KR940005586B1 - 플라비 비루스 항원 - Google Patents

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내용 없음.

Description

플라비 비루스 항원

제1a∼1i도는 JE 비루스 황색열병 비루스 및 웨스트나일 비루스의 V3 단백질을 코오딩하는 염기서열 및 상기 비루스의 V3 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것.

제2a∼2f도는 JE 비루스의 V3 단백질(이후 "JEV3 단백질"로 약칭한다)을 코오딩하는 염기서열(윗줄) 및 JEV3 단백질의 아미노산 서열(아랫줄)을 나타낸 것.

제3도는 pS22로부터 pS22XS를 형성하는 유통도를 나타낸 것.

제4도는 pJM105의 형성을 나타내는 유통도를 나타낸 것.

제5도는 pJEV3의 각종 재구성된 플라스미드의구조 및 pJM105의 구조를 나타낸 것.

제6도는 JE 비루스의 V3 단백질의 확인을 위한 전기영동 결과를 나타낸 것.

본 발명은 플라비 비루스 항원에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 항-플라비 비루스 항체에 반응하는 하나이상의 에피토플을 함유한 항원에 관한 것이다. 본 발명의 항원은 고순도이며 일본 뇌염의 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항원은 대규모 및 저가로 안정하게 제조될 수 있다

더욱이 그의 높은 특이 항원성으로 인해 본 발명의 항원은 항-플라비 비루스 항체의 진단제로 유리하게 이용될 수 있으며, 항-플라비 비루스 항체의 제조를 위해 이용될 수 있다.

일본 뇌염(이후 JE로 약칭한다)은 JE비루스의 감염에 의해 야기되는 전염성 질병이며, 이 질병에 의한 사망률은 매우 높고 이 질병은 무서운 후유증을 일으킨다.

일본에서 JE로 고통받는 환자의 수는 최근 현저히 감소하고 있다.

그러나 이 질병은 동, 동남 및 남부아시아국가에서 만연하고 있다.

이것은 사회적 문제를 야기하고 있으며 질병이 만연되고 있는 지역에 제한되지 않고 국가들 사이의 빈번한 접촉으로 인해 오늘날 국가적인 문제로 대두되고 있다. JE 비루스는 토가비리다에(Togaviridae)과의 플라비 비루스(Flavivirus)속에 속한다. 비루스 분류에 따르면 JE 비루스에 속하는 약 50 비루스가 플라비 비루스 속에 속한다. 플라비 비루스에 속하는 비루스는 단순히 플라비 비루스라고 불리운다. 지금까지 몇종의 플라비 비루스, 즉 JE 비루스 황색 열병 비루스 웨스트 나일 비루스, 덴지 비루스 등에 관한 각종 연구가 수행되었다. 플라비 비루스 입자의 구조는 3종이 구조 단백질 , 즉 플라비 비루스 입자의 엔벨로프의 대부분을 구성하는 당단백질 E(때로는 V3 항원이라고 명명되며, 약 53,000의 분자량은 갖는다); 엔벨로프에 존재하는 스몰 단백질 M(때로는 V1 항원이라고 명명되며 약 8,700의 분자량을 갖는다); 및 플라비 비루스 입자의 뉴클레어캡시드를 구성하는 단백질 C(때로는 C2 항원이라고도 하며, 약 13,500의 분자량을 갖는다)을 함유 한다는 것이 알려져 있다. 플라비 입자에 있어 약 3.8×10⁶∼약 4.2×10⁶의 분자량을 갖는 단일가닥 RNA를 함유하는 비루스성게놈이 있다. 비루스성게놈은 각각 상술한 3종이 구조 단백질을 코오딩하는 유전자를 함유한다. 상술한 3종의 단백질 중에서 단백질 E(이후 "V3항원"이라고 약칭한다)는 비루스 감염의 초기단계에 중요한 역할을 한다. 그러므로 비루스 감염을 예방 또는 진단하는데 있어 V3 항원의 이용이 기대되고 있다.

V3 항원의 각종 연구가 수행되었다. 예를 들면, V3 항원-중화 항혈청의 활성 및 V3 항원의 혈구 응집활성 감염세포- 융합 활성, 용혈 활성 등이 측정되었다. V3항원에 9가지 이상의 에피토프가 존재한다는 것을 보고하는 문헌이 있다.

또한 다른 종류의 플라비 비루스는 서러 밀접히 연관되어 있거나 유사한 항원을 갖는다는 것도 공지 되어있다.

일반적으로, JE 비루스의 V3 항원은 다음과 같이 제조된다. 비루스를 배양하기 위한 배양 숙주로 생쥐의 뇌 또는 동물로부터 유도된 체세포룰 사용하여 병원성 종 비루스를 배양하고 배양액으로부터 모든 비루스 입자를 분리한다. 이어서 물리-화학적 처리에 의해 모든 분리된 비루스 입자를 절단하여 V1, V2, 및 V3항원 비루스 RNA등의 혼합물을 수득하고 V3항원을 분리 및 정제한다.

상술한 공지의 방법은 다음의 단점을 갖는다.

(1) 병원성 비루스가 직접 취급되기 때문에 생물학적 위험의 가능성이 높다.

(2) 원료 제조공정 및 장비가 매우 복잡하기 때문에 생산 단가가 높다.

(3) V3 항원이 배양숙주 및 배양배지로부터 유도된 불순물로 오염될 가능성이 높기 때문에 고정제 V3항원을 수득하는 것은 매우 어렵다.

본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하기 위해 광범위하고 집중적인 연구를 수행하였다.

그 결과 JE 비루스 감염에서 중요한 역할을 하는 JE 비루스의 V3 항원을 코오딩하는 cDNA를 클로닝하고 JE 비루스의 V3 항원을 코오딩하는 cDNA의 염기서열을 결정하는데 성공하였다. 더욱이 예기치않게, cDNA를 재조합 DNA 기술에 의해 형질 발현시킬 때, JE 비루스의 V3 항원에 상응하는 아미노산 서열을 가지며 비루스와 같은 항원성을 갖는 단백질(이후"V3 단백질"로 약칭함)이 대규모로 안전 및 안정하게 수득될 수 있다는 것이 발견되었다. 상술한 신규의 발견을 기초로 본 발명이 완성 되었다.

그러므로 본 발명의 목적은 JE 백신으로 매우 효과적이며 대규모 및 저가로 안전하게 제조될 수 있는 신규의 플라비 비루스 항원을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기의 목적 및 그 외의 목적, 태양 및 이점은 첨부하는 도면과 함께 설명되는 하기의 설명에 의해 명백해 질 것이다.

제1a∼1i도에서 서열은 윗줄에서 아랫줄까지 다음의 순서로 배열되어 있다.

(1) JE 비루스의 V3 단백질을 코오딩하는 염기서열

(2) 상술한 염기서열(1)로부터 추론된 JE 비루스의 V3 단백질의 아미노산 서열

(3) 웨스트나일 비루스의 V3 단백질을 코오딩하는 염기서열

(4) 상술한 염기서열(3)로부터 추론된 웨스트나일 비루스의 V3 단백질의 아미노산 서열

(5) 황색 열병 비루스의 V3 단백질을 코오딩하는 염기서열

(6) 상술한 염기서열(5)로부터 추론된 황색열병 비루스의 V3 단백질의 아미노산 서열

더욱이 제1a∼li도에서 "***"기호는 염기서열 또는 아미노산 서열에서 이 부분이 상응하는 부분에서 JEV3 단백질의 염기서열 또는 아미노산 서열과 같은 코오돈 또는 아미노산이라는 것을 의미하고 : "---"기호는 염기서열 또는 아미노산 서열에서 이 부분이 누락되어, 이 기호양쪽에서 이 기호에 인접한 두 코오돈 또는 아미노산이 직접연결된 것을 의미한다.

필수적으로 본 발명에 따라 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산의 적어도 한 부분 즉 항-플라비 비루스 항원에 반응성인 하나이상의 에피토프를 함유하는 부분을 함유하는 항원이 제공된다.

(식중, Ala는 알라닌 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, Asn은 아스파라긴 잔기, Asp는 아스파르트산 잔기, Cys는 시스테인 잔기, Gln은 글루타민 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Iie는 이소류신 잔기, Lys는 리신잔기, Leu는 류신잔기, Met는 메티오닌 잔기, Phe는 페닐알라닌 잔기, Pro는 프로필 잔기, Ser은 세린 잔기, Thr은 트레오닌 잔기, Trp는 트립토판 잔기, Tyr은 티로신 잔기 및 Val은 발린 잔기를 나타낸다)

또한 본 발명에 따라, 상술한 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 한부분 즉, 항 플라비 비루스 항원에 반응성인 하나이상의 에피토프를 함유하는 부분을 함유한 항원을 코오딩하는 염기서열을 함유한 데옥시리보핵산이 제공된다.

더욱이 본 발명에 따라 (a) 상기 항원을 코오딩하는 염기서열을 함유한 데옥시리보핵산을 복제 가능한 형질 발현 벡타에 결찰 시켜 상기 데옥시리보핵산 및 상기 복제 가능한 형질 발현 벡타를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 수득하고; (b) 미생물 세포 또는 세포 배양액을 상기 복제 가능한 재조합 DNA로 형질전환켜 형질전환체를 형성하고; (c) 미생물의 모세포 또는 세포 배양액으로부터 형질 전환체를 선택하고; (d) 형질 전환체를 배양하여 형질 전환체가 상기 데옥시리보핵산을 형질 발현시켜 항원을 생산하도록 하고; (e) 배양된 형질 전환체로부터 항원을 분리함을 특징으로 하는 상술한 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 한부분 즉 항-플라비 비루스 항원에 반응성인 하나이상의 에피토프를 함유한 부분을 함유하는 항원의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 항원은 상술한 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 한부분을 함유한다. 일반식(I)의 아미노산 서열은 JE 비루스의 V3 항원의 전체 아미노산의 서열에 상응한다.

본 발명의 항원은 일반식(I)의 전체 아미노산 서열을 함유할 수 있다.

일반식(I)의 전체 아미노산 서열을 갖는 항원은 일반식 이후 JEV3 단백질로 약칭한다. 또한 본 발명의 항원은 항-플라비 비루스 항원에 반응성인 하나이상의 에피토프를 함유하는 한 일반식(I)의 아미노산 서열의 일부를 함유할 수 있다.

"에피토프"는 항원성 결정소이며 항원에 있어서 항원-항체반응의 특이성을 결정하는 구조를 의미한다.

일반식(I)의 아미노산 서열의 일부로서 예를 들면 일반식(I)의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 세어 4∼159번째 아미노산의 아미노산 서열에 상응하는 부분, 일반식(I)의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 세어 375∼456번째 아미노산 서열에 상응하는 부분등이 언급될 수 있다.

일반식(I)의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 항원(즉 JEV3 단백질)은 하기에 설명하는 단계(1)∼(9)의 방법에 의해 제조될수 있다

단계(1)에서 게놈 RNA를 JE 비루스로부터 추출한다. 이 단계에서는 페놀추출 기술등과 같은 공지의 통상적인 기술을 사용할 수 잇다.

단계(2)에서, 단계(1)에서 수득된 비루스 RNA에 상보적인 이중가닥 cDNA를 제조한다. 이 단계에서는 역전사효소를 사용한 공지의 통상적인 방법을 이용할 수 있다.

단계(3)에서 cDNA를 클로닝하고 클로닝된 cDNA의 염기서열을 결정한다.

클로닝 벡타로는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)등 같이 원핵세포에 적응성을 갖는 플라스미드 및 파지 T4파지 등과 같이 박테리오파지로부터 유도된 벡타와 같은 공지의 벡타를 사용할 수 있다.

이 단계에서는, 클로닝 벡터 및 숙주세포를 적당히 배합하여 선택하는 것이 바람직하다

단계(4)에서 JEV3 단백질을 코오딩하는 유전자(이후 "JEV3유전자"로 약칭한다)를 함유한 클로닝된 cDNA를 확인한다.

보통 세포로부터 유도된 구조 유전자는 번역의 개시 및 종결부분에 특이한 염기서열을 가지며 조절유전자의 구조가 유사하다. 그러므로 이런 구조유전자 부분의 검출 및 확인이 비교적 용이하다. 한편 JEV3 유전자의 경우 번역의 개시 및 종결부분 및 조절 유전자가 존재하지 않기 때문에 지표로 사용될 수 있는 특이한 염기서열이 없으며 따라서 JEV3 유전 부분의 검출 및 확인이 상당히 곤란하다.

그러나 이런 난점은 본 발명자들에 의해 무난히 극복되었다.

즉 본 발명자들은 클로닝된 cDNA의 염기서열을 분석하여 클로닝된 cDNA를 형질 발현시키고 형질 발현된 생성물의 면역적 검출 및 확인을 수행하였으며 클로닝된 cDNA의 염기서열을 이미 보고된 V3 단백질의 아미노산 서열 및 황색 열병 비루스 및 웨스트 나일 비루스의 V3 유전자에 관한 유전자의 염기서열을 비교함으로써 JEV3 유전자의 cDNA의 염기서열을 결정하였다.

그 결과 JEV3 유전자는 하기 일반식(Ⅱ)의 염기서열을 갖는다는 점이 발견되었다.

(식중 A는 데옥시아데닐산 잔기, G는 데옥시구아닐산 잔기, C는 데옥시시티딜산 잔기 및 T는 데옥시티미딜산 잔기를 나타내고 일반식(Ⅱ)의 좌측 및 우측 말단은 각각 5' 하드록실기 측 및 3'-히드록실시측을 나타낸다)

유전 코오드의 축퇴(degeneracy)에 따라 유전자로부터 생성된 폴리팹티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 유전자와 염기서열을 염기 하나이상을 다른 종류의 염기로 치환할 수 있다. 그러므로 JEV3 단백질을 코오딩하는 DNA는 유전 코오드의 축퇴(degeneracy)에 따라 치환에 의해 변화되는 어떤 염기서열을 가질 수 있다. 이 경우 상술한 치환에 의해 수득된 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열은 상기에 정의된 일반식(I)의 아미노산 서열과 동일하다.

단계(5)에서 JEV3 유전자의 cDNA를 복제 가능한 형질 발현벡타에 결찰시킨다.

이 단계에서는 단계(4)에서 수득된 클로닝된 cDNA로부터 JEV3 유전자의 cDNA를 제조하고 복제가능한 형질 발현 벡타에 결찰시켜 복제 가능한 재조합 DNA를 형성한다. 이 단계에 사용되는 복제 가능한 형질 발현벡타로는 사용된 숙주 세포에 적응성을 갖는 형질 발현 플라스미드, 형질 발현셔틀벡터 및 백시나 비루스 및 SV40과 같은 비루스로부터 유도된 형질 발현벡타와 같은 공지의 벡타를 언급할 수 있다.

숙주 세포에 대해서는 이후에 설명하기로 한다.

JEV3 유전자의 cDNA를 복제 가능한 형질 발현에 결찰시키는 것은 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 결찰을 수행하는데 있어서 JEV3 유전자의 cDNA는 번역의 개시 및 종결부분을 갖지 않기 때문에 이런 부분이 상응하는 염기서열을 갖는 DNA로 cDNA를 보충할 필요가 있다는 것을 알아두어야 한다. 이와 관련하여, cDNA에 결찰된 형질발현벡타가 상기 부분에 상응하는 염기서열을 함유하는 경우, cDNA가 이런 부분을 이용하여 형질 발현될 수 있도록 cDNA를 형질 발현벡타에 결찰시킨다.

한편, cDNA에 결찰된 형질 발현 벡타가 번역개시 및 종결부분을 함유하지 않은 경우, 이 부분에 상응하는 염기서열을 갖는 DNA에 의해 cDNA를 보충하고 형질 발현 벡타에 결찰시킨다.

더욱이 JEV3 유전자의 cDNA를 보충하고 형질 발현 벡타는 (1)형질 발현된 생성물(JEV3 단백질)의 항원성 및 면역성이 강화되고; (2)형질 발현 벡타 및 숙주세포에서 JEV3 유전자의 cDNA의 안정성이 증가되고; (3) 유전자 형질 발현에 의해 생성된 JEV3 단백질의 수율이 증가되고; (4)숙주세포에 유전자 형질 발현함으로써 생성된 JEV3 항체가 숙주세포로부터 분비되어 항원의 추출 및 정제가 단순화되도록 변형될 수 있다.

또한, JEV3 유전자의 cDNA를 형질 발현벡타에 결찰시키는데 따라서 필요하다면, JEV3 유전자의 cDNA를 적당한 링커를 토해 형질 발현벡타에 결찰시킬 수 있다.

상기 단계(4)에서 수득된 클로닝된 cDNA는 JEV3 단백질을 코오딩하는 염기 서열과 더불어 때때로 JEV3 유전자 이외의 JE 비루스의 유전자로부터 유도된 염기서열을 함유한다. 이런 경우 JEV3 단백질을 코오딩하는 것 이외의 염기서열은 결찰전 cDNA로부터 삭제될 수 있다.

또한 cDNA 그 자체를 사용할 수도 있다.

단계(6)에서 JEV3유전자의 cDNA를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 숙주세포에 이동시켜 형질 전환체를 수득한다.

이 단계에서는 재조합 DNA에 의한 숙주세포의 형질전환은 통상의 방법에 위해 수행된다. 숙주세포의 예로는 에스 케리키아 콜리 및 바실루수 서브틸리스와 같은 원핵 세포 및 이스트 및 고등생물체 세포배양액과 같은 진행세포가 언급될 수 있다.

형질 전환에 의해 형성된 형질 전환체는 표준으로 예를 들면 표현형 특성을 위한 유전자를 갖는 복제 가능한 형질 발현 벡타에 의해 제공된 약제 내성과 같은 표현형 특성을 이용하여 재조합 DNA로 형질 전환되지 않는 모세포로부터 선택된다.

단계(7)에서 형질 전환체를 배양하여 JEV3 유전자의 cDNA를 형질 발현시키고 JEV3 단백질을 제조한다.

단계(8)에서 형질 발현에 의해 생성된 본 발명의 항원을 통상의 추출 및 정제방법에 의해 배양된 형질 전환체로부터 분리한다.

이 단계에서는 통상의 기술을 배합하여 사용할 수 있다. 예를 들면 여과,염석, 원심분리 및 컬럼크로마토그래피와 같은 기술은 본 발명의 항원의 추출 및 정제하는데 배합 사용될수 있다.

그러므로 상술한 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 본 발명의 플라비 비루스 항원이 실제로 순수한 형태로 수득된다.

단계(9)에서 본 발명의 항원의 항원성 및 면역성을 분석한다.

이 단계에서는 공지의 기술을 배합하여 사용할 수 있다. 예를 들면 항원성 및 면역성을 분석하기 위해 효소 결합면역소르벤트 분석(이후 ELISA"로 약칭한다) 및 중화시험(50%플라크 환원 방법 : Standerd for the biological preparation of medicines" 76p. 일본국 Pharmaceutical and Supply Bureau. Ministry of Health and Welfare 감수, 1985년 10월 10일, Associstion of Bacterial Pharmaceutical Preparation 발행)과 같은 기술이 사용될 수 있다.

상술한 바와 같이 JEV3 단백질은 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기 서열을 갖는 JEV3 유전자의 cDNA를 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 상술한 방법에서 JEV3 유전자의 cDNA는 클로닝을 통해 JE 비루스로부터 수득된다. 또한 JEV3유전자의 cDNA는 상업적으로 이용 할 수 있는 자동 DNA 합성등을 사용하여 유기 화학적으로 합성될 수 있다.

본 발명의 항원이 항-플라비 비루스 항체에 반응성인 하나이상의 에피토프를 함유한 JEV3 단백질이 부분을 포함하는 경우, 이 항원은 JEV3 유전자의 cDNA 대신 JEV3 단백질의 상숭한 부분에 상응하는 JEV3 유전자의 cDNA부분을 형질 발현 벡타에 결찰시키는 것을 제외하고는 상기 단계(5)∼(8)에 설명된 것과 실제로 같은 방법으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. JEV3 유전자의 일부분은 예를 들면 적당한 효소등을 사용하여 JEV3유전자의 cDNA를 절단함으로써 제조될 수 있다. 또한 JEV3 유전자의 cDNA의 일부는 상업적으로 이용할 수 잇는 자동DNA 합성기를 사용하여 유기 화학적으로 합성될 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 항원은 유전자 형질 발현에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 항원은 JEV3 단백질의 아미노산 서열의 일부 또는 전체 및 그의 C-말단 및/ N-말단에 부착된 링커로부터 유도된 펩티드 형질 발현 벡타로부터 유도된 펩티드 및/또는 JEV3 단백질 이외의 플라비 비루스의 기타 구조 단백질로부터 유도된 펩티드와 같은 기타 펩티드이 아미노산 서열을 함유한 융합 펩티드의 형태로 수득될 수 있다. 이 경우 융합 펩티드를 화학적 또는 효소적으로 절단하여 JEV3 단백질 의 아미노산 서열의 일부 또는 전체 및 그에 부착된 기타 단백질의 아미노산 서열로 분리할 수 있다. 또한, 이와 같은 융합 펩티드는 항원성 및 면역성이 JEV3 단백질 이외의 기타 펩티드의 존재에 의해 영향받지 않는다면 항원으로 사용될 수 있다.

본 발명의 항원은 또한 상업적으로 이용할 수 있는 자동 펩티드 합성기 등을 사용하여 유기 화학적으로 합성될 수 있다. 더욱이 본 발명이 항원의 각 에피토프의 재구성 및 변형은 단백질 공학에서 공지된 통상적 방법에 따라 쉽게 수행될 수 있다. 본 발명의 항원은 플라비 비루스 백신의 활성성분, 특히 JE 백신으로 사용될 수 있다.

백신은 본 발명의 항원을 생리식염수 또는 인산 완충액과 같은 멸균 등장 용액에 가함으로써 제조될 수 있다. 이 경우 백신의 안정화제로 펩톤, 아미노산 사카라이드 등을 배합하는 것이 바람직하다.

이렇게 수득된 백신은 액체형이다. 그러나 백신은 면역성을 강화하기 위한 보조제를 가함으로써 침전된 백색으로 다시 제조되거나 매우 안정하여 운반이 편리한 동결 건조 백신으로 제조될 수 있다.

더욱이 본 발명의 항원의 면역성은 분자 융합기술에 의해 사카라이드 사슬을 항원에 도입하거나 , 번역후 세포에서 변형시킴으로서 강화될 수 있다.

본 발명의 항원을 함유한 백신은 일반적으로 액체 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다. 그러므로 백신이 동결 건조된 백신인 경우 백신을 투여 전에 상술한 멸균 등장용액에 용해 또는 현탁시킨다. 투여용 백신에서 본 발명의 항원의 농도는 일반적으로 약 0.001∼1.000㎍/ml일 수 있다. 일반적으로 백신을 피하 또는 근육내 투여할 수 있다. 성인의 백신 투여량은 일반적으로 0.1∼2.0ml이다.

일반적으로 어린이의 백신 투여량은 성인 백신 투여량의 1/2일 수 있다

백신은 일반적으로 약 1주∼1달 간격으로 2번 투여 하고 약 1년후 한번 더 투여 할 수 있다.

더욱이 본 발명의 항원은 JE 비루스로부터 감염을 검출하기 위한 면역 진단제로 사용될 수 있다. 본 발명의 항원은 또한 본 발명의 항원에 밀접한 관련을 갖거나 유사한 항원성을 갖는 JE 비루스 이외에 플라비 비루스로부터의 감염을 검출하기 위한 면역 진단제로 사용될수 있다. 예를 들면 본 발명의 항원은 형광색소, 효소, 방사선 동위원소등으로 표지의 항원 또는 항체를 각각 사용하는 ELISA, 혈구 응집시험, 능동적 혈구응집시험, 보충고정시험 및 기타 각종 시험에 사용하는데 유용하다.

본 발명의 항원은 상술한 각종 시험방법에 따라 플라비 비루스 항체를 검출 및 확인하는데 사용될수 있다.

본 발명의 항원은 본 발명의 항원에 대한 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이렇게 대한 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 항체는 상술한 시험 방법에 따라 플라비 비루스 항원을 검출 및 확인하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 이런 항체의 제조는 본 발명의 항원을 실험실 동물에 주사하여 동물이 항체를 생성하게 하고, 동물의 혈액 또는 체액을 수거하는 방법에 의해 수행될 수 있는 항체는 또한 통상의 세포융합기술에 의해 제조될 수 있다. 항체를 전자의 방법에 의해 제조할 때 다클론 항체가 수득된다.

또한 항체를 후자의 방법에 의해 제조할 때 단일클론항체가 수득된다.

더욱이 본 발명의 항원 또는 그에 대한 항체는 항원-항체 반응을 이용하는 생물 분리기, 생물 반응기 또는 생물 감응기로 사용될 수 있다. 이 경우에 본 발명의 항원 또는 이 항원에 대한 항체를 통상의 방법에 따라 기질 또는 지지물에 고정시킬 수 있다. 목적에 따라 본 발명의 항원 또는 이 항원에 대한 항체를 통상의 방법에 의해 형광색소, 효소, 방사선 동위원소 등으로 표지시킬 수 있다.

본 발명의 항원은 다음과 같은 이점을 갖는다.

본 발명의 항원의 분자구조가 명백하다. 그러므로 본 발명의 항원을 사용함으로써 높은 효과의 매우 안전 및 균일한 생물적 제제, 및 높은 특이성 및 높은 효과의 진단제을 제공할 수 있다. 더욱이 본 발명의 항원은 동물을 비루스로 감염시킴으로써 제조될 수 없으나 숙주 세포에 본 발명의 항원을 코오딩하는 DNA를 유전자 형질발현 시킴으로써 제조된다. 그러므로 본 발명의 항원 제조단계 동안 생물적 위험의 가능성이 실제로 제거 된다. 또한 제조 비용이 감소될 수 있다.

더욱이 배양계의 모든 물질(예, 배지)은 조성 및 그의 구성이 공지이기 때문에 전제가 용이 하고 고순도를 갖는 항원 생성물이 수득될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명되며 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

단계 1[일본뇌염 비루스의 게놈 RNA의 추출]

배향 숙주로 모기의 일종인 아에데스 알보픽 투스(Aedes albopictus)로부터 유도된 세포주 C6/36(이가라시, 에이., J. Gen. Virol. 40. 531 1973)의 세포를 사용하여 영양 배양 배지에서 28℃에서 48시간 동안 JE 비루스 균주 JaOArS982를 배양한다. 배양후 배양배지의 상층액을 수거한다. 상층액에 6g/dl의 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 2.22g/이의 염화나트륨을 가하고 수득된 혼합물을 15분동안 교반한다.

혼합물을 12,000g에서 30분동안 원심분리하여 비루스 입자를 침전시킨다

비루스 입자를 수거하여 STE완충액(0.1M NaCl, 0.01M 트리스- HCL 및 0.001M EDTA, pH7.6)에 현탁시킨다.

이렇게 수득된 현탁액을 원심분리 튜부에서 15% 슈크로오즈 용액위에 넣고 37,000rpm에서 120분동안 원심 분리하여 침전불을 수득한다. 생성된 침전믈을 STE-0.1% SDE(소듐 도데실설페이트)에 용해시킨다.

그리고, 수득된 용액에 같은 부피의 STE-포화페놀을 가하여 비루스의 게놈 RNA를 추출하고 생성된 혼합물을 철저히 교반한다. 혼합물의 수층을 취하고 에탄올의 수층부피의 2배 부피로 수층에 가한다.

수득된 혼합물을 -20℃에서 밤새 방치하고 15,000rpm에서 30분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다. 침전된 RNA를 수거 및 동결 건조시키고 STE-0.01% SDS에 현탁시킨다. 생성된 현탁액을 슈크로오즈 용액이 0.1% SDS를 함유하고, 15∼30%(w/w)의 밀도 경사를 갖는 원심분리 튜브내에 슈크로오즈 용액위에 넣고 45,000rpm으로 180분동안 원심분리한다.

42S의 침강상수를 갖는 분획을 원심분리 튜브로부터 수거하여 모으고 에탄올 침전물을 수득한다. 침전물을 건조시키고 50mM 트리스-HCL(pH7.9)에 용해시켜 정제된 비루스 RNA 용액을 수득한다.

단계 2[게놈 RNA에 상보적인 DNA를 함유한 이중가닥 cDNA의 제조]

10㎍의 게놈 RNA를 함유한 비루스 RNA용액 50μl에 10mM MgCl₂, 250mM NaCl. 2.5mM MnCl₂, 0.5㎎/ml 소혈청 알부민(이후 "BSA"로 약칭한다).

1mM ATP. 단위의 RNase 억제제 및 1단위의 폴리 (A) 폴리머라제를 가하고 생성된 혼합물을 37℃에서 5분 동안 배양한다. 혼합물을 페놀 추출하고 에탄올 침전시켜 RNA를 침전시킨 후, 원심 분리하여 침전물을 수득한다. 침전물을 건조시켜 건조된 RNA를 수득한다. 이어서, 수득된 RNA를 0.1mM KCL. 10mM MgCl₂, 10mM DTT. 1mM dNTP. 20㎍의 올리고(dT) 12∼18. 50mM 트리스-HCL 및 30단위의 역전사 효소를 함유한 용액 50μl에 용해시키고, 생성된 혼합물을 42℃에서 60분간 배양한다.

혼합물에 0.1mM MgSO₄ㆍ0.5㎎/ml BSA 1mM dNTP, 100μM NAD. 0.5M 트리스-HCL(pH7.9). 25단위의 RNase H. 1단위의DNA 리가아제 및 20단위의 DNA폴리머라제 I를 함유한 효소 용액 150μl의 혼합물을 수득한다. 혼합물을 15℃에서 2시간 동안 배양한다. 생성된 반응 혼합물을 페놀 추출하고, 에탄올 침전시켜 침전물을 수득한다.

침전물을 10mM MgCl₂ㆍ50mM NaCl, 0.1㎎/ml BSA, 1mM DTT. 1mM dNTP 및 50mM 트리스-HCL(pH7.9)를 함유한 수용액 100μl에 용해 시킨다.

생성된 용액에 2단위의 T4 DNA 폴라머라제를 가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 10분동안 배양한다. 배양후 혼합물을 페놀 추출 및 에탄올 침전시켜 비루스성 게놈 RNA에 상보적인 DNA를 함유한 이중가닥 cDNA를 수득한다.

단계 3[cDNA의 클로닝 및 그의 염기서열의 결정]

단계 2에서 수득된 이중가닥 cDNA를 60mM 트리스-HCL(pH7.6). 6.6mM MgCl₂, 10mM DTT및 1mM ATP를 함유한 수용액에 용해시킨다.

이렇게 수득된 용액에 BamHI 링커 및 T4 DNA 리가아제를 가하고, 4℃에서 16시간동안 배양하여 cDNA와 링커의 결찰 반응을 진행한다. 그후, 10mM 트리그-HCL(pH8.0),50mM NaCl 및 1mM EDTA를 함유한 TEN⁵⁰완충액으로 평형화된 CL-4B겔을 사용하여 겔여과를 수행함으로써 반응하지 않고 남아있는 BamH I 링커를 제거한다. 링커를 BamHI으로 분해하고 CL-4B겔을 사용하여 겔 여과를 수행함으로써 cDNA에 과다하게 결찰된 링커를 제거한다.

따라서 BamHI 링커가 양말단에 결찰된 이중가닥 cDNA를 제조한다.

이렇게 수득된 cDNA를 클로닝 벡타 pUC13(스웨덴 파마시아 파인 케미칼즈 제조 및 시판)의 BamH 부위에 삽입한다. 구체적으로 설명하면 pUC13을 BamHI으로 절단한다. BamHI 링커가 양 말단에 결찰된 cDNA를 절단된 pUC13가 가하고 생성된 혼합물을 T4 DNA리가아제 존재하에 4℃에서 16시간동안 반응시켜 cDNA를 벡타pUC13과 결찰시킨다. 생성된 결찰 생성물, 즉 재조합 DNA를 에스케리키아 콜리 균주 DH1(ATCC No. 33849)의 세포에 이전시켜 형질 전환체를 수득한다.

이어서 각종의 길이를 갖는 cDNA 단편을 다음과 같이 cDNA로부터 제조한다. 먼저, 상술한 형질 전환체로부터 cDNA를 제조하고, 50mM 트리스-HCL(pH8.0), 12mM CaCl₂, 12mM MgCl₂및 400mM NaCl로 구성된 Bal31 완충액의 100μl에 용해시킨다.

생성된 용액에 2단위의 엑소뉴클레아제 Bal31을 가하고, 20℃에서 배양한다.배양후 3, 6, 10 및 15분의 각 시점에서 20μl의 반응 혼합물을 수거하고 페놀 추출 및 에탄올 침전시켜 cDNA 단편을 수득한다.

cDNA단편을 70mM 트리스-HCL(pH7.5), 10mM MgCl₂, 5mM 디티오트레이톨 및 20μM dNTP를 함유한 T4 DNA폴리머라제 완충액에 용해시키고, T4 DNA 폴리머라제를 수득된 용액에 가한다. 생성된 혼합물을 37℃에서 30분동안 배양하여 cDNA 단편의 양쪽 말단을 각각 무딘 말단으로 전환시킨다. 이어서, cDNA 단편을 따로 클로닝 벡타 pUC19(스웨덴 파마시아 파인 케미칼즈 AB제조 및 시판)의 HincⅡ부위에 삽입하여 재조한 베타를 형성한다.

재조합 벡타를 따로 이.콜리균주 JM13에 이동시켜 각종크기의 cDNA 단편을 함유한 형질 전환체를 수득한다. 형질 전환체를 따로 배양하여 cDNA 단편 클론을 수득한다. 수득된 클론의 염기서열은 디데옥시 사슬 종졀방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463, 1977 및 Hattori, M. et al., Anal. Biol., 152, 232, 1986)에 의해 결정한다. 결과로 클론중 하나는 JE 비루스의 게놈 RNA의 부분 염기서열에 상응하는 약 4000염기쌍(이후 bp로 약칭한다)으로 구성된 cDNA라는 것이 발견된다. 상기부분 염기서열은 게놈 RNA의 5'-말단의 2000bp 하류부위로부터 출발하여 약 4000염기쌍의 위치까지 확장된다.

이 클론은 K68로 정의한다. 클론 K68은 JE 비루스의 V3 유전자의 일부에 상응하는 염기서열을 함유하나 V3 유전자의 전체서열은 아니라는 것이 발견된다.

그리고, JE 비루스 게놈 RNA에서 V3유전자의 일부에 상보적인 하기의 염기서열을 가지며, 클론 K68의 서열에 포함된 올리고뉴클레오타이드(26mer)를 유기 화학적으로 합성한다.

단계 4[V3 단백징을 코오딩하는 DNA부분을 함유한 클론 S22의 클로닝]

단계 3에서 제조된 올리고 뉴클레오티드(26mer)를 cDNA 합성용 프라이머로 사용하는 것을 제외하고는 단계2와 실제로 같은 방법을 반복하여 cDNA를 수득한다.

이렇게 수득된 cDNA를 따로 클로닝 벡타 pUC13에 삽입하여 재조합 벡타를 수득하고 재조합 벡타를 따로 상술한 이.콜리 균주에 이동시켜 형질 전환체를 형성한다. 형질전환체로부터 알칼리 추충방법[Nucleic Acid Res.,7(6), 1513∼1523(1979)]에 의해 재조합 벡타를 분리하고 단계3에 기재된 방법에 의해 염기서열을 결정한다. 그 결과 재조합 벡타 중 하나가 cDNA 단편이 JE 비루스의 게놈 RNA의 부분 염기서열에 상응하는 약 2500bp의 분자 길이를 갖는 cDNA 단편을 함유한다는 것이 발견된다. 상기의 부분 서열은 게놈 RNA의 5'-말단으로부터 출발하여 약 2500bp의 위치까지 확장된다. 이 cDNA 단편은 클론 S22로 정의된다. 클론 S22의 염기서열 및 염기서열에 의해 코오딩되는 아미노산 서열을 JE 비루스 이외의 2플라보비루스, 즉 황색 열병비루스 및 웨스트나일 비루스의 게놈 RNA의염기서열 및 게놈 RNA에 의해 코오딩되는 아미노산 서열[이 서열은 Rice, C M. et al., Science, 229, 726 1985 및 Wengler, G et al Virology, 147,264, 1985에 기재되어 있다]과 비교한다. 그 결과 클론 S22는 일본 뇌염 비루스의 V3 단백질을 코오딩하는 DNA 부분을 함유한다는 것이 발견된다.

결과는 제2a∼2f도에 나타낸다. 클론 S22를 운반하는 재조합 벡타는 플라스미드 pS22로 정의한다(제3도).

상기에서 수득된 클론 S22를 운반하는 재조합 벡타를 함유한 에스 케리키아 콜리는 이 콜리 군주 JM83/pS22로 정의하며, 일본국 통상 산업상 공업기술원 미생물 공엄기술연구소에 FERM BP-1074의 수탁번호로 기탁되어 있다.

이 균주는 또한 한국종균협회에 1987년 1월 7일자로 KFCC-10307의 수탁번호로 기탁되어 있다.

단계 5[V3 단백질 유전자를 운반하는 형질발현 플라스미드의 형성]

DNA 단편 클론 S22를 운반하는 플라스미드 pS22는 V3 단백질 유전자의 5'-말단의 49bp 상류에 MluI 부위를 가지며 유전자의 3'-말단의 7bp상류에 Sph I 부위를 갖는다.

pS22의 플라스미드를 단계4에 설명된 것과 실제로 같은 방법에 의해 이.콜리 균주 JM83/pS22로부터 분리하고, 10mM 트리스 HCL(pH7.5). 100mM NaCl 및 7mM MgCl₂를 함유한 용액에 용해시킨다. 이렇게 수득된 용액에 제한 효소 MluI 및 EcoRI을 가하고 37℃에서 2시간동안 배양하여 플라스미드의 2부위, 즉 MluI 부위 및 EcoRI 부위를 절단한다.

EcoRI 부위는 MluI부위보다 V3 단백질 유전자의 5'-말단의 상류에 위치한다. 절단후, 혼합물을 페놀추출 및 에탄올 침전시켜 DNA를 회수한다.

이 DNA를 상술한 T4 DNA 폴리머라제 완충액에 용해시키고 37℃에서 30분간 가열하여 DNA의 양쪽 말단을 무딘 말단으로 전환시킨다. 생성된 혼합물을 페놀추출 및 에탄올 침전시켜 DNA를 회수한다.

Xho I링커를 단계 3과 실제로 같은 방법에 의해 DNA의 양쪽 말단에 각각 결찰시킨다.

이.콜리 균주 JM83을 링커-결찰된 DNA로 형질전환시켜 형질전환체를 수득한다. 형질 전환체를 배양함으로써 링커-결찰 DNA를 클로닝한다.

클로닝된 링커 결찰 DNA는 S22로 정의 한다(제3도). S22X를 운반하는 플라스미드는 플라스미드 pS22X로 정의한다.

클론 S22X를 운반하는 플라스미드 pS22X를 10mM 트리드-HCL(pH7.5), 100mM NaCl 및 7mM MgCl₂를 함유한 용액에 용해시키고, 제한효소 Sph I 및 BamH I으로 37℃에서 2시간동안 분해한다.

DNA의 회수 및 T4 DNA 폴리머라제를 사용한 DNA 말단의 무딘 말단으로서의 전환은 상술한 것과 실제로 같은 방법으로 수행한다. 유니버살 터미네이터(스웨덴 파마시아 파인 케미칼즈사 제조 및 시판)를 DNA에 결찰시키고 터미네이터-결찰 DNA를 사용하여 이.콜리 균주 JM83을 형질 전환시킨다. 상기에서 수득된 DNA는 클론 S22X로 정의한다(제3도).

한편, 형질 발형 벡타 YEp133PCT룰 사용한다. 이 벡타는 본 발명자들에 의해 다음과 같이 형성된다. 첫째, 플라스미드 YEp13(ATCC 수탁번호 37115)에 있어, 플라스미드를 Xho I 및 Sal I우로 절단함으로써 수득된 그의 LEU2 유전자 단편을 나머지 플라스미드 단편에 역방향으로 결찰시켜 유전자 단편의 양 말단에서 Xho I부위 및 Sal I부위를 제거한다.

둘째, 플라스미드의 Tc' 유전자에 존재하는 BamH I-Sal I 단편을 pPH05로부터 유도된 PH05 프로모터를 함유한 약 650bp 길이의 Bam I-Sal I단편으로 대치한다(Kenji Arima et al., Nucl. Acid Res. 11. 1657.1983 참고). 셋째, 상기에 대치된 BamH I-Sal I 단편을 엑소뉴클레아제 Bal 31을 사용하여 그의 Sal I 부위로부터 그의 함유된 프로모터의3'-말단으로 정리한다. 넷째, Xho I 링커를 그의 3'-말단에서 프로모터에 삽입하여 클로닝 부위를 배합한다. 다섯째, Xho I 및 Sal I 링커를 각각 HindⅢ 및 EcoR I 부위에서 TRP1 터미네이터를 함유한 HindⅢ-EcoR I 단편에 결철시킴으로써 제조된 약 800bp 길이의 DNA 단편 및 HindⅢ-EcoR I 단편이 YRp7(ATCC 수탁번호 37060)으로부터 수득된 ARS(자동복제 서열)에 상기에서 제조된 클로닝 벡타에 삽입함으로써 형질 발현 벡타 YEp133PCT를 수득한다.

이렇게 수득된 형질 발현 벡타에 V3 단백질 유전자의 cDNA를 삽입한다. 구체적으로 설명하면, pS22XS를 제한 효소 Xho I 및 Sal I으로 분해하고 생성된 혼합물을 아가로즈 겔 전기영동하여 분자길이가 약 1600bp인 DNA단편을 회수한다.

회수된 DNA단편을 그의 Xho I 부위에서 형질 발현 벡타 YEp133PCT에 결찰 시킨다.

이.콜리 균주 JM83을 생성된 플라스미드로 형질 전환체를 형성한다. 형질 전환체를 분리하고 L-배지(1W/V% 박토트립톤, 0.5W/V 이스트 추출물, 0.5W/V% 염화 나트륨, 25㎍/ml 암피실린, pH7.2∼7.4)에서 배양한다.

상술한 알카리 추출 방법에 의해 형질 전환체로부터 플라스미드를 추출한다. 추출된 플라스미드에서 V3유전자를 포함한 DNA단편이 YEp133PCT에 결찰된 방향을, 플라스미드를 각종 제한효소로 분해하고, 분해 혼합물을 아가로즈 겔 전기영동함으로써 확인한다.

이 플라스미드는 pJEV3으로 정의한다(제4도 참고).

이 플라스미드로 이스트 형질 전환시키고 배양한다. 배양된 이스트에서 V3단백질의 생성은 ELISA 방법에 따라 확인한다.

V3 단백질의 생산 효율을 증가 시키기 위해 플라스미드 pJEV3를 재구성하려는 각동 시도가 있었다. 결과는 제5도에 나타낸다. 특히, pJEV3 DNA를 제한 효소 Xho I으로 분해하고 분해된 DNA의 양말단을 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 무딘 말단으로 전환시킨다. 생성된 DNA를 제한 효소 BamH I으로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동하여 13.000bp 길이의 DNA 단편을 회수한다.

이 DNA는 PH05 프로모터 부분이 없는 pJEV3에 해당된다. 한편, PH05 구조 유전자의 번역개시 코오돈 ATG를 이용하기 위해 pPH05를 제한 효소 BamH I 및 Dra I 으로 분해하고, 분해 혼합물을 아가로즈 겔 전기영동하여 PH05 프로모터 부분의 550bp 길이 DNA단편을 회수한다. 상술한 13.000bp DNA 단편을 이 550bP DNA 단편에 결찰시킨다.

이.콜리 균주 JM83을 결찰된 DNA로 형질전환시키고, 배양하여 결찰된 DNA를 클로닝한다.

생성된 클로닝된 DNA를 플라스미드 pJM105로 정의한다. 제4도의 유통도는 pJM105의 제조방법을 설명하는 것이다.

상기의 클로닝된 pJM105를 이용하면 519 아미노산으로 구성되어, 아미노산들이 하기의 순서로 결합된 아미노산 서열을 갖는 폴리팹티드를 제조할 수 있다.

(a) PH05로부터 유도된 2 아미노산, 즉 Met-Phe-;

(b) V1단백질 유전자의 하술하는 cDNA와 PH05 프로모터 사이의 부분으로부터 유도된 2 아미노산, 즉-Ser-Arg-;

(c) JE 비루스의 제놈 RNA에서 V3 단백질 유전자의 상류에 있는 V1 단백질 유전자의 cDNA로부터 유도된 16 아미노산, 즉 -Arg-Val-Val-Phe-Thr-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-Ala-Pro-Ala-Tyr-Ser-;

(d) 상술한 일반식(I)로 표시되는 아미노산의 C-말단으로부터 2 아미노산, 즉-His-Ala-가 삭제된 아미노산 서열을 가지며, V3 단백질의 cDNA로부터 유도된 498 아미노산; 및

(e) 유니버산 터미네이터로부터 유도된 1 아미노산 ,즉 -Ala-

단계 6[형질 발현 플라스미드 pJM105에 의한 이스트 형질 전환 및 형질전환된 이스트의 분리]

이스트 사카로미세스 세레비시아에(Saacharomyces Cerevisiae) 균주 SHY4(ATCC 수탁번호 44772)를 알칼리 양이온 방법에 따라 형질 발현 플라스미드 pJM105로 형질 전환시킨다. 상세히 설명하면, 이스트 YPD 배지(2W/V% 박토팹톤, 1W.V% 이스트 추출물, 2W/V% 댁스트로즈)에서 배양하고 5ml의 배양액을 2500rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 수거한다. 세포를 5ml의 TE 완충액(10mM 트리스 -HCL, pH8.0, 0.1mM EDTA)에 현탁시키고, 원심분리하여 세포를 수거한다. 세포를 0.6ml의 TE 완충액에 재현탁시킨다. 0.5ml의 현탁액에 0.5ml의2M 리튬 아세테이트를 가하고 30℃에서 60분간 배양한다. 8μl의 플라스미드 DNA를 0.1ml의 배양액에 가하고, 30℃에서 30분간 배양한다. 생성된 배양액에 0.1ml의 70W/W% 폴리에틸렌글리콜 4000을 가하고 60℃에사 60분간 배양한다.

배양액에 2ml의 증류수를 가하고 2500rpm에서 5분동안 원심분리하여 세포를 수거한다.

세포를 소량의 증류수에 재현탁시키고 류신을 함유하지 않은 선택적 배지인 SD 한천 배지[질소기재의 아미노산이 없는 0.67W/V% 박토이스트 (미국 Difco사 제조 및 시판), 2W/V% 댁스트로즈, 20㎍/ml 우라실, 20㎍/ml L-트립토판, 20㎍/ml L-히스티딘, 2W/V% 한천]에 접종시킨다. 배양에 의해 형성된 군락을 분리하여 형질 전환된 이스트를 수득한다.

형질 전환된 이스트 SHY4/pJM105로 정의한다.

단계 7[형질 전환된 이스트 배양 및 항원의 추출]

형질 전환된 이스트 SHY4/pJM105를 부르크홀더 배지[1.5g/l 열 염기성 인산 칼륨을 함유한 완전하게 합성된 배지(Burkholder. P.R. et al., Am. J. Botany. 30. 206. 1943]에 접종시키고 30℃에서 24시간동안 전탕 배양한다,.

배양후 배양액을 2500rpm에서 5분동안 원심분리 하여 세포를 수거한다.

세포를 증류수로 한번 세척하고 상술한 열염기성 인산 칼륨 대신 1.5g/l 염화 칼륨을 함유한 부르크홀더 배지에 접종시키고 30℃에서 48시간 동안 진탕 배양한다.

배양후, 세포를 원심분리에 의해 수거하여 세척하고 0.01M 인산 완충액(pH9.0)에 재현탁시킨다. 유리 구슬을 현탁액에 넣고 격렬하게 흔들어 세포를 파괴한다.

생성돤 현탁액을 10.000rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 분리한다. 따라서 이스트 추출물을 수득한다.

단계 8[형질 전환된 이스트 항원생산 효율]

ELISA 방법에 따라 이스트 추출물에서 항원의 정량 분석을 수행한다. 캐칭 항체로는 과량의 일본 뇌염 비루스(나가야마 균주)로 면역화된 생쥐의 혈청으로부터 수득된 정제된 IgG 및 검출 항체로는 HRPO(홍당무퍼옥시다제)-접합 항-일본 뇌염 V3 단백질 단일 클론 항체(Kimura. K. J. et al., J Virol. 45. 124. 1983)를 사용하여 샌드위치 방법에 의해 ELISA 타이터를 분석한다. ELISA 데이터를 분석을 수행하는 데 있어, 착색반응 o-페닐렌디아민으로 전개하고 420nm에서 흡광도를 측정한다.

시험견본의 ELISA 항원타이터는 표준으로 참고용 일본뇌염비루스 항원R-181(National Institute of Health of Japan)을 100단위로 하여 결정한다.

ELISA의결과는 표 1에 나타낸다. 분석에 의해 형질 전환된 SHY4/pJM105는 본 발명의 항원을 효과적으로 생산한다는 것이 확인된다.

[표 1]

1) 참고용 일본 뇌염 항원lot 181

단계 9[웨스턴 블로팅 기술에 따라 형질 전환된 이스트 SHY4/pJM105에 의해 생성된 항원의 확인 및 분자량 결정]

이스트로부터 항원 추출물을 20∼30W/V% 슈크로오즈 경사에 21.000rpm에서 20시간동안 원심분리함으로써 정제한다.

본 발명의 정제된 항원을 함유한 분획을 1W/V% 2-메르캅토에탄올/125mM 트리스-HCL (pH6.8)에 넣고 실온에서 20분간 유지한 후 10%폴리 아크릴 아미드겔에 전기영동한다. 겔을 제거하고 겔에 있는 단백질을 트랜스브로트

세포(미국 Bio-RAD사 제조 및 시판)를 사용하여 니트로셀룰로오즈막에 블로트한다. 생성된 니트로셀룰로오즈 필름을 상술한 항-일본 뇌염 비루스 V3 단일 클론 항체와 반응시키고 HRPO-접합 항-생쥐 IgG 염소 IgG와 반응시킨다.

착색반응을 4-클로로인도나프톨로 전개 시켜 항원의 확인을 수행한다.

제6도는 양 53KD(킬로달톤)의 분자량을 갖는 단백질과 항-V3 단일 클론 항체 사이의 반응을 설명하는 것이다. 이 분자량은 단계 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코오딩하는 염기 서열로부터 계산된 것과 일치 하기 때문에 이 단백질은 V3단백질의 아미노산 서열의 C-말단으로부터 세어 첫 번째및 두 번째 아미노산이 삭제된 아미노산 서열을 함유한 항원이라는 것이 확인된다.

단계 10[ 형질 전환된 이스트에 의해 생성된 본 발명의 항원의 면역성]

단계 7에서 수득된 항원 추출물을 20∼50W/W% 슈크로오즈 경사에 20.000rpm에서 20시간 동안 원심 분리하여 부분 정제된 항원을 수득한다. 항원을 보조제인 수산화 알루미늄과 혼합하여 항원용액을 수득한다.

항원용액을 4,20 및 100의 양(ELISA 항원 타이터)으로 4주된 ddY 생쥐에 복강내 주사하여 면역화시킨다.

1주후, 같은 양의 항원 추출물을 주사하여 생쥐를 면역화시킨다. 1주후, 각 생쥐로부터 혈액을 수거한다,

혈액에 대해 일본의 뇌염 비루스에 대한 ELISA 항체 타이터를 상술한 ELISA방법에 따라 분석하고, 일본 뇌염 비루스에 대한 중화 항체 타이터를 상술한 50% 플라크 환원 방법에 따라 분석한다. 결과는 표 2에 나타낸다. 표에서 나타낸 바와 같이 항원의 ELISA 항체 타이터는 ELISA 방법에 의해 검출되나, 중화항체타이터는 상술한 면역화 방법에서 검출되지 않는다.

[표 2]

1) ELISA 항원 타이터

2) 50% 플라크 환원방법에 따라

3) 참고용 일본 뇌염 항원 lot 181

단계 11[형질 전환된 이스트에 의해 생성된 항원의 면역성]

단계 10과 실제로 같은 방법에 의해 제조된 항원용액을 각 생쥐의 복강에 7일 간격(1,8,15,22,29 및 36일째)으로 6번 주사한다. 43일째에 각 생쥐로부터 혈액을 수거한다.

JE 비루스에 대한 혈액의 중화 항체 타이터를 JE 비루스로 나까야마 균주, 뻬이징 균주 및 JaOArS982 균주를 사용하여 분석하고 결과는 표 3에 나타낸다.

표에 나타낸 바와 같이 JE 비루스의 나까야마, 뻬이징 및 JaOArS982 균주 모두에게 중화 항체가 검출된다.

[표 3]

1),2),3): 표 2에서 설명.

[실시예 2]

실시예 1의 단계 4에서 수득된 이.콜리 균주 JM83 pS22를 배양하여 균주의 세포를 수득한다. 이렇게 수득된 세포로부터 실시예 1의 단계 4에 설명된 바와 같이 알칼리 추출방법에 의해 플라스 미드 pS22 DNA를 분리한다.

분리된 플라스 미드 DNA를 10mM 트리스-HCL(pH7.5). 100mM NaCl 및 7mM MgCl₂를 함유한 수용액을 용해시킨다. 생성된 혼합물에 제한 효소 Mlu I 및 Sph I을 가하고 37℃에서 2시간동안 배양함으로써 플라스 미드 DNA를 분해한다. 생성된 혼합물을 아가로즈 겔 전기 영동한다. 생성된 아가로즈 겔로부터 JEV3 단백질을 코오딩하는 염기서열을 함유한 약 1500bp의 분자량을 갖는 DNA단편을 회수한다. 제한 효소 Mlu I및 Sph I 대신 제한 효소 Nru I 및 Dde I을 사용하는 것을 제외하고는 상술한 것과 실제로 같은 방법에 의해 제한 효소를 사용하여 DNA 분해물을 수득한다. 이렇게 수득된 DNA 분해물을 아가로즈 겔 전기영동한다.

새어어된 아가로즈 겔로부터, 약 350bp의 분자 길이를 갖는 DNA단편을 회수한다.

회수된 DNA 단편을 Xho I 링커를 사용하여 실시예 1의 단계 3에서 수득된 벡타 YEp133PCT에 결찰시켜 재조합체를 수득한다. 재조합체를 이.콜리 균주 DH1의 세포에 이동시켜 형질 전환체를 수득한다.

상기에서 수득된 형질 전환체로무터 약 350bp의 목적하는 DNA 단편을 함유한 형질 전환체의 선택은 JEV3 단백질을 코오딩하는³²P-표자 DNA를 탐침으로 사용하여 군락 혼성화 방법에 위해 수행된다.

³²P-표지된 DNA는 다음과 같이 제조된다.

먼저 실시예 1의 단계 5에서 수득된 플라스 미드 pS22X를 제한효소 Xho I 및 Sal I으로 분해하고 생성된 혼합물을 아가로즈 겔 전기 영동하여 분자 길이가 약 1600bp인 DNA 단편을 회수한다. RM²다음, 회수된 DNA단편을 니트 번역 키트 N. 5000(Amersham Japan Limited 사 제조 및 시판)을 사용하여 니크 번역에 의해³²P-표지시킨다. 따라서, 상술한³²P-표지된 DNA를 수득한다.

상술한 군락 혼성화 방법에 의해 선택된 형질 전환체를 배양하여 형질 전환체의 클론을 수득한다. 클론으로부터 상술한 알칼리 추출방법에 의해 플라스미드를 분리한다.

이렇게 수득된 플라스미드로 이스트 균주 SHY4의 세포를 형질 전환시킨다.

생성된 세포를 실시예 1의 단계 6에서 설명한 SD 한천 배지에서 배양한다.

배양에 의해 형성된 군락을 분리하여 형질 전환된 이스트를 수득한다.

형질 전환된 이스트를 사용하여 일반식(I)의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 세어 375∼456번째 아미노산으로 구성된 일반식(I)의 아미노산의 일부를 함유한 폴리 펩티드를 제조한다.

실시예 1의 단계 7과 실제로 같은 방법으로 형질 전환체를 배양하여 이스트 세포를 수득하고 이렇게 수득된 이스트 세포로부터, 이스트 추출물을 수득한다.

이렇게 수득된 이스트 추출물의 분획을 JEV3 단백질의 4항원 티터젼트부분(1∼4군)에 대한 각 4단일클론 항체[J. Kimura-Kuroda and K. Yasui, Journal of Virology, 45(1). 124∼132(1983)]를 사용하여 클라크 및 카잘스의 방법(Amercian Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 7, 561∼573(1958))에 따라 혈구 응집 반응-억제(HAI) 시험한다. 결과는 이후에 기재될 표 4에 나타낸다. 결과는 형질 전환된 이스트의 이스트 추출물이 JEV3 항원의 항원디터전트 부분4군에 대한 단일클론 항체와 특별히 결합한 물질을 함유한다는 것을 나타낸다.

형질 전환된 이스트에 포함된 플라스미드를 pV3G4-96이라고 정의하며 형질 전환된 이스트는 이스트 균주 SHY4/pV3G4-96으로 정의 한다.

상기에서 수득된 이스트 추출물을 실시예 1의 단계 9와 실제로 같은 방법에 의해 정제하여 본 발명의 정제된 항원을 수득한다.

[실시예 3]

실시예 2와 실제로 같은 방법으로 반복하여 JEV3 단백질을 코오딩하는 염기서열을 함유한 약 1500bp의 분자길이를 갖는 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 제한 효소 HpaⅡ, Bg131 및 Stu I으로 연속분해하여 DNA분해물을 수득한다. DNA 분해물을 아가로즈 겔 진기영동하여 약 700∼800bp의 분자 길이를 갖는 DNA단편을 회수한다. 회수된 DNA 단편을 Xho I 링커를 사용하여 그의 Xho I 부위에서 벡타 YEp133PCT에 결찰시켜 재조합체를 수득한다. 재조합체를 이.콜리 균주 DH1의 세포에 이동시켜 형질 전환체를 수득한다.

상기에서 수득된 형질 전환체로부터 약 700∼800의 DNA단편을 함유한 형질 전환체의 선택은 실시예 2와 실제로 같은 방법에 따라 군락 혼성화 방법에 의해 수행한다. 이렇게 선택된 형질 전환체를 배양하여 형질 전환체의 클론을 수득한다. 클론으로부터 상술한 알칼리 추출 방법에 의해 플라스미드를 분리한다. 수득된 플라스미드로 이스트 균주 SHY4의 세포를 형질 전환시킨다.

생성된 세포를 실시예 1의 단계 6에 설명된 것과 같은 SD 한편 배지에서 배양한다.

배양에 의해 형성된 군락을 분리하여 형질 전환된 이스트를 수득한다.

형질 전환된 이스트를 사용하여 일반식(I)의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 세어 45∼159번째 아미노산으로 구성된 일반식(I)의 아미노산 서열의 일부를 함유한 폴리 펩티드를 제조한다. 실시예 1의 단계 7과 실제로 같은 방법에 의해 형질 전환된 이스트를 배양하여 이스트 세포를 수득하고 이렇게 수득된 이스트세포로부터 이스트추출물을 수득한다.

이렇게 수득된 이스트 추출물의 분획을 실시예 2와 같은 방법으로 HAI 시험한다. 결과는 하기 표 4에 나타낸다.

결과는 형질 전환된 이스트의 이스트추출물이 JEV3 항원의 항원 디터전트 부분 1군에 대한 단일 클론 항체와 특별히 결합한 물질을 함유한다는 것을 나타낸다. 형질 전환된 이스트에 포함된 플라스미드는 pV3Gl-38로 정의하며, 형질 전환된 이스트 균주 SHY4/pV3Gl-38로 정의한다.

상기에서 수득된 이스트 추출물을 실시예 1의 단계 9와 실제로 같은 방법에 의해 정제하여 본 발명의 정제된 항원을 수득한다. 한편, 실시예 1의 단계 7과 실제로 같은 방법에 의해 플라스미드를 보유하지 않은 이스트 균주 SHY4의 세포로부터 이스트 추출물을 수득한다. 이렇게 수득된 이스트 추출물을 대조군으로 사용하고 상술한 바와 같은 방법으로 HAI 시험한다.

결과는 표 4에 나타낸다.

[표 4]

주 : 1) Journal of Virology. 45(1) 124∼132(1983)에 보고된 항원 디터젼트 부분의 군에 해당하는 단일 클론 항체군의 수.

Claims (9)

1. (a) 목적 항원을 코오딩하는 염기서열을 함유한 데옥시리보헥산을 복제 가능한 형질 발현 벡타에 결찰시켜 상기의 데옥시리보헥산 및 상기의 복제 가능한 형질 발현 벡타를 함유한 가능한 재조합 DNA를 수득하고; (b) 수득된 복제 가능한 재조합 DNA로 미생물 세포 또는 세포 배양액을 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성하고; (c) 미생물의 모세포 또는 세포 배양액으로부터 형질 전환체를 선택하고; (d) 형질 전환체를 배양하여 형질전환체가 데옥시리보헥산을 형질 발현하여 항원을 생성하게 하고; (e) 배양된 형질 전환체로부터 항원을 분리함을 특징으로 하는 항-플라비 비루스 항원체에 반응성인 하나이상의 에피토프를 함유한 하기 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 적어도 일부를 포함하는 항원의 제조 방법.

   

   

   (식중, Ala는 알라닌 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, Asn은 아스파라긴 잔기, Asp는 아르파르트산 잔기, Cys는 시스테인 잔기, Gln은 글루타민 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ile는 이소류신 잔기, Lys는 리신 잔기, Leu는 류신 잔기, Met는 메티오닌 잔기, Phe는 페닐 알라닌 잔기, Pro는 프롤린 잔기, Ser은 세린 잔기, Thr는 트레오닌 잔기, Trp는 트립토판 잔기, Tyr은 티로신 잔기 및 Val은 발린 잔기를 나타낸다.
2. 제1항에 있어서 상기 항-플라비 비루스 항체가 항-일본 뇌염 V₃단백질 항체인 방법.
3. 제1항에 있어서 상기 아미노산 서열의 일부가 일반식(I)의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 세어 1∼498번째 아미노산의 서열에 해당하는 방법.
4. 제1항에 있어서 상기 아미노산 서열의 일부가 일반식(I)의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 45∼159번째 아미노산의 아미노산 서열에 해당하는 방법
5. 제1항에 있어서 상기 아미노산 서열의 일부가 일반식(I)의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 세어 375∼456번째 아미노산의 아미노산 서열의 해당하는 방법.
6. 제1항에 있어서 상기 항원이 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 일부, 및 그의 C-말단 및 /또는 N-말단에 부착된 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 적어도 일부를 갖는 항원 이외의 펩티드의 아미노산 서열을 함유한 융합펩티드인 방법
7. 제1항에 있어서 상기 DNA가 하기 일반식(Ⅱ)로 표식되는 염기서열 및 유전코드의 축퇴(degeneracy)에 의해 하기 일반식(Ⅱ)의 염기서열의 적어도 하나의 염기를 치환하는 것에 의해 수득된 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 항-플라비 비루스에 반응성인 하나 이상의 에피토프를 코오딩하는 염기 서열의 적어도 일부를 포함하는 DNA인 방법.

   

   

   

   (식중, A는 데옥시아데닐린 잔기, G는 데옥시구아닐린 잔기, C는 데옥시시티딜산, 잔기 및 T는 데옥시티미딜산 잔기를 나타내고 일반식(Ⅱ)의 L좌측 및 우측 말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록 실기측을 나타낸다.)
8. 항-플라비 비루스 항체에 반응성인 하나이상의 에피토프를 함유한 하기 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 면역학적으로 유효한 량의 플라비 비루스 항원 및 한가지 이상의 약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 혼합하는 것을 포함하는 플라비 비루스용 백신의 제조방법.

   

   

   (식중, Ala는 알라닌 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, Asn은 아스파라긴 잔기, Asp는 아르파르트산 잔기, Cys는 시스테인 잔기, Gln은 글루타민 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ile는 이소류신 잔기, Lys는 리신 잔기, Leu는 류신 잔기, Met는 메티오닌 잔기, Phe는 페닐알라닌 잔기, Pro는 플로린 잔기, Ser은 세린 잔기, Thr는 트레오닌 잔기, Trp는 트립토판 잔기, Try는 티로신 잔기 및 Val은 발린 잔기를 나타낸다.
9. 제8항에 있어서, 상기 플라비 비루스용 백신은 일본 뇌염 백신인 방법.

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