PL161448B1 - Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AIDS6 2 ) Numer zgloszenia,z którego nastapilo wydzielenie:268266 PL - Google Patents

Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AIDS6 2 ) Numer zgloszenia,z którego nastapilo wydzielenie:268266 PL

Info

Publication number
PL161448B1
PL161448B1 PL1987293520A PL29352087A PL161448B1 PL 161448 B1 PL161448 B1 PL 161448B1 PL 1987293520 A PL1987293520 A PL 1987293520A PL 29352087 A PL29352087 A PL 29352087A PL 161448 B1 PL161448 B1 PL 161448B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hiv
aids
protein
recombinant
virus
Prior art date
Application number
PL1987293520A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of PL161448B1 publication Critical patent/PL161448B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6045—RNA rev transcr viruses
    • C12N2810/6054—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1 . Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AID S, znamienny tym, ze kontak- tuje sie wspom niane przeciwciala z próbka bialka env wirusa AIDS, wytworzonego na drodze ekspresji z zastosowaniem rekom binow anego wirusa owadziego i wykrywa sie przeciwciala przeciwko wirusowi AIDS przez wykrycie wiazania lub reakcji pomiedzy wspomnianym bial- kiem wirusa AIDS a wspomnianymi przeciwcialami. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania przeciwciał przeciwko .wirusowi AIDS.
Nabyty zespół zaniku odporności (AIDS) jest chorobą wirusową o wielkim znaczeniu w skali światowej. Powodującym go czynnikiem jest retrowirus zwany ludzkim wirusem zaniku odporności (HIV), rozmaicie nazywany: wirus uogólnionego powiększenia węzłów chłonnych (LAV) (Barre-Sinoussi i in., 1983), ludzki wirus białaczki z komórkami T, typu III (HTLV-III) (Popowic i in., 1984) albo wirus związany z AIDS (ARV) (Levy i in., 1984). Strukturę i zorganizowanie genów kilku wirusów AIDS wyjaśniono na podstawie całkowitej sekwencji nukleotydów klonów w klonowaniu molekularnym i bezpośredniej analizy sekwencji białek wirusowych.
Białko otoczki jest najbardziej obiecującym kandydatem w rozwoju badań nad szczepionką przeciw AIDS i badań diagnostycznych (Francis i in., 1985). Przeciwciała przeciw glikoproteinom otoczki są zwykle wykrywane w surowicach pacjentów z AIDS (Robey i in., 1985). Poza tym glikoproteina otoczki przedstawia sobą główny antygen docelowy wirusa AIDS (Barin i in., 1985).
Wytwarzanie skutecznej szczepionki przeciw AIDS zależy od zdolności wytwarzania dużych ilości bezpiecznego antygenu, który stymuluje odporność ochronną gdy zostanie wstrzyknięty człowiekowi. Technologia rekombinacji DNA przedstawia najlepszą alternatywę wytwarzania antygenu z powodu jej odczuwalnej zdolności do wytwarzania dużych ilości bezpiecznych i ekonomicznych immunogenów. Wybór rekombinowanego układu do użycia/bakteryjnego, drożdzowego lub z zastosowaniem innych komórek eukariotycznych będzie związany z wzięciem pod uwagę następujących zagadnień: glikoprotein otoczki HIV jest specyficznie przetwarzana przez glikozylację i rozszczepienie, a więc rekombinowany układ powinien być zdolny do przetwarzania produktu genowego w pożądany sposób; komórki bakteryjne i drożdzowe nie glikozylują skutecznie swoich białek ekspresyjnych podczas gdy komórki ssaków okazują się odpowiednimi wektorami ekspresyjnymi, wykazują one jednak tę niedogodność, że zawierają wiele niepożądanych immunoreaktywnych antygenów i oprócz tego przedstawiają ryzyko w postaci tego, że mogą być siedliskiem czynników ubocznych.
Bakulowirusowy układ ekspresyjny przedstawia sobą atrakcyjną i życiowo ważną sposobność wytwarzania skutecznego immunogenu otoczki HIV. Bakulowirusów można użyć jako wysokoskutecznych eukariotycznych wektorów klonujących i ekspresyjnych do wytwarzania rekombinowanych białek w komórkach owadzich w hodowli. Bakulowirusy spełniają więcej niz tylko nie161 448 zbędne wymagania przy użyciu w postaci eurokariotycznych wektorów klonujących i ekspresyjnych. Bakulowirusy są bezpieczne z powodu swojego wąskiego zakresu wykorzystywanych gospodarzy, który ograniczony jest do stawonogów. Są one zdolne do przyjęcia bardzo dużych ilości egzogennego DNA. Ich układy w postaci hodowli komórkowych są bezpieczne, nietransformowane i skuteczne. Posiadają one bardzo skuteczny promotor poliedyry, aktywniejszy niż jakikolwiek inny znany promotor w komórkach eukariotycznych zakażonych wirusem.
Układ bakulowirusowy oferuje także duże korzyści przy wytwarzaniu polipeptydów do użycia w metodach diagnostycznych. Wielu ludzi i wiele zwierząt ma na ogół przeciwciała, reagujące z bakteryjnymi, drożdżowymi i heterologicznymi antygenami zgodności tkankowej. Obecność tych przeciwciał osłabia pewność metod diagnostycznych z powodu fałszywie dodatnich reakcji z zanieczyszczającymi białkami bakteryjnymi, drożdżowymi i białkami ssaków, znajdowanymi w preparatach wytwarzanych w odpowiednich układach ekspresyjnych. Ludzie (i zwierzęta) najprawdopodobniej nie byli w poprzednim okresie życia narażeni na ekspozycję immunologiczną na antygeny komórek motyli -lub bakulowirusów. Komórki motyli i bakulowirus zastosowany do wytwarzania rekombinowanych białek w tym układzie nie jest więc prawdopodobnie obciążony problemem zanieczyszczających antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała zwykle obecne u ludzi lub zwierząt. Tak więc zanieczyszczenia pochodzące z komórki motyla lub bakulowirusa nie będą prawdopodobnie prowadzić do fałszywie dodatnich reakcji w metodach diagnostycznych z zastosowaniem rekombinowanych antygenów tworzonych w tym układzie.
Informacje na temat poruszonych wyżej problemów można znaleźć w następujących publikacjach: Barin F., McLaneM.F., AllanJ.S i LeeT.H., Science 228:109^^1096 (1985); BarreSinoussi F., Chermann J.C., ReyF., NugeybeM.T., ChamaretS., GruestJ., DauguetC., AxlerBlinC., Vezinet-Brun F., RouzioexC., RozenbaumW. i Montagnier L., Science 220:868-870 (1983); Chakrabarti S., Robert-Curoff M., Wing-Staal F., Galio R.C., MossB., Naturę 320:535-537 (1986); Francis D.P., Petncciam J.C., New Eng. Journal of Med. L^<^^^1590 (1985); Hu Shiu-Lok, Kosowski S.G., Dalrymple J.M., Naturę 320:537-540 (1986); Iddekinge B.J.L., Hooft van, G.E. Smith i M.D. Summers, Virology 131:561 (1983); Kennedy R.C, Henkel R.D., PaulettiD., AllanJ.S., LeeT.H., EssexM., DroesmanG.R., Science 231:1556-1559 (1986); Kieny M.P, Rautmann G., Schmitt D., Dott K., Wain-Hobson S., Alison M., Girard M., Chamaret S., Laurent A., Montagnier L., LecocqJ.P., Research Papers 4: 790-795 (1986); Kozak M., Celi 44: 283-292 (1986); LaskyL.A., Groopman J.E., FennieC.W., BenzP.M., CaponD.H., DwobenkoD.J., NakamuraG.R., NunesW.M., RenzM.E., Berman P.W., Science 228: 209-212 (1986); LevyJ.A., Hoffman A.D., Kramer S.M., Shimabururo J.M. i OskiroL.S., Science 225: 840-842 (1984); McDougal J.S., Kennedy M.S., Sligh J.M., Cort S.P., Mawle A. i Nicholson J.K.A., Science 231: 382-388 (1986); Montagnierl., ClavelF., KrustB., Virology 144: 283-289 (1985); MuesingM.A., SmithD.H., CabradellaC.D. i inni, Naturę 313: 450-458 (1985); PennockG.D., C. Shoemaker i L.K. Miller, Mol. Celi, Biol. 4: 399 (1984); PopowicM., Sarngadharan M.G., ReadE. i Galio R.C., Science 224: 497-500 (1984); RatnerL., Hhaseltine W., PatarcaR. i inni, Naturę 313:277-284(1985); Robey W.G., Safai B., OroszlanS. i inni, Science 228: 595-595 (1985); Smith G.E., M.J. Fraser i M.D. Summers., J. Virol. 46: 584 (1983a); Smith G.E., M.D. Summers i M.J. Fraser. Mol. Celi, Biol. 3: 2156 (1983b); Smith G.E., G.Ju. B.L. Ericson, J. Moschera, H.W.Lahm i M.D. Summers, Proc. Natl., Acad. Science USA (1985, w druku); StarichB.R., Hahn B.H., Shaw G.M., McNeely P.D. Modrow S., Wolf H., Parks E.S., Parks W.P., Josephs S.F., Galio R.C., Wong-Staal F., Celi. 45' 637-648 (1986); Summers i G.Ju. Mol. Celi. Biol. (1985, w druku); TowhinH., StaehelinT. i GordonT., Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350-4353 (1979) oraz Wain-Hobson S , Sonigo P., Donos O., Cole S. i Alizon M. Celi 40: 9-17 (1985).
Sposób wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS według wynalazku polega na tym, ze kontaktuje się wspomniane przeciwciała z próbką białka env wirusa AIDS, wytworzonego na drodze ekspresji z zastosowaniem rekombinowanego wirusa owadziego i wykrywa się przeciwciała przeciwko wirusowi AIDS przez wykrycie wiązania lub reakcji pomiędzy wspomnianym białkiem wirusa AIDS a wspomnianymi przeciwciałami.
W jednym z wykonań sposobu według wynalazku stosuje się bakulowirus (ang. baculovirus) stanowiący wirus jądrowej poliedrozy Autographa californica (AcMNPY). Sekwencja promoto4
161 448 rowa użyta do ekspresji jest sekwencją genu poliedryny (occ) pochodzącą z tego wirusa. AcMNPV i preparaty wyjściowe wirusa rekombinowanego utrzymuje się w komórkach Spodoptera frugiperda (ang. fali armyworm). Rekombinant konstruuje się tak, że gen Pn ulega delecji, co nadaje rekombinowanemu wirusowi cechę occ”. Pozwala to na łatwą identyfikację wirusów rekombinowanych po prostu na podstawie morfologii łysinek. Wirusa rekombinowanego, gdy. się go wyizoluje, można użyć do zakażenia każdej permisyjnej lub półpermisyjnej populacji komórek utrzymywanej jako linia hodowlana lub jako część całego owada.
Klonowanie i ekspresja sekwencji kodującej obce białko w wektorze bakulowirusowym wymaga, aby sekwencja kodująca była ustawiona w szeregu z promotorem poliedryny i sekwencjami w górę, a z drugiej strony ze skróconymi sekwencjami kodującymi poliedrynę tak, że homologiczna rekombinacja z genomem bakulowirusa daje w wyniku przeniesienie obcej sekwencji kodującej uszeregowanej z promotorem poliedryny i nieaktywnym genem poliedryny. Zgodnie z tym, zaprojektowano do użycia w konstrukcji genu env AIDS różne wektory insercyjne. Każdy wektor insercyjny opisany w poniższej części niniejszego opisu był tak zaprojektowany, aby dostarczał translacyjnego kodonu inicjacyjnego ATG. Insercja obcych sekwencji do tych wektorów musi być tak przeprowadzona, aby faza translacyjna ustalana kodonem inicjacyjnym była utrzymywana prawidłowo wzdłuż obcych sekwencji.
Szczegóły dotyczące wprowadzania sposobu według wynalazku do praktyki zamieszczone są poniżej w odniesieniu do towarzyszących rysunków.
Figura 1 przedstawia sekwencje nukleotydów genu otoczki (o pełnej długości) izolatu LAV-la. Sekwencja nukleotydów jest przedstawiona łącznie z przewidywaną sekwencją aminokwasów. Informacje dotyczące sekwencji otrzymano z GENBANK. Numeracja nukleotydów postępuje od pierwszego nukleotydu przypuszczalnego kodonu incjacyjnego ATG. Aminokwasy numeruje się od kodonu inicjacyjnego ATG. Regiony odpowiadające sygnałowemu peptydowi zewnątrzkomórkowej glikoproteiny (gpl20) i transbłonowej glikoproteiny (gp41) są przedstawione razem z proponowanymi peptydowymi miejscami rozszczepienia i związanymi z asparaginą miejscami glikozylacji. Odnośne miejsca enzymów restrykcyjnych, są one wyliczone poniżej sekwencji nukleotydów.
Figura 2 obejmująca fig. 2A, fig. 2B, i fig. 2C przedstawia struktury rekombinowanych plazmidów pl614 i pl774. Plazmid pl774 zawiera całkowitą sekwencję kodującą genu env LAV. Plazmid skonstruowano w 2 stadiach: a) fragment KpnI genu env LAV o 2700 par zasadach (bp) wyodrębniono z p 1614 i klonowano do miejsca KpnI pUC18, tak, że miejsce Smal pUC18, było w górę od sekwencji genu env, b) syntetyczny oligomer o 121 par zasad ligowano do miejsca Smal metodą łączenia tępych końców. Strzałki wskazują polarność sekwencji kodujących. Przedstawiono odpowiednie miejsca endonukleaz restrykcyjnych. Sekwencję nukleotydów syntetycznych oligomerów otrzymanych dla celów wynalazku skonstruowano za pomocą Pharmacia Gene Assembler w oparciu o przewidywaną sekwencję aminokwasów regionu LAV z zastosowaniem korzystnego użycia kodonów genu poliedryny.
Figura 3 obejmująca fig. 3A, fig. 3B i fig. 3C przedstawia strukturę wektorów insercyjnych. Wektory insercyjne MGS-3, MGS-3 + 2, MGS-4 i MGS-5 pokazano z odpowiednimi miejscami endonukleaz restrykcyjnych i sekwencją nukleotydów. Polarność sekwencji promotorowych od lewej do prawej.
Figura 4 przedstawia przewidywaną strukturę drugorzędową i modele hydrofilowości prekursora gpl6O na podstawie analizy komputerowej z użyciem programu Chowa i Fastmana [Biochemistry, 13, 222 (1974)].
Figura 5 przedstawia podejście do zagadnienia konstrukcji wektorów rekombinowanych. Plazmidy pokazane na niej są opisane lub oznaczone literą (np. A), która odpowiada konstrukcjom opisanym w tabelach 1 i 2
Wektor insercyjny MGS-1 skonstruowano z fragmentu restrykcyjnego EcoRI-I klonu DNA wyodrębnionego z izolatu AcMNPV oczyszczonego techniką łysinek. Wektor insercyjny MGS-1 składa się z następujących części strukturalnych (patrz fig. 3) sekwencja o 4000 par zasad w górę od kodonu inicjacyjnego ATG genu poliedryny; polilinker wprowadzony na drodze ukierunkowanej mutagenezy, który zawiera kodon inicjacyjny ATG i miejsca restrykcyjne Smal i KpnI; sekwencja o
161 448 5
1700 par zasad rozciągająca się od miejsca restrykcyjnego KpnI (wewnętrznego w stosunku do genu poliedryny) do końcowego miejsca restrykcyjnego EcoRI klonu EcoRI-I.
Wektor insercyjny MGS-3 jest taki sam jak MGS-1, z tą różnicą, że polilinker składa się z miejsc restrykcyjnych Smal, KpnI, BglH i segmentu uniwersalnego kodonu stop.
Wektor insercyjny MGS-2 + 3 jest taki sam jak MGS-3, z tą różnicą, że zawiera on dwie dodatkowe reszty cytozyny w pozycji +3 MGS-3 i ma mniej o jedną resztę guanozyny w pozycji +4 MGS-3. Końcowym wynikiem jest przesunięcie w stosunku do MGS-3 fazy kodonowej o jeden nukleotyd.
Wektor insercyjny MGS-4 ma taki sam model strukturalny jak MGS-3, z tą różnicą, że skonstruowano go z syntetycznym polilinkerem, który zawiera sekwencje kodujące pierwszych 10 aminokwasów N-końcowej części genu poliedryny, a następnie miejsca restrykcyjne dla Smal, KpnI, BgllI i segment uniwersalnego kodonu stop. Wektor ten skonstruowano w oparciu o obserwację, że można osiągnąć podwyższony poziom ekspresji, jeśli kodony pierwszych 14 aminokwasów z N-końca genu poliedryny są sprzężone z N-końcem obcego genu (Smith i in., 1983).
Wektor insercyjny MGS-5 ma taki sam model strukturalny jak MGS-3, z tą różnicą, że skonstruowano go z syntetycznym polilinkerem, który zawiera sekwencje kodujące odszczepialny peptyd sygnałowy IL-2, a następnie miejsca restrykcyjne dla EcoRI, KpnI, BgUI i segment uniwersalnego kodonu stop. Wektora tego używa się do zapewnienia wewnętrznych sekwencji env HIV z sekwencją peptydu sygnałowego, co do której wykazano, że jest skutecznie rozpoznawana i usuwana w komórkach owadów (Smith i in., 1985).
Przykład . Zastosowano rekombinowany plazmid oznaczony NA-2, składający się z segmentu o 21,8 kilozasady całkowitego prowirusa AIDS wprowadzonego do pUC18. Klon ten był, jak donoszono, zakaźny, ponieważ mógł wytworzyć wirusa po transfekcji pewnych komórek ludzkich. Kompletne sekwencje genu otoczki NA-2 otrzymano ze szczepu LAV HIV (BarreSinoussi i in., 1983).
Gen otoczki LAV zawiera otwartą fazę odczytu, która koduje 861 aminokwasów zaczynając kodonem Met (Wain-Hobson i in., 1985). Szczep HTLV-IIIBHIO zawiera 856 kodonów (Starich i in., 1986).
Sekwencja peptydu sygnałowego zawiera 30 aminokwasów (2 z nich różnią się od aminokwasów z BHIO); część pozakomórkowa składa się z 486 aminokwasów (14 z nich różni się od aminokwasów z BHIO); a region transbłonowy składa się z 345 aminokwasów (5 z nich różni się od aminokwasów z BHIO). Fig. 1 przedstawia sekwencje: nukleotydów i wydedukowaną aminokwasów genu env LAV użytego w tych badaniach. Reszty aminokwasowe numeruje się zaczynając od przypuszczalnego sygnału inicjacyjnego Met. Reszty aminokwasowe przytaczane w niniejszym opisie odpowiadają numerom pokazanym na fig. 1.
Zdecydowano przeprowadzić ekspresję różnych domen genu env HIV w uzupełnieniu do całkowitego polipeptydu gpl60. Oparto tą decyzję na kilku faktach, w tym na strukturze białka i heterogenności izolatów retrowirusa AIDS, o której donoszono (Benn i in., 1985, Hahn i in., 1985). Zastosowano program komputerowy, który przewiduje drugorzędową strukturę białek z nałożonymi wartościami hydrofilowości (Chow i Fastman, 1984). Analiza przedstawiona na fig. 4 ujawniła kilka domen hydrofilowych z obrotami β. Wykazano, ze te domeny są połączone z antygenowymi epitopami i strukturalnym umiejscowieniem (Westhoff i in., 1984). W oparciu o te wyniki i obecność dogodnych miejsc restrykcyjnych zdecydowano przeprowadzić ekspresję C-końcowych skróconych form białka otoczki pokazanego na fig. 4. Korzyścią wynikającą z tych konstrukcji jest otrzymanie progresywnych delecji zaczynających się z C-końcową domeną hydrofobową. Oprócz tego zdecydowano tez przeprowadzić ekspresję regionu objętego przez sekwencje kodujące gp41. Co najmniej dwa (2) immunodominantowe epitopy zawarte są w regionach mających ulec ekspresji. Dla tych konstrukcji zaprojektowano wektor zawierający rozszczepialny sygnał dla IL-2. Ostatnio wykazano, ze peptyd sygnałowy powodował towarzyszenie ekspresji genu IL-2, z rekombinowanego genomu bakulowirusowego, prawidłowego przetwarzania komórkowego w zakażonych komórkach (Smith i in., 1985).
Strategię klonowania obmyśloną dla ekspresji sekwencji env HIV przedstawiono na fig. 5.
Gen otoczki początkowo wyizolowano z NA-2, jako fragment restrykcyjny EcoRI/SacI o 3846 par zasad i klonowano do miejsca restrykcyjnego EcoRI/SacI pUC19. Powstały plazmid
161 448 oznaczono p708. Gen otoczki następnie izolowano ponownie jako fragment restrykcyjny KpnI o 2800 par zasad i klonowano do miejsca restrykcyjnego KpnI pUC18. Pozostały klon oznaczono p 1614 (patrz fig. 2A). Ten fragment restrykcyjny KpnI zawierał nieco skróconą część genu otoczki, tak, że utracono sekwencję o 121 par zasad odpowiadającą N-końcowi. Tę utraconą część, która zawierała sekwencje peptydu sygnałowego, zastąpiono w genie przez insercję dwuniciowego syntetycznego oligomeru, zaprojektowanego na podstawie sekwencji aminokwasów LAV z użyciem korzystnych kodonów genu poliedryny.
W celu ułatwienia dalszych manipulacji, nową sekwencję restrykcyjną Smal wprowadzono jednocześnie w miejsce kodonu inicjacyjnego ATG. Kodon inicjacyjny ATG powinien być zapewniony przez wektor insercyjny. Powstały plazmid oznaczono pl774 i przedstawiono na fig. 2B.
Fragmenty restrykcyjne z pl774 zawierające sekwencje kodonowe różnych domen otoczki AIDS klonowano do wektorów MGS tak, że kodon inicjacyjny ATG wektora insercyjnego był w fazie z kodonami genu otoczki. Przeprowadzono następujące konstrukcje (patrz fig. 5).
A. gplóO o pełnej długości klonowania jako fragment z trawienia Smal i częściowego KpnI do MGS-3 w jego miejscu Smal. Klon ten zawierał wszystkie kodujące sekwencje gp 160 z wykorzystaniem jej autentycznego kodonu terminacyjnego translacji.
Al .gpl 6O o pełnej długości klonowania jako fragment z trawienia Smal i częściowego KpnI do MGS-4 w jego miejscu Smal/KpnI. Klon ten zawiera całość sekwencji kodujących gpl60 z wykorzystaniem jej autentycznego kodonu terminacyjnego translacji.
B. Skrócona gpl60, klonowana jako fragment restrykcyjny Smal/BamHI w miejscu restrykcyjnym Smal/Bglll MGS-3. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-757 pgl60 z wykorzystaniem kodonu teiminacyjnego zapewnionego przez wektor MGS-3.
Bl. Skrócona gpl60 jako fragment restrykcyjny Smal/BamHI w miejscu restrykcyjnym Smal/Bgl/II. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-757 gpl60 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego zapewnionego przez wektor MGS-4.
C. Skrócona gpl60 klonowana jako fragment Smal/Hindlll, uzupełniony w Hindlll, w miejscu Smal MGS-3. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-645 gpl60 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego zapewnionego przez wektor MGS-3.
F. Skrócona gpl20, klonowana jako fragment restrykcyjny Smal/HgllI do MGS-3 w jego miejscu Smal/Bglll. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-279 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego dostarczonego przez wektor MGS-3.
G. Skrócona gpl20, klonowana jako fragment restrykcyjny Smal/Dral do MGS-3 w jego miejscu Smal. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-129 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego dostarczonego przez wektor MGS-3.
H. Powyższa konstrukcja Smal/Dral, do której wprowadzono sekwencje kodujące HBsAg, jako fragment BamHI, do miejsca Bglll umiejscowionego na wektorze w dół. Klon ten zawiera sekwencje kodujące pierwszych 129 N-końcowych aminokwasów gpl20, a następnie, w fazie sekwencje kodujące HBsAg.
I. gp41 klonowana jako fragment restrykcyjny Bglll do MG S-3 w jego miejscu Bglll. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy od 472 do C-końca gpl60.
J. gp41 klonowana jako fragment Smal/KpnI wyodrębniony z P3156 i klonowany do wektora MGS-5 przy wyciętym miejscu EcoRI i miejscu KpnI. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy od 473 do C-końca gpl60.
K. Skrócona gp41, klonowana jako fragment Bglll/BamHI do MGS-3 do jego miejsca Bglll. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 472-757 gpl60 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego dostarczonego przez wektor MGS-3.
L Skrócona gp41, klonowana jako fragment KpnI/BamHI wyodrębniony z p3166 i klonowany do pMGS-5 w jego miejscu KpnI/BamHI. Klon ten zawiera sekwencje kodujące peptyd sygnałowy kodujący aminokwasy 472-757 gpl 60.
Rekombinowane plazmidy z genem env HIV wytrącono fosforanem wapnia z AcMNPV i dodano do nich zakażonych komórek Spodoptera frugiperda. Następnie chimeryczne geny wprowadzono do genomu AcMNPV na drodze rekombinacji homologicznej. Rekombinowane wirusy zidentyfikowano na podstawie morfologii łysinek occ”. Łysinki te wykazują nadający się do identyfikacji efekt cytopatyczny, lecz nie wykazują okluzji jądrowych Przeprowadzono dwa
161 448 dodatkowe następujące po sobie procesy oczyszczania techniką łysinek w celu otrzymania rekombinowanego wirusa. Rekombinowany DNA wirusowy analizowano pod względem specyficznej co do miejsca insercji sekwencji env HIV przez porównanie jego charakterystyki restrykcyjnej i hybrydyzacyjnej z wirusowym DNA typu dzikiego.
Ekspresja sekwencji env HIV z rekombinowanych wirusów w komórkach owadzich powinna doprowadzić do syntezy pierwotnego produktu translacji w postaci preprobiałka zawierającego wszystkie aminokwasy kodowane od nieinicjacyjnego kodonu ATG wektora ekspresyjnego w dół od promotora poliedryny. Ten pierwotny produkt powinien składać się z aminokwasów dobieranych w wyniku translacji kodonów dostarczanych przez rekombinowany wektor. I tak np., pierwotny produkt translacji konstrukcji A powinien powstać w rezultacie odczytania na N-końcu: Met-Pro-Gly-Arg-Val, kodony Mot-Pro-Gly zostały zapewnione w rezultacie strategii klonowania.
Dwa potencjalne miejsca przetwarzania do rozszczepienia prekursorowej glikoproteiny env doprowadziłyby najpierw do usunięcia 30 reszt aminokwasowych peptydu sygnałowego przy N-końcu, a następnie do utowrzenia dużego transbłonowego białka zawierającego 345 aminokwasów i części zewnątrzkomórkowej z 486 aminokwasów. Na ogół uważa się, że rozpoznanie i odszczepienie peptydu sygnałowego jest wymagane do skutecznego przetwarzania komórkowego.
W celu określenia ekspresji sekwencji genu env HIV z rekombinantowych bakulowirusów zakażono hodowle komórek owadzich każdym z różnych wirusów rekombinantowych w obecności 35S-metioniny, 35S-cystyny lub 3H-mannozy w późnych okresach zakażenia. Znakowane ekstrakty komórkowe przedstawiono poddając je elektroforezie w żelu SDS-poliakryloamidowym (PAGE) i autoradiografii.
Użyto trzech typów surowicy do oceny autentyczności rekombinowanego białka wytworzonego w komórkach owadzich zakażonych bakulowirusami rekombinantowymi HIV.
1. HIV-dodatnie surowice ludzkie dostarczane przez Center for Disease Control (CDC, Atlanta, Georgia) jako HIV-dodatni wzorzec porównawczy.
2. HIV-ujemne surowice ludzkie dostarczane przez CDC jako HIV-ujemny wzorzec porównawczy.
3. Przeciwciało poliklonalne, którego powstawanie wywołano u kóz, przeciw oczyszczonemu białku gpl20 otrzymanemu z oczyszczonego, zakaźnego wirusa HTLV-III. Wyniki zestawiono w poniższych tabelach 1 i 2.
Tabela 1
Izolator nr Opis HIV-ujemna Surowica HIV-dodatnia gpl20-dodatnia
Kontrola
nie zakażone komórki Sf — — —
zakażone (wt) komórki Sf — — —
Rekombinant
A 2863 całkowita gpl60 1-861 — + +
Al 3715 nd nd nd
B 3046 skrócona gpl6O 1-757 — + +
BI 3540 nd nd nd
C 3774 skrócona gpl60 1-645 nd nd nd
D 4646 gpl20, 1-516 nd nd nd
E 2040 skrócona gpl20 1-472 — + +
F 2165 skrócona gpl20 1-279 — — +/—
G 2196 skrócona gpl20 1-129 — — —
H 3076 aminokwasy 1-129 sprzężone z HBsAg nd nd nd
I 3156 gp41.472-861 — + +
J 4585 sygnałIL-2/gp41 nd nd nd
K 3166 skrócona gp41 472-757 — + +
L sygnaaIL-2/skrocona gp41 — — —
W powyższej tabeli 1 użyto następującego oznaczenia nd = me oznaczono
161 448
Tabela 2
Zestawienie przewidywanych i zaobserwowanych wyników dotyczących izolatów
Konstrukcja/izolat Aminokwasy otoczki Wielkość przewidywana 2 Wielkość zaobserwowana 3
Nr
nie glikozylowana glikozylowana
A 2863 całkowita gpl60 1-861 93,200 160,000 160,000
56,000 120,000 120,000
37,00 41,000 41,000
Al 3715 jak w A jak w A jak w A
B 3046 skrócona gplćO 1-757 82,000 150,000 150,000
56,000 120,000 120,000
26,000 30,000 30,000
Bl 3540 jak w B jak w B jak w B
C 3774 skrócona gpl60 1-645 69,000 130,000
56,000 120,000
14,000 18,000
D 4646 gpl20, 1516 56,000 120,000 ND
E 2040 skrócona gpl20 1-472 51,000 110,000 110,000
90,000
F 2165 skrócona gpl20 1-279 30,000 60,000 60,000
G 2196 skrócona gpl20 1-129 12,000 15,000 15,000
H 3076 aminokwasy 1-129 sprzężone z HB sAG 35,000 40,000
I 3156 gp41,472-861 42,000 46,000
J 4585 sygnałlL-2/gp41 42,000 46,000 N D
K 3166 skrócona gp4I 47-757 30,000 33,000 ND
L sygnał lL-2/ skrócona gp41 30,000 33,000 N.D
W powyższej tabeli 2 użyto następujących oznaczeń.
1 Reszty aminokwasów przewidywanych jako obecne w preprodukcie genowym, nie przetworzonym, określone na podstawie sekwencji nukleotydów 2 Oznaczona na podstawie reszt aminokwas<5w w postaciach aktualnych i przewidywanych po przetworzeniu 3 Dotyczy glównych immunoreaktywnych polipeptydów ND - nie oznaczono
Rekombinowanych białek gpl6O użyto z dobrym wynikiem w typowych testach diagnostycznych, takich jak ELISA i radioimmunoprecypitacja w uzupełnieniu do blottingu metodą Westetna.
Rekombinowane białka otoczki HIV wytwarza się w komórkach S. frugiperda w ciągu 4-5 dni po zakażeniu HIV-rekombinantowym wirusem AcNPV. Większość białek powstających w wyniku ekspresji białek pozostaje w połączeniu z zakażonymi komórkami. Ponieważ wszystkie produkty genu otoczki HIV opisane w niniejszym opisie mają podobne właściwości, to znaczy w pierwszym rzędzie pozostają w połączeniu z komórkami i są glikoproteinami, można użyć jednej metody oczyszczania dla wszystkich produktów genu otoczki HIV opisanych w niniejszym zgłoszeniu patentowym, lub innych podobnych konstrukcji. Następujący test jest przykładem sposobu oczyszczania rekombinowanego białka gpl60 tworzonego przy zastosowaniu wektora ekspresyjnego Ac3046.
Komórki S frugiperda zakaża się rekombinowanym Ac3046. Po 4-5 dniach od zakażenia zbiera się komórki i przemywa, uwalniając od podłoża do hodowli komórek. Najpierw komórki rozdziela się na frakcje błonowe, jądrowe i cytoplazmatyczne znanymi metodami. Frakcją glikoproteinową zawierającą białko gpl6O solubilizuje się i glikoproteiny oczyszcza stosując chromatografię powinowactwa do lektyny z soczewicy i używając zwykłych metod. Frakcja glikoproteinowa zawiera białko gplóO i w tym stadium białko gpł6O stanowi 25-50% całości frakcji glikoproteinowej, jak można sądzić na podstawie analizy w żelu SDS-poliakryloamidowym. W celu dalszego oczyszczania gplóO, frakcję glikoproteinową przeprowadza się przez kolumnę do chromatografii cieczowej z sitem molekularnym. Białko gpl6O jest eluowane z kolumny jako frakcja o wysokiej masie cząsteczkowej i białko gplóO stanowi w przybliżeniu 90% białka całkowitego we frakcji o wysokiej masie cząsteczkowej.
161 448
W pewnym stopniu interesujący jest, w odniesieniu do niniejszego wynalazku, artykuł zatytułowany „AIDS Virus Env Protein Expressed from a Recombinant Vaccinia Virus“ M.P. Kien/ego i in., Bio/Technology, tom 4, wrzesień, 1986, str. 790-795. Publikacja ta ujawnia, że sekwencję kodującą env, odnoszącą się do białka env LAV, wprowadzono do wektora stanowiącego wirus krowianki. Powstający żywy wirus rekombinowany VVZGeLAV określa następnie wytwarzanie białka env w zakażonych komórkach ssaków. To rekombinowane białko reaguje z surowicami pacjentów z AIDS i okazuje się, że jest ono glikozylowane i przetwarzane w taki sam sposób, jak w przypadku autentycznego env retrowirusa LAV. Dalej, inokulacja myszy WTTGeLAV wywołuje powstanie immunosurowic o wysokim mianie, rozpoznających determinanty krowianki, lecz przeciwciało rozpoznające białka env LAV ma niskie miano. Komórki zakażone rekombinowanym wirusem szybko uwalniają przetworzoną postać białka env do podłoża hodowli. Tym niemniej to podejście do zagadnienia wytwarzania i wykorzystywania białka env jako takiego, tak jak w szczepionce przeznaczonej do wywołania odpowiedzi immunologicznej na wirus LAV lub HIV, nie jest całkowicie zadowalające, zwłaszcza z powodu użycia wirusa krowianki jako wektora.
Interesujący jest też, w odniesieniu do niniejszego wynalazku, artykuł zatytułowany „Production of Humań Beta Interferon in Inseot Cells Infected with Baculovirus Expresion Vector“ G.E. Smitha i in., Molecular and Cellular Biology, tom 3, nr 12, str. 183-192, grudzień 1983, oraz artykuł zatytułowany „Strong and Regulated Expression of Escherichia coli Beta-Galactosidase in Inseet Cells with a Baculovirus Vector“ G.D. Pennocka i in., Molecular and Cellular Biology, tom 4, nr 3, str. 399-406, marzec, 1984. Także interesujące jest równoczesne, współprzeniesione zgłoszenie patentowe nr kolejny 810938, złożone 18 grudnia 1985 r. Europejska publikacja patentowa nr 0 127 839 opublikowana 12 grudnia 1984 r. i europejska publikacja patentowa nrO 155474 opublikowana 25 września 1985 są również interesujące w odniesieniu do niniejszego wynalazku. Ujawnienia z tych artykułów, publikacji patentowych i zgłoszenia patentowego są włączone do niniejszego opisu i stanowią część niniejszego ujawnienia.
Ponieważ ludzki nabyty zespół zaniku odporności (AIDS) jest chorobą epidemiczną w Stanach Zjednoczonych Ameryki, Afryce centralnej, Europie i innych obszarach świata, wynalazek ma wielkie znaczenie. Jak wskazano w niniejszym opisie powyżej, czynnikiem powodującym chorobę AIDS, jest retrowirus nazywany ludzkim wirusem zaniku odporności (HIV), był on również nazywany rozmaicie: wirus uogólnionego powiększenia węzłów chłonnych (LAV), ludzki wirus białaczki z komórkami T, typu III (HTLV-III) lub wirus związany z AIDS (ARV). Strukturę i zorganizowanie genowe kilku wirusów AIDS wyjaśniono na podstawie całkowitej sekwencji nukleotydów klonów w klonowaniu molekularnym i bezpośredniej analizy sekwencji białek wirusowych. Gen otoczki HIV (env) koduje glikoproteinę o masie cząsteczkowej 160000, która w niniejszym opisie przytaczana jest jako gpl60. W komórkach zakażonych wirusem prekursor gpl60 jest rozszczepiany przy konserwatywnej sekwencji zasadowych aminokwasów z utworzeniem N-końcowej glikoproteiny gpl20 i mniejszego C-końcowego białka gp41. Glikoproteiny HIV gpl60, gpl20 i gp41, zawierają, odpowiednio, 833, 488 i 345 aminokwasów.
Dojrzała gp 120 jest połączona z otoczką wirusa i jest uważana za zewnętrzną, podczas gdy gp41 ma dwa długie ciągi reszt hydroforowych i jeden lub oba z nich mogą przenikać w poprzek otoczkę wirusa. Prekursor gp 160, dojrzałą gp 120 i białka gp41 wykrywa się lmmunosurowicami w większości osobników po ekspozycji. Wykazano także, iż białko gp 120 wiąże się z cząsteczką T4 na powierzchni komórki będącej limfocytem induktorowym/pomocniczym T i w ten sposób białko gpl60 HIV jest w stanie indukować tworzenie się syncytium z udziałem komórek, które przeprowadzają ekspresję białka receptorowego T4. Wiadomo również, ze 104 aminokwasy karboksykońcowe gpl60 nie są wymagane do fuzji limfocytów T4+ T-.
Glikoproteina otoczki wirusa AIDS gpl60 HIV stosowana w sposobie wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS według wynalazku powstaje w rezultacie ekspresji genu env AIDS, który klonowano z zakaźnego izolatu HIV Gen env HIV użyty do ekspresji koduje tylko z wykorzystaniem sekwencji znajdowanych w natywnym genie env HIV. Wirus env HIV wprowadzono do rekombinowanego bakulowirusa tak, ze ekspresja dawała w rezultacie dojrzałe białko, które nie zawierało zmienionych lub dodatkowych aminokwasów. Z szeregu wytworzonych rekombinantów, jeden zawiera całkowity gen env HIV, a inny jest całkowity, z wyjątkiem małej delecji sekwencji o około 100 aminokwasach przy C-końcu gp!60. Delecję tę przeprowadzono w
161 448 celu dopomożenia w stabilizacji utworzonego w wyniku ekpresji rekombinowanego białka gpl60 z nieusunięciem dwóch hydrofobowych domen obecnych w gp41.
gp 160 HIV wytworzono sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu w układzie ekspresyjnym komórek owadzich i jest ona, jak również sugerowano w powyższej części niniejszego opisu, wolna od zanieczyszczających białek komórek ssaków. Ekspresję i oczyszczanie białka gpl60 przeprowadzono w warunkach pozwalających na utrzymanie struktury natywnego białka i jego aktywności biologicznej. Za pomocą immunoprecypitacji, blottingu metodą Westerna i techniki ELISA wykazano, że utworzone w rezultacie ekspresji białko env HIV przejawia w wysokim stopniu reaktywność z surowicami pacjentów z AIDS.
Białko gpl60 HIV stosowane w sposobie według wynalazku wytwarzano w różnych ilościach, czystości i postaciach, takich jak w jałowym buforze wodnym w stężeniu około 100pg białka otoczki na ml przy czystości wyższej od 50%, jak to określono za pomocą analizy FPLC w SDS-poliakryloamidzie. Stwierdzono, że białko gpl60 HIV jest stabilne w ciągu co najmniej sześciu tygodni w temperaturze 4°C. Zapewniono to białko w ilościach lub objętościach do pojedynczego użycia i jest ono przechowywane z dobrym skutkiem w temperaturze -70°C. Pożądane jest, aby unikać powtarzania cykli zamrażania i rozmrażania.
Rozcieńczenia można dokonać z użyciem roztworów zawierających odpowiednie białka lub detergenty, aby zapobiec utracie białka i aktywności biologicznej. Do odpowiednich rozcieńczalników należy 0,1% bydlęca albumina surowicza (BSA) lub jej ekwiwalent, 0,1% surowica w wodzie jałowej lub podłożu hodowli i 0,1% siarczan dodecylowo-sodowy lub inny odpowiedni detergent w wodzie lub buforze. Białko do wykrywania przeciwciał sposobem według wynalazku, gpl60 HIV, jest stosowane w użyteczny sposób, jak wykazano w powyższej części niniejszego opisu, konfekcjonowano je w porcje różniące się wielkością zależnie od potrzeby i przewidywanego zastosowania, jaknp. opakowania zawierające 25pg, 50//glub 100//g białka. Białkojest użyteczne w badaniach in vitro i innych poszukiwaniach, w zależności od rozmaitych aspektów badań nad AIDS, obejmujących rozwijanie sposobów otrzymywania szczepionki, blotting metodą Westerna, technikę ELISA, wiązanie się z receptorami, immunoprecypitację, wytwarzanie immunosurowic, tworzenie syncytium i inne zastosowania, w tym badania fizyczne, oraz jako wzorzec porównawczy.
Blotting metodą Westerna stanowi jedną z najbardziej swoistych i czułych metod, dostępnych przy wykrywaniu przeciwciał przeciw AIDS i często stosuje się ją w rozmaitych aspektach badań nad AIDS. Jak wzmiankowo w powyższej części niniejszego opisu, prekursor gpl60, dojrzała gpl20 i białka gp41, wykrywane są przez immunosurowice osobników seropozytywnych pod względem AIDS. W sposobie według wynalazku, białko otoczki wirusa AIDS lub env stosuje się na odpowiednim podłożu, takim jak podłoże ceramiczne, szklane, płytki polistyrenowe, studzienki lub błony, takie jak paski membrany nitrocelulozowej, w celu wykorzystania do wykrywania przeciwciał przeciw AIDS.
W szczególności, według wynalazku, paski membrany nitrocelulozowej impregnuje się elektroforetycznie wydzielonym rekombinowanym białkiem otoczki AIDS, gpl60 HIV, do użycia w blottingu metodą Westerna, czyli jako pasków do blottingu. Ponieważ gp env HIV stosowana w sposobie według wynalazku powstaje w układzie ekspresyjnym komórek owadzich, jest ona wolna od zanieczyszczeń białkami komórek ssaków.
Stwierdzono, ze materiał ten, zdeponowany na paskach nitrocelulozowych do użycia jako paski do blottingu metodą Westerna, jest w wysokim stopniu reaktywny z surowicami pacjentów z AIDS. gpl60 HIV zdeponowano na paskach nitrocelulozowych badano, i to z dobrymi rezultatami, z udziałem ludzkich dodatnich surowic AIDS, w rozcieńczeniach 1/100 do 1/10000. Swoiście związane przeciwciało wykryć można albo odczynnikami związanymi z enzymami, takimi jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza, skonjugowanymi drugimi przeciwciałami, albo swoistymi przeciw-przeciwciałami, lub wreszcie białkiem A znakowanym jodem radioaktywnym. Procesy immunologiczne stosowane w blottingu metodą Westerna, w których wykorzystuje się sposób według wynalazku, to jest zastosowanie jako nośników białka env HIV impregnowanych pasków do blottingnu do użycia w blottingu metodą Westerna, są dobrze znane.
Paski z gpl60 HIV lub nośniki stosuje się w sposobie według wynalazku w płytkach do jednorazowego użycia z odpowiednią ilością pasków, np. 8, w ośmiu oddzielnych studzienkach.
161 448
Wszystkie procesy inkubacji można przeprowadzić w płytce, która jest zaopatrzona w pokrywkę, tak, że płytki można użyć jako dogodnego pojemnika do przechowywania rozwiniętych naniesień metodą Westerna lub wyników detekcji. Każdy taki pasek stosowany według wynalazku, jest impregnowany rekombinowanym białkiem gpl60 otoczki HIV, rozdzielonym za pomocą elektroforezy w 10% żelu SDS- poliakryloamidowym, a następnie przeniesionym elektroforetycznie na nitrocelulozowe membrany, albo paski, albo nośniki. Wytworzone tak produkty są użyteczne przy wykrywaniu in vitro przeciwciał przeciw otoczce AIDS, do badań na zwierzętach, albo do badań z użyciem hodowli komórkowych lub tkankowych, w zależności od różnych aspektów poszukiwań związanych z AIDS, w tym blottingu metodą Westerna w celu wykrycia przeciwciał przeciw AIDS, do kontroli jakości, screeningu banku krwi i rozpoznawania AIDS. Stwierdzono, że nitrocelulozowe nośniki membranowe są trwałe w ciągu co najmniej 6 tygodni w temperaturze pokojowej i prawidłowo przechowuje się je, tak jak w płytkach, w miejscu zimnym i suchym.
Płytki ELISA gpl60 HIV do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS stanowią płytki do jednorazowego użytku z odpowiednią ilością, taką jak 96, oddzielnych studzienek. Wszystkie procesy inkubacji prowadzi się w płytkach. Do każdej studzienki dodaje się w odpowiedniej ilości gpl60 HIV, tak jak np. ΙΟΟμΙ oczyszczonej gpl60 HIV w stężeniu 1 /^ggp^i^O HIV na ml. Dopuszcza się do przylgnięcia białka gpl60 HIV do tworzywa sztucznego w studzienkach w ciągu odpowiedniego okresu czasu, na przykład w ciągu nocy w temperaturze 4°C. Następnie usuwa się pozostały płyn z każdej studzienki w płytkach ELISA i pozwala się na wyschnięcie tych płytek w temperaturze pokojowej. Stwierdzono, że płytki z gpl60 HIV wprowadzoną do studzienek są trwałe w temperaturze pokojowej w ciągu co najmniej 6 tygodni i prawidłowo przechowuje się je, tak jak poprzednio wspomniane płytki, w miejscu zimnym i suchym. Wytworzony produkt jest użyteczny przy wykrywaniu przeciwciał przeciw otoczce AIDS sposobem według wynalazku, lub jako antygen do badań na zwierzętach, albo do badań z zastosowaniem hodowli komórkowych lub tkankowych, w zależności od różnych aspektów poszukiwań związanych z AIDS, w tym do techniki ELISA, do screeningu, do badań diagnostycznych ludzkich surowic pod względem obecności przeciwciała przeciw AIDS lub antygenu.
m s
LL
~5>
tetyczny ra
ΤΑΑ promotor oliedryny
- proir.o- ATG (ΤΓΰΚ (STAtt GAC KT- 3* tor po- i I feal -KpaJ feal liedryny
TM TG T(i GAT TAT KA TAT (GT CCC ACC AK GGG CCC GGG GGT ACC AGA TCT TM TTA ATT AAG T - 3* ♦ ♦ ł I-1
Seal KpnI Bglll STOP
FIG. 3A puce EcoRI
<
<
ł—
H<
<
<
O.
<
LJ
CL
O
Κι/) cn ·—« c
CL o o o
S-<5- e
LJ l/>
LJ
LJ
LJ
O f— <
ro
s=a
ao ►—1
(Z) o o
l/l ,-T t=l JZ
□ in X
o o*
Q_
LJ
LJ
Λ
C
Ll Λ O L> -P tJ O Φ ε o
L. O CL O.
tn
>—
BstEU
b·— i <U νι
Z? 19 «u £.
<S b— vi -« 79 <9
o.
o
LZ)
S β/ fc_ w- /*· tJ
UJ \ ►— '
I —’ O bO jM W»ta
I bO »M Ρ» β V) c rt>
ω < — l9_ 91
o eu U-»— c-/ c · £X -w CM tt
t •r4
*!« 79 ►—· 19 c o
J^ta c. 97 V» 19 v-> b“ •w C- o
V» ·—« «*C QC o
U *-*
-cS u.
U
- S2
VI ««<
<9
6Λ jc: u «>« <c ra ►— * ta «Γ ·*» c
»« >» O fc> +» Tl o 9 B ·* O r-t fc> O a. a.
ta a» »— ra ł— — t_r ra ta ta
OJ »— <u ta ta <L) »—
N
O
N
V)
U
O
K·
Φ o
<0 i~9 i*
X
Brak miejsce dlo psłl, NcoI,Xbal,lttb Sstl pUCI8
FIG. 2A »
ΰη
FIG. 2B
Φ
Ε ο
σ>
c > φ φ ξ> 5
C ω
α ι
Ο (Ν cn
Ll ω
co ο
Ζ>
Ο.
d
LL ać
N u
o
P o
h
O o s>
OO ·“ w
U o
Η H '°K
W 4
>4 es
► 4
&o S P 0.0 o o «ΈΓο * Cl H «30 “SB
fc i—i H H
o O O x- «5
o O O H 1 r4
4 r-ł U H t A
rł O O (OH o >ou
C H as •H 4 id (i > o £4
H A
O o U o CU o w H >o O H
W H xO w u o r— fi m μ 4 λ v>
V 4 rl H m 4 oh
SA o
o£Ó <Λ H 4 w
>
u
o o « > O
,H 3
4 V
3 .4
O 0
H P
A Cu
o p
4 f.
0 H
Λ 3 ,s
A O
H >
o >4
O i—i
H O
A >
.0 W
4 >
3 O
H O
A P
4 (U
A O
1 >
►
8 3 O
H »4
O P
fi O
4 tn
o c
A rA
4 o Λ i
E & 4
A & :
A Η 1
4 3 ,
4 O 1
o ► 1
►
S 2! P W 0 r~ S8
f— (Λ A 4 co O A
f- U H ZS
<5 W O
4 CC) 4 t— A
H U H p o
fc o O O o O
U) 4 w A
H c fi O O
o O 4 1-ł fi
H 4 4 n 4
O P O C fi
H fi O o <
O fi 4 4 4
4 C fi O O
O O 4 Λ H
O 4 4 W Ii
O P ii P H
o jc O O O
4 H 4 W H
4 P H O O
4 O >,0
h Wi 4 O fi
a C Fi C O
4 O 4 o 4
4 4 4 4
A P O o A
H £ o >4
o ii 4 i-) 4
H C ii « 4
O O 4 i— fi
H 4 4 W <
A P H 3 O
O O O rl 4
O w 4 o 3
O C H >4
4 it O •- 3
4 A 0 o o
4 f ii « 4
H O A >4
O A 4 H 4
O >,O 3 O
O rH •p A
4 o o o 3
4 3 o P o
4 ► & Σ: 4
3 O. O o P p O fA
3 4 o S 4
o P H P o
o fi o O H
H P 4 Σ 4
4 O o 3 4
H o r-l <Ł
H O H o 3
Ό
P H 4) O W 4
3!
<o >>O m — o rłOO
«40 a oo a ο ο
b b.£J b ο m 40® 28 b <Λ SO
O 3 3 §3 δ fc
2 3 3 4 i fc
α u O 0 £ b
« i b b au >b — U
Η < P 4 ο <
* *
U
a >
« 4 « b a b c d
o b o-ι b d y a 4
H 4 H 4 4 0 < 4
8-5 5K O8 b 4
4 3 > o a u b 4
3 b u 4 a u Mb
w p d y >p
u u o b 4 0 O b
n 4 M U « b o £
>4 £ U >o M U
p 4 b 4 o b s u
Μ b c u m b >4
&s sa rH O (9 O
01P Łb O b » b X 0 b §
£ P S6 b 4 >4 r-l t9
£ P O 4 w 4 <9 0
a 4 m 4 .O/' £ b-
58 es M U s u « 4 4-4
u b 3 U ® b 2 P
£2 38: o b H 4 2 P
3 4 M 19 o 4 M U
b 4 fi <*> h u
o 3 b 4 s u P 4
« 4 M b 3 < n U
SS frg u 3 35
c o M O s t* C b
o* 4 « 3 £ b 2 *5
o u v) 4 O b 2 4
b O M U M u C b
a b > o b U « u w b 2 4
m o iMS r-i 4 n b
a b > <9 S8
>b Ob « u* (0 <
58 sa 3*5 3’5
σ s 3 4 c d 5i OU CM U 3 4 56
O « 4 o ab o ab o « b
r* b b σι <n 4 rd >O ΓΊ O b
b I-I 4 b 4 3 cm a b CM M 4
o in <M « 4 «Λ 4
2%
S6
Sg sg
8Ś m b es «3 W (h b 4 26
5ί > o su
Cm U 015 as
5C
H 4 >4 b O o O
CC fi x 3 b 4 b 4 η b b 4 a b > O
O n
o b
«42 b b ®» M 40 Γ*
M U es
W 4 &
b c b <s αυ b 4 b 4 « U £h c z 55 a u łl H « C H W l· H §3$ £ 41 5C w 4 o 4 a b > o b 4 a b > o <9 o 3 3§
4 r— o o
O
3 4 O r- o H c (N J) U c σ«4 o l 3 m 4 4 R r55 >l< b (
U ( i
« b o b H 4 w 4
3* 4 &
O 1 r—
C m 4 4 « 4 b 4
0 M u u 5U
CM <9 b 4
θ' 4 rl b
H 3 a b
4 4 > e
M 4 « b
£ u £ b
b 4 Cm b
m b a 4
>o b O
o b 4 0
c b o*4
n 4 M 3
4 4 4 4
a b
rl b b U
W 4 u> 0
3 o 4
b r) M 3
«9 0 s u
b 4 >4
a b b O
> <9 o 0
u b ΟΌ
« U M U
O) b 4 4
C 4 C Q
ol 4 3 4
19 U <9 3
C s « u
n 4 b b
4 4 w 4
3 u» Cnb
5 b O 08
c o « p
ol 4 o-l b
O □ w 4
b 4 M b
a b « (9
> O O) 4
O < b H M <
O »—— m w i >· ►5 t
C 0 O h r: r O 0 cm rco r >2 *3 <
es a u c b ff8 b b o 4 >4 ► 4 5U <9 tP4 H O 4 4
M b « O V) 4
5C u 4 c u m 4 4 4
W fi >«9 O b « fi x§
5U
O c r-H o
tJ»4 as
P o 22 C fi
350
Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gin Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gin Ser ATA GCT AGC AAA TTA AGA GAA CAA TTT GGA AAT AAT AAA ACA ATA ATC TT? AAG CAA TCC o
co co u o o >.<00 Η H <n r~ « o sc
2 o 3 >.( >-< t O ( si eS
Μ H 4> O V) <
i O i (A
4» 2 O Η Η H m < *n śf
3 σ>2 o H 3 r~ 2 2 jn r·
SS
SB
3§
0.0 4) < M
rH O lu O rH fi Φ
O o Η H W < CZ)
iii 3b Cn< u 3 Φ r-H
o o H < 2 < H
« t-« Μ H w o O
>o 4) O M
O H W < o ί» A*
C H C H ° O
0 < « < M O M
< 5 < 2 (U O Cu
ss
CU Η CU H
H f-i 41 O U~> < OT U
X 3
M O x a ί-l <
r-i <<
> δ
SS
H <
Λ r-i Λ
O 3
CU U 0.0 33 >0 rH O o o >.< r—1 U o o
O M < r- 4) O co w H β·8
Μ H £%
Μ H O O <0 <
C H V) <
3 ss 0. (-«
O se s3
O 4» H ►J O £3 t- <
a o
Ul· £3
4) O *J o
—U «ί
> i £ <
M <0 «C
X O rH O
H < < O
0.0 » rf
« <
3 4 2
M H
4) O rH 3
to O o
rf rM <4
r-t 3 <0 H
O 0 > o
rH O £ ϋ
H <
C U W rU O c o o 3 fr8 >o o <-( (JCO o O tP rC H OT <
2 c O ss c o ss
C H
SS >l· rd O O O
O 8
Łl· o><
M (3 2 2 33
H 2 3 2 ss ►J O
O 4» H ►4 O >o o 8
H 2
SS
W <
C H v 3
U H O tn< o
Η Η Ό $u 3 < < m r-
r~ r*
23 ΟΊ* ti f N
SS 2«
M O
><
o 3 p 2
U t-u <0 <£
« o r-t O
to 2 < o
cn< H 3 OT o ><
2 < ►a 2 3
0.0 u o M O X o O c o
Η H t- < rM
C H o o jQ Ui r-
w < M O
< 2 CU o Q
0.0 (0 <
OT a£ rH O «Ρ
< 3 < o C
Cno -U < O
M O <0 H Ή
< < > o bO Φ cc
*J o >.<
<n co
H < 2 H t-< to H M
H C H 4-» O U 2 3
< OT 2 4> H 4) 3 rH
2 2 2 £ 2 tO H O
(u O U rf o C O o OT H O lu
O rH 41 O CO w 2 in >O r- 4)
H 10 H U· < 2 O H to
O
O
H
4) t-<
£ <
0.H n aC 2 3
Λ*3
O O ><
o o >.< r-4 O o o
O H P O Pu O O»2 a§
M
4) C H t- »—I en 0 o o 3 i su
CU o <t «—4 <2 o 3
SS w <
n ti >.« ►a t >,< o r-« O r-ł
O O co r3 O
SS
4* O
SS >.o o o o
4)
U
4»
X
CU s
(0 rH <
ff-i o
o s
o
H
H tO
O
S3 o o
4* < -i H M <
I >.< I r-ł 3 l o o I
I -t O I 10 H I > o i3 < U
O •Μ < +> O C
33® > O N ot < c >2 o bO
U l· Φ £3“
Cnrf H 3 2 2 m < >.2 ►a 2
2 rH A o 3
5» 8* 3 o * * * c
Ό O E
O <-ł
O o
H
O
O W I <n >. UT l-l ' o -u O rU <0 H m > o
SB as
o « to o 9 < S °
Γ- ,0 4 ΓΊ r-l » s 4
Ο X 0 O O t 9 o
f- ł* r-
c p r-l ł
o
2B
W 4 o c H θ
ΙΛ « 4 rO θ 4 2 d
?§ as 3S
4 o * R 2 P
38 * R SB
c o U 3 3 2 o 3 20 H 4
> δ SB C4 m p
> δ w 4 2 2
M U 4 b «4
c. u S χ
H < < o 2 O
5g σ 5 3 5 B§
b U c O H 4 3 5 S B 5g
*1 O 3 P cp
8S S P o 3
* 3 s 2 « o
V> (o < 2 A rf
n i
2*ί
3Ś lo
V
Ui
CO M O 4 u 23
O >o rM θ o 0 iS
Μ to & 4 W 4
W 4 >4 Ή O o 8 &
BS §s cs > |o ΰ 8 h 4 >O rO θ
U U rH O a F > δ S& S S og
B§ £P
Η P
MB
M 4 >p 0 8 SB 58 B§ Bs
OH ss (0 O
4
SC
Sg as as sg η 4 ss c *2 ss W 4
W 4
OO £0
Μ to « O Ui d a H r0 O 4 8 c H w 4 4 2 £ P
P P
8B
Oo U r-l O
H > 0 4 H
3H u U o «05 «0 « h x3
Si
H 4 5fL
4«5 4« 5 X ło 0 £3
C to
2S
S4 2 2 MH
H 2
O 0 53
OH θ w 4 m <3n s£ as sg 5B as as as c to
2Λ3
Ot O su as as
4 o r-l fo θ ► 4 <M GO
W rf
S'S s S
H 4 tt H £3 £8 b
H 1S tt
4) 4 r- H W 4 c 0 η & 4 4 « fo X fo CM P * 4 o η ρ m h 4 < co * B to P sis rH rf £B r-ł
O
5&
a 4 Ή H H 4 C4 8§ 3 2 S 2 >.P
B 8 33 > O o u o lo U r-l
Λ o 2: co
M U es
2§
5g w u x 3 c o
B 3 ou ło U V o V) H 3 4
SB
Oo U to 4 a O to H
OU 0) « 2 0 c rO O 53 8*8 fo H 3 O * H P Μ H £3
£8 C % c H >u >.<4
£8 M % w 4 r-l Q 1—4 O
H U 2 2 4 2 0 8 o o
3 O rH 4 C rO U £H 5$ c o rH et
0 0 O U H H o o O O
41 U H O 3 U r-l 4 tPO
* H * O β» P 8 P * O
£ 2 U) to S Ρ 8 δ * 4
£8 3 3 w B * 4 s P
£8 rO w B r-l to S P
to P O 3 Ui 4 M 4 8 6
s§ as
O 4 m r-4
3 O u « ω to υ to 3 O SB Μ P £3 M 4 to to O 4 41 V Σ g 4) rO H B 4 8*8 Η H * •Ή M
4 o 3 O o 3 O O σ2 O O O c O O 3 4 o w 4 o 4
O on V to Γ* * H 47 M O c-2 Λ U n 4 4A * to Γ* ijBrf σ\ X
O ιΠ >- P ιΛ 3 υ lA 4 4 U> to 4 4 4 1O ► to u> A «2 v> £
5ί lg r-l O 4 H > o
u o o 3 H o P b o PO O OHO Ι- Ο
0> b < O) O m H rf H P O r- 2
Ob «π — o «η 21 2 20 O O r* Cu O i H
20 «0 00 00 00 O
O
O ł— o
tO
O « rf r- (W <
tn«t ο,ο S
C p > P O rH O p b < O O
O 0) o 20 H Η 2 « H d ί
2 < i) 2 > Ο £ H > O x 3
0. o rt CU 0» b c e A rt HO
O p O r-l b -u e r-l o H O
< 3 2 o M < O 3 2 o 2 o
σ p 2 3 O tn O 3 2 0» 2 0» b
O a H ρ 3 δ b r-l H
2 < 1 O 2 2 •3 o »-» 2 1 <
3 O 2 0.H ki o 3 O A O A H
2- C o 2 b r-l q -<O
o 3 2 3 H 2 > o 2 3 2Ό
> 2 0.0 r-l < C H H < H2
h1 3 Μ 2 ιβ H W < e o H 3
o o < 3 > ο < 2 H < 2 2
r“i H O 0.0 w o 0» b r-l b HH A r— o o O H >O
O O Η H I-I 2 H H 2 o O H
3 rH A 0) O r-l H 3 o 0» b HH c O H 2 A H d ο
O O H 2 i-l P H H 2 2 < o
P < 3 b 3 O P b 3 o >2
r-3 2 0) P 0» H £2 0» H rl 3
o 3 ► O ►4 O £ H » O o o
9 2 3 2 3 ? o 2 3 O c 2
h4 o ei 3 O 2 O SP >2 1 2 4 ►4 H r- 2 o 3
O <2 3 < 0.0 3 o p O d 2
·— H a H O 2 a H O 3 A H
jh et t-J P < 3 O tn 2 > ο
c o
X
t- o o o o g o o ξ H H 2
o o s 3
H < o O
P 3 2 fS
H H <3
r- O
O O s£ rH 3z o 3 o o p u
CU u 0O P 3 2 < 0.0 23 o o p u CU o
0*0 o o
O CU m P O r- < <
P d
a c y ρ 3
w t- 2 2 2
> “ 2 3 0
H C o 3 2 38
c o ΟΟ
o r P o
< 2 2 o
rU O o o
Λ H x 3
> O x 3
3 2 P o
SP S3
o2 u o
p 3 o o
2 o w <
O) H α o
rl t— £ b
H < £ b
P o O 3 0
Ol O r- 0) f-
W H Γ-* ► O
A O
2O
2 •m a o 3 &H
Η H >O rH O o 3 o»q 22 co 28 o o o o
O 4» H ►5 O rA H > O o H
P t-« 0 O V) < C H
O O
SS
2 *5 #-2 <βί o 3 o c o r-l -U 2 oo o 3 r < A H > O
2 1-1 2 o 3
M < Cu>
2 r-l <
o 3
O
Kpn Bgl ii
O ί*Ί
CD
§ >o o 8 g
H c o o
p r-l tt H
O o 3
o o'2 L· l4 β
o 2 2 ii
< 3 53 t- <
>o < O o o
0» 2
-t * w 2 C2 rl trrt ia p O oo 2 2 o
o o
o tO go , σι
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz
Cena 10 000 zł

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS, znamienny tym, że kontaktuje się wspomniane przeciwciała z próbką białka env wirusa AIDS, wytworzonego na drodze ekspresji z zastosowaniem rekombinowanego wirusa owadziego i wykrywa się przeciwciała przeciwko wirusowi AIDS przez wykrycie wiązania lub reakcji pomiędzy wspomnianym białkiem wirusa AIDS a wspomnianymi przeciwciałami.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się gpl6O.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się gpl20.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się gp41.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się jego fragment immunogenny.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo znakowane białko wirusa AIDS.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się białko wirusa AIDS włączone lub unieruchomione na stałym podłożu, korzystnie przeźroczystym, takim jak studzienki płytki polistyrenowej, folii lub filtru.
PL1987293520A 1986-10-16 1987-10-16 Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AIDS6 2 ) Numer zgloszenia,z którego nastapilo wydzielenie:268266 PL PL161448B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92019786A 1986-10-16 1986-10-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL161448B1 true PL161448B1 (pl) 1993-06-30

Family

ID=25443341

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1987268266A PL161165B1 (pl) 1986-10-16 1987-10-16 Sposób wytwarzania bialek wirusa AIDS PL
PL1987293520A PL161448B1 (pl) 1986-10-16 1987-10-16 Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AIDS6 2 ) Numer zgloszenia,z którego nastapilo wydzielenie:268266 PL

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1987268266A PL161165B1 (pl) 1986-10-16 1987-10-16 Sposób wytwarzania bialek wirusa AIDS PL

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP0265785A3 (pl)
JP (1) JPS63207397A (pl)
CN (1) CN87107837A (pl)
AR (1) AR241940A1 (pl)
AU (2) AU7984287A (pl)
BR (1) BR8705535A (pl)
DD (3) DD284046A5 (pl)
DK (1) DK541987A (pl)
FI (1) FI874564A (pl)
HU (1) HUT45095A (pl)
IE (1) IE872748L (pl)
IL (1) IL84154A0 (pl)
LT (3) LTIP1794A (pl)
LV (1) LV10654B (pl)
PL (2) PL161165B1 (pl)
ZA (1) ZA877752B (pl)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0272858A3 (en) * 1986-12-15 1989-07-12 Repligen Corporation Recombinant hiv envelope proteins produced in insect cells
IL85149A0 (en) * 1987-01-27 1988-06-30 Microgenesys Inc Hiv gp160 aids virus envelope protein-containing substrates and methods for detection of aids antibody thereby
US5681713A (en) * 1987-05-08 1997-10-28 Smithkline Beecham Corporation Expression of heterologous proteins in Drosophila cells
IL89118A0 (en) * 1988-02-03 1989-08-15 Microgenesys Inc Vaccine containing polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus type 1
IL90048A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Merck & Co Inc Recombinant gag precursor of hiv,its preparation and its use as aids vaccine
JP2511494B2 (ja) * 1988-05-12 1996-06-26 善治 松浦 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法
CA2003300A1 (en) * 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
JP2852431B2 (ja) * 1988-12-07 1999-02-03 財団法人阪大微生物病研究会 レトロウイルスのプロテアーゼ、逆転写酵素及びエンドヌクレアーゼ、並びにこれ等の酵素の製法
AU5187190A (en) * 1989-02-23 1990-09-26 University Of Ottawa Improved baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
US5194376A (en) * 1989-02-28 1993-03-16 University Of Ottawa Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
WO1990010230A1 (en) * 1989-02-23 1990-09-07 University Of Ottawa Polypeptide having immunological activity for use as diagnostic reagent and/or vaccine
IL93599A0 (en) * 1989-03-03 1990-12-23 Microgenesys Inc Kit and/or composition for the prevention or treatment of aids
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
EP0421626A1 (en) * 1989-09-19 1991-04-10 Merck & Co. Inc. Vaccine for aids and hepatitis B
US5346989A (en) * 1990-08-22 1994-09-13 Syntello Vaccine Development Kb Peptides for use in induction of T cell activation against HIV-1
WO1993022683A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Measles virus-specific antibody detection using recombinant measles proteins
DE4405810A1 (de) 1994-02-23 1995-08-24 Behringwerke Ag Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung
JP2002512501A (ja) 1996-07-03 2002-04-23 メリアル インコーポレイテッド 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ）
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US6224882B1 (en) 1997-11-07 2001-05-01 Protein Science Corp. Insect cells or fractions as adjuvant for antigens
JP2002030098A (ja) * 2000-07-17 2002-01-29 Institute Of Immunology Co Ltd バキュロウィルスの発芽ウイルスからウイルスエンベロープを回収する方法
US7741437B2 (en) 2002-09-19 2010-06-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services P. ariasi polypeptides, p. perniciosus polypeptides and methods of use
AU2003287267A1 (en) 2002-10-29 2004-05-25 Centro De Pesquisas Goncalo Moniz Lutzomyia longipalpis polypeptides and methods of use
EP2390352A1 (en) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
US7468273B2 (en) 2003-05-01 2008-12-23 Meial Limited Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use
US20050112139A1 (en) * 2003-10-23 2005-05-26 Nmk Research, Llc Immunogenic composition and method of developing a vaccine based on factor H binding sites
ES2417019T3 (es) 2003-11-13 2013-08-05 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Procedimiento de caracterización del virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa
JP2007525217A (ja) 2004-02-19 2007-09-06 ザ ガバナーズ オブ ザ ユニバーシティー オブ アルバータ レプチンプロモーター多型及びその使用
CN101208104B (zh) 2005-04-25 2012-10-31 梅瑞尔有限公司 Nipah病毒疫苗
US20080241184A1 (en) 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
JP2009515529A (ja) 2005-11-14 2009-04-16 メリアル リミテッド 腎不全のための遺伝子療法
US7771995B2 (en) 2005-11-14 2010-08-10 Merial Limited Plasmid encoding human BMP-7
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
GB2440528A (en) * 2006-07-27 2008-02-06 Ist Superiore Sanita Antigen-antibody complexes
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
EP3112866B1 (en) * 2007-02-01 2020-07-29 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Specific activation of a regulatory t cell and its use for treatment of asthma, allergic disease, autoimmune disease, graft rejection and for tolerance induction
BRPI0906946A2 (pt) * 2008-01-09 2015-07-14 Univ Konkuk Ind Coop Corp Vacinas baseadas em baculovírus
ES2760004T3 (es) 2008-05-08 2020-05-12 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Vacuna contra Leishmania utilizando un inmunnógeno salival de mosca de la arena
EP2414386B1 (en) 2009-04-03 2016-01-27 Merial Limited Newcastle disease virus vectored avian vaccines
AR078253A1 (es) 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
WO2012030720A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Merial Limited Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
US20140287931A1 (en) 2011-04-04 2014-09-25 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut - Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
US9216213B2 (en) 2011-04-20 2015-12-22 Merial, Inc. Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile
CA2834288A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
CA2837375C (en) 2011-06-01 2019-07-16 Merial Limited Needle-free administration of prrsv vaccines
CA2832109C (en) 2011-06-10 2021-07-06 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CN103957932B (zh) 2011-07-20 2017-06-23 梅里亚有限公司 包含最优化的猫白血病病毒包膜基因的重组猫白血病病毒疫苗
SI2741740T1 (sl) 2011-08-12 2017-08-31 Merial, Inc. Vakuumsko konzerviranje bioloških proizvodov, zlasti cepiv
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
WO2013033092A2 (en) 2011-09-03 2013-03-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Streptococcus suis pilus antigens
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
WO2013138776A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g
AU2013235423B2 (en) 2012-03-20 2017-03-30 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein C and uses thereof
MX360137B (es) 2013-02-21 2018-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas h5 del virus de la influenza h5n1 para usarse como un medicamento.
EP2968514A1 (en) 2013-03-12 2016-01-20 Merial, Inc. Reverse genetics schmallenberg virus vaccine compositions, and methods of use thereof
EP3125932A1 (en) 2014-04-03 2017-02-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine epidemic diarrhea virus vaccine
EP3215188A1 (en) 2014-11-03 2017-09-13 Merial, Inc. Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
AU2016282772B2 (en) 2015-06-23 2019-09-05 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. PRRSV minor protein-containing recombinant viral vectors and methods of making and use thereof
PL3344289T3 (pl) 2015-08-31 2021-01-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Szczepionki Pestiwirusowe na drżenia wrodzone
AU2016323106A1 (en) 2015-09-16 2018-03-29 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Salmonella Choleraesuis-Salmonella Typhimurium vaccines
NZ751014A (en) 2016-09-20 2023-03-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh New ehv insertion site orf70
AR109538A1 (es) 2016-09-20 2018-12-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vacuna contra la gripe porcina
EP3516064A1 (en) 2016-09-20 2019-07-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH New promoters
CA3036386A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Canine adenovirus vectors
HUE061972T2 (hu) 2016-11-03 2024-02-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vakcina sertés parvovirus és sertés reprodukciós és légzõszervi szindróma vírus ellen, és eljárások ezek elõállítására
UA127859C2 (uk) 2016-11-03 2024-01-31 Бьорінгер Інгельхайм Ветмедіка Гмбх Вакцина проти свинячого парвовірусу
EA201991762A1 (ru) 2017-01-30 2020-01-23 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Вакцины против коронавируса свиней
BR112020000711A2 (pt) 2017-07-12 2020-07-14 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. composições imunogênicas de senecavírus a e métodos destas
MY201967A (en) 2017-09-23 2024-03-27 Boehringer Ingelheim Pharma Paramyxoviridae expression system
WO2019092027A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sapelovirus immunogenic compositions and uses thereof
US11033616B2 (en) 2018-02-23 2021-06-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
AU2019239552A1 (en) 2018-03-19 2020-09-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh EHV insertion site UL43
AU2019239562A1 (en) 2018-03-19 2020-08-13 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh New EHV with inactivated UL18 and/or UL8
EA202092216A1 (ru) 2018-03-26 2021-06-11 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Способ получения иммуногенной композиции
EP3852800A1 (en) 2018-09-20 2021-07-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Intranasal vector vaccine against porcine epidemic diarrhea
CN112867505A (zh) 2018-09-20 2021-05-28 勃林格殷格翰动物保健有限公司 经修饰的pedv刺突蛋白
CN115768784A (zh) 2020-02-06 2023-03-07 勃林格殷格翰动物保健有限公司 用于检测抗弹状病毒抗体的多肽
US20220160864A1 (en) 2020-10-05 2022-05-26 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Fusion protein comprising circoviridae capsid protein, and chimeric virus-like particles composed thereof
AU2021356630A1 (en) 2020-10-05 2023-06-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Fusion protein useful for vaccination against rotavirus
US20240050555A1 (en) 2022-04-05 2024-02-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic composition useful for vaccination against rotavirus

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE78293T1 (de) * 1983-05-27 1992-08-15 Texas A & M Univ Sys Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
GR862412B (en) * 1985-09-25 1987-01-23 Oncogen Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome
ZA867281B (en) * 1985-09-25 1987-05-27 Oncogen Vaccines and immunoassays for acquired immune deficiency syndrome
EP0228036A3 (en) * 1985-12-18 1988-09-07 Microgenesys, Inc. Method for producing selected polypeptides in virally infected insect cells and polypeptides isolated therefrom
EP0272858A3 (en) * 1986-12-15 1989-07-12 Repligen Corporation Recombinant hiv envelope proteins produced in insect cells

Also Published As

Publication number Publication date
LTIP1793A (en) 1995-08-25
IE872748L (en) 1988-04-16
ZA877752B (en) 1989-06-28
LV10654A (lv) 1995-04-20
DD283935A5 (de) 1990-10-31
DK541987D0 (da) 1987-10-16
AU7984287A (en) 1988-04-21
DD284046A5 (de) 1990-10-31
PL268266A1 (en) 1988-08-18
EP0265785A2 (en) 1988-05-04
PL161165B1 (pl) 1993-05-31
EP0265785A3 (en) 1989-11-08
DD269629A5 (de) 1989-07-05
FI874564A0 (fi) 1987-10-16
AU8832491A (en) 1992-04-30
CN87107837A (zh) 1988-12-21
LV10654B (en) 1995-10-20
LTIP1794A (en) 1995-08-25
IL84154A0 (en) 1988-03-31
AR241940A1 (es) 1993-01-29
BR8705535A (pt) 1988-05-24
HUT45095A (en) 1988-05-30
JPS63207397A (ja) 1988-08-26
FI874564A (fi) 1988-04-17
LTIP1792A (en) 1995-08-25
DK541987A (da) 1988-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL161448B1 (pl) Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AIDS6 2 ) Numer zgloszenia,z którego nastapilo wydzielenie:268266 PL
RU2201421C2 (ru) Синтетический пептид hiv (варианты), иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против пептидов hiv, диагностический набор для определения hiv-специфичных антител
Griffiths et al. Hybrid human immunodeficiency virus Gag particles as an antigen carrier system: induction of cytotoxic T-cell and humoral responses by a Gag: V3 fusion
Girard et al. Vaccine-induced protection of chimpanzees against infection by a heterologous human immunodeficiency virus type 1
AU700371B2 (en) Hiv envelope polypeptides
US5580773A (en) Chimeric immunogenic gag-V3 virus-like particles of the human immunodeficiency virus (HIV)
EP0546787A2 (en) Expression of specific immunogens using viral antigens
Luo et al. Expression of gag precursor protein and secretion of virus-like gag particles of HIV-2 from recombinant baculovirus-infected insect cells
WO1991000904A1 (en) Expression of retrovirus gag protein in eukaryotic cells
EP0714444A1 (en) Dampening of an immunodominant epitope of an antigen for use in plant, animal and human vaccines and immunotherapies
EP0449116B2 (en) DNA sequences encoding modified retroviral gag polypeptides and vaccines containing them or aggregates thereof
JP2010172335A (ja) Ｈｉｖ−１のｏグループ（またはサブグループ）レトロウイルス性抗原のヌクレオチド配列
EP0502105A1 (en) Non-replicating recombinant-made retroviral particles used as antiviral agents and immunogens
Luo et al. Chimeric gag-V3 virus-like particles of human immunodeficiency virus induce virus-neutralizing antibodies.
SK18993A3 (en) Vaccine and treatment method of hiv infection
IE60671B1 (en) Monoclonal antiobodies to HIV and related peptides
EP0272858A2 (en) Recombinant HIV envelope proteins produced in insect cells
KR0172970B1 (ko) Aids백신에 유용한 키메릭 단백 및 그의 제조방법
DESGRANGES et al. Identification of novel neutralization-inducing regions of the human T cell lymphotropic virus type I envelope glycoproteins with human HTLV-I-seropositive sera
EP0651806B1 (en) Anti-feline immunodeficiency virus (fiv) vaccines
HUT61323A (en) And treating htlv-1 peptides and antibodies against them for diagnosting htlv-1 infection and for vaccination against it
NZ264190A (en) Recombinant adenovirus vaccines and their use in inducing immunity to an infectious organism particularly hiv-1
EP0693938B1 (en) Peptides for use in vaccination and induction of neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus
JPS6368075A (ja) 後天性免疫不全症候群に関するワクチンおよび免疫検定法
WO1995032000A1 (en) Hiv polyprotein immunogens