 4. héten lett pozitív. A gpl60 elleni antitest titerek az 5. hétig nőttek, és ekkor körülbelül 1:100 000, illetve 1:2 000 000 határhígításos titereket kaptunk. Az antitest titer mindkét állatban kissé esett a 6-11. hét folyamán.

Ez a válasz-típus mind kvantitatív, mind kvalitatív szempontból hasonló azokhoz az antitest válaszokhoz, amelyeket általában a humán hepatitis B vírus vakcinával vakcináit csimpánzoknál figyeltek meg.

B. Kereskedelmi ELISA teszt:

A VaxSyn vakcinával (a VaxSyn a MicroGeneSys, Inc. itt leírt AIDS vakcinájának márkaneve) immunizált csimpánzok szérumának MGSearch HÍV 160 ELISA vizsgálatából és Western biot analíziséből kitűnt, hogy

HU 211 505 A9 a szérumok konverziója megtörtént, és antitesteket tartalmaztak a rekombináns gpl60-nal szemben, Hogy meghatározzuk, vajon olyan anti-HIV antitesteket is tartalmaznak, amelyek a natív virális burokproteineket is felismerik, az immunizálás előtti szérumokat és az

1-11. héten keresztül vett szérum mintákat megvizsgáltuk a törzskönyvezett, kereskedelmi ELISA készlettel és a LAV ELA™ teszt-készlettel (Genetic System Co., Seattle, Washington, USA). A 80 gg gpl60-nal immunizált állat széruma a második héten 1:100 hígításban pozitív volt, és a 6. hétig nőtt az antitest titere. A 40 gg gpl 60-nal immunizált állat széruma 1:100 hígításban a 6. héten lett pozitív.

14. példa:

Antitestek megoszlása a gpl 20 és gp41 között.

Lényeges megállapítani, hogy egy vakcináit állatban a gpl60 elleni antitest válaszok a gp41 vagy a gpl20 ellen, vagy mindkettő ellen irányulnak-e. Különböző immunológiai módszereket - radio-immun-precipitációt (RIP), immunfluoreszcenciát (IF), Western biot analízist (WB) és kvantitatív ELISA-t - használtunk, hogy a három különböző rekombináns burokantigénnel szemben kimutassuk és mérjük a különböző HIV-1 burokproteinek elleni antitestek megoszlását.

A 6. ábra három különböző rekombináns antigén immunreaktivitását ábrázolja. Ezek a következők: (1) gpl20-delta (csonka rekombináns HIV-1 gpl20; a molekula C-terminális végéről körülbelül 40 aminosav hiányzik); (2) gpl 20 (teljes hosszúságú rekombináns HIV-1 gpl20); (3) gpl60.

Ötven HIV-] antitest pozitív beteg ember széruma és 3 kevert humán szérum igen reaktív volt gpl60-nal szemben, enyhén reaktív volt gpl20-szal szemben, és kevés vagy egyetlen antitest sem reagált csonka gpl20-szal. Valószínű, hogy a csonka gpl20, amely a HTV-1 külső glükoproteinjének több mint 90%-át képviseli, protektív determinánsokat tartalmaz. Az a megfigyelés, hogy a humán AIDS pozitív szérumok kevés antitestet tartalmaznak ezen burok-terület ellen, egybevág azzal a ténnyel, hogy a vírusfertőzésre adott immunválasz nem teljesen protektív, és hogy a pozitív humán szérumok alacsony neutralizáló aktivitást fejtenek ki in vitro.

Ezzel szemben, mind a gpl 60 immunogénnel, mind a csonka gpl20-szal immunizált Rhesus majmok széruma olyan antitesteket tartalmazott, amelyek erősen reagáltak a HIV-1 burok csonka gpl20 részével. A virális burok mentén az antitest felismerő helyek megoszlásában fennálló különbségek és a majmokban megfigyelt magasabb titerek érthetővé teszik azt a tényt, hogy a majom szérumok neutralizációs titere magas.

E három rekombináns burok antigén immunreaktivitásának kvantitatív meghatározását humán és immunizált Rhesus szérumokon ábrázolja a 7. ábra. Minden vizsgált majom-szérum magas antitest titert mutatott csonka gpl20 antigénnel (gpl20-delta) szemben, úgyszintén azok a szérumok is, amelyek gpl60-nal immunizált állatból származtak.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a rekombináns gpl60 olyan antitest választ vált ki Rhesus majmokban, amely különbözik attól, ami a legtöbbször fordul elő természetes fertőzés folyamán. A gpl60 gpl20-delta területén olyan epitópok vannak, amelyeket az immunizált majmok széruma hatékonyan felismer, ugyanakkor a humán immunrendszer a fertőzés folyamán ezt nem ismeri fel. Ezek az új epitópok fontosak lehetnek a HIV-1-gyei szembeni védelem szempontjából, és a rekombináns gpl60-nak fontos tulajdonságát képezhetik a HÍV fertőzés megelőzését és kezelését illetően.

15. példa:

A vakcina terápiás alkalmazása

Klinikai vizsgálatot végeztünk 30 HIV-szeropozitív beteg emberen abból a célból, hogy meghatározzuk a klónozott HÍV gpl 60-nal (a fent ismertetett bakulovírus rendszerben termelve) való vakcinálás hatékonyságát HIV-fertőzött egyénekben.

A rekombináns gpl 60-nal való vakcinálás a 30 HÍV szeropozitív önként vállalkozó közül 19-nél (63%) a gpl60-specifikus humorális és celluláris immunválasz növekedését vonta maga után. Tizenöt önként vállalkozó egyén közül 14-nél (93%), akik a vakcinából 6 dózist kaptak, megnőtt az ossz gpl60 antitest tartalom. Tehát a rekombináns HÍV proteineket (például: rgp41, rgpl20, rgpl60 és ezek keverékei) eredményesen alkalmazhatjuk a HIV-fertőzött beteg emberek kezelésére szolgáló módszerekben. A találmány szerinti megvalósítási formában használt HÍV protein hatékony mennyiségét a szakterületen jól ismert technikák alapján, az alábbiakban ismertetett módon határozhatjuk meg. A hatékony mennyiség általában 1-100 gg/kg test-tömeg lehet betegenként. A beadás gyakoriságát szintén ismert módon határozzuk meg. Egy előnyös kiviteli alak szerint a beadás parenterális úton történik, például intravénásán, intraperitoneálisanm intramuszkulárisan, intradermálisan, stb. a gyakorlott szakemberek által jól ismert módon.

A. Önként vállalkozók kiválasztása:

Harminc önként jelentkező HÍV fertőzött beteget toboroztunk. Csak olyan szeropozitív önkénteseket vettünk be, akik a HÍV fertőzés korai szakaszában voltak a Walter Reed 1-es vagy 2-es fokozat szerint (a CD4 sejt-szám 400-nál nem kevesebb több, mint 3 hónapig limfadenopátiával vagy enélkül) [Redfield et al., New Engl. J. Med., 314, 131-132 (1986)]. Az önként jelentkezők bevonásának kritériuma szerint olyan 18-50 éves felnőtteket választottunk, akiknél a vérsejtszám normális volt, végkészülék betegségre nem volt lelet, akik nem voltak alkoholisták vagy kábítószerélvezők a megelőző 12 hónap folyamán és akik nem kaptak anti-retrovirális gyógyszereket vagy immunmodulátorokat. Minden beteget 2 hónapos alapkiértékelésnek vetettünk alá, mielőtt a kezelendő csoportokba találomra kiválasztottuk őket.

A 30 önkéntes közül 26 férfi és 4 nő volt. Ezek közül 14 volt kaukázusi, 13 fekete és 3 hispániai. A férfiak átlag életkora 29 év (18-49) volt. A bevonáskor 8 önkéntes az 1-es Walter Reed fokozathoz, 22 önkén10

HU 211 505 A9 tes a 2-es Walter Reed fokozathoz tartozott. Az alap CD4 szám átlaga 668 (388-1639) volt. A kezdeti diagnózis és a kísérletbe való bevonás között eltelt idő átlag 24 hónap (3-49 hónap) volt.

B. Vakcina készítmény és immunizálási séma:

Az itt leírt vakcina nem-fertőző glükoprotein alegységet tartalmazott, azaz bakulovírusban kifejezett gpl60 proteint. Az immunogén proteint Lepidopteran rovarsejtekben termeltük, biokémiai módszerekkel tisztítottuk, és alumínium-foszfátra adszorbeáltuk a végső vakcina formázásakor.

Agpl6-ból háromféle dózist formáztunk: 40 pg/ml, 160 pg/ml és 320 pg/ml. Az injekció térfogata a 40 és 160 μg-os dózisok esetében 1 ml volt, a 320 μg-os dózis esetén 2 ml-ben 640 μg került beadásra.

A 30 önként jelentkezőt 6 csoportba osztottuk be, mindegyikbe 5 önkéntes tartozott. Két immunizálási sémát vizsgáltunk meg. A séma: vakcinálás a 0., 30. és 120. napon és B séma: vakcinálás a 0., 30., 60., 120., 150. és 180. napon. Mindkét immunizálási sémához (A és B) három csoport tartozott, ezek különböző dózisú vakcinákat kaptak (lásd a 7. táblázatot). A vakcinálást intramuszkuláris injekció formájában alkalmaztuk, a deltoid izomba oltva. A vizsgálat időtartama 10 hónap volt: 2 hónapig alapkiértékelést, majd az első vakcinálást követő 8 hónapon át folyamatos kiértékelést végeztünk.

7. táblázat

Immunizálási séma	A beadott gpl60 mennyisége (pg)
0	30	60	120	150	180
	Nap	+
A séma
l. csoport	40	40	-	40	-	-
3. csoport	160	160	-	160	-	-
5. csoport	640	640	-	640	-	-
B séma
2. csoport	40	40	40	160	160	160
4. csoport	160	160	160	640	640	640
6. csoport	640	640	640	640	640	640

C. Ártalmatlanság és toxicitás vizsgálata:

Az injekció utáni 0., 1., 2., 3., 15. és 30. napon mindegyik önkéntest kikérdeztünk és megvizsgáltunk. Az önkénteseknek a következőkre vonatkozóan tettünk fel kérdéseket: láz, hidegrázás, hányinger, hányás, ízületi fájdalom (arthralgia), izomfájdalom (myalgia), rossz közérzet, kiütés (urticaria), asztmás légzés, szédülés vagy fejfájás. Az injekció helyén a lokális reakciók ellenőrzésekor a következőket vizsgáltuk: erythema (rózsaszínű kiütés), duzzanat, viszketés, fájdalom és érzékenység, bőr elszíneződés, repedezett bőr, regionális lymphadenopathia változás a beoltott végtag-funkcióban és szubkután göb képződés az injekció helyén. Havonta végeztünk teljes vérsejt számlálást, elvégeztük a szérumok kémiai vizsgálatát, vizsgáltuk az alvadási viszonyokat, és vizeletvizsgálatot is végeztünk.

Az in vitro celluláris immunfunkciókat T-sejt fenotipizálással (ossz limfocita, CD4 és CD8 sejt fenotípusok) vizsgáltuk Rickman és munkatársai leírása szerint [Clinical Immunoi., 52, 85-95 (1989)] és Birx és munkatársai szerint [J. Acquir. Immuné Defic. Syndr., 4, 188-196 (1991)]. Mitogénekre (pokeweed és ConA) és kontroll antigénekre (Candida albicans és tetanusz) adott T-sejt proliferatív választ is kiértékeltük (Birx el al., lásd fentebb). Az in vivő immunfunkciót a kontroll antigénekkel (például: mumpsz, tetanusz toxoid, Candida albicans és trychophyton) szembeni késleltetett hiperszenzitív bőr teszttel vizsgáltuk.

A perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC = peripheral blood mononuclear cell) és a plazma kvantitatív virális tenyésztését Bürke és munkatársai [J. Acquir. Immuné Defic. Syndr., 3, 1159-1167 (1991)] szerint végeztük. DNS polimeráz láncreakciót végeztünk [Wages et al., J. Med. Virol., 33, 58-63 (1991)], és szérum p24 antigén szinteket határoztunk meg, hogy az in vivő vírus terhelést figyelemmel kísérjük.

Nem észleltünk általános toxicitásra utaló bizonyítékot, de a betegek 87%-ánál (minden vakcináit csoportban: 13) helyi reaktivitást figyeltünk meg. A lokális reakciók a következők voltak: keményedés, érzékenység, átmeneti szubkután göb képződés az injekció helyén; ritkán észleltünk megnövekedett nyirokcsomó elváltozást. Egy beteg sem utasított vissza emlékeztető oltást. A helyi reakciók gyakorisága szempontjából nem volt különbség az első immunizáló oltások, az emlékeztető oltások vagy a dózisok között.

Nem mutattunk ki immunrendszerre ható mellékhatásokat. Ezt mitogénnel és antigén specifikus proliferatív válaszokkal in vitro mértük, és in vivő késleltetett hiperszenzitivitási bőrteszt válaszokkal vagy kvantitatív CD4 sejt kimerítés gyorsítással.

Az alap CD4 sejt szám átlaga 716 volt a vakcinára válaszolóknál, illetve 605 a nem-válaszolóknál. A vizsgálat 180-240 napja folyamán a CD4 sejtek átlaga 714 és 561 volt. A 240 napos vizsgálat folyamán a CD4 sejt-szám nettó változása mínusz 0,2% volt, míg a vakcinára nem-reagálók között az átlag CD4 sejtszám 7,3%-kal csökkent (11. ábra). A vakcina indukálta HÍV immunogenitást nem kísérte gyorsabb CD4 csökkenésre utaló jel egyetlen betegben sem a vizsgálat teljes tartama alatt.

Hogy megvizsgáljuk annak eshetőségét, hogy vajon a vakcináció következményeként növekszik-e a betegekben a HÍV replikáció és a vírus terhelés, megmértük in vivő a vírus aktivitást kvantitatív plazma és PBMC virális tenyésztés segítségével, PBMC polimeráz láncreakcióval, és mértük a szérum p24 antigén szinteket. A kvantitatív tenyésztésekkel és a DNS polimeráz láncreakcióval végzett mérések nem mutattak változásokat e vizsgálat folyamán. A betegek szérumában nem lehetett kimutatni p24 antigént.

D. Immunogenitás vizsgálata:

A teljes HÍV proteinek elleni antitesteket rekombináns technikával előállított gpl60, p66, p24 virális géntermékek és a prototípus HÍV MN törzs teljes viráll

HU 211 505 A9 lis lizátumának használatával mértük. Dót biot és Western biot technikákat használtunk Towbin és munkatársai [Proc. Natl. Acad, Sci., 76, 4350-4354 (1979)] leírása szerint. Mértük a specifikus burok epitópokra adott antitest válaszokat is (lásd a 7. ábrát).

A 7. ábrán a 88-as (a gpl20-ban a 88-98. aminosavak) és a 448C (gp 120-ban a 448-514. aminosavak) epitópokat választottuk, minthogy a gp 120 ezen területeiről közölték, hogy kapcsolatban vannak a HÍV fertőzés korai szakaszával.

A 106-os (a gp 120-ban a 106-121. aminosavak), 241 es (241-272. aminosavak), a 254-es (254-272. aminosavak), a 300-as (300-340. aminosavak), a 308-as (308322. aminosavak), a 422-es (422-454. aminosavak) és a 735-ös (735-752. aminosavak) epitópokat a valószínű funkcionális fontosságuk miatt választottuk. A 106-os és 422-es epitóp szerepet játszik a CD4 meg¹'ütésében; a 241-es, 254-es és 735-ös epitóp a csoport-specifikus neutralizációban játszik szerepet; a 300-as és 308-as epitóp pedig a típus-specifikus neutralizációban.

Az 582-es (582-602. aminosavak) epitópot kontroll gyanánt választottuk, mivel ez képviseli természetes HÍV fertőzésekben az immunológiailag domináns burok domént. Vizsgáltuk továbbá a 49-es (49-128. aminosavak) és a 342-es (342—405. aminosavak) epitópot.

A 7. ábrán a besatírozott kockák a HÍV burokra adott immunválasz dokumentált változását jelentik. A satírozott kockák (-) jellel primer humorálís választ jelentenek; a satírozott kockák (+) jellel másodlagos humorálís választ jelentenek; a (-) jelek a specifikus epitópra negatív antitest választ jeleznek az immunizálás előtt és után; a (+) jelek a specifikus epitópra pozitív antitest választ jeleznek az immunizálás előtt és után, kvantitatív változás nélkül. A satírozott kockák (.) jellel új T-sejt proliferatív választ jelentenek gpl60-nal szemben az immunizálást követően. A csak (.) jel azt jelenti, hogy nincs celluláris válasz gpl60-ra; a hb jel („high background”) jelentése: értelmezhetetlen; az nd (nőt done) jelentése: nem vizsgált.

A neutralizációs aktivitást három izolált prototípussal (HIV-IIIB), RF és MN) szemben szincicium gátlási vizsgálattal mértük Nara leírása szerint [Natúré, 333, 469-470 (1988)). A HÍV specifikus celluláris válaszokat ismert limfocita proliferációs vizsgálómódszerekkel mértük, gpl60, p24, valamint bakulovirális expressziós rendszer kontroll protein (Birx, lásd fent) használatával.

E. Vakcinára válaszolók és nem-válaszolók:

A betegeket csak akkor soroltuk a vakcinára válaszolók csoportjába, ha a HÍV burok-specifikus epitópok ellen mind a celluláris, mind a humorálís immunválasz reprodukálható, szelektív növekedése összefüggött a vakcinálási sorozattal (7. ábra). A vakcina által indukált Immorális immunitást úgy definiáltuk, mint a HÍV burokspecifikus epitópokkal szembeni szerokonverziót és/vagy mint a burok specifikus epitópokkal szembeni másodlagos emlékező immunválaszt. A vakcina által indukált celluláris immunitást úgy definiáltuk, mint ami egy új, reprodukálható, vakcinálással járó gpl60 elleni proliferatív válasz. (A vakcinára válaszolók ezen definíciója erősen megszorító meghatározás e vizsgálat-sorozat tudományos céljának a szempontjából: például, hogy megállapítsuk a fertőzés utáni immunizálás alkalmazhatóságát.) Azokat a betegeket, akik sem humorálís, sem celluláris proliferatív választ nem adtak, vagy csak humorális vagy csak celluláris proliferatív választ adtak a gpl60 epitópokra vagy a HÍV burokra, a nem-válaszolók csoportjába osztottuk be.

E A vakcina által indukált humorálís válaszok:

Utalva a 7. ábrára, a 30 beteg közül 19 (63%) betegnél vakcina-indukált növekedés mutatkozott a gpl60 HÍV specifikus humorálís és celluláris immunválaszban. A 11 ,jiem-válaszoló”-ban csak humorálís vagy csak celluláris immunválasz fejlődött ki. Az a hét beteg, akik nem mutattak semmilyen észlelhető vakcina-indukált választ, csak 3 dózist kapott (A séma). Nem észleltünk változást a HÍV polimerázhoz (p66) vagy a strukturális (p24) géntermékhez vagy a nem HÍV, kontroll tetanusz antigénhez való antitest kötődésben. Egyetlen betegben sem keletkezett a bakulovírus Lepidopteran sejt kontroll protein elleni antitest.

Tizenhárom betegnél mutattunk ki burok antitest (gpl60) növekedést Western biot analízissel, teljes HIVMN vírus lizátumot használva. A változások az immunizálási sémával voltak kapcsolatban: Az A séma esetén 15 betegből háromnál (20%) és a B séma esetén 15 betegből 10-nél (67%) volt változás. A B séma a burok proteinek elleni antitest-szint növekedését idézte elő (P = 0,025, Fisher-féle exakt teszt, két-oldali). A 13 betegnél a specifikus burok epitópokra szerokonverzió is fellépett.

Ezzel szemben, annál a 10 betegnél, akiknél nem volt szerokonverzió, egyetlen burok-specifikus epitóppal szemben sem emelkedett a burok antitest szint Western biot analízis szerint. A maradék 7 beteg, akiknél volt szerokonverzió a specifikus burok epitópokkal szemben, az ossz vírus burok antitest szintben nem volt kimutatható változás Western biot analízissel. Egyetlen betegben sem figyeltünk meg változásokat a nem burok HÍV proteinek elleni antitest szintben.

A B sémánál 15 betegből 14-nél (93%) nőtt az ossz gpl60 antitest szint, ezzel szemben az A sémánál (3 dózis) a 15 betegből csak 7-nél nőtt (P = 0,01 Fisher szerint, két-oldali) (7. ábra).

A 8. ábra bemutatja az egyes gp!60 specifikus epitópok elleni pre-immunizációs szintek poszt-vakcinációs változását: 49-es epitok (27-ről 70%-ra), 88-as epitóp (28-ról 52%-ra), 106-os epitóp (50-ről 87%-ra), 214-es epitóp (O-ról 14%-ra), 254-es epitóp (O-ról 13%-ra), 300-as epitóp (47-ről 77%-ra), 308-as epitóp (42-ről 69%-ra), 342-es epitóp (O-ról 27%-ra), 422-es epitóp (3-ról 10%-ra), 448C epitóp (73-ról 87%-ra) és 735 ös epitóp (17-ről 33%-ra). Mindegyik specifikus epitóppal szemben kimutattunk szerokonverziót, kivéve az 582-es epitópot (7. ábra). A 241, 254 vagy 342-es epitópokkal szemben csak a vakcinációját követően mutattunk ki antitesteket (szerokonverziót).

Másodlagos immunválaszt a következő epitópoknál észleltünk: 88, 106. 300, 448C és 582. Az 582-es epi12

HU 211 505 A9 tóp elleni antitest szint 100%-ban pre-vakcinációs volt, és csak egy betegnél (3%) észleltünk másodlagos immunválaszt.

A vakcina által indukált burok epitópok elleni HÍV antitest változatos képet mutatott (7. ábra). Elsődleges antitest válasz (szerokonverzió) legalább egy epitóp ellen 20 betegben fordult elő; a B séma szerint oltott 15 betegből 14-nél és az A séma szerint oltott 15-ből 6 betegnél (P = 0,005 Fisher szerint, kétoldali). Az A séma szerinti betegek a 110 potenciális epitóp közül, amelyekkel szemben nem rendelkeztek pre-immunizációs antitestekkel, csak 15-re reagáltak szerokon verzióval. A B séma szerint oltott betegek közül 60-ra reagáltak szerokonverzióval (47%; P<0,0001 Fisher szerint, két-oldali). A B séma szerint oltott betegek közül 9 (60%) reagált három vagy több burok epitópra szerokonverzióval, ugyanakkor az A sémához randomizált betegek közül csak 2 beteg (13%; P = 0,02 Fisher szerint, kétoldali).

A 0., 90. és 195. napon 7 betegben három különböző törzs (HIV-IIIB, MN és RF) ellen mutattunk ki szérum neutralizációs aktivitást. A vakcinára válaszoló 5 beteg közül 4 mutatott növekvő neutralizációs aktivitást egy vagy több kitenyésztett anyaggal szemben. A vakcinára válaszolóknál, összehasonlítva a nem-válaszolókkal, a szincicium képződés gátlása jobb volt.

G. A vakcina-indukált celluláris válaszok:

A celluláris immunválasz változásait a pre-vakcinációs (alap) és a poszt-vakcinációs limfocita stimulációs indexek (LSI = lymphocyte stimulation index) összehasonlítására alapoztuk, felhasználva a Wilcoxon-féle rang összeg (Wilcoxon ránk sum test) tesztet.

A 30 beteg közül 21-ben (70%) új T-sejt proliferatív válasz indult meg gp 160-nal való immunizálás után (7. ábra).

A 9. ábra négy tipikus vakcinára válaszoló betegnél a gpl6-ra, p24-re és egy bakulovírus kontroll proteinre adott proliferatív válaszokat ábrázolja az idő függvényében. Minden betegnél a gpl60 indukált proliferáció az alap átlag 3 LSI-ről 10 LSI-re (az utolsó immunizáló oltás után kapott 4 érték átlagából számítva) emelkedett. Ezzel szemben nem észleltünk változást a HÍV p24 protein vagy a kontroll bakulovírus proteinnel szembeni proliferatív válaszoknál.

A 10. ábra az összes betegre, a vakcinára adott válaszadási készség szerint csoportosított betegekre és az immunizálási sémák szerint csoportosított betegekre vonatkozó átlag LSI értékek vakcina által indukált változásait ábrázolja.

A gpl 60-ra adott proliferatív válasz változása tekintetében szignifikáns különbség volt a vakcinára válaszolók és nem-válaszolók között (P<0,001, Wilcoxon, egy-oldali). A B séma (6 dózis) által indukált gpl60 proliferatív válaszok nagyobbak voltak, mint az A séma (3 dózis) által indukált válaszok (P<0,10, Wilcoxon. egy-oldali).

A 21 olyan beteg közül, akik gpl 60-ra proliferatív választ adtak, 19 beteg humorális választ is adott (vakcinára válaszolók). Az összes vakcinára válaszolóknál észlelt maximális átlag limfocita stimulációs index (LSI) gpl60-ra 50,1 volt. Azonban minden vakcinára válaszoló beteg válasza különbözött a (a csúcsértékek LSI 3-tól 171-ig terjedtek) (7. ábra), ugyanígy különbözött a gpl 60-ra adott celluláris válaszok nagyságának és tartamának a vakcinálással való időbeli összefüggése (9. ábra).

H. Az eredmények kiértékelése:

E vizsgálat korlátozott mintaszáma ellenére számos olyan faktort mutattunk be, melyek összefüggtek a vakcina immunogenitásával. Az A séma szerint oltott 15 betegből hatan (40%), míg a B séma szerint oltott 15 betegből tizenhármán (87%) voltak vakcinára válaszolók (P = 0,02 Fisher, két-oldali) (7. ábra). A 16 betegből, akiknél az alap CD4 szám több mint 600/ml volt, tizenhármán voltak vakcinára válaszolók (81%), míg 14 beteg közül, akiknél a kezdeti átlag CD4 szám kisebb volt 600/ml-nél, hatan (P = 0,07 Fisher, két-oldali). A 8. táblázat alapján megállapítható, hogy a többszöri immunizáló oltások javítják az immunogenitást, még azoknál a betegeknél is, akiknél az alap CD4 szám kisebb volt, mint 600/ml. Például: a B séma (6 oltás) szerint oltott 6 betegből öt volt vakcinára válaszoló, míg 8 olyan beteg közül, akik 3 oltást (A séma) kaptak, csak egy (P = 0,03 Fisher, két-oldali) (8. táblázat).

8. táblázat

Az alap CD4 szám és az immunizálási séma befolyása a gpl60 vakcina immunológiai reaktivitására.

CD4 száma	N	Válaszolók száma (%)	Nem-válaszolók száma (%)
A séma
600	7	5(71)	2(29)
500-600	5	1 (20)	4(80)
500	3	0(0)	3(100)
Összesen	15	6(40)	9(60)
B séma
600	9	8(89)	1 (11)
500-600	2	2(100)	0(0)
500	4	3(75)	1 (25)
Összesen	15	13 (87)	2(13)
ÖSSZESEN:	30	19(63)	11 (37)

A vakcinák terápiás felhasználását Pasteur vezette be a 19. században, akut rabies fertőzés (veszettség) kezelésre. Ennek az eljárásnak a használhatóságát más fertőzések kezelésében eddig nem kutatták behatóan. Bár a vírus-specifikus immunitás fertőzés utáni módosításának más példái is vannak (mint a hepatitis A és B fertőzés eshetősége után, nincsenek jól dokumentált humán vizsgálatok, amelyek bemutatnák ennek a megközelítésnek a kivitelezhetőségét egy fellépő vagy krónikus vírusfertőzés vonatkozásában.

HU 211 505 A9

Ez a találmány fertőzés utáni aktív immunizálás révén vírusspecifikus immun-módosulást ismertet. Részletesebben kifejtve, egy HÍV burok gén eredetű gp 160 vakcina a humán gazdaszervezetben képződött vírus-specifikus humorális és celluláris válaszokat 30 korábban HÍV fertőzött személy közül 19-ben megnövelte.

Ebben a tanulmányban a specifikus HÍV epitópok elleni egyes antitest válaszokat minőségileg és mennyiségileg mértük természetes fertőzések esetén és fertőzés utáni immunizálásoknál. Ilyen módon a már fertőzött személyeknél vakcina által indukált humorális immunogenitást a betegek 70%-ánál tudtunk bizonyítani. Például 20 betegnél (19 vakcinára válaszoló és 1 vakcinára nem-válaszoló) szerokonverzió következett be specifikus burok epitópokra. Tíz betegnél fordult elő olyan szerokonverzió, mely kizárólag a vakcinálással volt kapcsolatban (241-es, 254-es és 342 es epitóp).

Ezenkívül a vakcinára adott humorális válaszok változatossága, amit epitóp-térképezéssel vizsgáltunk, a specifikus antitest válaszok okának és következményének jövőbeni analízisét teszi lehetővé, és egyedülálló alkalmakat kínál a természetes fertőzések folyamán eddig még fel nem derített potenciális immunreguláló mechanizmusok vizsgálatára.

Bár a szérum neutralizáló aktivitásának in vivő jelentősége jelenleg nem ismert, öt vakcinára válaszoló beteg közül négyben a különböző HÍV törzsekkel (IIIB. RF, MN) szemben megnövekedett neutralizáló aktivitás arra enged következtetni, hogy a fertőzés utáni immunizálás változásokat indukál a funkcionális antitestekben. A teszt vakcina a különböző HÍV törzsek elleni szérum neutralizáló kapacitás növekedését indukálja, és potenciális segítséget jelenthet a csoport-specifikus neutralizációs epitópok meghatározásában.

HÍV burokproteinek elleni proliferatív válasz ritkán fordul elő természetes HÍV fertőzésben. Azonban gpl6Onal való immunizálás után specifikus T-sejt proliferációs válaszokat észleltünk 21 betegnél (70%). A különbség oka nem világos. Az egyik lehetőség az, hogy az új proliferatív válasz olyan epitóp(ok) ellen irányul, amely(ek) a vakcinára kivételesen jellemzőik) (mint a vakcina termelés metodológiájának vagy egy alternatív in vivő antigén feldolgozás eredménye). A másik lehetőség, hogy a proliferációs vizsgálatban használt protein esetleg nem stimulálja a természetes vírus „vad-típusú” burkával szembeni primer T-sejt proliferatív válaszokat. Azonban további bizonyítékát kaptuk annak, hogy a vakcinálás beindítja a gazdaszervezet celluláris immunválaszát: kiválasztott vakcinára válaszolóknál emlékeztető immunizáló oltások után HIV-ΠΙΒ típus-specifikus citotoxikus T-sejt válaszokat kaptunk.

HIV-fertőzött emberekben a vakcina immunológiai reaktivitásáért felelős faktorok még tisztázásra szorulnak. Még korai HÍV fertőzés esetén is, az egyének számos vakcinára szuboptimális válaszokat adnak, összehasonlítva megfelelő kontroliokkal. Ez az alacsony reaktivitás a korai B sejt diszregulációval és a T-sejt diszfunkcióval függ össze. Ez esetben a vakcina immunológiai reaktivitása az alap CD4 sejtszámmal függött össze, s ez összeegyeztethető azzal a hipotézissel, miszerint a gazdaszervezet immunológiai státusa fontos meghatározója egy vakcina reaktivitásának. Azonban az immunizálási séma - specifikus T-sejt szám határok között - szintén befolyásolja a vakcina reaktivitását: a B séma (6 injekció) kiemelkedő volt. Az alacsony CD4 sejtszámmal rendelkező betegeknél a vakcinára adott gyengébb válaszolást készséget valóban meg lehetett javítani a vakcinálások számának növelésével, amiből arra lehet következtetni, hogy az adagolás, alkalmazás, adjuvánsok vagy formázás további módosításával a beteg immunológiai válaszadási készségének további javulása várható.

Bár aggodalmak merültek fel a HÍV fertőzött személyek HÍV specifikus vakcina készítményekkel való aktív immunizálásának biztonságával kapcsolatban, nem volt bizonyíték immunspecifikus toxicitásra. A kvantitatív tenyésztések, a DNS polimeráz láncreakcióval végzett vizsgálatok és a szérum antigén vizsgálatok azt mutatták, hogy nőtt az in vivő HTV terhelés. A HÍV replikáció kitűnő in vivő markere, azaz a CD4 sejtek csökkenésének a mértékére vonatkozóan kedvező hatás mutatkozott különösen azoknál a betegeknél, akiket a vakcinára válaszolók közé soroltunk. A válaszolóknál az átlag CD4 számban bekövetkezett változás -0,2% és a nem-válaszolóknál -7,3% volt. Ezek az adatok mutatják hogy a fertőzés utáni immunreaktivitás nem jár a CD4 sejtek növekvő pusztulásával, és feltételezhetően csökkenő in vivő HTV replikáció társul hozzá.

E tanulmány folyamán kapott vakcinálási eredményeket összehasonlítottuk tíz fertőzött és nem kezelt olyan egyén adataival, akiknek a kora, etnikai csoportja és alap CD4 sejtszáma hasonló volt. Ebben a referencia csoportban az átlag CD4 szám 8,7%-kal csökkent, az A séma szerinti oltott betegeknél a csökkenés 7,2%, a B séma szerint oltott betegeknél a csökkenés 0,6% volt. Ezek az adatok bizonyítják, hogy a rekombináns HÍV burokproteinnel végzett, fertőzés utáni vakcináció ésszerű, és az eredmény még bátorítást is jelent az ilyen vakcinák profilaktikus használatát illetően.

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Humán immunelégtelenség vírussal (HÍV) fertőzött egyén kezelésére szolgáló, gyógyszerészeti beadásra alkalmas készítmény, amely HIV-specifikus celluláris vagy humorális immunválaszokban fokozódás kiváltására elegendő mennyiségű rekombináns HÍV burokproteint tartalmaz.
2. 2. Egy 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns proteint egy bakulovírus rovarsejt expressziós rendszer termelte.
3. 3. Egy 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns protein molekulatömege körülbelül 145 000.
4. 4. Egy 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a HÍV burokprotein a gpl60, gpl20 és a gp41 legalább egyike.
5. 5. Egy 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns proteint az Ac3046 bakulovírus rovarsejt vektor fejezte ki.

   HU 211 505 A9
6. 6. Egy 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns protein legalább körülbelül 2 000 000 molekulatömegű részecskékké van agglomerálódva.
7. 7. Egy 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns protein valamilyen adjuvánssal van kombinálva.
8. 8. Humán immunelégtelenség vírussal (HÍV) fertőzött egyén kezelésére alkalmas készítmény, amely egy rekombináns HÍV burokproteint és egy alumíniumfoszfát adjuvánst tartalmaz, ahol a rekombináns protein legalább körülbelül 2 000 000 molekulatömegű részecskékké van alakítva.
9. 9. Egy 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns proteint egy baulovírus rovarsejt expressziós rendszer termelte.
10. 10. Egy 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns protein a rekombináns gplóO, rekombináns gpl20, rekombináns gp41, egy körülbelül 145 000 molekulatömegű rekombináns HÍV burokprotein és egy Ac3046 vektor által kifejezett rekombináns protein által alkotott csoportból van választva.
11. 11. Egy 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns protein a gplóO körülbelül 757 egymást követő aminosavát tartalmazza, és lényegében hiányzik belőle a gplóO egymást követő 40 terminális aminosava.
12. 12. Egy terápiás HÍV vakcina készítmény, amely egy rekombináns HÍV burokproteint és egy alumínium-foszfát adjuvánst tartalmaz, ahol a rekombináns protein legalább körülbelül 2 000 000 molekulatömegű részecskékké van alakítva.
13. 13. Egy 12. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns HÍV burokprotein körülbelül 10 pg-4000 pg/dózis mennyiségben van jelen.
14. 14. Egy 13. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns proteint egy bakulovírus rovarsejt expressziós rendszer termelte.
15. 15. Egy 13. igénypont szerinti készítmény, amelyben a rekombináns protein a gplóO körülbelül 757 egymást követő aminosavát tartalmazza, egy körülbelül 757 helyzetnél csonkított gplóO peptid, és lényegében mentes a gplóO körülbelül 40 terminális aminosavától.