KR101145911B1 - 대장균의 외막단백질 ＯｍｐＷ를 이용한 목적단백질의 표면발현 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 C-말단이 제거된 OmpW를 외래단백질의 표면 발현 모체로 포함하는 외래단백질의 표면 발현벡터에 관한 것으로, 구체적으로 139번째 아미노산 이후의 C-말단 또는 191번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 OmpW를 외래단백질의 표면 발현 모체로 포함하는 외래단백질의 표면 발현벡터에 관한 것이다. 본 발명의 외래단백질이 표면발현된 세포는 단백질 어레이, 항체제작, 생물전환 및 외래단백질 개량에 유용하게 이용될 수 있다.
OmpW, 표면 발현 모체, 단백질 어레이, 항체제작, 생물전환, 단백질 개량
Description
본 발명은 OmpW를 외래단백질의 표면 발현 모체로 포함하는 외래단백질의 표면 발현벡터에 관한 것이다.
세포 표면 발현은 단백질이나 펩타이드 등을 적절한 표면 발현 모체(anchoring motif)와 융합시켜서 그램 음성, 양성균, 곰팡이, 효모, 동물세포의 표면에 발현 시키는 기술을 말한다(Lee SY et al., Trends Biotechnol., 21:4552, 2003). 최초의 세포표면 발현 기술은 1980년대 상대적으로 표면이 단순한 파이지를 이용하여 펩타이드나 작은 단백질을 필라멘터스 파아지(filamentous phage)의 pIII와 융합하여 발현시켜 이를 표면 발현 시스템(surface-expression system)이라고 하였다. 파아지를 이용한 세포표면 발현은 항체의 스크리닝이나, 에피토프(epitope), 고친화성 리간드 등의 스크리닝에 사용되었으나, 파아지의 표면에 발현될 수 있는 단백질의 크기가 상대적으로 제한이 되어있어서 한계점을 드러내게 되었다. 따라서 그 대안으로 박테리아를 이용한 세포 표면 발현이 개발되었다. 즉, 박테리아나 효모와 같은 미생물의 표면 단백질을 표면 발현 모체(surface anchoring motif)로 사용하여 외래단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 분야이다.
복잡한 막구조를 가지고 있는 대장균과 같은 박테리아에서 세포 표면 발현을 성공적으로 수행하기 위해서는 우선 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래단백질을 세포 표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 표면 발현 모체의 사용이 요구되는데, 지금까지 대장균에서 사용된 표면 발현 모체는 외막 단백질, 지질단백질(lipoprotein), 자기전달체(autotranspoters), 표면 부속물(surface appendage)의 S층(S-layer) 단백질 등이 표면 발현 모체로 사용되었다. 그중에서 외막 단백질의 경우 3차원 구조가 세포외막을 통과하는 루프 구조를 가지고 있으므로, 다양한 단백질을 발현할 수 있는 융합 부위(site)를 제공할 수 있는 장점으로 인하여 표면 발현 모체로 많이 사용되었다.
그 중 Omp(Outermembrane Protein)A, OmpS, LamB, OprF, PhoE 등과 같은 세포 외막 단백질의 경우 상대적으로 분자량이 작은 펩티드, 항체, 도메인, 수용체 등의 발현에 사용되었다(Agterberg M et al., Gene 88:37-45, 1990; Lang H et al., Eur. J. Bacteriol., 267:163-170, 2000). 삽입된 외래단백질의 C-말단과 N-말단이 입체적으로 가깝게 위치해야 하므로, 단백질이 큰 경우에는 단백질의 안정성이 낮아진다. 실제로 LamB 또는 PhoE의 경우 50 내지 60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래단백질을 삽입하면, 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하 지 못하고, 대장균의 포린(porin) 세포 외막 단백질을 사용하는 경우, 최고 150개의 아미노산으로 구성된 단백질이 아닌 에피토프(epitope)나 금속결합 모티프(metal binding motif) 등에 국한되어 사용되었다(Stahl S et al., Trends Biotechnol., 15:185-192, 1997; Kjaergaad K et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:10-14, 2000).
박테리아의 분비 시스템을 응용한 세포 표면 발현의 응용 범위는 매우 넓다. 표면에 발현되는 단백질이나 펩타이드 등에 따라 다양한 용도로 사용될 수 있다. 특정 단백질을 표면에 발현 하여 펩타이드나 항체, 수용체 등의 스크리닝을 간단하게 수행할 수 있고(Francisco JAR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10444-10448, 1993), 항원 에피토프를 세포 표면에 발현시켜서 강력한 면역 반응을 나타낼 수 있는 생백신(live vaccine)을 생성할 수 있다. 또한 정밀화학, 농약, 의약 등에서 요구되는 특정효소를 세포표면에 발현하여 전세포 생촉매의 용도로 사용하거나, 오염물질을 분해하거나, 금속 이온을 흡착할 수 있는 단백질을 발현하여 생물학적 분해(bioremediation)에 사용할 수 있다(Charbit A et al., Gene 70:181-189, 1988; Sousa C et al., J. Bacteriol., 180:2280-2284, 1998; Richins R et al., Nat. Biotechnol., 15: 984-987, 1997).
본 발명자들은 성공적인 세포 표면 발현을 위해서는 표면 발현 모체의 대상으로서 대장균의 세포외막 단백질 OmpW를 선택하였다. 대장균의 OmpW는 그람 음성균이 많이 보유하고 있는 작은 외막 단백질 패밀리(small outer membrane protein family)에 속하는 외막 단백질로서 그 기능은 정확히 알려져 있지 않지만, 최근 연구결과에 의하면 환경 스트레스에 저항하는 기능이 있는 것으로 알려져 있다. OmpW 단백질의 구조를 살펴보면, 단백질의 N-말단과 C-말단이 주변세포질에 존재하며 4개의 루프(loop)가 세포외막 바깥쪽으로 나와 있고, 3개의 루프가 주변세포질 쪽으로 나와 있다(Heedeok et al., A. Biol. Chem. 281: 7568-7577, 2006).
현재 까지 다양한 종류의 세포표면 발현 모체가 보고되어있다. 그러나 세포표면 발현 모체로 표면 발현시킬 수 있는 대상이 제한되어 다양한 단백질을 세포표면 발현시키기 위해서는 서로 다른 세포표면 발현 모체를 개발하는 것이 필요하다고 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 대장균의 세포외막 단백질 OmpW의 세포외막 바깥쪽으로 나와 있는 4개의 루프 중 발현 가능성이 클 것으로 예상되는 C-말단의 3 및 4번째 루프가 제거된 OmpW를 외래단백질의 표면 발현 모체로 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 이용하여 페르하이드롤라아제(perhydrolase)와 리파제를 융합발현시킨 결과, 상기 효소들이 세포표면에 발현될 뿐만 아니라 생물전환반응에도 유용한 것을 확인함으로써, 본 발명의 C-말단이 제거된 OmpW가 외래단백질의 안정적인 세포표면 발현에 유용하게 이용될 수 있음을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 C-말단이 제거된 OmpW를 외래단백질의 표면 발현 모체로 포함하는 상기 외래단백질의 표면 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된, 상기 외래단백질이 표면발현된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 외래단백질이 표면발현된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 외래단백질이 표면발현된 세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 포함하는 단백질 어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 항체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 생물전환 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 외래단백질의 개량방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표면 발현 모체로 C-말단이 제거된 OmpW와 외래단백질의 유전자를 포함하는 상기 외래단백질의 표면 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된, 상기 외래단백질이 표면발현된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 외래단백질이 표면발현된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 외래단백질이 표면발현된 세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 포함하는 단백질 어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 숙주에 투여하여 면역반응을 유도하는 단계; 및,
2) 상기 면역반응에 의해 상기 개체내에서 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 상기 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 항체 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 생물전환 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 외래단백질의 변이체를 암호화하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;
2) C-말단이 제거된 OmpW를 상기 외래단백질 변이체의 표면 발현 모체로 포함하는 상기 외래단백질 변이체의 표면 발현벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 표면 발현벡터가 형질 도입된, 상기 외래단백질 변이체가 표면발현 된 형질전환체를 제조하는 단계;
4) 상기 형질전환체를 배양하여 상기 외래단백질 변이체가 표면발현된 세포를 제조하는 단계;
5) 개량된 형질을 갖는 외래단백질 변이체가 표면발현된 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 외래단백질의 개량방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"외래단백질(heterologous protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 목적 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현할 수 있는 모든 단백질을 의미한다.
"융합 단백질(fusion protein)"은 원래의 외래단백질의 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.
"발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 또한, 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 증폭제(enhancer), 폴리아데닐화 신호, 기타 등을 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
"작동 가능하게 연결된"은 단편은 배열되어서 그들은 일제히 그들의 의도한 목적, 예를 들면, 전사는 프로모터에서 개시하고 암호화 단편을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하는 것을 나타낸다.
"생물전환"은 생체내에 존재하는 효소나 생체 자체를 생물학적 촉매로 이용하여 화합물의 화학적 변화를 일으키는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표면 발현 모체로 C-말단이 제거된 OmpW와 외래단백질의 유전자를 포함하는 상기 외래단백질의 표면 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, OmpW의 3 및 4번째 루프(loop) 이후의 C-말단이 제거된 OmpW를 발현하는 pSHO13 및 pSHO19 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1 참조). 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제(perhydrolase)를 융합발현시킨 결과, 상기 페르하이드롤라아제가 세포표면에 발현된 것을 면역형광분석방법으로 확인하였고(도 2 참조), 또한 상기 세포표면에 발현된 페르하이드롤라아제가 베타-부티로락톤(beta-butyrolactone)을 개환중합(ring opening polymerization)하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다. 또한, 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 리파제를 융합발현시킨 결과, 상기 리파아제가 트리뷰티린이 첨가된 배지에서 할로(halo)를 형성하였고(도 3 참조), 베타-부티로락톤을 개환중합하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다.
현재 까지 다양한 종류의 세포표면 발현 모체가 보고되어있다. 그러나 세포표면 발현 모체로 표면 발현시킬 수 있는 대상이 제한되어 다양한 단백질을 세포표면 발현시키기 위해서는 서로 다른 세포표면 발현 모체를 개발하는 것이 필요하다고 할 수 있다. OmpW의 경우 대장균 자체의 외막단백질이고, 단백질의 크기가 작으므로 대장균을 숙주로 하여 외래단백질을 융합 발현 시에 용이하여, 표면발현 가능성을 높인다. 또한, 여러 세포표면 발현 시스템에서 세포표면 발현된 효소의 단점이라 지적되어온 안정성을 가지고 있다. 즉, 세포표면 발현된 효소가 여러 조건(고온, 유기용매 등)에서 오랜 시간동안 활성을 유지하는 장점을 가지고 있다.
이에, 본 발명의 표면 발현벡터는 외래단백질을 세포표면에 발현시키는데에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 OmpW는 대장균의 세포외막 단백질 OmpW의 세포외막 바깥쪽으로 나와 있는 4개의 루프 중 발현 가능성이 클 것으로 예상되는 C-말단의 3 또는 4번째 루프가 제거된 형태로, 구체적으로 139번째 아미노산 이후의 C-말단 또는 191번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 형태이다.
상기 발현벡터는 뼈대 벡터에 표면 발현 모체로서 C-말단이 제거된 OmpW 유전자와 외래단백질의 유전자가 연결되어 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, pUC18, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 발현벡터는 pUC18 뼈대 벡 터에 상기 C-말단이 제거된 OmpW 유전자와 외래단백질의 유전자를 삽입할 부위를 일련의 순서로 포함함으로써 상기 OmpW와 외래단백질을 재조합 단백질로 세포 표면에 발현할 수 있다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 상기 OmpW 및 외래단백질을 암호화하는 염기서열은 순차적으로 연결될 수 있고, 또는 링커로 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 외래단백질은 표면발현에 유리하도록 외래단백질 아미노산 서열 중 일부분이 제거되거나 위치 특이적으로 돌연변이될 수 있다. 상기 외래단백질은 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 특히, 의료, 연구용 및 산업용 단백질, 예를 들어, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 혹은 그 일부분, 항원, 항체 혹은 그 일부분, 단쇄항체, 세포수용체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성을 갖는 다양한 외래단백질을 재조합 단백질로 발현할 수 있다. 구체적으로, 의료, 연구용 단백질로는 대표적으로 인간 미니프로인슐린(human minipro-insulin), 인간 상피세포 성장인자(human epidermal growth factor), 인간 프리프로-그렐린(human prepro-ghrelin), 인간 인터루킨-2(human interleukin-2), 인간 활성유도 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase), 인간 글루타메이트 디카르복실레이즈(human glutamate decarboxylase), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor) 및 한냉 자가염증 증후군 Nacht 도메인[cold autoinflammatory syndrome1(NALP3) Nacht domain] 등이 있고, 산업용 단백질로는 제1형 당뇨병의 진단 마커로 알려진 글루탐산 탈카르복시화 효소의 448 내지 558 아미노산(glutamate decarboxylase448-585)과 섬유의 전처리에 이용되고 플라스틱 분해능을 가져 친환경 산업용 효소로 각광받고 있는 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 큐티네이즈(cutinase), 페르하이드롤라아제(perhydrolase) 및 리파제 등이 있다. 본 발명에서는 OmpW를 표면 발현 모체로 사용하여 세포표면 발현된 외래단백질이 생물전환반응에 사용될 수 있는 가능성을 검증하기 위하여, 페르하이드롤라아제와 리파제와 융합 발현하였다. 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제를 융합발현시킨 결과, 상기 페르하이드롤라아제가 세포표면에 발현된 것을 면역형광분석방법으로 확인하였고(도 2 참조), 또한 상기 세포표면에 발현된 페르하이드롤라아제가 베타-부티로락톤을 개환중합하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다. 또한, 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 리파제를 융합발현시킨 결과, 상기 리파아제가 트리뷰티린이 첨가된 배지에서 할로(halo)를 형성하였고(도 3 참조), 베타-부티로락톤을 개환중합하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다.
또한, 상기 발현벡터는 프로모터, 종료암호, 선택마커 및 복제기점을 포함한다. 이때, 상기 프로모터는 바이러스 기원의 프로모터, 원핵생물 기원의 프로모터 또는 진핵생물 기원의 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 바이러스 기원의 프로모 터는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 계두 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터, 조류 육종 바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, B형 간염 바이러스 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 원핵생물 기원의 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, 열충격단백질(heat-shock protein) 70 프로모터, β-락타마제, 락토스 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 트립토판 프로모터, 또는 tac 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 진핵생물 기원의 프로모터는 효모 기원의 프로모터, 식물 기원의 프로모터 또는 동물 세포 기원의 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 효모 기원의 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 에놀라제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 프로모터, 헥소키나제 프로모터, 피루베이트 디카르복실라제 프로모터, 포스포프럭토키나제 프로모터, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 프로모터, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터, 포스포글루코스 이소머라제 프로모터, 글루코키나제 프로모터, 알코올 디히드로게나제 2 프로모터, 이소시토크롬 C 프로모터, 애시딕포스파타제(acidic phosphatase) 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL1 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL7 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL10 프로모터, 또는 Pichia pastoris AOX1 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 동물 세포 기원의 프로모터는 열-충격 단백질(heat-shock protein) 프로모터, 프로액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 프로모터는 본 발명의 외래유전자를 숙주세포에서 정상적으로 발현시킬 수 있는 것이라면 모두 사용가능하다.
또한, 본 발명의 외래단백질이 표면 발현된 세포의 분리 정제가 용이하도록, 본 발명의 발현벡터의 외래단백질의 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, poly-His 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 벡터는 상기 표면 발현 모체, 외래단백질의 유전자 및 분리정제용 태그를 삽입할 부위를 일련의 순서로 포함함으로써 상기 표면 발현 모체, 외래단백질 및 분리정제용 태그를 포함하는 재조합 단백질로 세포 표면에 발현될 수 있었다.
발명의 실시태양에서, 상기 외래단백질을 암호화하는 유전자는 제한효소 부위를 통해 벡터에 상기 벡터와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 재조합 단백질이 생산될 수 있도록 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된, 상기 외래단백질이 표면발현된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, OmpW의 3 및 4번째 루프(loop) 이후의 C-말단이 제거된 OmpW를 발현하는 pSHO13 및 pSHO19 재조합 플라스미드를 제작하였다 (도 1 참조). 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제를 융합발현시킨 결과, 상기 페르하이드롤라아제가 세포표면에 발현된 것을 면역형광분석방법으로 확인하였고(도 2 참조), 또한 상기 세포표면에 발현된 페르하이드롤라아제가 베타-부티로락톤을 개환중합하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다. 또한, 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 리파제를 융합발현시킨 결과, 상기 리파아제가 트리뷰티린이 첨가된 배지에서 할로(halo)를 형성하였고(도 3 참조), 베타-부티로락톤을 개환중합하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 표면 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체는 외래단백질을 세포표면에 발현시킬 수 있다.
이때, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 세포 표면발현에 유리하도록 발현된 외래단백질을 분해할 수 있는 세포내 또는 세포외 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것을 특징으로 하고, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것이 바람직하고, 상기 원핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 대장균, 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하며, 상기 진핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 또는 식물 세포인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 외래단백질이 표면발현된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 외래단백질이 표면발현된 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, OmpW의 3 및 4번째 루프(loop) 이후의 C-말 단이 제거된 OmpW를 발현하는 pSHO13 및 pSHO19 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1 참조). 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제 또는 리파아제를 융합발현시킨 결과, 상기 효소를 세포표면에 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 이에, 본 발명의 방법은 외래단백질이 세포표면에 안정적으로 발현된 세포의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 배양액으로부터 외래단백질이 세포표면에 발현된 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 외래단백질은 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 특히, 의료, 연구용 및 산업용 단백질, 예를 들어, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 혹은 그 일부분, 항원, 항체 혹은 그 일부분, 단쇄항체, 세포수용체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성을 갖는 다양한 외래단백질을 재조합 단백질로 발현할 수 있다. 바람직하게는 상기 외래단백질은 페르하이드롤라아제 또는 리파아제일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 포함하는 단백질 어레이를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, OmpW의 3 및 4번째 루프(loop) 이후의 C-말단이 제거된 OmpW를 발현하는 pSHO13 및 pSHO19 재조합 플라스미드를 제작하였다 (도 1 참조). 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제 또는 리파아제를 융합발현시킨 결과, 상기 효소를 세포표면에 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 이에, 본 발명의 외래단백질이 세포표면에 발현된 세포는 외래단백질을 세포표면에 안정적으로 발현하고 있기 때문에 단백질 어레이로 유용하게 이용될 수 있다.
단백질 어레이는 표적단백질의 발현여부 및 발현정도 등을 분석하기 위한 수단으로, 상기 표적단백질을 검출할 수 있는 단백질, 즉 검출체가 고형 기판에 고정화된 형태로 제공된다. 상기 단백질 어레이를 이용한 분석과정에서 상기 단백질에 고온, 고염 및 pH 변화 등의 다양한 처리가 이루어지므로, 상기 악환경에서 견딜 수 있는 안정화된 단백질의 고정화가 필요하다. 그러나 수 천 내지 수 만가지의 분리된 단백질을 수득하는 과정 및 이를 고형 기판의 표면에 고정화하는 일은 매우 많은 반복적인 노력이 필요하다. 따라서 상기 작업을 보다 단순하고 신속하게 할 필요가 있다. 이에, 본 발명의 외래단백질을 세포표면에 안정적으로 발현하고 있는 세포를 이용하여 상기 단백질 어레이를 제조할 경우, 정제과정을 생략할 수 있으므로, 상기한 작업 더욱 용이하게 할 수 있는 수단을 제공한다.
본 발명의 단백질 어레이의 제조과정에는 통상적으로 당업계에 이용되는 제조방법이 적용될 수 있다(WO 00/61806; WO 00/54046; US 5,807,754; EP 0818467; WO 97/42507; US 5,114,674 및 WO 96/35953). 본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질과 단백질간 또는 단백질과 리간드간 및 항원과 항체간의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성(combinatorial biosynthesis) 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 고체 기판은 유리(예: 작용기가 노출된 유리), Si, Ge, GaAs, GaP, SiO, SiN4, 변형된 실리콘 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오리드, 폴리스틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 나일론, 섬유 또는 이의 조합이다. 상기 기판에는 단백질의 고정화를 위하여 링커 분자가 부착될 수 있고, 스팟팅이 되지 않은 나머지 부분은 블록킹되는 것이 바람직하다. 한편, 각각의 스팟(또는 어드레스)에 적용되는 본 발명의 외래단백질이 표면발현된 세포의 양은 어레이 형태에 따라 결정된다. 고체 기판에 고정화된 본 발명의 외래단백질이 표면발현된 세포와 시료의 상호작용은 상기 외래단백질의 고유 특성(예: 면역반응성)을 이용하여 검출할 수도 있고, 또는 세포에 표면발현된 외래단백질에 적합한 표식 물질(예: 형광물질, 발광물질, 방사능 물질, 에피토프)을 결합시켜 표식 물질의 신호 변화를 검출할 수도 있다. 본 발명의 단백질 어레이에 의한 최종적인 결과의 분석은 당업계에서 "스캐너" 또는 "리더"로 공지되어 있는 자동화된 장치를 이용하여 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 상기 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 숙주에 투여하여 면역반응을 유도하는 단계; 및,
2) 상기 면역반응에 의해 상기 개체내에서 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 상기 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 항체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, OmpW의 3 및 4번째 루프(loop) 이후의 C-말단이 제거된 OmpW를 발현하는 pSHO13 및 pSHO19 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1 참조). 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제 또는 리파아제를 융합발현시킨 결과, 상기 효소를 세포표면에 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 이에, 본 발명의 외래단백질이 세포표면에 발현된 세포는 외래단백질을 세포표면에 안정적으로 발현하고 있기 때문에 항체 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 숙주는 인간을 제외한 척추동물이 바람직하고, 구체적으로 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 척추동물을 포함한다. 상기 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체로 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체로 제조되는 것이 바람직하다. 상기 세포는 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 불완전 프로이드 보조제(adjuvant) 및 완전 프로이드 보조제와 같은 보조제와 함께 투여할 수 있다. 한편, 충분한 양의 항체를 수득하기 위해서 투여는 1차 투여 후 적합한 시기내에 부스터 투여를 하는 것이 바람직하다. 상기 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, OmpW의 3 및 4번째 루프(loop) 이후의 C-말단이 제거된 OmpW를 발현하는 pSHO13 및 pSHO19 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1 참조). 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제를 융합발현시킨 결과, 상기 페르하이드롤라아제가 세포표면에 발현된 것을 면역형광분석방법으로 확인하였고(도 2 참조), 또한 상기 세포표면에 발현된 페르하이드롤라아제가 베타-부티로락톤을 개환중합하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다. 또한, 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 리파제를 융합발현시킨 결과, 상기 리파아제가 트리뷰티린이 첨가된 배지에서 할로(halo)를 형성하였고(도 3 참조), 베타-부티로락톤을 개환중합하여 생물전환반응에도 유용한 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 외래단백질이 표면발현된 세포는 생물전환에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 외래단백질은 생물전환에 관련된 화학반응을 촉매할 수 있는 효소, 촉매항체 등이 사용될 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 페르하이드롤라아제와 리파제를 이용하였다.
상기 생물전환의 예로는 페르하이드롤라아제 또는 리파제를 세포표면에 안정적으로 발현하는 세포를 이용하여 락톤(lacton) 화합물로부터 고분자 화합물을 제조하는 공정, 상기 리파제가 세포표면에 안정적으로 발현된 세포를 이용하여 라세미 에스터 화합물(racemic ester compound)로부터 키랄성 에스터, 키랄성 유기산 또는 키랄성 알코올로 광학분할하는 키랄 화합물을 제조하는 공정 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은
1) 외래단백질의 변이체를 암호화하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;
2) C-말단이 제거된 OmpW를 상기 외래단백질 변이체의 표면 발현 모체로 포함하는 상기 외래단백질 변이체의 표면 발현벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 표면 발현벡터가 형질 도입된, 상기 외래단백질 변이체가 표면발현된 형질전환체를 제조하는 단계;
4) 상기 형질전환체를 배양하여 상기 외래단백질 변이체가 표면발현된 세포를 제조하는 단계;
5) 개량된 형질을 갖는 외래단백질 변이체가 표면발현된 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 외래단백질의 개량방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, OmpW의 3 및 4번째 루프(loop) 이후의 C-말단이 제거된 OmpW를 발현하는 pSHO13 및 pSHO19 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1 참조). 상기 재조합 플라스미드에 포함된 C-말단이 제거된 OmpW에 페르하이드롤라아제 또는 리파아제를 융합발현시킨 결과, 상기 효소를 세포표면에 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 이에, 본 발명의 외래단백질이 세포표면에 발현되도록 하는 표면 발현벡터는 외래단백질의 개량방법에 유용하게 이용될 수 있다.
단계 1)의 유전자 라이브러리를 구축하는 단계는 DNA 셔플링법(Stemmer, Nature, 370:389-391, 1994), StEP법(Zhao H et al., Nat. Biotechnol. 16:258-261, 1998), RPR법(Shao Z et al., Nucleic Acids Res. 26:681-683, 1998), 분자육종법(Ness JE et al., Nat. Biotechnol. 17:893-896, 1999), ITCHY법(Lutz S et al., Cur. Opi. Biotechnol. 11:319-324, 2000), 에러 유발(error-prone) PCR(Cadwell RC et al., PCR Methods Appl., 2:28-33, 1992), 점돌연변이법(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)을 이용하여 야생형 외래단백질을 암호화하는 유전자를 변이시킴으로써 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 개량방법의 목적은, 종래의 방법으로는 용이하게 얻을 수 없는, 생물학적으로 발생하지 않는 화학반응을 촉매하는 효소(예: Diels-Alder 축합반응), 비자연적인 입체 선택성 또는 위치선택성(regioselectivity) 활성을 갖는 효소, 유기용매 또는 유기용매-수용액 이상의 용액에서 반응을 촉매할 수 있는 효소, 및 고온 고압과 같은 극한 조건에서 반응을 촉매하는 효소 등을 야생형 효소를 개량함으로써 신속하게 수득하기 위한 것이다.
이에, 단계 5)의 상기 스크리닝 단계는 상기 개량방법의 목적에 따라, 외래단백질 변이체의 활성을 측정하는 방법, 외래단백질 변이체에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질을 이용한 방법, 외래단백질에 결합하는 라벨링된 리간드를 이용한 방법 또는 외래단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 방법을 통해 수행될 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 단계는 유세포 분석기(Georgiou, G., Adv Protein Chem., 55:293-315, 2000)를 이용하여 실시할 수도 있고, 단백질의 활성을 이용하는 경우에는 단백질이 발현되는 숙주의 성장을 측정하거나, 또는 단백질에 의해 촉매되는 발색반응을 측정하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 외래단백질이 표면발현된 세포는 단백질 어레이, 항체제작, 생물전환 및 외래단백질 개량에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 재조합 벡터 pSHO13 및 pSHO19의 제조
Tac 프로모터 상에서의 세포 외막 단백질 ompW를 발현하는 재조합 플라스미드 pSHO13 및 pSHO19를 제조하였다.
<1-1> tac 프로모터를 가진 플라스미드의 제작
tac 프로모터를 가진 플라스미드를 만들기 위하여 pKK223-3 플라스미드(Amersham, USA)와 pUC18 플라스미드(ATCC, USA)를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 절단하여 각각 4,500 bp와 50 bp정도의 DNA 절편을 얻은 후 서로 연결시켜 재조합 플라스미드를 수득하고, 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 대장균 XL10-Gold(Stratagene, USA)에 도입하여 형질전환시킨 다음, 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하고, 이로부터 pKK223-18MCS 재조합 플라스미드(도 1)를 수득하였다
<1-2> pSHO13의 제조
139번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 대장균의 세포 외막 단백질(OmpW) 유전자(서열번호 9)를 확보하기 위하여, 대장균 염색체(choromosomal DNA)를 주형으로 하고, 서열번호 1(5'-ggaattcATGAAAAAGTTAACAGTGGCG-3')과 2(5'-gtctagaGCCATGATCGTTAAATCCATT-3')의 프라이머쌍을 사용하여 PCR(첫번째 변성 95℃ 5분, 두번째 변성 95℃ 30초, 교잡 50℃ 1분, 연장 72℃ 30초, 25회 반복)을 수행하였다.
아가로즈 겔 전기영동법으로 전기 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 절편에서 약 500 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였고, 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하였다. 이를 tac 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pKK223-18MCS를 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하여 수득한 DNA 절편과 연결시켜 재조합 플라스미드를 수득하였고, 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 대장균 XL10-Gold에 도입하여 형질전환시킨 다음, 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였고, 이로부터 pSHO13 재조합 플라스미드(도 1)를 수득하였다.
<1-3> pSHO19의 제조
191번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 OmpW 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 염색체를 주형으로 하고, 서열번호 1과 3(5'-gtctagatgcaccgcccagcttataat-3')의 프라이머쌍을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
아가로즈 겔 전기영동법으로 전기 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 절편에서 약 600 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였고, 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하였다. 이를 tac 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pKK223-18MCS를 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하여 수득한 DNA 절편과 연결시켜 재조합 플라스미드를 수득하였고, 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 대장균 XL10-Gold에 도입하여 형질전환시킨 다음, 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하고, 이로부터 pSHO19 재조합 플라스미드(도 1)를 수득하였다.
<실시예 2> 재조합 발현벡터 pSHO13PA 및 pSHO19PA의 제조
페르하이드롤라아제(perhydrolase)를 세포표면 발현하는 재조합 플라스미드를 제조하기 위하여 우선 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 페르하이드롤라아제 유전자(서열번호 10)를 작제하였다.
구체적으로, 슈도모나스 애루기노사(ATCC, USA)의 염색체(Sambrook, J., and D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.)를 주형으로 하고, 서열번호 4(5'-ttctaga ATG GGT TAC GTG ACA ACG AAG G-3')와 5(5'-cccaagctt TCA CCG CGG ATG AAG GCC-3')의 프라이머쌍을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
아가로즈 젤 전기영동법을 이용하여, PCR로 증폭한 DNA 절편으로 부터 약 800 bp 크기의 DNA 절편인 페르하이드롤라아제 유전자를 수득하였다. 페르하이드롤라아제 유전자를 XbaI과 HindIII로 절단하였고, pSHO13과 pSHO19에 삽입시켜서 재조합 발현벡터 pSHO13PA과 pSHO19PA(도 1)를 각각 제조한 후, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL10-Gold에 도입하여 형질전환시켰다. 형질전환된 균주는 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 선별된 균주는 LB 액체배지에서 배양하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
<실시예 3> 재조합 발현벡터 pSHO13PAH 및 pSHO19PAH의 제조
6×히스티딘(Histidine)이 표지된 페르하이드롤라아제를 표면발현 시키기 위하여 슈도모나스 애루기노사의 염색체를 주형으로 하고, 서열번호 4 및 6(5'-cccaagctt TTA ATG GTG ATG ATG GTG ATG CCG CGG ATG AAG GCC-3')의 프라이머쌍을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
아가로즈 젤 전기영동법을 이용하여, PCR로 증폭한 DNA 절편으로 부터 약 800 bp 크기의 DNA 절편인 페르하이드롤라아제-6×H 융합유전자를 수득하였다. 유전자를 XbaI과 HindIII로 절단하고, pSHO13과 pSHO19에 삽입시켜서 재조합 발현벡터 pSHO13PAH과 pSHO19PAH을 각각 제조하였고, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL10-Gold에 도입하여 형질전환시켰다. 형질전환된 균주는 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 선별된 균주는 LB 액체배지에서 배양하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
<실시예 4> 페르하이드롤라아제의 세포표면발현
실시예 3에서 제조된 pSHO13PAH 및 pSHO19PAH 형질전환체를 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 10 ㎖의 LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 배양하였다. 분광광도계로 600 ㎚ 파장에서 측정한 흡광도가 0.5일 때 0.5 mM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 발현유도 5시간 경과 후, 4℃, 6000 rpm에서 5분 동안 배양액을 원심분리 하여 세포를 수득하였고, 인산완충용액(PBS; phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 세척한 후, 3wt% 소혈청알부민(BSA;bovine serum albumin)이 포함된 PBS용액에 재현탁하였다. 3wt% BSA가 첨가된 PBS용액에 1:1000의 비율로 1차 항체인 마우스 항--6×His 혈청을 첨가한 후, 4℃에서 4시간 동안 배양하였다. PBS용액으로 5번 세척한 후, FI-TC가 연결된 2차 항체(rabbit anti-mouse IgG)를 1:3000의 비율로 첨가해준 후, 4℃에서 12시간 동안 배양하였다. 반응하지 않은 2차 항체를 제거하기 위하여 PBS용액으로 5번 세척 한 후, delta vision 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하여, 페르하이드롤라아제가 세포표면에 발현된 것을 확인하였다(도 2).
<실시예 5> 세포표면에 발현된 페르하이드롤라아제를 이용한 개환중합(ring opening polymerization)
실시예 2에서 제조된 pSHO13PA 형질전환체를 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 100 ㎖의 LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 배양하였다. 분광광도계로 600 ㎚ 파 장에서 측정한 흡광도가 0.5일 때 0.5 mM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 발현유도 5시간 경과 후, 4℃, 6000 rpm에서 5분 동안 배양액을 원심분리 하여 세포를 수득하고, PBS용액(pH 7.2)으로 세척한후 동결건조 하였다. 동결건조한 세포 20 ㎎을 베타-부티로락톤(beta-butyrolactone; Sigma Aldrich, USA) 1 ㎖에 넣고 50℃에서 5일 동안 반응한 후, 하기의 분석조건으로 GPC(gel permeation chromatography; Viscotek, USA)를 이용하여 분석한 결과 605의 Mn과 863의 분자량을 가지는 고분자가 합성되었다.
분석 조건:
컬럼: MesoPore Guard, 50×7.5 ㎜(1개), MesoPore, 300x7.5 ㎜(2개), OligoPore, 300 × 7.5 ㎜(1개) (제조사: Polymer Laboratories, USA)
유속: 1 ㎖/min
용매: THF(Tetrahydrofuran; Sigma Aldrich, USA)
검출기: RI(Refractive Index; Waters, USA)
<실시예 6> 재조합 발현벡터 pSHO13PL 및 pSHO19PL의 제조
리파제를 세포표면 발현하는 재조합 플라스미드를 제조하기 위하여 슈도모나스 플루레센스(Pseudomonas fluorescens)의 리파제 유전자(서열번호 11)를 작제하였다.
구체적으로, 슈도모나스 플루레센스(ATCC, USA)의 염색체(Sambrook, J., and D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.)를 주형으로 하고, 서열번호 7(5'-gctctagaatgggtgtatttgactacaagaac-3')과 서열번호 8(5'-cccaagctttcaactgatcagcacacc-3')의 프라이머쌍을 사용하여, PCR(첫번째 변성 95℃ 5분, 두번째 변성 95℃ 45초, 교잡 60℃ 45초, 연장 72℃ 1분 30초, 30회 반복)을 수행하였다.
아가로즈 젤 전기영동법을 이용하여, PCR로 증폭한 DNA 절편으로 부터 약 1.4 kbp 크기의 DNA 절편인 리파제 유전자를 수득하였다. 전기 리파제 유전자를 XbaI과 HindIII으로 절단하고, pSHO13과 pSHO19에 삽입시켜서 재조합 발현벡터 pSHO13PL과 pSHO19PL(도 1)을 각각 제조하였고, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL10-Gold에 도입하여 형질전환시켰다. 형질전환된 균주는 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 선별된 균주는 LB 액체배지에서 배양하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
<실시예 7> 세포표면에 발현된 리파제의 활성
실시예 6에서 제조된 pSHO13PL과 pSHO19PL 형질전환체를 앰피실린(50 ㎍/L)과 트리뷰티린(1%v/v; Sigma Aldrich, USA)이 첨가된 LB 평판배지에서 배양하였다. 72시간 경과 후, 리파제 활성으로 인하여 배지에 halo가 생성되었다(도 3).
<실시예 8> 세포표면에 발현된 리파제를 이용한 개환중합
실시예 6에서 제조된 pSHO13PL 형질전환체를 앰피실린(50 ㎍/L)이 첨가된 100 ㎖의 LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 배양하였다. 분광광도계로 600 ㎚ 파장에서 측정한 흡광도가 0.5일 때 0.5 mM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 발현유도 5시간 경과 후, 4℃, 6000 rpm에서 5분 동안 배양액을 원심분리 하여 세포를 수득하고, PBS용액(pH 7.2)으로 세척한 후 동결건조 하였다. 동결건조한 세포 20 ㎎을 베타-부티로락톤 1 ㎖에 넣고 50℃에서 15일동안 반응한 후, 실시예 5의 방법으로 GPC로 분석한 결과, 1229의 Mn과 1672의 분자량을 가지는 고분자가 합성되었다.
도 1은 본 발명의 재조합 플라스미드 pKK223-18MCS, pSHO13, pSHO19, pSHO13PA, pSHO19PA, pSH13PL 및 pSH19PL을 나타낸 도이다.
도 2는 세포표면 발현된 페르하이드롤라아제에 대한 면역형광 분석 결과를 나타낸 도이다:
a: XL10-Gold (pSHO19PAH)에 FITC가 표지된 6×히스티딘 항체를 결합시킨 결과; 및,
b: XL10-Gold (pSHO19PAH)에 FITC가 표지된 6×히스티딘 항체를 결합시킨 결과.
도 3은 세포표면 발현된 리파제의 활성을 입증하기 위하여 XL10-Gold (pSHO13PL)과 XL10-Gold (pSHO19PL)를 트리뷰티린 고체배지에서 배양한 결과를 나타낸 도이다.
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology
<120> Method for Cell Surface Display of Target Proteins Using OmpW of
E. coli
<130> 8P-11-62
<160> 11
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OmpW forward primer
<400> 1
ggaattcatg aaaaagttaa cagtggcg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 139-OmpW reverse primer
<400> 2
gtctagagcc atgatcgtta aatccatt 28
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 191-OmpW reverse primer
<400> 3
gtctagatgc accgcccagc ttataat 27
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> perhydrolase forward primer
<400> 4
ttctagaatg ggttacgtga caacgaagg 29
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> perhydrolase reverse primer
<400> 5
cccaagcttt caccgcggat gaaggcc 27
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6Xperhydrolase reverse primer
<400> 6
cccaagcttt taatggtgat gatggtgatg ccgcggatga aggcc 45
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lipase forward primer
<400> 7
gctctagaat gggtgtattt gactacaaga ac 32
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lipase reverse primer
<400> 8
cccaagcttt caactgatca gcacacc 27
<210> 9
<211> 639
<212> DNA
<213> Escherichia coli OmpW
<400> 9
atgaaaaagt taacagtggc ggctttggca gtaacaactc ttctctctgg cagtgccttt 60
gcgcatgaag caggcgaatt ttttatgcgt gcaggttctg caaccgtacg tccaacagaa 120
ggtgctggtg gtacgttagg aagtctgggt ggattcagcg tgaccaataa cacgcaactg 180
ggccttacgt ttacttatat ggcgaccgac aacattggtg tggaattact ggcagcgacg 240
ccgttccgcc ataaaatcgg cacccgggcg accggcgata ttgcaaccgt tcatcatctg 300
ccaccaacac tgatggcgca gtggtatttt ggtgatgcca gcagcaaatt ccgtccttac 360
gttggggcag gtattaacta caccaccttc tttgataatg gatttaacga tcatggcaaa 420
gaggcagggc tttccgatct cagtctgaaa gattcctggg gagctgccgg gcaggtgggg 480
gttgattatc tgattaaccg tgactggttg gttaacatgt cagtgtggta catggatatc 540
gataccaccg ccaattataa gctgggcggt gcacagcaac acgatagcgt acgcctcgat 600
ccgtgggtgt ttatgttctc agcaggatat cgtttttaa 639
<210> 10
<211> 831
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa perhydrolase
<400> 10
atgggttacg tgacaacgaa ggatggcgtc gaactcttct acaaggactg ggggccgcgc 60
gacgcccagg tgatctactt ccatcatggc tggccactga gttccgacga ctgggatgcg 120
cagatgctgt tcttcctcgc cgagggcttt cgcgtagtgg cccacgaccg ccgtggccac 180
ggtcgttcca gccaggtctg ggacggccat gacatggacc actacgccga cgacgtggcg 240
gcggtggtcg agcgcctcgg ggtgcgcggg gcgatccatg tcggccattc caccggcggc 300
ggcgaggtcg tccactacat cgcccgctat cccgacgacc cggtgccgaa ggcggcgatc 360
atcagcgcgg tgccgccgct gatggtgaag accgagggca atccgggcgg cctgccgaag 420
agcgtcttcg acgatctcca ggcgcagctc gcggccaatc gcgcgcagtt ctaccaggac 480
attcccgccg gcccgttcta tggctacaac cgtcccgggg cgcagccctc ggaagggatc 540
gtccgcaact ggtggcggca gggcatgatg ggcggcgcca aggcccacta cgacgggatc 600
gtggcctttt cccagaccga cttcagcgat gacctgaagc gcatcgacat cccggtgctg 660
gtgatgcatg gcgacgacga ccagatcgtg ccctacgaga attccggcgt actctcggcg 720
aagctgctgc gcaacggcac gctgaagacc tatccggggt tcccgcacgg catgccgacc 780
acccaggccg aggtgatcaa cgccgacctg ctggccttca tccgcggctg a 831
<210> 11
<211> 1431
<212> DNA
<213> Pseudomonas fluorescens Lipase
<400> 11
atgggtgtat ttgactacaa gaacctcggc accgaagcca gcaaaacctt gttcgccgat 60
gccaccgcaa tcacgttgta tacctatcac aacctggata acggcttcgc agtcggctac 120
cagcaacatg gcttggggct cggcctgccg gccacactgg tcggggcgtt gctcggcagc 180
acagactccc agggagtgat ccccggcatt ccctggaatc ctgactcgga aaaggccgcc 240
ctggacgcgg tgcacgcagc cggttggacg ccaatcagcg ccagcgcact gggctacggc 300
ggcaaggtgg atgcgcgggg cacttttttt ggcgagaagg ccggctacac cacggcccag 360
gccgaagtgc tgggcaagta cgatgacgcc ggcaaactgc tcgagatcgg catcggtttt 420
cgtggcacct cgggccctcg ggaaagcctg attaccgact ccatcggcga tctggtcagc 480
gacctgctcg ccgcgctggg ccccaaggac tatgcgaaaa actatgccgg cgaagcgttt 540
ggcggcttgc tcaagacggt ggccgactat gccggcgccc atggcctgag tggcaaggat 600
gtgctggtca gcggccacag cctgggcggc ctggcggtca acagcatggc cgacctgagc 660
accagcaaat gggcgggttt ctacaaggac gccaactacc tggcctacgc ctcgcccacc 720
cagagcgccg gcgataaggt cctgaatatc ggctacgaaa acgacccggt attccgtgcg 780
ctggacggct ccaccttcaa cctgtcgtcc ctcggcgtgc atgacaaggc ccacgagtcg 840
accaccgaca acatcgtcag cttcaacgac cactacgcct cgacgttgtg gaatgtgctg 900
ccgttttcca tcgccaacct gtcgacctgg gtgtcgcatt tgcccagcgc ttacggcgac 960
ggcatgacgc gtgtgctgga atcggggttc tacgagcaaa tgacccgtga ctcgacgatt 1020
atcgtcgcca acctgtccga cccggcgcgc gccaacacct gggtccagga cctcaaccgc 1080
aatgccgagc cgcacacagg caataccttc atcatcggca gcgacggcaa tgacctgatc 1140
cagggcggca agggcgcgga cttcatcgaa ggcggcaagg gcaatgacac gatccgcgac 1200
aacagcgggc acaacacctt tttgttcagc gggcattttg gccaggatcg gattatcggc 1260
taccagccga ccgacaggct ggtgttccag ggcgccgacg gcagcaccga cctgcgcgac 1320
cacgcgaagg ccgtgggggc cgatacggtg ctgagttttg gcgccgactc ggtgaccctg 1380
gtcggggtcg ggctgggcgg cctgtggagc gagggtgtgc tgatcagttg a 1431
Claims (24)
- 표면 발현 모체로서 대장균 OmpW(Outermembrane Protein W)(Gene ID: 945128) 단백질의 전체 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 139번째 아미노산 이후 또는 191번째 아미노산 이후의 아미노산 서열이 제거된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 외래단백질의 유전자를 포함하는 상기 외래단백질의 표면 발현벡터.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 외래단백질은 표면발현에 유리하도록 외래단백질 아미노산 서열 중 일부분이 제거되거나 위치 특이적으로 돌연변이된 것을 특징으로 하는 외래단백질의 표면 발현벡터.
- 제 1항에 있어서, 상기 외래단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저 해제, 신호전달단백질 혹은 그 일부분, 항원, 항체 혹은 그 일부분, 단쇄항체, 세포수용체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 외래단백질의 표면 발현벡터.
- 제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 프로모터, 종료암호, 선택마커 및 복제기점을 포함하는 것을 특징으로 하는 외래단백질의 표면 발현벡터.
- 제 6항에 있어서, 상기 프로모터는 tac 프로모터인 것을 특징으로 하는 외래단백질의 표면 발현벡터.
- 제 1항, 및 제 4항 내지 7항 중의 어느 한 항의 외래단백질의 표면 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된, 상기 외래단백질이 표면발현된 형질전환체.
- 제 8항에 있어서, 상기 숙주세포는 세포 표면발현에 유리하도록 발현된 외래 단백질을 분해할 수 있는 세포내 또는 세포외 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것을 특징으로 하는 외래단백질이 표면발현된 형질전환체.
- 제 9항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 외래단백질이 표면발현된 형질전환체.
- 제 8항의 외래단백질이 표면발현된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 외래단백질이 표면발현된 세포의 제조방법.
- 제 11항에 있어서, 배양된 배양액으로부터 외래단백질이 세포표면에 발현된 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 외래단백질이 표면발현된 세포의 제조방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 외래단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 혹은 그 일부분, 항원, 항체 혹은 그 일부분, 단쇄항체, 세포수용체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백 질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 외래단백질이 표면발현된 세포의 제조방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 외래단백질은 페르하이드롤라아제 또는 리파아제인 것을 특징으로 하는 외래단백질이 표면발현된 세포의 제조방법.
- 제 12항의 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 포함하는 단백질 어레이.
- 1) 제 12항의 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 인간을 제외한 척추동물에 투여하여 면역반응을 유도하는 단계; 및,2) 상기 면역반응에 의해 상기 인간을 제외한 척추동물 내에서 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 상기 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 항체 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 12항의 방법에 의해 제조된, 외래단백질이 표면발현된 세포를 이용한 생물전환 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 외래단백질은 생물전환에 관련된 화학반응을 촉매할 수 있는 효소 또는 촉매항체인 것을 특징으로 하는 생물전환 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 외래단백질은 페르하이드롤라아제 또는 리파제인 것을 특징으로 하는 생물전환 방법.
- 1) 외래단백질의 변이체를 암호화하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;2) 대장균 OmpW(Outermembrane Protein W)(Gene ID: 945128) 단백질의 전체 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 139번째 아미노산 이후 또는 191번째 아미노산 이후의 아미노산 서열이 제거된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 상기 외래단백질 변이체의 표면 발현 모체로 포함하는 상기 외래단백질 변이체의 표면 발현벡터를 제조하는 단계;3) 상기 표면 발현벡터가 형질 도입된, 상기 외래단백질 변이체가 표면발현된 형질전환체를 제조하는 단계;4) 상기 형질전환체를 배양하여 상기 외래단백질 변이체가 표면발현된 세포를 제조하는 단계;5) 개량된 형질을 갖는 외래단백질 변이체가 표면발현된 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 외래단백질의 개량방법.
- 삭제
- 제 22항에 있어서, 단계 5)의 상기 스크리닝은 외래단백질 변이체의 활성을 측정하는 방법, 외래단백질 변이체에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질을 이용한 방법, 외래단백질에 결합하는 라벨링된 리간드를 이용한 방법 및 외래단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 외래단백질의 개량방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000056440A (ko) * | 1999-02-22 | 2000-09-15 | 윤덕용 | 세포 표면 발현 모체로서의 대장균 유래 세포외막 단백질 Ｃ(ＯｍｐＣ)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 |
| US20050095258A1 (en) | 1999-02-17 | 2005-05-05 | Manuel Campos | Fusion proteins comprising carriers that can induce a dual immune response |
| KR20050119786A (ko) * | 2004-06-17 | 2005-12-22 | 한국과학기술원 | 대장균의 외막 단백질을 이용한 목적 단백질의 미생물표면발현 방법 |
| KR20070009029A (ko) * | 2005-07-15 | 2007-01-18 | 한국과학기술원 | ＯｍｐＦ와 목적단백질의 동시 발현을 통한 목적 단백질의세포외 분비·생산 방법 |
-
2008
- 2008-12-22 KR KR1020080131375A patent/KR101145911B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20050119786A (ko) * | 2004-06-17 | 2005-12-22 | 한국과학기술원 | 대장균의 외막 단백질을 이용한 목적 단백질의 미생물표면발현 방법 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20100072848A (ko) | 2010-07-01 |
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