PL161448B1

PL161448B1 - Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AIDS6 2 ) Numer zgloszenia,z którego nastapilo wydzielenie:268266 PL

Info

Publication number: PL161448B1
Application number: PL1987293520A
Authority: PL
Priority date: 1986-10-16
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1993-06-30
Also published as: IE872748L; DK541987A; FI874564A; LTIP1792A; LV10654B; JPS63207397A; ZA877752B; DD269629A5; FI874564A0; LV10654A; LTIP1793A; AR241940A1; LTIP1794A; EP0265785A3; CN87107837A; IL84154A0; DK541987D0; DD283935A5; HUT45095A; AU8832491A

Abstract

1 . Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AID S, znamienny tym, ze kontak- tuje sie wspom niane przeciwciala z próbka bialka env wirusa AIDS, wytworzonego na drodze ekspresji z zastosowaniem rekom binow anego wirusa owadziego i wykrywa sie przeciwciala przeciwko wirusowi AIDS przez wykrycie wiazania lub reakcji pomiedzy wspomnianym bial- kiem wirusa AIDS a wspomnianymi przeciwcialami. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania przeciwciał przeciwko .wirusowi AIDS.

Nabyty zespół zaniku odporności (AIDS) jest chorobą wirusową o wielkim znaczeniu w skali światowej. Powodującym go czynnikiem jest retrowirus zwany ludzkim wirusem zaniku odporności (HIV), rozmaicie nazywany: wirus uogólnionego powiększenia węzłów chłonnych (LAV) (Barre-Sinoussi i in., 1983), ludzki wirus białaczki z komórkami T, typu III (HTLV-III) (Popowic i in., 1984) albo wirus związany z AIDS (ARV) (Levy i in., 1984). Strukturę i zorganizowanie genów kilku wirusów AIDS wyjaśniono na podstawie całkowitej sekwencji nukleotydów klonów w klonowaniu molekularnym i bezpośredniej analizy sekwencji białek wirusowych.

Białko otoczki jest najbardziej obiecującym kandydatem w rozwoju badań nad szczepionką przeciw AIDS i badań diagnostycznych (Francis i in., 1985). Przeciwciała przeciw glikoproteinom otoczki są zwykle wykrywane w surowicach pacjentów z AIDS (Robey i in., 1985). Poza tym glikoproteina otoczki przedstawia sobą główny antygen docelowy wirusa AIDS (Barin i in., 1985).

Wytwarzanie skutecznej szczepionki przeciw AIDS zależy od zdolności wytwarzania dużych ilości bezpiecznego antygenu, który stymuluje odporność ochronną gdy zostanie wstrzyknięty człowiekowi. Technologia rekombinacji DNA przedstawia najlepszą alternatywę wytwarzania antygenu z powodu jej odczuwalnej zdolności do wytwarzania dużych ilości bezpiecznych i ekonomicznych immunogenów. Wybór rekombinowanego układu do użycia/bakteryjnego, drożdzowego lub z zastosowaniem innych komórek eukariotycznych będzie związany z wzięciem pod uwagę następujących zagadnień: glikoprotein otoczki HIV jest specyficznie przetwarzana przez glikozylację i rozszczepienie, a więc rekombinowany układ powinien być zdolny do przetwarzania produktu genowego w pożądany sposób; komórki bakteryjne i drożdzowe nie glikozylują skutecznie swoich białek ekspresyjnych podczas gdy komórki ssaków okazują się odpowiednimi wektorami ekspresyjnymi, wykazują one jednak tę niedogodność, że zawierają wiele niepożądanych immunoreaktywnych antygenów i oprócz tego przedstawiają ryzyko w postaci tego, że mogą być siedliskiem czynników ubocznych.

Bakulowirusowy układ ekspresyjny przedstawia sobą atrakcyjną i życiowo ważną sposobność wytwarzania skutecznego immunogenu otoczki HIV. Bakulowirusów można użyć jako wysokoskutecznych eukariotycznych wektorów klonujących i ekspresyjnych do wytwarzania rekombinowanych białek w komórkach owadzich w hodowli. Bakulowirusy spełniają więcej niz tylko nie161 448 zbędne wymagania przy użyciu w postaci eurokariotycznych wektorów klonujących i ekspresyjnych. Bakulowirusy są bezpieczne z powodu swojego wąskiego zakresu wykorzystywanych gospodarzy, który ograniczony jest do stawonogów. Są one zdolne do przyjęcia bardzo dużych ilości egzogennego DNA. Ich układy w postaci hodowli komórkowych są bezpieczne, nietransformowane i skuteczne. Posiadają one bardzo skuteczny promotor poliedyry, aktywniejszy niż jakikolwiek inny znany promotor w komórkach eukariotycznych zakażonych wirusem.

Układ bakulowirusowy oferuje także duże korzyści przy wytwarzaniu polipeptydów do użycia w metodach diagnostycznych. Wielu ludzi i wiele zwierząt ma na ogół przeciwciała, reagujące z bakteryjnymi, drożdżowymi i heterologicznymi antygenami zgodności tkankowej. Obecność tych przeciwciał osłabia pewność metod diagnostycznych z powodu fałszywie dodatnich reakcji z zanieczyszczającymi białkami bakteryjnymi, drożdżowymi i białkami ssaków, znajdowanymi w preparatach wytwarzanych w odpowiednich układach ekspresyjnych. Ludzie (i zwierzęta) najprawdopodobniej nie byli w poprzednim okresie życia narażeni na ekspozycję immunologiczną na antygeny komórek motyli -lub bakulowirusów. Komórki motyli i bakulowirus zastosowany do wytwarzania rekombinowanych białek w tym układzie nie jest więc prawdopodobnie obciążony problemem zanieczyszczających antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała zwykle obecne u ludzi lub zwierząt. Tak więc zanieczyszczenia pochodzące z komórki motyla lub bakulowirusa nie będą prawdopodobnie prowadzić do fałszywie dodatnich reakcji w metodach diagnostycznych z zastosowaniem rekombinowanych antygenów tworzonych w tym układzie.

Informacje na temat poruszonych wyżej problemów można znaleźć w następujących publikacjach: Barin F., McLaneM.F., AllanJ.S i LeeT.H., Science 228:109^^1096 (1985); BarreSinoussi F., Chermann J.C., ReyF., NugeybeM.T., ChamaretS., GruestJ., DauguetC., AxlerBlinC., Vezinet-Brun F., RouzioexC., RozenbaumW. i Montagnier L., Science 220:868-870 (1983); Chakrabarti S., Robert-Curoff M., Wing-Staal F., Galio R.C., MossB., Naturę 320:535-537 (1986); Francis D.P., Petncciam J.C., New Eng. Journal of Med. L^<^^^1590 (1985); Hu Shiu-Lok, Kosowski S.G., Dalrymple J.M., Naturę 320:537-540 (1986); Iddekinge B.J.L., Hooft van, G.E. Smith i M.D. Summers, Virology 131:561 (1983); Kennedy R.C, Henkel R.D., PaulettiD., AllanJ.S., LeeT.H., EssexM., DroesmanG.R., Science 231:1556-1559 (1986); Kieny M.P, Rautmann G., Schmitt D., Dott K., Wain-Hobson S., Alison M., Girard M., Chamaret S., Laurent A., Montagnier L., LecocqJ.P., Research Papers 4: 790-795 (1986); Kozak M., Celi 44: 283-292 (1986); LaskyL.A., Groopman J.E., FennieC.W., BenzP.M., CaponD.H., DwobenkoD.J., NakamuraG.R., NunesW.M., RenzM.E., Berman P.W., Science 228: 209-212 (1986); LevyJ.A., Hoffman A.D., Kramer S.M., Shimabururo J.M. i OskiroL.S., Science 225: 840-842 (1984); McDougal J.S., Kennedy M.S., Sligh J.M., Cort S.P., Mawle A. i Nicholson J.K.A., Science 231: 382-388 (1986); Montagnierl., ClavelF., KrustB., Virology 144: 283-289 (1985); MuesingM.A., SmithD.H., CabradellaC.D. i inni, Naturę 313: 450-458 (1985); PennockG.D., C. Shoemaker i L.K. Miller, Mol. Celi, Biol. 4: 399 (1984); PopowicM., Sarngadharan M.G., ReadE. i Galio R.C., Science 224: 497-500 (1984); RatnerL., Hhaseltine W., PatarcaR. i inni, Naturę 313:277-284(1985); Robey W.G., Safai B., OroszlanS. i inni, Science 228: 595-595 (1985); Smith G.E., M.J. Fraser i M.D. Summers., J. Virol. 46: 584 (1983a); Smith G.E., M.D. Summers i M.J. Fraser. Mol. Celi, Biol. 3: 2156 (1983b); Smith G.E., G.Ju. B.L. Ericson, J. Moschera, H.W.Lahm i M.D. Summers, Proc. Natl., Acad. Science USA (1985, w druku); StarichB.R., Hahn B.H., Shaw G.M., McNeely P.D. Modrow S., Wolf H., Parks E.S., Parks W.P., Josephs S.F., Galio R.C., Wong-Staal F., Celi. 45' 637-648 (1986); Summers i G.Ju. Mol. Celi. Biol. (1985, w druku); TowhinH., StaehelinT. i GordonT., Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350-4353 (1979) oraz Wain-Hobson S , Sonigo P., Donos O., Cole S. i Alizon M. Celi 40: 9-17 (1985).

Sposób wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS według wynalazku polega na tym, ze kontaktuje się wspomniane przeciwciała z próbką białka env wirusa AIDS, wytworzonego na drodze ekspresji z zastosowaniem rekombinowanego wirusa owadziego i wykrywa się przeciwciała przeciwko wirusowi AIDS przez wykrycie wiązania lub reakcji pomiędzy wspomnianym białkiem wirusa AIDS a wspomnianymi przeciwciałami.

W jednym z wykonań sposobu według wynalazku stosuje się bakulowirus (ang. baculovirus) stanowiący wirus jądrowej poliedrozy Autographa californica (AcMNPY). Sekwencja promoto4

161 448 rowa użyta do ekspresji jest sekwencją genu poliedryny (occ) pochodzącą z tego wirusa. AcMNPV i preparaty wyjściowe wirusa rekombinowanego utrzymuje się w komórkach Spodoptera frugiperda (ang. fali armyworm). Rekombinant konstruuje się tak, że gen Pn ulega delecji, co nadaje rekombinowanemu wirusowi cechę occ”. Pozwala to na łatwą identyfikację wirusów rekombinowanych po prostu na podstawie morfologii łysinek. Wirusa rekombinowanego, gdy. się go wyizoluje, można użyć do zakażenia każdej permisyjnej lub półpermisyjnej populacji komórek utrzymywanej jako linia hodowlana lub jako część całego owada.

Klonowanie i ekspresja sekwencji kodującej obce białko w wektorze bakulowirusowym wymaga, aby sekwencja kodująca była ustawiona w szeregu z promotorem poliedryny i sekwencjami w górę, a z drugiej strony ze skróconymi sekwencjami kodującymi poliedrynę tak, że homologiczna rekombinacja z genomem bakulowirusa daje w wyniku przeniesienie obcej sekwencji kodującej uszeregowanej z promotorem poliedryny i nieaktywnym genem poliedryny. Zgodnie z tym, zaprojektowano do użycia w konstrukcji genu env AIDS różne wektory insercyjne. Każdy wektor insercyjny opisany w poniższej części niniejszego opisu był tak zaprojektowany, aby dostarczał translacyjnego kodonu inicjacyjnego ATG. Insercja obcych sekwencji do tych wektorów musi być tak przeprowadzona, aby faza translacyjna ustalana kodonem inicjacyjnym była utrzymywana prawidłowo wzdłuż obcych sekwencji.

Szczegóły dotyczące wprowadzania sposobu według wynalazku do praktyki zamieszczone są poniżej w odniesieniu do towarzyszących rysunków.

Figura 1 przedstawia sekwencje nukleotydów genu otoczki (o pełnej długości) izolatu LAV-la. Sekwencja nukleotydów jest przedstawiona łącznie z przewidywaną sekwencją aminokwasów. Informacje dotyczące sekwencji otrzymano z GENBANK. Numeracja nukleotydów postępuje od pierwszego nukleotydu przypuszczalnego kodonu incjacyjnego ATG. Aminokwasy numeruje się od kodonu inicjacyjnego ATG. Regiony odpowiadające sygnałowemu peptydowi zewnątrzkomórkowej glikoproteiny (gpl20) i transbłonowej glikoproteiny (gp41) są przedstawione razem z proponowanymi peptydowymi miejscami rozszczepienia i związanymi z asparaginą miejscami glikozylacji. Odnośne miejsca enzymów restrykcyjnych, są one wyliczone poniżej sekwencji nukleotydów.

Figura 2 obejmująca fig. 2A, fig. 2B, i fig. 2C przedstawia struktury rekombinowanych plazmidów pl614 i pl774. Plazmid pl774 zawiera całkowitą sekwencję kodującą genu env LAV. Plazmid skonstruowano w 2 stadiach: a) fragment KpnI genu env LAV o 2700 par zasadach (bp) wyodrębniono z p 1614 i klonowano do miejsca KpnI pUC18, tak, że miejsce Smal pUC18, było w górę od sekwencji genu env, b) syntetyczny oligomer o 121 par zasad ligowano do miejsca Smal metodą łączenia tępych końców. Strzałki wskazują polarność sekwencji kodujących. Przedstawiono odpowiednie miejsca endonukleaz restrykcyjnych. Sekwencję nukleotydów syntetycznych oligomerów otrzymanych dla celów wynalazku skonstruowano za pomocą Pharmacia Gene Assembler w oparciu o przewidywaną sekwencję aminokwasów regionu LAV z zastosowaniem korzystnego użycia kodonów genu poliedryny.

Figura 3 obejmująca fig. 3A, fig. 3B i fig. 3C przedstawia strukturę wektorów insercyjnych. Wektory insercyjne MGS-3, MGS-3 + 2, MGS-4 i MGS-5 pokazano z odpowiednimi miejscami endonukleaz restrykcyjnych i sekwencją nukleotydów. Polarność sekwencji promotorowych od lewej do prawej.

Figura 4 przedstawia przewidywaną strukturę drugorzędową i modele hydrofilowości prekursora gpl6O na podstawie analizy komputerowej z użyciem programu Chowa i Fastmana [Biochemistry, 13, 222 (1974)].

Figura 5 przedstawia podejście do zagadnienia konstrukcji wektorów rekombinowanych. Plazmidy pokazane na niej są opisane lub oznaczone literą (np. A), która odpowiada konstrukcjom opisanym w tabelach 1 i 2

Wektor insercyjny MGS-1 skonstruowano z fragmentu restrykcyjnego EcoRI-I klonu DNA wyodrębnionego z izolatu AcMNPV oczyszczonego techniką łysinek. Wektor insercyjny MGS-1 składa się z następujących części strukturalnych (patrz fig. 3) sekwencja o 4000 par zasad w górę od kodonu inicjacyjnego ATG genu poliedryny; polilinker wprowadzony na drodze ukierunkowanej mutagenezy, który zawiera kodon inicjacyjny ATG i miejsca restrykcyjne Smal i KpnI; sekwencja o

161 448 5

1700 par zasad rozciągająca się od miejsca restrykcyjnego KpnI (wewnętrznego w stosunku do genu poliedryny) do końcowego miejsca restrykcyjnego EcoRI klonu EcoRI-I.

Wektor insercyjny MGS-3 jest taki sam jak MGS-1, z tą różnicą, że polilinker składa się z miejsc restrykcyjnych Smal, KpnI, BglH i segmentu uniwersalnego kodonu stop.

Wektor insercyjny MGS-2 + 3 jest taki sam jak MGS-3, z tą różnicą, że zawiera on dwie dodatkowe reszty cytozyny w pozycji +3 MGS-3 i ma mniej o jedną resztę guanozyny w pozycji +4 MGS-3. Końcowym wynikiem jest przesunięcie w stosunku do MGS-3 fazy kodonowej o jeden nukleotyd.

Wektor insercyjny MGS-4 ma taki sam model strukturalny jak MGS-3, z tą różnicą, że skonstruowano go z syntetycznym polilinkerem, który zawiera sekwencje kodujące pierwszych 10 aminokwasów N-końcowej części genu poliedryny, a następnie miejsca restrykcyjne dla Smal, KpnI, BgllI i segment uniwersalnego kodonu stop. Wektor ten skonstruowano w oparciu o obserwację, że można osiągnąć podwyższony poziom ekspresji, jeśli kodony pierwszych 14 aminokwasów z N-końca genu poliedryny są sprzężone z N-końcem obcego genu (Smith i in., 1983).

Wektor insercyjny MGS-5 ma taki sam model strukturalny jak MGS-3, z tą różnicą, że skonstruowano go z syntetycznym polilinkerem, który zawiera sekwencje kodujące odszczepialny peptyd sygnałowy IL-2, a następnie miejsca restrykcyjne dla EcoRI, KpnI, BgUI i segment uniwersalnego kodonu stop. Wektora tego używa się do zapewnienia wewnętrznych sekwencji env HIV z sekwencją peptydu sygnałowego, co do której wykazano, że jest skutecznie rozpoznawana i usuwana w komórkach owadów (Smith i in., 1985).

Przykład . Zastosowano rekombinowany plazmid oznaczony NA-2, składający się z segmentu o 21,8 kilozasady całkowitego prowirusa AIDS wprowadzonego do pUC18. Klon ten był, jak donoszono, zakaźny, ponieważ mógł wytworzyć wirusa po transfekcji pewnych komórek ludzkich. Kompletne sekwencje genu otoczki NA-2 otrzymano ze szczepu LAV HIV (BarreSinoussi i in., 1983).

Gen otoczki LAV zawiera otwartą fazę odczytu, która koduje 861 aminokwasów zaczynając kodonem Met (Wain-Hobson i in., 1985). Szczep HTLV-IIIBHIO zawiera 856 kodonów (Starich i in., 1986).

Sekwencja peptydu sygnałowego zawiera 30 aminokwasów (2 z nich różnią się od aminokwasów z BHIO); część pozakomórkowa składa się z 486 aminokwasów (14 z nich różni się od aminokwasów z BHIO); a region transbłonowy składa się z 345 aminokwasów (5 z nich różni się od aminokwasów z BHIO). Fig. 1 przedstawia sekwencje: nukleotydów i wydedukowaną aminokwasów genu env LAV użytego w tych badaniach. Reszty aminokwasowe numeruje się zaczynając od przypuszczalnego sygnału inicjacyjnego Met. Reszty aminokwasowe przytaczane w niniejszym opisie odpowiadają numerom pokazanym na fig. 1.

Zdecydowano przeprowadzić ekspresję różnych domen genu env HIV w uzupełnieniu do całkowitego polipeptydu gpl60. Oparto tą decyzję na kilku faktach, w tym na strukturze białka i heterogenności izolatów retrowirusa AIDS, o której donoszono (Benn i in., 1985, Hahn i in., 1985). Zastosowano program komputerowy, który przewiduje drugorzędową strukturę białek z nałożonymi wartościami hydrofilowości (Chow i Fastman, 1984). Analiza przedstawiona na fig. 4 ujawniła kilka domen hydrofilowych z obrotami β. Wykazano, ze te domeny są połączone z antygenowymi epitopami i strukturalnym umiejscowieniem (Westhoff i in., 1984). W oparciu o te wyniki i obecność dogodnych miejsc restrykcyjnych zdecydowano przeprowadzić ekspresję C-końcowych skróconych form białka otoczki pokazanego na fig. 4. Korzyścią wynikającą z tych konstrukcji jest otrzymanie progresywnych delecji zaczynających się z C-końcową domeną hydrofobową. Oprócz tego zdecydowano tez przeprowadzić ekspresję regionu objętego przez sekwencje kodujące gp41. Co najmniej dwa (2) immunodominantowe epitopy zawarte są w regionach mających ulec ekspresji. Dla tych konstrukcji zaprojektowano wektor zawierający rozszczepialny sygnał dla IL-2. Ostatnio wykazano, ze peptyd sygnałowy powodował towarzyszenie ekspresji genu IL-2, z rekombinowanego genomu bakulowirusowego, prawidłowego przetwarzania komórkowego w zakażonych komórkach (Smith i in., 1985).

Strategię klonowania obmyśloną dla ekspresji sekwencji env HIV przedstawiono na fig. 5.

Gen otoczki początkowo wyizolowano z NA-2, jako fragment restrykcyjny EcoRI/SacI o 3846 par zasad i klonowano do miejsca restrykcyjnego EcoRI/SacI pUC19. Powstały plazmid

161 448 oznaczono p708. Gen otoczki następnie izolowano ponownie jako fragment restrykcyjny KpnI o 2800 par zasad i klonowano do miejsca restrykcyjnego KpnI pUC18. Pozostały klon oznaczono p 1614 (patrz fig. 2A). Ten fragment restrykcyjny KpnI zawierał nieco skróconą część genu otoczki, tak, że utracono sekwencję o 121 par zasad odpowiadającą N-końcowi. Tę utraconą część, która zawierała sekwencje peptydu sygnałowego, zastąpiono w genie przez insercję dwuniciowego syntetycznego oligomeru, zaprojektowanego na podstawie sekwencji aminokwasów LAV z użyciem korzystnych kodonów genu poliedryny.

W celu ułatwienia dalszych manipulacji, nową sekwencję restrykcyjną Smal wprowadzono jednocześnie w miejsce kodonu inicjacyjnego ATG. Kodon inicjacyjny ATG powinien być zapewniony przez wektor insercyjny. Powstały plazmid oznaczono pl774 i przedstawiono na fig. 2B.

Fragmenty restrykcyjne z pl774 zawierające sekwencje kodonowe różnych domen otoczki AIDS klonowano do wektorów MGS tak, że kodon inicjacyjny ATG wektora insercyjnego był w fazie z kodonami genu otoczki. Przeprowadzono następujące konstrukcje (patrz fig. 5).

A. gplóO o pełnej długości klonowania jako fragment z trawienia Smal i częściowego KpnI do MGS-3 w jego miejscu Smal. Klon ten zawierał wszystkie kodujące sekwencje gp 160 z wykorzystaniem jej autentycznego kodonu terminacyjnego translacji.

Al .gpl 6O o pełnej długości klonowania jako fragment z trawienia Smal i częściowego KpnI do MGS-4 w jego miejscu Smal/KpnI. Klon ten zawiera całość sekwencji kodujących gpl60 z wykorzystaniem jej autentycznego kodonu terminacyjnego translacji.

B. Skrócona gpl60, klonowana jako fragment restrykcyjny Smal/BamHI w miejscu restrykcyjnym Smal/Bglll MGS-3. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-757 pgl60 z wykorzystaniem kodonu teiminacyjnego zapewnionego przez wektor MGS-3.

Bl. Skrócona gpl60 jako fragment restrykcyjny Smal/BamHI w miejscu restrykcyjnym Smal/Bgl/II. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-757 gpl60 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego zapewnionego przez wektor MGS-4.

C. Skrócona gpl60 klonowana jako fragment Smal/Hindlll, uzupełniony w Hindlll, w miejscu Smal MGS-3. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-645 gpl60 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego zapewnionego przez wektor MGS-3.

F. Skrócona gpl20, klonowana jako fragment restrykcyjny Smal/HgllI do MGS-3 w jego miejscu Smal/Bglll. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-279 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego dostarczonego przez wektor MGS-3.

G. Skrócona gpl20, klonowana jako fragment restrykcyjny Smal/Dral do MGS-3 w jego miejscu Smal. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 1-129 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego dostarczonego przez wektor MGS-3.

H. Powyższa konstrukcja Smal/Dral, do której wprowadzono sekwencje kodujące HBsAg, jako fragment BamHI, do miejsca Bglll umiejscowionego na wektorze w dół. Klon ten zawiera sekwencje kodujące pierwszych 129 N-końcowych aminokwasów gpl20, a następnie, w fazie sekwencje kodujące HBsAg.

I. gp41 klonowana jako fragment restrykcyjny Bglll do MG S-3 w jego miejscu Bglll. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy od 472 do C-końca gpl60.

J. gp41 klonowana jako fragment Smal/KpnI wyodrębniony z P3156 i klonowany do wektora MGS-5 przy wyciętym miejscu EcoRI i miejscu KpnI. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy od 473 do C-końca gpl60.

K. Skrócona gp41, klonowana jako fragment Bglll/BamHI do MGS-3 do jego miejsca Bglll. Klon ten zawiera sekwencje kodujące aminokwasy 472-757 gpl60 z wykorzystaniem kodonu terminacyjnego dostarczonego przez wektor MGS-3.

L Skrócona gp41, klonowana jako fragment KpnI/BamHI wyodrębniony z p3166 i klonowany do pMGS-5 w jego miejscu KpnI/BamHI. Klon ten zawiera sekwencje kodujące peptyd sygnałowy kodujący aminokwasy 472-757 gpl 60.

Rekombinowane plazmidy z genem env HIV wytrącono fosforanem wapnia z AcMNPV i dodano do nich zakażonych komórek Spodoptera frugiperda. Następnie chimeryczne geny wprowadzono do genomu AcMNPV na drodze rekombinacji homologicznej. Rekombinowane wirusy zidentyfikowano na podstawie morfologii łysinek occ”. Łysinki te wykazują nadający się do identyfikacji efekt cytopatyczny, lecz nie wykazują okluzji jądrowych Przeprowadzono dwa

161 448 dodatkowe następujące po sobie procesy oczyszczania techniką łysinek w celu otrzymania rekombinowanego wirusa. Rekombinowany DNA wirusowy analizowano pod względem specyficznej co do miejsca insercji sekwencji env HIV przez porównanie jego charakterystyki restrykcyjnej i hybrydyzacyjnej z wirusowym DNA typu dzikiego.

Ekspresja sekwencji env HIV z rekombinowanych wirusów w komórkach owadzich powinna doprowadzić do syntezy pierwotnego produktu translacji w postaci preprobiałka zawierającego wszystkie aminokwasy kodowane od nieinicjacyjnego kodonu ATG wektora ekspresyjnego w dół od promotora poliedryny. Ten pierwotny produkt powinien składać się z aminokwasów dobieranych w wyniku translacji kodonów dostarczanych przez rekombinowany wektor. I tak np., pierwotny produkt translacji konstrukcji A powinien powstać w rezultacie odczytania na N-końcu: Met-Pro-Gly-Arg-Val, kodony Mot-Pro-Gly zostały zapewnione w rezultacie strategii klonowania.

Dwa potencjalne miejsca przetwarzania do rozszczepienia prekursorowej glikoproteiny env doprowadziłyby najpierw do usunięcia 30 reszt aminokwasowych peptydu sygnałowego przy N-końcu, a następnie do utowrzenia dużego transbłonowego białka zawierającego 345 aminokwasów i części zewnątrzkomórkowej z 486 aminokwasów. Na ogół uważa się, że rozpoznanie i odszczepienie peptydu sygnałowego jest wymagane do skutecznego przetwarzania komórkowego.

W celu określenia ekspresji sekwencji genu env HIV z rekombinantowych bakulowirusów zakażono hodowle komórek owadzich każdym z różnych wirusów rekombinantowych w obecności ³5S-metioniny, ³5S-cystyny lub 3H-mannozy w późnych okresach zakażenia. Znakowane ekstrakty komórkowe przedstawiono poddając je elektroforezie w żelu SDS-poliakryloamidowym (PAGE) i autoradiografii.

Użyto trzech typów surowicy do oceny autentyczności rekombinowanego białka wytworzonego w komórkach owadzich zakażonych bakulowirusami rekombinantowymi HIV.

1. HIV-dodatnie surowice ludzkie dostarczane przez Center for Disease Control (CDC, Atlanta, Georgia) jako HIV-dodatni wzorzec porównawczy.

2. HIV-ujemne surowice ludzkie dostarczane przez CDC jako HIV-ujemny wzorzec porównawczy.

3. Przeciwciało poliklonalne, którego powstawanie wywołano u kóz, przeciw oczyszczonemu białku gpl20 otrzymanemu z oczyszczonego, zakaźnego wirusa HTLV-III. Wyniki zestawiono w poniższych tabelach 1 i 2.

Tabela 1

	Izolator nr	Opis	HIV-ujemna	Surowica HIV-dodatnia	gpl20-dodatnia
Kontrola
nie zakażone komórki Sf		—	—	—
zakażone (wt) komórki Sf	—	—	—
	Rekombinant
A	2863	całkowita gpl60 1-861	—	+	+
Al	3715		nd	nd	nd
B	3046	skrócona gpl6O 1-757	—	+	+
BI	3540		nd	nd	nd
C	3774	skrócona gpl60 1-645	nd	nd	nd
D	4646	gpl20, 1-516	nd	nd	nd
E	2040	skrócona gpl20 1-472	—	+	+
F	2165	skrócona gpl20 1-279	—	—	+/—
G	2196	skrócona gpl20 1-129	—	—	—
H	3076	aminokwasy 1-129 sprzężone z HBsAg	nd	nd	nd
I	3156	gp41.472-861	—	+	+
J	4585	sygnałIL-2/gp41	nd	nd	nd
K	3166	skrócona gp41 472-757	—	+	+
L		sygnaaIL-2/skrocona gp41	—	—	—

W powyższej tabeli 1 użyto następującego oznaczenia nd = me oznaczono

161 448

Tabela 2

Zestawienie przewidywanych i zaobserwowanych wyników dotyczących izolatów

Konstrukcja/izolat	Aminokwasy otoczki	^Wielkość przewi^dywana ²	Wielkość zaobserwowana ³
	Nr
nie glikozylowana	glikozylowana
A	2863	całkowita gpl60 1-861	93,200	160,000	160,000
			56,000	120,000	120,000
			37,00	41,000	41,000
Al	3715		jak w A	jak w A	jak w A
B	3046	skrócona gplćO 1-757	82,000	150,000	150,000
			56,000	120,000	120,000
			26,000	30,000	30,000
Bl	3540		jak w B	jak w B	jak w B
C	3774	skrócona gpl60 1-645	69,000	130,000
			56,000	120,000
			14,000	18,000
D	4646	gpl20, 1516	56,000	120,000	ND
E	2040	skrócona gpl20 1-472	51,000	110,000	110,000
					90,000
F	2165	skrócona gpl20 1-279	30,000	60,000	60,000
G	2196	skrócona gpl20 1-129	12,000	15,000	15,000
H	3076	aminokwasy 1-129 sprzężone z HB sAG	35,000	40,000
I	3156	gp41,472-861	42,000	46,000
J	4585	sygnałlL-2/gp41	42,000	46,000	N D
K	3166	skrócona gp4I 47-757	30,000	33,000	ND
L		sygnał lL-2/ skrócona gp41	30,000	33,000	N.D

W powyższej tabeli 2 użyto następujących oznaczeń.

¹ Reszty aminokwasów przewidywanych jako obecne w preprodukcie genowym, nie przetworzonym, określone na podstawie sekwencji nukleotydów ² Oznaczona na ^po^dstawie reszt amino^kwas<5w w ^postaciac^h a^ktua^ln^yc^h i ^przewi^dywan^yc^{h p}o ^przetworzeniu ³ Dotyczy gl^ównyc^h immunorea^kt^ywn^yc^{h p}oli^pe^pt^ydów ND - nie oznaczono

Rekombinowanych białek gpl6O użyto z dobrym wynikiem w typowych testach diagnostycznych, takich jak ELISA i radioimmunoprecypitacja w uzupełnieniu do blottingu metodą Westetna.

Rekombinowane białka otoczki HIV wytwarza się w komórkach S. frugiperda w ciągu 4-5 dni po zakażeniu HIV-rekombinantowym wirusem AcNPV. Większość białek powstających w wyniku ekspresji białek pozostaje w połączeniu z zakażonymi komórkami. Ponieważ wszystkie produkty genu otoczki HIV opisane w niniejszym opisie mają podobne właściwości, to znaczy w pierwszym rzędzie pozostają w połączeniu z komórkami i są glikoproteinami, można użyć jednej metody oczyszczania dla wszystkich produktów genu otoczki HIV opisanych w niniejszym zgłoszeniu patentowym, lub innych podobnych konstrukcji. Następujący test jest przykładem sposobu oczyszczania rekombinowanego białka gpl60 tworzonego przy zastosowaniu wektora ekspresyjnego Ac3046.

Komórki S frugiperda zakaża się rekombinowanym Ac3046. Po 4-5 dniach od zakażenia zbiera się komórki i przemywa, uwalniając od podłoża do hodowli komórek. Najpierw komórki rozdziela się na frakcje błonowe, jądrowe i cytoplazmatyczne znanymi metodami. Frakcją glikoproteinową zawierającą białko gpl6O solubilizuje się i glikoproteiny oczyszcza stosując chromatografię powinowactwa do lektyny z soczewicy i używając zwykłych metod. Frakcja glikoproteinowa zawiera białko gplóO i w tym stadium białko gpł6O stanowi 25-50% całości frakcji glikoproteinowej, jak można sądzić na podstawie analizy w żelu SDS-poliakryloamidowym. W celu dalszego oczyszczania gplóO, frakcję glikoproteinową przeprowadza się przez kolumnę do chromatografii cieczowej z sitem molekularnym. Białko gpl6O jest eluowane z kolumny jako frakcja o wysokiej masie cząsteczkowej i białko gplóO stanowi w przybliżeniu 90% białka całkowitego we frakcji o wysokiej masie cząsteczkowej.

161 448

W pewnym stopniu interesujący jest, w odniesieniu do niniejszego wynalazku, artykuł zatytułowany „AIDS Virus Env Protein Expressed from a Recombinant Vaccinia Virus“ M.P. Kien/ego i in., Bio/Technology, tom 4, wrzesień, 1986, str. 790-795. Publikacja ta ujawnia, że sekwencję kodującą env, odnoszącą się do białka env LAV, wprowadzono do wektora stanowiącego wirus krowianki. Powstający żywy wirus rekombinowany VVZGeLAV określa następnie wytwarzanie białka env w zakażonych komórkach ssaków. To rekombinowane białko reaguje z surowicami pacjentów z AIDS i okazuje się, że jest ono glikozylowane i przetwarzane w taki sam sposób, jak w przypadku autentycznego env retrowirusa LAV. Dalej, inokulacja myszy WTTGeLAV wywołuje powstanie immunosurowic o wysokim mianie, rozpoznających determinanty krowianki, lecz przeciwciało rozpoznające białka env LAV ma niskie miano. Komórki zakażone rekombinowanym wirusem szybko uwalniają przetworzoną postać białka env do podłoża hodowli. Tym niemniej to podejście do zagadnienia wytwarzania i wykorzystywania białka env jako takiego, tak jak w szczepionce przeznaczonej do wywołania odpowiedzi immunologicznej na wirus LAV lub HIV, nie jest całkowicie zadowalające, zwłaszcza z powodu użycia wirusa krowianki jako wektora.

Interesujący jest też, w odniesieniu do niniejszego wynalazku, artykuł zatytułowany „Production of Humań Beta Interferon in Inseot Cells Infected with Baculovirus Expresion Vector“ G.E. Smitha i in., Molecular and Cellular Biology, tom 3, nr 12, str. 183-192, grudzień 1983, oraz artykuł zatytułowany „Strong and Regulated Expression of Escherichia coli Beta-Galactosidase in Inseet Cells with a Baculovirus Vector“ G.D. Pennocka i in., Molecular and Cellular Biology, tom 4, nr 3, str. 399-406, marzec, 1984. Także interesujące jest równoczesne, współprzeniesione zgłoszenie patentowe nr kolejny 810938, złożone 18 grudnia 1985 r. Europejska publikacja patentowa nr 0 127 839 opublikowana 12 grudnia 1984 r. i europejska publikacja patentowa nrO 155474 opublikowana 25 września 1985 są również interesujące w odniesieniu do niniejszego wynalazku. Ujawnienia z tych artykułów, publikacji patentowych i zgłoszenia patentowego są włączone do niniejszego opisu i stanowią część niniejszego ujawnienia.

Ponieważ ludzki nabyty zespół zaniku odporności (AIDS) jest chorobą epidemiczną w Stanach Zjednoczonych Ameryki, Afryce centralnej, Europie i innych obszarach świata, wynalazek ma wielkie znaczenie. Jak wskazano w niniejszym opisie powyżej, czynnikiem powodującym chorobę AIDS, jest retrowirus nazywany ludzkim wirusem zaniku odporności (HIV), był on również nazywany rozmaicie: wirus uogólnionego powiększenia węzłów chłonnych (LAV), ludzki wirus białaczki z komórkami T, typu III (HTLV-III) lub wirus związany z AIDS (ARV). Strukturę i zorganizowanie genowe kilku wirusów AIDS wyjaśniono na podstawie całkowitej sekwencji nukleotydów klonów w klonowaniu molekularnym i bezpośredniej analizy sekwencji białek wirusowych. Gen otoczki HIV (env) koduje glikoproteinę o masie cząsteczkowej 160000, która w niniejszym opisie przytaczana jest jako gpl60. W komórkach zakażonych wirusem prekursor gpl60 jest rozszczepiany przy konserwatywnej sekwencji zasadowych aminokwasów z utworzeniem N-końcowej glikoproteiny gpl20 i mniejszego C-końcowego białka gp41. Glikoproteiny HIV gpl60, gpl20 i gp41, zawierają, odpowiednio, 833, 488 i 345 aminokwasów.

Dojrzała gp 120 jest połączona z otoczką wirusa i jest uważana za zewnętrzną, podczas gdy gp41 ma dwa długie ciągi reszt hydroforowych i jeden lub oba z nich mogą przenikać w poprzek otoczkę wirusa. Prekursor gp 160, dojrzałą gp 120 i białka gp41 wykrywa się lmmunosurowicami w większości osobników po ekspozycji. Wykazano także, iż białko gp 120 wiąże się z cząsteczką T4 na powierzchni komórki będącej limfocytem induktorowym/pomocniczym T i w ten sposób białko gpl60 HIV jest w stanie indukować tworzenie się syncytium z udziałem komórek, które przeprowadzają ekspresję białka receptorowego T4. Wiadomo również, ze 104 aminokwasy karboksykońcowe gpl60 nie są wymagane do fuzji limfocytów T4+ T-.

Glikoproteina otoczki wirusa AIDS gpl60 HIV stosowana w sposobie wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS według wynalazku powstaje w rezultacie ekspresji genu env AIDS, który klonowano z zakaźnego izolatu HIV Gen env HIV użyty do ekspresji koduje tylko z wykorzystaniem sekwencji znajdowanych w natywnym genie env HIV. Wirus env HIV wprowadzono do rekombinowanego bakulowirusa tak, ze ekspresja dawała w rezultacie dojrzałe białko, które nie zawierało zmienionych lub dodatkowych aminokwasów. Z szeregu wytworzonych rekombinantów, jeden zawiera całkowity gen env HIV, a inny jest całkowity, z wyjątkiem małej delecji sekwencji o około 100 aminokwasach przy C-końcu gp!60. Delecję tę przeprowadzono w

161 448 celu dopomożenia w stabilizacji utworzonego w wyniku ekpresji rekombinowanego białka gpl60 z nieusunięciem dwóch hydrofobowych domen obecnych w gp41.

gp 160 HIV wytworzono sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu w układzie ekspresyjnym komórek owadzich i jest ona, jak również sugerowano w powyższej części niniejszego opisu, wolna od zanieczyszczających białek komórek ssaków. Ekspresję i oczyszczanie białka gpl60 przeprowadzono w warunkach pozwalających na utrzymanie struktury natywnego białka i jego aktywności biologicznej. Za pomocą immunoprecypitacji, blottingu metodą Westerna i techniki ELISA wykazano, że utworzone w rezultacie ekspresji białko env HIV przejawia w wysokim stopniu reaktywność z surowicami pacjentów z AIDS.

Białko gpl60 HIV stosowane w sposobie według wynalazku wytwarzano w różnych ilościach, czystości i postaciach, takich jak w jałowym buforze wodnym w stężeniu około 100pg białka otoczki na ml przy czystości wyższej od 50%, jak to określono za pomocą analizy FPLC w SDS-poliakryloamidzie. Stwierdzono, że białko gpl60 HIV jest stabilne w ciągu co najmniej sześciu tygodni w temperaturze 4°C. Zapewniono to białko w ilościach lub objętościach do pojedynczego użycia i jest ono przechowywane z dobrym skutkiem w temperaturze -70°C. Pożądane jest, aby unikać powtarzania cykli zamrażania i rozmrażania.

Rozcieńczenia można dokonać z użyciem roztworów zawierających odpowiednie białka lub detergenty, aby zapobiec utracie białka i aktywności biologicznej. Do odpowiednich rozcieńczalników należy 0,1% bydlęca albumina surowicza (BSA) lub jej ekwiwalent, 0,1% surowica w wodzie jałowej lub podłożu hodowli i 0,1% siarczan dodecylowo-sodowy lub inny odpowiedni detergent w wodzie lub buforze. Białko do wykrywania przeciwciał sposobem według wynalazku, gpl60 HIV, jest stosowane w użyteczny sposób, jak wykazano w powyższej części niniejszego opisu, konfekcjonowano je w porcje różniące się wielkością zależnie od potrzeby i przewidywanego zastosowania, jaknp. opakowania zawierające 25pg, 50//glub 100//g białka. Białkojest użyteczne w badaniach in vitro i innych poszukiwaniach, w zależności od rozmaitych aspektów badań nad AIDS, obejmujących rozwijanie sposobów otrzymywania szczepionki, blotting metodą Westerna, technikę ELISA, wiązanie się z receptorami, immunoprecypitację, wytwarzanie immunosurowic, tworzenie syncytium i inne zastosowania, w tym badania fizyczne, oraz jako wzorzec porównawczy.

Blotting metodą Westerna stanowi jedną z najbardziej swoistych i czułych metod, dostępnych przy wykrywaniu przeciwciał przeciw AIDS i często stosuje się ją w rozmaitych aspektach badań nad AIDS. Jak wzmiankowo w powyższej części niniejszego opisu, prekursor gpl60, dojrzała gpl20 i białka gp41, wykrywane są przez immunosurowice osobników seropozytywnych pod względem AIDS. W sposobie według wynalazku, białko otoczki wirusa AIDS lub env stosuje się na odpowiednim podłożu, takim jak podłoże ceramiczne, szklane, płytki polistyrenowe, studzienki lub błony, takie jak paski membrany nitrocelulozowej, w celu wykorzystania do wykrywania przeciwciał przeciw AIDS.

W szczególności, według wynalazku, paski membrany nitrocelulozowej impregnuje się elektroforetycznie wydzielonym rekombinowanym białkiem otoczki AIDS, gpl60 HIV, do użycia w blottingu metodą Westerna, czyli jako pasków do blottingu. Ponieważ gp env HIV stosowana w sposobie według wynalazku powstaje w układzie ekspresyjnym komórek owadzich, jest ona wolna od zanieczyszczeń białkami komórek ssaków.

Stwierdzono, ze materiał ten, zdeponowany na paskach nitrocelulozowych do użycia jako paski do blottingu metodą Westerna, jest w wysokim stopniu reaktywny z surowicami pacjentów z AIDS. gpl60 HIV zdeponowano na paskach nitrocelulozowych badano, i to z dobrymi rezultatami, z udziałem ludzkich dodatnich surowic AIDS, w rozcieńczeniach 1/100 do 1/10000. Swoiście związane przeciwciało wykryć można albo odczynnikami związanymi z enzymami, takimi jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza, skonjugowanymi drugimi przeciwciałami, albo swoistymi przeciw-przeciwciałami, lub wreszcie białkiem A znakowanym jodem radioaktywnym. Procesy immunologiczne stosowane w blottingu metodą Westerna, w których wykorzystuje się sposób według wynalazku, to jest zastosowanie jako nośników białka env HIV impregnowanych pasków do blottingnu do użycia w blottingu metodą Westerna, są dobrze znane.

Paski z gpl60 HIV lub nośniki stosuje się w sposobie według wynalazku w płytkach do jednorazowego użycia z odpowiednią ilością pasków, np. 8, w ośmiu oddzielnych studzienkach.

161 448

Wszystkie procesy inkubacji można przeprowadzić w płytce, która jest zaopatrzona w pokrywkę, tak, że płytki można użyć jako dogodnego pojemnika do przechowywania rozwiniętych naniesień metodą Westerna lub wyników detekcji. Każdy taki pasek stosowany według wynalazku, jest impregnowany rekombinowanym białkiem gpl60 otoczki HIV, rozdzielonym za pomocą elektroforezy w 10% żelu SDS- poliakryloamidowym, a następnie przeniesionym elektroforetycznie na nitrocelulozowe membrany, albo paski, albo nośniki. Wytworzone tak produkty są użyteczne przy wykrywaniu in vitro przeciwciał przeciw otoczce AIDS, do badań na zwierzętach, albo do badań z użyciem hodowli komórkowych lub tkankowych, w zależności od różnych aspektów poszukiwań związanych z AIDS, w tym blottingu metodą Westerna w celu wykrycia przeciwciał przeciw AIDS, do kontroli jakości, screeningu banku krwi i rozpoznawania AIDS. Stwierdzono, że nitrocelulozowe nośniki membranowe są trwałe w ciągu co najmniej 6 tygodni w temperaturze pokojowej i prawidłowo przechowuje się je, tak jak w płytkach, w miejscu zimnym i suchym.

Płytki ELISA gpl60 HIV do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS stanowią płytki do jednorazowego użytku z odpowiednią ilością, taką jak 96, oddzielnych studzienek. Wszystkie procesy inkubacji prowadzi się w płytkach. Do każdej studzienki dodaje się w odpowiedniej ilości gpl60 HIV, tak jak np. ΙΟΟμΙ oczyszczonej gpl60 HIV w stężeniu 1 /^ggp^i^O HIV na ml. Dopuszcza się do przylgnięcia białka gpl60 HIV do tworzywa sztucznego w studzienkach w ciągu odpowiedniego okresu czasu, na przykład w ciągu nocy w temperaturze 4°C. Następnie usuwa się pozostały płyn z każdej studzienki w płytkach ELISA i pozwala się na wyschnięcie tych płytek w temperaturze pokojowej. Stwierdzono, że płytki z gpl60 HIV wprowadzoną do studzienek są trwałe w temperaturze pokojowej w ciągu co najmniej 6 tygodni i prawidłowo przechowuje się je, tak jak poprzednio wspomniane płytki, w miejscu zimnym i suchym. Wytworzony produkt jest użyteczny przy wykrywaniu przeciwciał przeciw otoczce AIDS sposobem według wynalazku, lub jako antygen do badań na zwierzętach, albo do badań z zastosowaniem hodowli komórkowych lub tkankowych, w zależności od różnych aspektów poszukiwań związanych z AIDS, w tym do techniki ELISA, do screeningu, do badań diagnostycznych ludzkich surowic pod względem obecności przeciwciała przeciw AIDS lub antygenu.

m s

LL

~5>

tetyczny ra

ΤΑΑ promotor oliedryny

- proir.o- ATG (ΤΓΰΚ (STAtt GAC KT- 3* tor po- i I feal -KpaJ feal liedryny

TM TG T(i GAT TAT KA TAT (GT CCC ACC AK GGG CCC GGG GGT ACC AGA TCT TM TTA ATT AAG T - 3* ♦ ♦ ł I-1

Seal KpnI Bglll STOP

FIG. 3A puce EcoRI

<

ł—

H<

<

O.

<

LJ

CL

O

Κι/) cn ·—« c

CL o o o

S-<5- e

LJ l/>

LJ

O f— <

ro

s=a
	ao		►—1
(Z)	o		o
l/l	,-T	t=l	JZ
		□ in	X

o o*

Q_

LJ

Λ

C

Ll Λ O L> -P tJ O Φ ε o

L. O CL O.

tn

>—

BstEU

b·— i <U νι

Z? 19 «u £.

<S b— vi -« 79 <9

o.

o

LZ)

S β/ fc_ w- /*· tJ

UJ \ ►— '

I —’ O bO jM W»ta

I bO »M Ρ» β V) c rt>

ω < — l9_ 91

	o eu	U-»— c-/	c · £X -w	CM tt
t				•r4
*!«	79	►—· 19		c o
J^ta	c. 97 V»	19 v-> b“		•w C- o

V» ·—« «*C QC o

U *-*

-cS u.

U

- S2

VI ««<

<9

6Λ jc: u «>« <c ra ►— * ta «Γ ·*» c

»« >» O fc> +» Tl o 9 B ·* O r-t fc> O a. a.

ta a» »— ra ł— — t_r ra ta ta

OJ »— <u ta ta <L) »—

N

O

N

V)

U

O

K·

Φ o

<0 i~9 i*

X

Brak miejsce dlo p_słl, NcoI,Xbal,^lttb Sstl pUCI8

FIG. 2A »

ΰη

FIG. 2B

Φ

Ε ο

σ>

c > φ φ ξ> 5

C ω

α ι

Ο (Ν cn

Ll ω

co ο

Ζ>

Ο.

d

LL ać

N u

o

P o

h

O o	s>
OO	·“ w
U o
Η H	'°K
W 4
>4	es
► 4

&o S P 0.0 o o «ΈΓο * Cl H «30 “SB

fc	i—i H	H
o	O O	x- «5
o	O O H	1 r4
4	r-ł U H	t A

rł O O (OH o >^ou

C H as •H 4 id (i > o £4

H A

O o U o CU o w H >o O H

W H xO w u o r— fi m μ 4 λ v>

V 4 rl H m 4 oh

SA o

o£Ó <Λ H 4 w

>

u

o o	« > O
,H	3
4	V
3	.4
O	0
H	P
A	Cu
o	p
4	f.
0	H
Λ	3 ,s
A	O
H	>
o	>4
O	i—i
H	O
A	>
.0	W
4	>
3	O
H	O
A	P
4	(U
A	O
¹	>
	►
8	3 O
H	»4
O	P
fi	O
4	tn
o	c
A	rA
4	o Λ i
E	& 4
A	& :
A	Η 1
4	3 ,
4	O 1
o	► 1

►

	S 2!	P W	⁰ r~	S8
f—		(Λ	A 4 co	O A
f-		U	H	ZS
<5		W	O
4		CC)	4	t— A
H		U	H	p o
fc o		O	O	o O
	U)	4	w A
H		c	fi	O O
o	O	4	1-ł fi
H		4	4	n 4
O		P	O	C fi
H		fi	O	o <
O		fi	4	4 4
4		C	fi	O O
O		O	4	Λ H
O		4	4	W Ii
O	P	ii	P H
o		jc	O	O O
4		H	4	W H
4		P	H	O O
⁴		O		>,0
h		Wi	4	O fi
a		C	Fi	C O
4		O	4	o 4
		4	4	4 4
A		P	O	o A
H		£	o	>4
o	ii	4	i-) 4
H		C	ii	« 4
O		O	4	i— fi
H		4	4	W <
A		P	H	3 O
O		O	O	rl 4
O		w	4	o 3
O		C	H	>4
4		it	O	•- 3
4		A	0	o o
4		f	ii	« 4
H		O	A	>4
O		A	4	H 4
O		>,O	3 O
O		rH		•p A
4		o	o	o 3
4		3	o	P o
4		►	&	Σ: 4
3		O. O	o	P p O fA
3		4	o	S 4
o		P	H	P o
o		fi	o	O H
H		P	4	Σ 4
4		O	o	3 4
H			o	r-l <Ł
H		O H	o 3

Ό

P H 4) O W 4

3!

<o >>O m — o rłOO

«40	a oo	a ο ο
b b.£J	b ο m 40®	28	b <Λ SO
O 3	3 §3	δ fc
2 ³	3 4	i fc
α u	O 0	£ b
« i b b	au	>b — U
Η <	P 4	ο <

* *

U

a >

« 4	« b	a b	c d
o b	o-ι b	d y	a 4
H 4	H 4	4 0	< 4
8-5	5K	O8	b 4
4 ³	> o	a u	b 4
3 b	u 4	a u	Mb
	w p	d y	>p
u u	o b	4 0	O b
n 4	M U	« b	o £
>4	£ U	>o	M U
p 4	b 4	o b	s u
Μ b	c u	m b	>4
&s	sa		rH O (9 O
01P	Ł_b O b	» b X 0	b §
£ P	S6	b 4	>4 r-l t9
£ P	O 4	w 4	<9 0
a 4	m 4	.O/'	£ b-
58	es	M U s u	« 4 4-4
u b	3 U	® b	2 P
£2	38:	o b H 4	2 ^P
3 4	M 19	o 4	M U
b 4	fi <*>	h u
o 3	b 4	s u	P 4
« 4	M b	3 <	n U
SS	frg	^{u 3}	35
c o	M O	s t*	C b
o* 4	« 3	£ b	2 *5
o u	v) 4	O b	² 4
b O	M U	M u	C b
a b > o	b U	« u w b	2 4
m o	iMS	r-i 4	n b
	a b > <9	S8
>b	Ob	« u*	(0 <
58	sa	3*5	3’5

	σ s	3 4	c d 5i	OU CM U	3 4 56
O	«	4	o ab	o ab	o « b
r*	b	b	σι <n 4	rd >O	ΓΊ O b
b	I-I	4	b 4 3	cm a b	CM M 4

o in <M « 4 «Λ 4

2%

S6

Sg sg

8Ś m b es «³W (h b 4 26

5ί > o su

Cm U 015 as

5C

H 4 >4 b O o O

CC fi ^{x 3}b 4 b 4 η b b 4 a b > O

O n

o b

«42 b b ®» M 40 Γ*

M U es

W 4 &

b c b <s αυ b 4 b 4 « U £h ^c z 55 a u łl H « C H W l· H §3$ £ 41 5C w 4 o 4 a b > o b 4 a b > o <9 ^{o 3}3§

4 r— o o

O

3 4 O r- o H c (N J) U c σ«4 o l 3 m 4 4 R r55 >l< b (

U ( i

« b o b H 4 w 4

3* ⁴&

O ¹ r—

C m 4	⁴	« 4 b 4
0 M	u u	5U
CM	<9	b 4
θ'	4	rl b
H	3	a b
4	4	> e
M	4	« b
£	u	£ b
b	4	Cm b
m	b	a 4
>o	b O
o	b	4 0
c	b	o*4
n	4	M 3
4	4	4 4
a	b
rl	b	b U
W	4	u> 0
3		o 4
b	r)	M 3
«9	0	s u
b	4	>4
a	b	b O
>	<9	o 0
u	b	ΟΌ
«	U	M U
O)	b	4 4
C	4	C Q
ol	4	3 4
19	U	<9 3
C	s	« u
n	4	b b
4	4	w 4
3	u»	Cnb
5	b O	08
c	o	« p
ol	4	o-l b
O	□	w 4
b	4	M b
a	b	« (9
>	O	O) 4

O < b H M <

O »—— m w i >· ►5 t

C 0 O h r: r O 0 cm rco r >2 *3 <

es a u c b ff8 b b o 4 >4 ► 4 5U <9 tP4 H O 4 4

M b « O V) 4

5C u 4 c u m 4 4 4

W fi >«9 O b « fi x§

5U

O c r-H o

tJ»4 as

P o 22 C fi

350

Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gin Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gin Ser ATA GCT AGC AAA TTA AGA GAA CAA TTT GGA AAT AAT AAA ACA ATA ATC TT? AAG CAA TCC o

co co u o o >.<00 Η H <n r~ « o sc

2 o 3 >.( >-< t O ( si eS

Μ H 4> O V) <

i O i (A

4» 2 O Η Η H m < *n śf

3 σ>2 o H 3 r~ 2 2 jn r·

SS

SB

3§

	0.0	4) <	M
rH O	lu O	rH fi	Φ
O o	Η H	W <	CZ)
iii	3b	Cn< u 3	Φ r-H
o o	H <	2 <	H
« t-«	Μ H	w o	O
>o	4) O		M
O H	W <	o ί»	A*
C H	C H	°	O
0 <	« <	M O	M
< 5	< 2	(U O	Cu

ss

CU Η CU H

H f-i 41 O U~> < OT U

X 3

M O x a ί-l <

r-i <<

> δ

SS

H <

Λ r-i Λ

O 3

CU U 0.0 33 >0 rH O o o >.< r—1 U o o

O M < r- 4) O co w H β·8

Μ H £%

Μ H O O <0 <

C H V) <

3 ss 0. (-«

O se s3

O 4» H ►J O £3 t- <

a o

Ul· £3

4)	O	*J o
—U		«ί
> i		£ <
M		<0 «C
X	O	rH O
H	<	< O
0.0	» rf
«	<
	3	4 2
M	H
4)	O	rH 3
to		O o
	rf	rM <4
r-t	3	<0 H
O	0	> o

rH O £ ϋ

H <

C U W rU O c o o 3 fr8 >o o <-( (JCO o O tP rC H OT <

2 c O ss c o ss

C H

SS >l· rd O O O

O 8

Łl· o><

M (3 2 2 33

H 2 3 2 ss ►J O

O 4» H ►4 O >o o 8

H 2

SS

W <

C H v 3

U H O	tn<	o
Η Η Ό	$u 3 < <	m r-
r~		r*
23	ΟΊ* ti f N
SS	2«
	M O
	><
o 3	p 2
U t-u	<0 <£
« o	r-t O
to 2	< o
cn< H 3	OT o ><
2 <	►a 2	3
0.0 u o	M O X o	O c o
Η H	t- <	rM
C H	o o	jQ Ui r^-
w <	M O
< 2	CU o	Q
0.0	(0 <
OT a£	rH O	«Ρ
< 3	< o	C
Cno	-U <	O
M O	<0 H	Ή
< <	> o	bO Φ cc
*J o	>.<

<n co

H		< 2	H	t-<		to H		M
H		C H	4-»	O		U 2		3
<		OT 2	4>	H		4) 3		rH
2		2 2	£	2		tO H		O
(u	O	U rf	o C	O	o	OT H	O	lu
O	rH	41 O	CO w	2	in	>O	r-	4)
H		10 H	U· <	2		O H		to

O

H

4) t-<

£ <

0.H n aC 2 3

Λ*3

O O ><

o o >.< r-4 O o o

O H P O Pu O O»2 a§

M

4) C H t- »—I en 0 o o 3 i su

CU o <t «—4 <2 o 3

SS w <

n ti >.« ►a t >,< o r-« O r-ł

O O co r3 O

SS

4* O

SS >.o o o o

4)

U

4»

X

CU s

(0 rH <

ff-i o

o s

o

H

H tO

O

S3 o o

4* < -i H M <

I >.< I r-ł 3 l o o I

I -t O I 10 H I > o i3 < U

O •Μ < +> O C

33® > O ^N ot < c >2 o bO

U l· Φ £3“

Cnrf H 3 2 2 m < >.2 ►a 2

2 rH A o 3

5» 8* 3 o * * * c

Ό O E

O <-ł

O o

H

O

O W I <n >. UT l-l ' o -u O rU <0 H m > o

SB as

o	«	to	o	9 <	S °
Γ-	,0	4	ΓΊ	r-l »	s ⁴
Ο	X	0	O	O t	9 o
f-			ł*		r-
	c	p		r-l ł

o

2B

W 4 o c H θ

ΙΛ « 4 rO θ 4 2 d

?§	as	3S
4 o	* R	2 P
38	* ^R	SB
c o U 3	³ 2 o ³	20 H 4
> δ	SB	C4 m p
> δ	w 4	2 2
M U	4 b	«4
c. u		S χ
H <	< o	2 O
5g	σ 5 3 ⁵	^B§
b U c O H 4	3 5 S B	5g
*1 O	3 P	cp
8S	S ^P	o 3
* 3	s 2	« o
V> (o	< 2	A rf

n i

2*ί

3Ś lo

V

Ui

CO M O 4 u 23

O >o rM θ o 0 iS

Μ to & 4 W 4

W 4 >4 Ή O o 8 &

BS §s ^cs > |o ΰ 8 h 4 >O rO θ

U U rH O a F > δ ^S& S S og

B§ £P

Η P

MB

M 4 >p ^{0 8}SB 58 B§ Bs

OH ss (0 O

4

SC

Sg as as sg η 4 ss c *2 ss W 4

W 4

OO £0

Μ to « O Ui d a H r0 O 4 8 c H w 4 4 2 £ P

P P

8B

Oo U r-l O

H > 0 4 H

3H u U o «05 «0 « h x3

Si

H 4 ^5fL

4«₅ ⁴« ⁵X ło 0 £3

C to

2S

S4 2 2 MH

H 2

O 0 53

OH θ w 4 m <3n s£ as sg ⁵B as as as c to

2Λ3

Ot O su as as

4 o r-l fo θ ► 4 <M GO

W rf

S'S s S

H 4 tt H £3 £8 b

H ^1Stt

4) 4 r- H W 4 c 0 η & 4 4 « fo X fo CM P * 4 o η ρ m h 4 < co * B to P ^sis rH rf £B r-ł

O

5&

a 4 Ή H H 4 C4 8§ 3 2 S 2 >.P

B 8 33 > O o u o lo U r-l

Λ o 2: co

M U es

2§

5g w u x 3 c o

B 3 ou ło U V o V) H 3 4

SB

Oo U to 4 a O to H

OU 0) « 2 0	c rO O	⁵³	8*8 fo H	3 O * H P	Μ H £3
£8	C	%	c H	>u	>.<4
£8	M	%	w 4	r-l Q	1—4 O
H U	2	2	4 2	0 8	o o
3 O rH 4	C rO	U	£H	5$	c o rH et
0 0	O	U	H H	o o	O O
41 U	H	O	3 U	r-l 4	tPO
* H	*	O	β» P	8 P	* O
£ 2	U)	to	S Ρ	8 δ	* 4
£8	3	3	w B	* 4	s P
£8	rO		w B	r-l to	S P
to P	O	3	Ui 4	M 4	8 6

s§ as

O 4 m r-4

3 O

u « ω

to υ to

3 O SB

Μ P £3

M 4 to

to O 4

41 V Σ

g

4) rO H

B 4

8*8 Η H

* •Ή M

4

o

3

O

o

3 O

O

σ2

O

c

O

3

4

o

w 4

o

4

O

on

V

to

Γ*

* H

47

M O

c-2

Λ

U

n

4

4A

*

to

Γ*

ijBrf

σ\

X

O

ιΠ

>-

P

ιΛ

3 υ

lA

4 4

U>

to

4

1O

►

to

u>

A «2

v>

£

5ί lg r-l O 4 H > o

u o o	3 H o	P b o	PO O	OHO	Ι- Ο
	0> b <	O) O m	H rf H	P O r-	2
Ob «π	— o «η	21 2 20	O O r*	Cu O i	H
20	«0	00	00	00	O

O

O ł— o

tO

O « rf r- (W <

tn«t ο,ο S

C p	>	P O	rH O	p b		<	O O
O	0) o	20 H	Η 2	«	H	d ί
2	<	i) 2	> Ο	^£ H	>	O	x 3
0.	o rt	CU	0» b	c e	A	rt	HO
O	p O	r-l b	-u e	r-l	o	H O
<	3	2 o	M <	O 3	2	o	2 o
σ p	2	3 O	tn O	3 2	0»	2	0» b
O	a H	ρ 3	δ b	r-l	H
2	<	1 O	2 2	•3 o	»-»	2	1 <
3	O 2	0.H	ki o	3 O	A	O	A H
2-		C o	2 b	r-l	q	-<O
o	3	2 3	H 2	> o	2	3	2Ό
>	2	0.0	r-l <	C H	H	<	H2
h1	3	Μ 2	ιβ H	W <	e	o	H 3
o	o	< 3	> ο	< 2	H	<	² 2
r“i	H O	0.0 w o	0» b r-l b	HH	A r—	o o	O H >O
O	O	Η H	I-I 2	H H	2	o	O H
3 rH	A	0) O r-l H	3 o 0» b	HH	c O	H 2	A H d ο
O	O	H 2	i-l P	H H	2	2	< o
P	<	3 b	3 O	P b	3	o	>2
r-3	2	0) P	0» H	£2	0»	H	rl 3
o	3	► O	►4 O	^£ H	»	O	o o
9	2	3 2	3 ?	o 2	3	O	c 2
h4 o	ei	3 O 2 O	SP	>2 1 2	4 ►4	H	r- 2 o 3
O	<2	3 <	0.0	3 o	p	O	d 2
·—	H	a H	O 2	a H	O	3	A H
jh	et	t-J P	< 3	O	tn	2	> ο

c o

X

t- o o	o o g	o o ^ξ	H H 2
o	o	s	3
H	<	o	O
P	3	2	fS
	H	H	<3

r- O

O O s£ rH 3z o 3 o o p u

CU u 0O P 3 2 < 0.0 23 o o p u CU o

0*0 o o

O CU m P O r- < <

P d

a c	_y ρ 3
w t-	2 2 2
> “	2 3 0
H C o 3	² 38
c o	ΟΟ
o r	P o
< 2	² o
rU O	o o
Λ H	x 3
> O	x ³
3 2	P o
SP	S3
o2	u o
p 3	o o
² o	w <
O) H	α o
rl t—	£ b
H <	£ b
P o	O 3 0
Ol O	r- 0) f-
W H	Γ-* ► O

A O

2O

2 •m a o 3 &H

Η H >O rH O o 3 o»q 22 co 28 o o o o

O 4» H ►5 O rA H > O o H

P t-« 0 O V) < C H

O O

SS

2 *5 #-2 <βί o 3 o c o r-l -U 2 oo o 3 ^r < A H > O

2 1-1 2 o 3

M < Cu>

2 r-l <

o 3

O

Kpn Bgl ii

O ί*Ί

CD

§	>o ^{o 8}	^g
H	c o	o
p	r-l tt	H
O	o 3
o	o'2 L· l4	β
o 2	2 ii

< 3 53 t- <

>o < O o o

0» 2

-t * w 2 C2 rl trrt ia p O oo 2 2 o

o o

o tO go , σι

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi AIDS, znamienny tym, że kontaktuje się wspomniane przeciwciała z próbką białka env wirusa AIDS, wytworzonego na drodze ekspresji z zastosowaniem rekombinowanego wirusa owadziego i wykrywa się przeciwciała przeciwko wirusowi AIDS przez wykrycie wiązania lub reakcji pomiędzy wspomnianym białkiem wirusa AIDS a wspomnianymi przeciwciałami.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się gpl6O.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się gpl20.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się gp41.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko env wirusa AIDS stosuje się jego fragment immunogenny.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo znakowane białko wirusa AIDS.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się białko wirusa AIDS włączone lub unieruchomione na stałym podłożu, korzystnie przeźroczystym, takim jak studzienki płytki polistyrenowej, folii lub filtru.