KR101438149B1

KR101438149B1 - 스타필러코커스 해모라이티쿠스 l62 리파아제의 세포 표면 발현과 트랜스에스테르화 생물 전환 공정의 응용

Info

Publication number: KR101438149B1
Application number: KR1020130051467A
Authority: KR
Inventors: 김형권; 김순자
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2014-09-15

Abstract

본 발명은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 자기 수송체 막 단백질을 세포 표면 고정 모체(surface anchoring motif)로 사용하고, 생물학적 촉매 작용을 수행하는 스타필러코커스 해모라이티쿠스(Staphylococcus haemolyticus) L62 리파아제를 숙주 세포 표면에 발현하는 세포 표면 발현 시스템과, 이 시스템을 이용하여 숙주 세포의 표면에서 L62 리파아제를 제조하는 방법 및 숙주 세포의 표면에서 발현된 L62 리파아제를 이용하여 바이오디젤과 같은 생물 전환 공정에 응용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템을 이용하여 생물 전환 공정에 사용되는 L62 리파아제의 활성과 안정성을 유지하면서 효율적으로 바이오디젤인 지방산 알킬 에스테르를 합성할 수 있다.

Description

스타필러코커스 해모라이티쿠스 L62 리파아제의 세포 표면 발현과 트랜스에스테르화 생물 전환 공정의 응용{Cell Surface Display of Staphylococcus haemolyticus L62 Lipase and Its Application for Transesterificatin Reaction}

본 발명은 생물학적 촉매인 효소를 발현하는 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외래 단백질인 효소를 숙주 세포의 표면에 효율적으로 발현하는 시스템 및 이 시스템에 발현된 효소를 촉매로 이용하여 해당 촉매가 매개하는 반응에 따라 얻어지는 물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

분자생물학적 지식이 확대되고 생명공학 기술이 발전하면서 생명체가 만들어내는 생물학적 촉매인 효소를 이용하여 원하는 화합물을 합성, 제조하는 것이 가능하게 되었다. 생물학적 촉매인 효소 중에서도 리파아제(lipase) 효소는 다양한 종류의 카르복시산 에스테르(carboxylic acid) 또는 아마이드(amide)의 가수분해나 합성을 촉진하여, 식품, 세제, 화학, 의약 및 환경소재 공업 등의 산업 전반에 걸쳐서 널리 이용되고 있다. 구체적으로, 리파아제는 가수분해(hydrolysis), 알코올분해 (alcoholysis), 산분해(acidolysis), 에스테르화 반응(esterification), 아미노분해(aminolysis) 등과 같이 다양한 화학촉매 반응에 관여하고, 수용액 상태에서 뿐만 아니라 유기 용매에서도 활성을 유지하고, 촉매반응 과정에 별도의 보조인자 (cofactor)를 필요로 하지 않고, 다양한 기질에 대해 기질 특이성을 나타내고, 광학이성질체 중 어느 한쪽에 대해서만 활성을 나타내는 이성질체 선택성을 가지고 있어 산업적 응용성이 높은 효소이다.

한편, 지구 온난화의 주요한 원인으로 지목되고 있는 화석 연료인 원유 가격이 상승함에 따라 원유를 대체할 수 있는 에너지원에 대한 관심이 높아지고 있다. 원유를 대체할 수 있는 에너지원 중에서도 바이오디젤은 무독성이고, 생분해성이며 재생 가능하여 대표적인 친환경적인 에너지로 주목을 받고 있다.

바이오디젤(Biodiesel)이란, 식물성 오일(vegetable oil) 또는 동물성 지방(animal fats)과 같은 유지 성분이 알코올과 반응하여 에스테르 교환 반응(trans-esterification) 또는 글리세롤 성분이 제거된 지방산과 알코올이 반응하여 에스테르 반응에 의하여 형성되는 짧은 사슬의 지방산 알킬 에스테르로 이루어지는 비-원유 기반의 디젤 연료를 지칭한다.

초기에 산 또는 알칼리 촉매를 이용하는 화학적 합성법을 통하여 바이오디젤을 생산하였다. 하지만, KOH, NaOH 및 K₂CO₃과 같은 강염기 촉매를 사용하면 반응성이나 공정의 효율성이 떨어지고, 술폰산과 같은 산이나 수산화칼륨과 같은 강염기의 화학적 촉매를 이용하면 이들 촉매가 엔진을 부식시키므로 생산 공정에서 반드시 중화, 세척 공정이 요구되고, 그 과정에서 유기 용매가 다량 사용되며 다량의 폐수가 발생한다. 특히, 화학적 합성법에 의하여 바이오디젤을 합성하기 위해서 높은 온도에서 반응이 진행되어야 하므로 많은 양의 에너지가 소모되며 촉매의 재사용이 곤란하다. 아울러, 바이오디젤의 원료로서 폐유를 사용하는 경우, 폐유에 포함된 수분을 제거하여야 하며, 폐유에 잔존하는 지방산은 화학적 촉매와 반응하여 염을 형성하여 촉매의 기능을 저하시킨다. 이에 따라, 최근에는 미생물에서 유래한 다양한 리파아제 효소를 이용하는 생물학적 방법으로 바이오디젤을 생산하는 방법에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

일반적으로 생물학적 촉매인 효소를 사용한 에스테르 교환 반응을 통해 바이오 디젤을 합성할 경우, 화학적 촉매 공정에서보다 낮은 온도, 일반적인 압력상태에서 반응이 진행되므로 공정에서 요구되는 에너지 소모를 줄일 수 있으며, 부산물로 얻어지는 글리세롤의 분리가 용이하므로 제품화 하여 바이오 디젤 생산 단가를 낮출 수 있는 장점이 있다. 또한 원료 내에 잔류하는 유리 지방산(free fatty acid)에 의해서도 비누화 반응이 유발되지 않고, 원료 내에 잔류하는 수분에 의해 영향을 받지 않을 뿐만 아니라 수율이 매우 양호하다. 더불어 생성된 바이오 디젤에 의해서 엔진이 부식되지 않기 때문에 에스테르화 반응에 의해 생성된 알킬 에스테르를 따로 정제할 필요가 없어 생산 비용 절감에도 도움이 되며 공정에서 유기용매를 사용하지 않으므로 이로 인한 환경 오염문제도 발생되지 않으며, 부산물로 얻어지는 글리세롤의 정제가 용이하기 때문에 이를 제품화하여 바이오 디젤의 생산 단가를 낮출 수 있다.

그러나 에스테르 교환 반응(또는 트랜스에스테르화 반응)을 통해 바이오디젤을 합성하는데 현재 상용화 되어 있는 효소는 매우 고가로 판매되고 있으며, 수용액 상태의 효소는 재사용이 어렵고 회수 과정에서 변성이나 오염에 의하여 사용하지 못하는 경우가 많이 있다. 따라서 생물학적 촉매인 효소를 이용한 바이오디젤의 합성에 있어서 이 효소를 적절한 방법으로 고정화하여 사용하면, 최종적으로 얻어진 산물로부터 효소를 분리하기 용이하고, 고가의 효소를 손쉽게 회수하여 재사용할 수 있어서 연속 공정에서 활용될 수 있으며, 효소가 특유의 3차원 구조를 유지할 수 있어서 반복적인 재사용에 의해서도 활성을 유지할 수 있으며, 광범위한 pH 및 온도 범위, 다양한 유기 용매에 대해서도 안정성, 활성, 특이성(specificity) 또는 선택성(selectivity)을 가질 수 있다.

종래에는 효소를 고정화하기 위하여 지지체(support) 또는 담체(carrier)에 물리적 화학적 방법으로 고정하거나 포획법 또는 캡슐화 방법(entrapment, encapsulation) 방법 등을 이용하였다. 바이오디젤의 전환과 관련해서도 생물학적 촉매인 다양한 효소를 재사용하여 경제성을 높이기 위하여 리파아제를 다양한 담체에 고정화하고 반응 후 효소를 분리하여 재사용하는 방식이 연구, 개발되고 있다. 하지만 바이오디젤의 합성과 관련해서 널리 사용되고 있는 Candida sp. 유래의 효소는 메탄올에 대한 내성이 부족하기 때문에, 원하는 수준의 바이오디젤 전환 효율을 얻기 위해서는 저-농도의 메탄올을 여러 번 공급하여야 한다. 따라서 제조 공정이 복잡할 수밖에 없고 효율적인 생산성을 추구하는데 있어서 한계를 갖는다. 또한, 메탄올에 대한 내성이 있는 것으로 알려진 P. cepacia 유래의 효소의 경우에도 고농도 메탄올을 첨가하는 경우, 바이오디젤의 수율은 예상했던 것보다 높지 않다.

아울러, 종래 화학적 합성에 의하여 제조된 지지체나 담체를 사용하여 생물학적 촉매를 고정화하는 경우에 다음과 같은 문제점이 지적되고 있다. 예를 들어, 고정된 효소가 비가역적으로 비-활성화되면 고가의 효소와 지지체를 모두 사용할 수 없고, 부피가 큰 담체가 도입되면 실제 비-촉매 부분이 상당 부분을 차지하게 되어 효소의 활성이 희석되어 생산성 및 수율이 저하될 수 있다. 또한 고분자 네트워크 또는 매트릭스 내에 효소를 포획하거나 중공 섬유나 마이크로캡슐과 같은 멤브레인(membrane) 내에 효소를 포획하는 포획법의 경우, 효소의 존재 하에서 고분자성 네트워크의 합성이 요구되며, 효소의 활성 및 안정성이 감소될 수 있으며, 미세 환경을 제어하기 곤란하다.

다시 말하면, 생물학적 촉매인 효소를 이용한 생물 전환 공정 개발에 있어서 효소의 생산 비용이 가장 중요한 경제적 결정 요인이 되고 있는데, 기존의 고정화 방법에서는 효소의 활성과 안정성에 변화가 일어날 수 있다. 효소의 나노 입자화를 통해서 이러한 문제를 해결할 수 있지만, 이러한 방법을 산업적 스케일에 적용하기에는 여전히 한계가 있고, 화학적 합성으로 제조된 담체 등에 효소를 고정할 때 기질과 효소의 접근성이라는 문제점과 단위 담체 당 활성을 갖는 효소의 절대량(enzyme loading capacity)이 높아야 한다는 제한점도 발생하게 되었다.

이에 최근에 분자 생물학적 방법과 단백질 공학으로 바이오 촉매인 효소를 산업적 목적에 맞게 인위적으로 변형시킬 수 있는 방법이 모색되었다. 구체적으로 재조합 유전자 발현 기술을 이용하여 특정 생명체에서 유래한 효소 등의 단백질이나 펩타이드를 숙주 세포의 표면에 고정시켜 안정화시킬 수 있는 기술로서 이른바 '세포 표면 발현 시스템(Cell Surface Display)'이 제안되었다.

세포 표면 발현 시스템은, 발현시키고자 하는 외래 단백질 또는 펩타이드(이를 표적 단백질(passenger protein)이라고 함)를 결합 단백질, 영양분 흡수 단백질, 단백질 분비 관련 단백질, DNA의 세포간 전달을 위한 응집 관련 단백질 등 세포 표면 단백질인 세포 표면 고정용 모체(surface anchoring motif)에 부착, 융합하여 파지(phage)나 세균이나 효모와 같은 미생물 등의 숙주 세포 표면에 발현하는 시스템이다.

대장균을 포함한 그람 음성 세균에서 표면 발현을 위한 고정 모체로서는 외막 단백질(outer membrane protein, OMP), 지질 단백질(lipoprotein), 자기 수송체(autotransporter), 표면 부속물(surface appendage)의 S층(S-layer) 단백질이 개발되었으며, 그람 양성 세균에 대해서는 세포벽에 존재하는 단백질 등이, 효모에서도 또한 세포벽에 존재하는 표면 단백질을 활용하여 효과적으로 외래 단백질을 세포 표면에 발현하는 시스템이 개발되었다.

예를 들어, 그람 음성 세균에서는 OmpA, LamB, FadL, OprF, Lpp'OmpA, EaeA, INP 등과 같은 OMP와 AgAb, AIDA-Ⅰ, Ag43, MisL 등과 같은 자기 수송체가 개발되었으며, 그람 양성 세균에서는 Protein A와 같이 LPXTG 모티프를 갖는 세포벽 고정(cell-anchoring) 단백질이 효과적이다. 또한 효모 세포의 표면 발현과 관련해서는 Aga2p, Flop1, Agα1p의 세포벽에 존재하는 단백질을 표면 발현 고정 모체로 사용하여 다양한 생물학적 촉매와의 융합 단백질을 세포 표면에 발현하여 세포 표면에 고정된 생물학적 촉매로서의 기능을 보여주었다.

이처럼 기능성이 있는 외래 단백질을 표면 단백질에 융합하여 박테리아나 효모 등의 숙주 세포에 발현시키는 세포 표면 발현 시스템은 표적 단백질이 세포 표면에 고정되어 발현되므로 숙주 세포의 선별이 용이하기 때문에, 외래 단백질이 표면에 발현된 숙주 세포를 다양한 바이오 융합 기술로 활용될 수 있다. 예를 들어, 항원 결정부위(epitope)를 박테리아 표면에 디스플레이한 형태의 서브유닛 백신 전달(subunit vaccine delivery)이나 박테리아의 스포어(spore)를 기반으로 하는 생백신(live vaccine)의 개발이나, 백색 생명공학(white biotechnology)의 하나로서 생물 공학적으로 유용한 효소를 표면에 발현하여 세포에 고정화된 생물학적 촉매를 갖는 바이오 촉매(whole-cell catalysts)의 개발이나, 항체와 같이 생체 분자 또는 화학물질 등의 리간드와 결합할 수 있는 생체결합 단백질이 발현된 세포를 배양하여 생체결합 단백질이 코팅되어 있는 박테리아를 마이크로 입자로 활용하여 중금속과 같은 유해 물질을 제거하거나 면역학적 분석 등에 활용하는 흡착성 세포(whole cell bioadsorbent)의 개발이나, 세포 표면에 발현된 항체 라이브러리 등을 분석하여 단백질-단백질의 상호 작용 분석, 항체 엔지니어링, 효소 엔지니어링 및 특정 세포를 표적으로 하는 펩타이드 스크리닝과 같은 초고속 스크리닝 툴의 개발 등 다양한 분야로 응용될 수 있다.

세포 표면 발현 시스템을 이용하는 경우, 세포 표면에 발현된 효소를 분리, 정제하지 않고 단순히 세포를 배양하고 회수하는 것으로 효소를 대량으로 준비할 수 있기 때문에 효소 생산 비용을 획기적으로 낮추어 효소가 고가이기 때문에 상업화가 되지 못한 공정이 경제적 경쟁력을 가질 수 있다. 특히, 화학적 합성으로 만들어지는 고정화 담체는 대부분 수백 ㎛의 크기를 갖는데 반하여, 세포 표면 발현 시스템의 세균 세포는 대부분 1~2 ㎛이므로 단위 부피 표면적이 세균이 담체에 비해 수백 배 더 높게 되어 단위 부피당 효소의 절대량(enzyme loading capacity)이 훨씬 높고 결과적으로 고정화 효소의 비활성(specific activity)이 높은 장점을 갖는다.

따라서 생물학적 촉매인 효소를 세포 표면 발현 시스템을 이용하여 세포에 고정시키고, 이와 같이 세포 표면에 고정된 생물학적 촉매를 이용하여 생물전환 공정에 이용하여 효소 공학 산업의 활성화와 경제성을 높일 수 있는 기술의 필요성이 대두되고 있다. 또한 바이오디젤의 생산과 관련해서도 효소의 안정성이나 활성을 유지하여 반복사용이나 재사용이 가능하고, 특히 알코올에 내성이 있는 효소를 사용하여 생산 효율이나 수율을 향상시킬 필요성이 있다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해소하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 발현 효율이 양호하고, 발현된 단백질이 세포 표면에 견고하게 고정되어 안정적으로 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 세포 표면 발현 시스템을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 표면 발현 시스템을 이용하여 상기 외래 단백질이 표면에 발현되도록 형질전환 세포를 배양하여, 외래 단백질을 예를 들어 생물학적 촉매로 이용하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 표면 발현 시스템을 통하여 발현된 외래 단백질을 이용하여 반응 기질로부터 지방산 알킬 에스테르로서의 바이오디젤로의 전환 공정을 매개하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 세포 표면 발현 시스템으로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 세포 표면 발현 시스템을 숙주 세포에 주입하고 숙주 세포를 배양시켜 외래 단백질을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

전술한 목적을 갖는 본 발명은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)에서 유래한 자기 수송체인 EstA 단백질의 C-말단 링커 부분과 EstAβ로 구성된 자기 수송체를 세포 표면 고정 모체로 사용하고, 스타필로코커스 해모라이티쿠스(Staphylococcus haemolyticus) 유래의 L62 리파아제를 표적 단백질로 하는 세포 표면 발현 시스템 및 이 시스템을 이용한 L62 리파아제의 생산 및 생산된 L62 리파아제를 세포에 고정한 상태에서 바이오디젤인 지방산 알킬 에스테를 생산하는 공정에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 일 관점에 따르면 외래 단백질로서 서열식별번호:1의 아미노산 서열로 구성되는 L62 리파아제와, 세포 표면 고정 모체(cell surface anchoring motif)로서 서열식별번호:3의 아미노산 서열로 구성되는 에스터라아제 A의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 제공한다.

예시적으로, 상기 외래 단백질인 L62 리파아제는 서열식별번호:2의 염기 서열로 코딩되는 핵산에 의하여 발현될 수 있고, 상기 세포 표면 고정 모체인 에스터라아제 A는 서열식별번호:4의 염기 서열로 코딩되는 핵산에 의하여 발현될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템은 그람 음성 세균인 숙주 세포의 표면에서 발현될 수 있는데, 예를 들어 숙주 세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시 형태에 따르면, 세포 표면 발현 시스템은 융합 단백질을 세포 표면으로 이동시키며, 세포 외막에서 절단되는 리더 서열을 더욱 포함할 수 있는데, 일례로 상기 리더 서열은 서열식별번호:5의 염기 서열인 PelB 리더 서열로 구성될 수 있다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 상기 세포 표면 발현 시스템은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 서열과, 상기 융합 단백질의 발현 여부를 확인하는 선택 마커(선별 인자) 서열 및 복제 개시 원점을 더욱 포함할 수 있다.

일례로, 상기 세포 표면 발현 시스템은 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 예시적으로 상기 재조합 발현 벡터는 플라스미드 재조합 발현 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 외래 단백질로서 서열식별번호:1의 아미노산 서열로 구성되는 L62 리파아제와, 세포 표면 고정 모체(cell surface anchoring motif)로서 서열식별번호:3의 아미노산 서열로 구성되는 에스터라아제 A의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열로 구성되는 핵산을 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 숙주 세포에 주입하는 단계; 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 숙주 세포의 표면에서 상기 L62 리파아제를 발현시키는 단계; 및 상기 숙주 세포의 표면에서 발현된 L62 리파아제에, 유지 또는 지방산과, 알코올을 포함하는 반응 매질을 첨가하여, 에스테르 교환 반응 또는 에스테르 반응을 유도하는 단계를 포함하는 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 에스테르 교환 반응은, 상기 유지가 상기 반응 매질 내에 잔류하는 수분에 의한 가수분해에 의하여 상기 유지로부터 글리세롤이 제거된 뒤, 적어도 한 개의 글리세롤이 제거된 유지 또는 지방산이 알코올과 반응하여 지방산-알코올 에스테르로 전환되는 단계와, 상기 지방산-알코올 에스테르를 상기 글리세롤 성분 및 수분으로부터 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

지방산 알킬 에스테를 생산하기 위하여 기질로 사용되는 상기 알코올은 C₁ ~ C₄의 모노 알코올일 수 있으며, 상기 유지는 식물성 오일, 동물성 지방 또는 폐유를 포함할 수 있다.

예시적으로, 상기 알코올과 상기 유지는 1:3 내지 1:10의 몰비로 상기 반응 매질에 첨가되는 것을 특징으로 한다.

예를 들어 기질로 사용되는 알코올은 반응 매질에 대하여 1 ~ 60%의 농도로 1회 이상, 바람직하게는 1회 첨가될 수 있으며, L62 리파아제가 매개하는 에스테르 반응 또는 에스테르 교환 반응은 예를 들어, 20 ~ 55℃ 범위의 온도 및/또는 pH 7 ~ 12의 범위에서 진행되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면 전술한 세포 표면 발현 시스템에 의하여 형질전환된 미생물을 제공한다. 예시적으로 형질전환된 미생물은 대장균(E. coil), Salmonella속 세균, Pseudomonas속 세균과 같은 그람 음성 세균일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 발명은 전술한 세포 표면 발현 시스템을 적절한 숙주 세포, 예를 들면 그람 음성 세균에 주입하는 단계; 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 숙주 세포의 표면에 발현된 L62 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 L62 리파아제의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 외래 단백질을 발현시킬 수 있도록 고안된 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 EstA 단백질의 C-말단 펩타이드로 구성되는 자기 수송체(autotranslocator)인 세포 표면 고정 모체와, 외래/표적 단백질인 L62 리파아제의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 제안한다. 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템을 예를 들어 대장균과 같은 그람 음성 세균일 수 있는 숙주 세포에 주입하고, 숙주 세포를 배양하면 숙주 세포의 외막에 표적 단백질인 L62 리파아제가 발현된다.

본 발명에 따르면 L62 리파아제는 숙주 세포의 표면에 고정되어 발현되기 때문에, 유지나 지방산 및 알코올을 포함하는 반응 매질과 반응하여 재생 연료인 바이오디젤로 활용될 수 있는 지방산 알킬 에스테르를 효율적, 안정적으로 합성하여 생물 전환 공정에 활용될 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템은 세포를 이용하여 표적 단백질을 고정할 수 있고, 이와 같이 생물학적 시스템에 고정화된 표적 단백질을 이용하여 생물학적 전환 공정에 응용할 수 있으므로, 산업적 규모로 효소를 이용하는데 있어서 매우 경제적인 비용으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템의 일예로서, 외래 단백질인 L62(SHL62) 리파아제와 표면 고정 모체인 EstAβ8을 코딩하는 뉴클레오티드가 삽입된 재조합 발현 플라스미드 벡터인 pPELB-Tu 및 pPELB-Tu::L62의 개략적인 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템이 주입된 숙주 세포인 대장균의 세포 표면에 SHL62 리파아제의 발현 여부를 검증한 실험 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로, 도 2의 A는 대장균 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제 활성을 확인하기 위하여 도 1에 도시한 pPELB-Tu와 pPELB-Tu::L62 재조합 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하여 만든 형질 전환체를 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)가 첨가된 트리 뷰티린 고체 배지에서 수행한 스파팅 분석 결과이고, 도 2의 B는 형질전환된 대장균을 배양한 후 세포로부터 외막 단백질을 분리하고 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 분석한 실험 결과이며, 도 2의 C는 배양된 대장균에서 발현된 SHL62 리파아제를 1차 항체로 SHL62와 FITC가 표지된 2차 항체와 반응한 후 유세포 분석기로 분석한 결과이며, 도 2의 D는 면역 형광 현미경으로 관찰한 도면이다.
도3은 pPELB-Tu와 pPELB-Tu::L62 재조합 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하여 만든 형질 전환체를 배양한 후 대장균의 세포 표면에서 발현된 SHL62의 효소 활성을 p-NPC 방법 (A)과 pH-STAT 방법(B), 그리고 프로테아제 접근성 분석법(C, D, E)에 따른 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도4는 본 발명에서 대장균 세포 표면에 발현된 SHL62리파아제를 이용하여 다양한 온도 (A), pH (B), 온도에 대한 안정성 (C) 그리고 다양한 합성 기질 선호도 (D)에 대한 것을 측정한 그래프이다.
도 5의 A는 본 발명에 따른 pPELB-Tu와 pPELB-Tu::L62 재조합 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하여 만든 형질 전환체를 배양한 후 대장균 세포 표면 발현된 SHL62 리파아제를 이용하여 올리브유와 메탄올로부터 바이오 디젤 생성물을 박층크로마토그래피(Thin layer chromatography) 분석 결과를 도시한 사진이고, 도 5의 B는 기체크로마토그래피(Gas chromatography)를 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 예를 들어 생물학적 촉매를 이용하여 안정적으로 바이오디젤과 같은 연료를 생산할 수 있는 방법을 연구하여, 적절한 세포 표면 고정 모체와 표적 단백질을 사용하는 세포 표면 발현 시스템을 개발하였다. 본 발명에 대한 상세한 설명에 앞서, 본 발명과 관련해서 일부 용어의 의미를 정의한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "핵산 (분자)" 또는 "뉴클레오티드"는 예컨대 cDNA와 같은 DNA 및/또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미로서, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "외래 단백질 (heterologous protein, foreign protein)" 또는 "표적 단백질(passenger protein)"은 본 발명의 발현 시스템을 통하여 대량으로 생산하고자 하는 목적 단백질로서, 표면 발현 시스템에 해당 단백질을 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드를 삽입하여 형질 전환체에서 발현할 수 있는 모든 단백질을 의미한다. 예시적으로, 본 명세서에서 "외래 단백질"은 스타필러코커스 해모라이티쿠스(Staphylococcus haemolyticus)의 L62 (SHL62) 리파아제를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "융합 단백질 (fusion protein)"은 원래의 외래 단백질의 서열의 N-말단, 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현 시스템" 또는 "발현 벡터"는 외래 단백질 및/또는 융합 단백질의 전사에 제공되는 추가 단편에 작동 가능하게 연결된 발현 대상인 외래 단백질인 폴리펩타이드를 코딩하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 핵산 분자이다. 그와 같은 추가 단편은 프로모터와 같은 전사 조절 서열 및/또는 종료암호 서열을 포함할 수 있다. 또한, 발현 시스템은 하나 이상의 복제 개시 원점, 하나 이상의 선택 마커(선별 인자), 증폭제 (enhancer), 폴리아데닐화 신호, 기타 서열 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스의 핵산으로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생물 전환"은 생체 내에 존재하는 효소나 생체 자체를 생물학적 촉매로 이용하여 화합물의 화학적 변화를 일으키는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "유지"라는 용어는 식물성 오일, 동물성 지방 및 폐식용유와 같은 폐유 또는 폐-지방을 모두 지칭하는 것을 의미한다. 이러한 의미에서 본 명세서에서 '유지'라는 용어는 글리세롤이 3가의 지방산과 결합되어 있는 '트리글리세라이드 (triglyceride)'는 물론이고 글리세롤과 결합하지 않은 유리 지방산을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "바이오디젤"이란 용어는 식물유, 동물성 지방 및 폐유와 같은 트리글리세라이드(triglyceride) 및/또는 유리 지방산을 포함하고 있는 유지가 촉매의 존재 하에 알코올과 반응하여 에스테르 교환 반응에 의하여 부산물로서 글리세롤 또는 물을 생성하면서 제조되는 지방산 알킬 에스테르를 의미한다. 따라서 본 명세서에서 바이오디젤과 지방산 알킬 에스테르는 서로 교환적인 의미로 사용될 수 있다. 예를 들어 탄소수 10 ~ 30의 포화 또는 불포화 지방산의 메틸, 에틸 에스테르를 바이오디젤의 일예로 들 수 있지만, 본 발명의 바이오디젤이나 지방산 알킬 에스테르가 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 바이오디젤은 원유 기반의 경유(diesel)와 물성이 유사하기 때문에 경유를 대체하거나 경유와 혼합하여 디젤 엔진 등에 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "SHL62 리파아제" 또는 "L62 리파아제"는 스타필러코커스 해모라이티쿠스(Staphylococcus haemolyticus)에서 유래하여, 예를 들어 대한민국 특허출원 제10-2012-0059611에 프리프로(prepro) 시그널 염기서열(signal sequence)이 제거된 완성된 형태(mature form)로서 아미노산 서열(서열식별번호:1)과, 염기 서열(서열식별번호:2)을 가지는 리파아제를 의미한다.

이하 본 발명에 따라, SHL62 리파아제를 세포 표면에 발현시키기 위한 세포 표면 발현 시스템의 구성 및 그 제조 과정과 이를 이용하여 생물 전환 공정을 통하여 바이오디젤을 합성하는 공정에 대해서 구체적으로 설명한다.

A. 세포 표면 발현 시스템

도 1을 참조하면서 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템을 설명한다. 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템은 세포 표면 고정 모체(surface anchoring motif)와, 발현 대상이 되는 외래 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 또는 핵산 서열을 포함하고, 선택적으로 필요에 따라 융합 단백질을 적절한 숙주 세포의 표면으로 이동시키는 리더/신호 서열(leader/signal sequence)과, 융합 단백질의 전사 조절 서열, 복제 원점 및 선별 인자(선택 마커) 서열 등을 포함할 수 있다.

예를 들어, 박테리아의 표면 단백질을 이용하여 외래 단백질을 세포 표면에 발현시키기 위하여, 적당한 표면 단백질과 외래 단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합 단백질이 생-합성되도록 하고, 이들이 안정적으로 세포 내막을 통과하여 세포 표면에 부착하여 유지되어야 한다. 특히, 세포 표면 발현 시스템에 사용되는 세포 표면 고정 모체는 외래 단백질과 핵산 수준에서 융합되어 외래 단백질의 활성을 변화시키지 않으면서 숙주 세포 내막을 통과하여 세포 외막으로 안정적으로 부착, 발현시킬 필요가 있다.

이를 위하여 세포 표면 고정 모체는 숙주 세포의 외부 세포막에서 적절한 peptidase에 의해 인식, 절단되는 서열을 가지고 있을 수 있으며, 세포 외막 표면에 안정적으로 부착될 수 있는 신호 서열을 가질 수 있다. 특히 예시적으로 그람 음성 세균은 세포 내막(inner membrane), 주변 세포질(periplasmic space), 세포 외막(outer membrane)으로 이루어진 독특한 막 구조를 가지고 있는데, 이러한 막 구조를 갖는 그람 음성 세균에서 세포 표면 발현을 위해서는, 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 세포 표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 세포 표면 발현 모체의 사용이 필요하다.

본 발명에서는 세포 표면 고정 모체로서 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 에스터라아제 A(Esterase A, EstA)의 C-말단(아미노산 서열은 서열식별번호:3, 염기 서열은 서열식별번호:4)을 이용한다. 슈도모나스 푸티다 유래의 EstA는 자기 수송체(autotranslocator)로 알려져 있으며, 대략 622개의 아미노산 잔기로 구성되어 있다. EstA는 촉매 활성을 갖는 N-말단의 EstAα 도메인과, 그람 음성 세균의 세포 외막(outer membrane)을 통과시켜 N-말단 촉매 활성 부분이 세포 표면 바깥으로 나올 수 있도록 유도하는 C-말단의 링커 영역(linker region) 및 세포막을 통과하는 수송체(translocator) 영역인 EstAβ 도메인으로 구성되어 있다. 특히, EstA의 membrane topology에 따르면, EstA의 C-말단의 링커 영역이 시작되는 297번째 아미노산부터 대략 315번째까지의 아미노산은 세포 외막의 표면으로 루프(loop)를 형성하면서 노출되어 있는 것으로 여겨지고 있다. 이에 본 발명에서는 EstA의 C-말단 영역의 링커 부분과 수송체 도메인(EstAβ8)으로 구성되는 자기 수송체를 세포 표면 고정 모체로 사용한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 세포 표면 고정 모체는 슈도모나스 푸티다의 자기 수송체의 EstA 단백질의 C-말단의 링커부분의 서열 297번째의 아미노산부터 수송체 (translocator) 부분의 EstAβ의 서열 622번째를 포함하는 EstAβ8(C말단 297째 아미노산 ~ 622째 아미노산; 서열식별번호:3)로 구성될 수 있으며, 예시적으로 서열식별번호:4의 염기 서열로 코딩되는 펩타이드이다.

한편, 본 발명의 세포 표면 발현 시스템은 외부 단백질로서 스타필로코커스 해모라이티쿠스( Staphylococcus haemolyticus) 유래의 L62 리파아제(SHL62 리파아제, 아미노산 서열은 서열식별번호:1, 염기 서열은 서열식별번호:2)를 사용한다. 이때, 세포 표면 고정 모체로서 자기 수송체를 코딩하는 핵산 및/또는 외래 단백질을 코딩하는 핵산은 전체 또는 일부 또는 이들이 두 번 이상 반복된 것일 수 있으며, 반복되는 경우 이들은 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 자기 수송체인 세포 표면 고정 모체와 외래 단백질은 임의의 조합으로 융합될 수 있으며, 본 발명의 표면 고정 모체가 자기 수송체라는 점을 고려할 때, 외부 단백질은 세포 표면 고정 모체의 N-말단 쪽으로 융합되는 것이 바람직하다.

이때, 본 발명의 세포 표면 발현 시스템에 사용되는 세포 포면 고정 모체와 외래 단백질의 아미노산 서열 및/또는 염기 서열은 전술한 서열식별번호:1 내지 서열식별번호:4로 표시되는 것 외에도, 일부가 변형될 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 고정 모체 및/또는 SHL62 리파아제를 코딩하는 핵산은 세포 표면 발현에 유리하도록 일부 염기 서열이 인위적으로 변형될 수 있다. 이러한 염기 서열의 변형은 상응하는 아미노산의 변형을 수반하거나 하지 않을 수 있으며, 아미노산의 변형을 수반하는 경우에는 이러한 변형이 유발된 유전자는 이에 의해 코딩되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 것으로, 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체(homologues)를 포함할 수 있다. 유전자 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변형을 수반하지 않는 경우는 예를 들어 축퇴 변이가 있는데, 축퇴 변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 상기 유전자에 포함된다. 인위적 유전자 염기서열의 변형은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이 형성(site-directed mutagenesis, Kramer et al, 1987), 에러유발 PCR(Cadwell et al, 1992), 점-돌연변이법(Sambrook et al, 2001) 등에 의해 제조될 수 있다.

다시 말해, 본 발명에 따른 세포 표면 고정 모체 및/또는 외래 단백질은 그 기능을 잃지 않는 범위에서, 서열목록에 기재된 아미노산 서열 및/또는 염기 서열로 한정되지 않는다. 염기 또는 뉴클레오티드에서의 변이는 단백질에서의 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이와 같은 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오티드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 세포 표면 고정 모체 및/또는 외래 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 표면 고정 모체 및/또는 외래 단백질에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 서열식별번호:1 또는 서열식별번호:3으로 표시되는 펩타이드를 구성하는 아미노산과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 수 있다. 이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 이때, 변이를 도입하는데 있어서 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index) 및/또는 친수성 값(hydrophilicity value)이 고려될 수 있다.

예시적으로, 본 발명의 세포 표면 발현 시스템은 외래 단백질을 발현하기 위한 벡터로서 구축될 수 있는데, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 원핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명에 따른 세포 표면 고정 모체 및/또는 외래 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 원핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 해당 기술분야에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC18, pUC19, pET, pT7, pET28a, pGEX 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 표면 고정 모체-외래 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되는 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예시적으로, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 파지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터) 등이 발현 조절 부위로서 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 세포 표면 발현 시스템으로서의 발현 벡터는 세포 표면에의 부착 서열 이외에 외래 단백질을 세포 표면까지 전달/수송하기 위한 리더 서열(또는 신호 서열, 분비 신호 서열)을 또한 포함할 수 있다. 리더 서열은 일반적으로 약 18-30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 주로 단백질의 N-말단에 위치하며 후에 적절한 peptidase에 의해 절단된다. 이러한 리더 서열의 특징 및 종류는 해당 기술분야에서 공지된 것으로 예를 들면, 외래 단백질이 세포 표면 고정 모체의 C-말단에 융합되어 발현되는 경우에는 세포 표면 고정 모체에 원래 존재하는 것, 또는 외래 단백질이 세포 표면 고정 모체의 N-말단에 융합되는 경우에는 외래 단백질 자체의 리더 서열 또는 다른 세포 표면 단백질의 리더 서열을 융합하여 사용할 수 있다.

예시적으로, 본 발명의 세포 표면 발현 시스템은 전술한 세포 표면 고정 모체 및 외래 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일 말단에 리더 서열이 위치할 수 있다. 바람직하게는, 외래 단백질로서의 SHL62 리파아제-표면 고정 모체로서의 EstAβ의 융합 단백질을 숙주 세포의 외막으로 이동, 발현시키기 위한 적절한 리더 서열이 외래 단백질의 N-말단에 위치할 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 표면 고정 모체로서 자기 수송체를 사용하였다는 점을 고려해 볼 때, 그람 음성 세균에서 특정 단백질을 세포 외막으로 수송하는 임의의 리더 서열을 사용할 수 있다. 예시적으로, 리더 서열로는 단백질을 세균의 주변 세포질로 유도한 뒤 적절한 signal peptidase에 의해 절단되는 서열식별번호:5로 표시되는 pelB(pectase lyase B of Erwinia carotovora CE) 리더 서열일 수 있지만, 본 발명의 리더 서열이 예시한 pelB 리더 서열로 한정되는 것은 아니다. 당업자라면, 본 명세서의 기재 및 당업계의 상식으로부터, 외래 단백질 및 숙주세포를 고려하여 적절한 리더 서열을 선택할 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명의 세포 표면 발현 시스템의 일예인 플라스미드는 그 외 발현 플라스미드에 일반적으로 포함되는 전사종결인자, 약물저항성 및/또는 영양요구성 선별 인자, 복제 개시원점을 또한 포함할 수 있다.

즉, 상기 플라스미드에 포함되는 복제 개시 원점으로는 예를 들어 세균의 증식 및 유지에 통상적으로 사용되는 다양한 복제 개시 원점이 사용될 수 있는데, 예를 들어 f1 origin, pBR322 유래의 pUC origin, pSC101, 15A origin 등이다. 하지만, 본 발명이 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 플라스미드에 포함되는 전사종결인자는 단백질 코딩 유전자의 하류에 존재하는 염기서열로서, 유전자의 mRNA로의 적절한 전사 종결에 필요한 것으로 공지의 것이 사용될 수 있다.

아울러, 상기 플라스미드에 포함되는 선별 인자(선택 마커)로서, 해당 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

특히, 본 발명의 세포 표면 발현 시스템으로서의 벡터를 안정적으로 연속하여 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 해당 기술분야에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등의 E. coli 균주는 물론이고, Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella bongori 등과 같은 Salmonella속 세균, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae 등과 같은 Pseudomonas속 세균, Legionella속 세균 등과 같은 그람 음성 세균을 들 수 있다.

예시적으로, 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템을 제조하기 위하여 뼈대 벡터(backbone vector)로서 pET-22b(+)를 사용하고, PelB 리더/신호 서열에, N-말단이 제거되고 C-말단의 EstAβ8 핵산이 연결된 대장균 세포 표면 발현 벡터인 pPELB-Tu를 구축하였다(도 1의 A). 전술한 것과 같이, 발현 벡터의 뼈대 벡터는 상기 발표에 사용한 pET-22b(+)에 특별히 제한되는 것은 아니다. 예시적으로 대장균과 같은 그람 음성 세균에 주입되어 숙주 세포를 형질전환할 수 있는 벡터가 사용될 수 있는데, 예시적으로 pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC18, pUC19, pET, pT7, pET28a, pGEX 등 다양한 벡터를 사용할 수 있다.

이어서, 본 발명의 세포 표면 발현 벡터의 pPELB-Tu에 SHL62 리파아제 염기서열(서열식별번호:2)을 삽입하여 대장균 세포 외막에 SHL62 리파아제를 표면 발현 하고자 pPELB-Tu::L62 벡터를 구축하였다(도 1의 B). 이 벡터의 SHL62 리파아제는 예를 들어, 대한민국 특허 출원 제10-2012-0059611에서 제공한 염기 서열(서열식별번호:2)이 삽입되어 있는 재조합 벡터인 pSHML로부터 DNA의 5 말단의 NcoI 제한효소 인식 부위를 갖는 정방향 프라이머(서열식별번호:6)와, DNA의 3 말단의 SacI 제한 효소 인식 부위를 갖는 역방향 프라이머(서열식별번호:7)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 SHL62 리파아제 DNA를 증폭하여 얻을 수 있다. 증폭된 SHL62 리파아제 염기서열과 pPELB-Tu 벡터를 제한효소 NcoI가 SacI의 제한효소를 처리하고 연결 반응(ligation)을 한 후 pPELB-Tu::L62의 SHL62 리파아제가 삽입된 세포 표면 발현 벡터를 구축한다.

또한, 본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 본 발명의 표면 발현 시스템이 주입된 대장균 세포의 표면에 SHL62 리파아제의 발현 여부를 검증하기 위한 일련의 분석을 수행하였다. 먼저, 스파팅 분석(spotting analysis)에서 투명환이 형성되었으며(도 2의 A), 배양 세포에서 세포 외막 단백질을 분획하고, 분획된 단백질을 SDS-PAGE (sodium-dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하여 세포 외막에 슈도모나스 푸티다의 고정용 모체 EstAβ8 및 SHL62 리파아제가 성공적으로 융합단백질로 세포 표면에 발현되었으며(도 2의 B 위쪽), 리파아제 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)에서도 SHL62 리파아제의 효소가 자기 수송체 EstAβ8의 고정용 모체를 이용하여 세포 표면에 효율적으로 발현된다(도 2의 B 아래쪽). 또한 유세포 분석기 (Flow cytometric analysis)와 면역 형광 현미경 (Immunofluorescence microscopy)을 분석을 통하여 대장균 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 형광으로 보이는 것을 관찰할 수 있다(도 2의 C, D, E).

따라서 본 발명은 전술한 세포 표면 발현 시스템의 주입에 의하여 외래 단백질인 SHL62 리파아제를 표면에서 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 즉 형질전환체에 관한 것이다. 예를 들어, 형질 전환체는 대장균(E. coil), Salmonella속 세균, Pseudomonas속 세균과 같은 그람 음성 세균에서 유래할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

B. 세포 표면 발현 시스템을 이용한 리파아제의 제조 및 지방산 알킬 에스테르의 제조

상기에서 언급한 것과 같이 본 발명의 세포 표면 발현 시스템을 적절한 숙주 세포에 주입하고, 표면 발현 시스템이 주입된 숙주 세포를 배양하면, 외래 단백질인 SHL62 리파아제가 세포 표면 발현 시스템을 통하여 숙주 세포의 외막에서 발현된다. 따라서 본 발명은 전술한 세포 표면 발현 시스템을 적절한 숙주 세포, 예를 들어 대장균(E. coil)과 같은 그람 음성 세균에 주입하고, 세포 표면 발현 시스템이 주입된 숙수 세포를 각각의 성장에 적절한 조건에서 배양하여, 숙주 세포의 표면에 발현된 SHL62 리파아제를 수득하는 L62 리파아제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 대장균 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 기존에 알려진 발현 시스템에서 얻어진 효소에 비하여 활성이 훨씬 증가하였는데(도 3의 A 내지 D 참조), 본 발명의 세포 표면 발현 시스템이 효율적으로 외래 단백질인 SHL62 리파아제를 세포 표면에 발현한다는 점을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따르면 전술한 세포 표면 발현 시스템에 의하여 숙주 세포의 표면에 고정된 형태로 발현되는 SHL62 리파아제를 이용하여 바이오디젤로서의 지방산 알킬 에스테르를 제조하는데 응용될 수 있다. 예시적으로, 본 발명의 실시예에 따라 대장균 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 활성과 관련해서, 지방산 알킬 에스테르를 위한 에스테르 교환 반응 및/또는 에스테르 반응은 20 ~ 55℃, 바람직하게는 25 ~ 50℃, 더욱 바람직하게는 30 ~ 50℃, 가장 바람직하게는 예를 들어 40 ~ 45℃일 수 있는 35 ~ 45℃ 범위에서 수행될 수 있다(도 4의 A). 또한, 대장균 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 pH 7 ~ 12, 바람직하게는 8 ~ 11, 더욱 바람직하게는 8.5 ~ 10의 범위에서 최적 활성을 가질 수 있다(도 4의 B). 특히, 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 상대적으로 알칼리 pH에서 안정적임을 확인하였으며, 온도에 대한 안정성은 45℃까지 최고 활성에 80% 이상이 유지되며(도 4의 C), 기질에 대한 선호도는 p-nitrophenyl caprylate(C8)에 가장 높다(도 4의 D).

이러한 결과를 토대로 본 발명의 실시예에서는 숙주 세포 표면에 고정된 형태로 발현된 SHL62 리파아제를 생물학적 촉매로 사용하여 바이오디젤, 즉 지방산 알킬 에스테르를 합성하는 데 응용될 수 있다는 점을 확인하였다(도 5의 A 및 B).

따라서 본 발명은 또한 전술한 세포 표면 발현 시스템을 적절한 숙주 세포에 주입하고, 세포 표면 발현 시스템에 의하여 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 숙주 세포의 표면에 고정된 형태로 외래 단백질인 SHL62 리파아제를 발현하고, 숙주 세포의 표면에 고정된 형태로 발현된 SHL62 리파아제에, 바이오디젤의 원료 물질인 유지(또는 지방산)와 알코올을 포함하는 반응 매질을 첨가하여 에스테르 교환 반응 또는 에스테르 반응을 유도하여 바이오디젤인 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.

즉, 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템에 따라 외래 단백질인 SHL62 리파아제는 예를 들어 대장균과 같은 숙주 세포의 표면에 고정된 형태로 발현되는데, 이와 같이 세포 표면에 고정된 SHL62 리파아제를 사용하여 지방산 알킬 에스테르를 제조할 수 있다. 구체적으로, 세포 표면에 고정된 SHL62 리파아제를 생물학적 촉매로 사용하고, 반응 매질 내의 기질인 유지 및 알코올의 에스테르 교환 반응시키거나, 또는 반응 매질 내의 지방산 및 알코올 사이의 에스테르 반응시켜, 예를 들어 바이오디젤과 같은 지방산 알킬 에스테르를 제조할 수 있다. 후술하는 실시예를 통해서 분명해지겠지만, 본 발명에 따른 세포 표면 발현 시스템에 따라 적절한 숙주 세포의 표면에 고정된 형태로 발현된 SHL62 리파아제를 사용하여 에스테르(교환) 반응을 매개하는 경우, 재사용이 가능하고, 광범위한 pH, 온도 및 다양한 유기용매에 대해서도 촉매 활성이 저해되지 않고 안정적으로 활성을 유지할 수 있다.

세포 표면에 고정화된 SHL62 리파아제를 사용하여 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 공정은 기본적으로 반응 기질로 사용되는 유지 및/또는 지방산과 알코올에 의한 에스테르 교환 반응(trans esterification) 또는 에스테르 반응(esterification)에 의하여 지방산 알킬 에스테르(fatty acid alkyl ester, FAAE)인 바이오디젤로의 전환 공정을 이용한다. 트리글리세라이드는 글리세롤과 결합되어 있는 고급의 포화 또는 불포화 지방산 에스테르로서, 식물성 오일 또는 동물성 오일 또는 지방과 같은 유지의 주요 구성 성분이다. 한편, 폐 식물성 오일(waste vegetable oil, WVO), 폐지방(waste fat), 폐식용유와 같은 폐유를 포함하여 식물성 오일 및 동물성 지방에는 일정 함량의 유리 지방산(free fatty acid)을 포함하고 있다.

특히, 본 발명과 관련하여 세포 표면에 고정된 생물학적 촉매인 SHL62 리파아제를 사용하는 경우, 트리글리세라이드는 알코올과 반응하여 에스테르 교환 반응에 의하여 지방산 알킬 에스테르 및 글리세롤 또는 물로 변환될 수 있으며, 유리 지방산(free fatty acid)은 알코올과 반응하여 에스테르 반응에 의하여 지방산 알킬 에스테르 및 물로 변환될 수 있다. 이에 따라 트리글리세라이드 및 유리 지방산을 모두 포함하고 있는 유지의 경우에는 상술한 에스테르 교환 반응 및 에스테르 반응을 통하여 바이오디젤로 전환될 수 있다. 예를 들어, 반응 매질 내에 잔류하는 수분에 의하여 유지가 가수분해(hydrolysis)되면 유지로부터 글리세롤이 제거되는데, 이때 적어도 한 개의 글리세롤이 제거된 유지(디글리세라이드 또는 모노글리세라이드) 또는 지방산이 알코올과 반응하여 지방산-알코올 에스테르로 전환되고, 전환된 지방산-알코올 에스테르를 상기 글리세롤 성분 및 수분으로부터 분리되는 일련의 단계를 거치면서 지방산 알킬 에스테르가 얻어질 수 있다.

본 발명과 관련하여 바이오디젤, 즉 지방산 알킬 에스테르로 전환될 수 있는 원료인 유지에는 식물성 오일은 물론이고, 동물성 오일 또는 지방 및 폐유를 포함한다. 사용될 수 있는 식물성 오일에는 유채유(rapeseed oil), 대두유(soybean oil), 겨자씨유(mustard oil), 아마유(flax oil), 올리브유, 해바라기씨유, 야자유(palm oil), 피마자유(castor oil), 코코넛 오일(coconut oil), 옥수수유(corn oil), 면실유(cottonseed oil), 대마유(hemp oil), 낙화생유(peanut oil), 홍화유(safflower oil)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 동물성 오일 또는 동물성 지방으로는 우지(牛脂, tallow), 돼지기름(lard), 닭의 지방, 어유(fish oil)의 오메가-3 지방산 생산의 부산물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명에 따르면 세포 표면에 고정된 형태로 발현되는 SHL62 리파아제를 생물학적 촉매로 사용하여 천연적으로 생성되는 위 식물성 오일 및 동물성 지방에 비하여 비교적 많은 함량의 수분을 갖고 있는 폐유에 대해서도 지방산 알킬 에스테를 합성할 수 있다. 예를 들어 폐식용유(waste edible oil) 또는 폐 식물성 오일과 같이 식물성 오일로부터 폐기된 성분 및 폐지방과 같이 동물성 지방으로부터 폐기된 성분을 포함하지만 결코 이에 한정되지 않는다.

예를 들어, 본 발명에 따라 세포 표면에 고정화된 SHL62 리파아제는 특히 알코올과 같은 유기용매에 대하여 내성이 향상되어 지방산 알킬 에스테르의 전환 공정에서 고농도의 알코올에 대해서도 활성을 잃지 않는다. 따라서 예를 들어 세포 표면에 고정된 형태로 발현된 SHL62 리파아제를 사용하여 지방산 알킬 에스테르를 합성 또는 제조하는 과정에서, 기질로 사용된 유지(또는 지방산)와 알코올로부터 에스테르 교환 반응 또는 에스테르 반응에 의하여 지방산 알킬 에스테르가 생성되고, 이 과정에서 유지에 결합되어 있는 글리세롤이 부산물로 생성된다. 구체적으로 유지에 포함되어 있는 트리글리세라이드는 세포 표면에 고정화된 SHL62 리파아제의 도움을 받아 반응 매질 내지는 유지에 함유되어 있는 수분에 의하여 가수분해가 이루어져서 3개의 지방산과 결합되어 있는 글리세롤이 순차적으로 분리됨으로써, 카르복시산(carboxylic acid) 형태의 중간 산물이 생성된다. 이어서 이 카르복시산 형태의 중간 산물이 알코올과 에스테르 반응함으로써, 지방산 알킬 에스테르 및 물로 전환된다. 다시 말하면 유지에 함유되어 있는 트리글리세라이드의 경우에는 "가수분해-에스테르화"라는 에스테르 교환 반응을 통하여 바이오디젤로 전환된다. 이에 반하여, 유지에 함유되어 있는 유리 지방산은 알코올과 직접 반응하여 에스테르 반응에 의하여 바이오디젤로 전환된다.

이처럼, 본 발명에서 사용되는 세포 표면에서 고정화된 SHL62 리파아제는 유지의 주성분인 트리글리세라이드로부터 바이오디젤로 전환되는 과정에서 수분에 의한 가수분해 과정을 거치기 때문에, 천연 유지와 비교할 때 다량의 수분이 함유되어 있는 폐유에도 용이하게 채택될 수 있다. 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니지만, 예를 들어 유지 총량에 대해서 수분 함량이 1-20 중량%, 예를 들어 5-10 중량%를 차지하고 있는 임의의 폐유에 대해서도 적용될 수 있다. 따라서 바이오디젤로의 전환을 위한 원료 기질로서 값싼 폐유를 사용할 수 있기 때문에 바이오디젤의 제조 과정에서 생산 단가를 줄일 수 있는 이점을 갖게 된다.

한편, 유지를 이루는 트리글리세라이드와 알코올을 기질로 사용하여 바이오디젤로 전화하는 과정에서 지방산 알킬 에스테르 외에도 글리세롤이 부산물로 생성되며, 유리 지방산을 기질로 사용하는 경우에는 물이 생성될 수 있다. 이론적으로 알코올과 트리글리세라이드는 1:3의 몰비로 반응하여 바이오디젤로 전환되지만, 효율적인 바이오디젤로의 전환을 위해서 이 몰비를 넘는 과량의 알코올이 사용될 수 있다.

이때, 바이오디젤로의 전환 공정 후에 반응 혼합물로부터 과량의 알코올 및 물을 분리하여야 하는데, 과량의 알코올 및 물은 당업계에서 잘 알려져 있는 임의의 방법인 증발법, 흡착법, 추출법 등을 통하여 분리될 수 있다. 또한, 반응 혼합물로부터 물과 알코올이 분리된 다음에는 혼합물로부터 반응하지 않은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드 및 생촉매로서의 L62 리파아제를 분리할 필요가 있는데, 이러한 물질은 흡착법, 추출법, 결정화 방법, 막 형성 방법 등을 통해서 분리될 수 있다.

이와 관련해서, 바이오디젤로의 전환 공정을 위한 다른 하나의 기질로서 알코올은 본 발명의 기술분야에서 일반적으로 사용되고 있는 알코올이 사용될 수 있다. 이러한 알코올은 예를 들어 탄소수 1~4(C₁ ~ C₄)의 모노 알코올로서, 구체적으로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, tert-부탄올 중에서 선택되는 적어도 어느 하나의 알코올이다. 바이오디젤로의 전환 및 합성 공정에서의 제조 단가를 고려해 볼 때, 메탄올이 가장 바람직하지만 본 발명이 이에 한정되지 않는다.

특히, 본 발명의 지방산 알킬 에스테르 제조 공정과 관련해서 세포 표면에 고정된 형태로 발현되는 SHL62 리파아제의 경우, 알코올의 농도가 최고 60%로 사용된다고 하더라도 효소 활성이 유지될 수 있다(도 4 참조). 종래 지방산 알킬 에스테르 제조 공정에 사용된 생물학적 촉매가 통상적으로 20%의 알코올 농도 이상에서는 활성을 잃는 것과 비교할 때, 본 발명에 따라 세포 표면에 고정된 SHL62 리파아제는 고농도의 알코올이 반응 매질 중에 포함되어도 무방하기 때문에 제조 공정에 있어 이점을 갖는다.

다시 말하면 종래의 생물학적 촉매를 사용하여 기질로서 알코올을 사용하는 경우에는 알코올에 대한 내성이 있기 때문에 고농도의 알코올을 사용할 수 없다. 따라서 종래의 생물학적 촉매를 사용하는 경우에는, 통상적으로 알코올의 농도를 단계별로 증가시키는데, 통상적으로 반응 매질에 첨가되는 알코올의 농도를 3단계로 구분하여 점진적으로 증가된 알코올을 반응 매질에 첨가하는 공정으로 진행되기 때문에 반응 공정이 복잡해질 뿐만 아니라 결과적으로 생산성을 저하시키는 주요한 원인으로 여겨지고 있다.

하지만, 본 발명에서는 처음부터 고농도의 알코올을 사용하더라도 세포 표면에 고정화된 SHL 리파아제의 활성이 유지되기 때문에 종래와 같이 다단계의 알코올 첨가 공정이 필요 없다. 아울러, 종래 생물학적 촉매를 이용한 바이오디젤 전환 공정에 있어서는 유지와 알코올의 몰비가 최종적으로 1:3 미만으로 할 수밖에 없었다. 이 비율을 초과하면 알코올로 인하여 생물학적 촉매의 활성이 저하될 우려가 있기 때문이었다. 하지만, 본 발명에 따라 세포 표면에 고정화된 SHL62 리파아제는 다양한 알코올에 대한 내성이 크게 향상되었기 때문에, 반응 매질에서 유지와 알코올을 최고 1:10의 몰비로 사용할 수 있다. 예를 들어 유지와 알코올은 1:3 내지 1:10, 바람직하게는 1:3 내지 1:6의 몰비로 사용될 수 있다. 이런 일련의 실험을 통하여 고정화된 HC-L62리파아제가 산업적으로 바이오디젤의 지방산 에스테를 전환 공정과정에서 매우 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로 본 발명의 목적은 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 재조합 발현 벡터 pPELB - Tu 의 제조

T7/lacI 프로모터, 외래 단백질을 세포 표면에 성공적으로 발현하기 위해서 PelB 신호/리더 서열, 그리고 세포 표면 발현 고정용 모체로 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 자기 수송체인 EstA 단백질 C-말단의 링커 부분 서열 297번째의 아미노산부터 수송체(translocator) 부분의 EstAβ의 서열 622번째를 포함하는 EstAβ8(서열식별번호:3)을 구성 요인으로 한다. 사용된 뼈대 벡터는 pET-22b(+)로서 PelB 신호 서열에 N-말단이 제거되고 C-말단의 EstAβ8 유전자가 연결된 대장균 세포 표면 발현 벡터인 pPELB-Tu를 구축하였다. 구축된 벡터를 NcoI과 SacI으로 절단하여 실시예 2에서 준비한 DNA와 결합하기 위한 벡터로 준비하였다(도 1의 A 참조)

실시예 2: 재조합 발현벡터 pPELB - Tu :: L62 의 제조

세포 표면에 스타필러코커스 해모라이티쿠스 L62 (SHL62) 리파아제를 발현하기 위하여 이 벡터의 SHL62 리파아제의 염기서열(서열식별번호:1)이 삽입되어 있는 재조합 벡터인 pSHML을 주형으로 하고 서열번호 3과 서열번호 4를 프라이머로 사용하여 다음과 같이 중합 효소 연쇄반응(첫 번째 변성 94℃ 5분, 1회 반복; 두 번째 변성 94℃ 30초, 교잡 52℃ 30초, 연장 72℃ 1분 30초, 30회 반복; 연장 72℃)을 수행 하였다. SHL62 리파아제를 증폭하기 위하여 서열식별번호:6의 정방향 프라이머와, 서열식별번호:7의 역방향 프라이머를 사용하였다.

이어서 아가로스 젤 전기영동법으로 상기 연쇄 중합 효소 연쇄 반응 방법으로 얻은 약 1.2 Kb 크기의 DNA 절편을 분리하여 5' 말단의 NcoI과 3'말단의 SacI의 제한효소 인식 부위를 이들 제한효소로 절단하고 전기 실시예 1에서 준비한 NcoI과 SacI의 제한 효소로 절단된 pPELB-Tu 벡터와 결합한 DNA를 대장균 XL1-Blue로 형질전환하여 형질전환체로부터 재조합된 pPELB-Tu::L62 벡터를 수득하였다(도 1의 B 참조).

실시예 3: 재조합 발현벡터 pPELB - Tu :: L62 로부터 SHL62 :: EstA β8의 융합단백질의 제조

실시예 2에서 제작된 재조합 발현벡터 pPELB-Tu::L62로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)에서 SHL62::EstAβ8로 구성되는 융합 단백질을 발현하기 위하여 재조합 대장균들을 암피실린(100 ㎍/㎖)이 포함된 LB 액체 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨) 50 ㎖이 담긴 250 ㎖ 삼각 플라스크에 접종하여 흡광도(O. D. 600 ㎚)가 0.5가 될 때 까지 배양한 후, 0.1 mM IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 20℃에서 22시간동안 배양하였다.

실시예 4: 세포 외막 단백질 분리

실시예 3의 배양 과정을 통하여 얻은 대장균 배양액 10 ㎖를 사용하여 세포외막 단백질을 분리하기 위하여 다음과 같은 방법으로 세포 외막 단백질을 분획하였다. 배양액을 4℃에서 6000 rpm (3700 x g)으로 5분 동안 원심분리 한 후 침전물을 50 mM Tris-HCl pH 8.0 완충용액으로 씻어주고, 동일한 조건으로 원심분리 한 후 1 ㎖의 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 현탁하였다. 이어, 현탁한 용액을 초음파(soinication)로 처리(최고 속도의 15% 세기로 각각 20초씩, 3번)하여 세포를 파쇄하고, 4℃에서 1500 x g 속도로 5분 동안 원심 분리하여 파쇄되지 않은 세포를 분리하고, 상등액을 4℃에서 21,800 x g의 속도로 30분간 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 이 침전물에 세포 외막 단백질이 포함되어 있으며 0.15 ㎖의 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 현탁하였다.

실시예 5: 스파팅 , 웨스턴 블로팅 , 유세포 분석, 면역 형광 현미경 관찰을 통한 세포 표면에 발현된 SHL62 :: EstA β8 융합단백질 검증

본 실시예에서는 세포 표면 발현 시스템을 통하여 숙주 세포에 주입된 외래 단백질인 SHL62 리파아제의 발현 여부를 검증하였다. 실시예 2에 따라 배양한 대장균 세포를 회수하여 대장균의 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 기능적 효소 활성을 측정하기 위하여, 트리뷰티린 (Tributyrin)이 포함된 고체 배지 상에서 스파팅 분석(Spotting assay)을 수행하였다. 도 2의 A에 도시된 것과 같이, 배양된 대장균 세포의 외부에 투명환(Halo)이 형성된 것을 확인하였다.

이어서, 실시예 4에서 얻은 상기 침전물의 현탁액을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였고, 분석된 SDS-PAGE의 젤의 시료를 나이트로 셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 일렉트로 블로팅 한 후(electro-blotting), TBS (Tris-buffered saline, 20 mM Tris-HCl pH7.6, 137 mM NaCl) 완충용액에 5% 스킴 밀크(Skim milk) 용액에 반응한 후, 1:10,000으로 희석된 SHL62 리파아제 항체와 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 이어 0.1% 트윈 20 (Tween 20)이 포함된 TBS 용액으로 3번 씻어 주고, SHL62 리파아제 항체와 반응하는 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 1:10,000으로 희석된 2차 항체로 실온에서 한 시간 반응 후, 0.1% 트윈 20 (Tween 20)이 포함된 TBS 용액으로 다시 3번 씻어 주고, ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 사용하여 항원과 항체가 결합된 부분을 확인하였다. 본 실시예에 따라 SDS-PAGE의 분석 및 리파아제 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 결과는 도 2의 B에 도시되어 있다.

유세포 분석과 형광 현미경 관찰을 위하여 실시예 3에서 얻은 시료를 원심분리(6000 rpm, 5분, 4℃)하여 PBS (10 mM sodium phosphate pH 7.8, 150 mM NaCl) 완충용액으로 3번 씻어주고, 5% 스킴밀크 (Skim milk)와 1:5000으로 희석된 SHL62 리파아제 항체를 포함하는 PBS 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS 용액으로 다시 3번 정도 씻어주고, 1:200으로 희석된 형광 이소씨오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC))가 결합된 SHL62 리파아제와 반응 할 수 있는 2차 항원으로 실온에서 1시간 반응하였다. 그리고 PBS로 다시 4번 씻어주고, 유세포 분석기 (CYTOMICS FC500)와 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 유세포 분석 결과와 면역 형광 현미경 분석 결과는 각각 도 2의 C와 도 2의 D에 도시되어 있는데, 본 발명의 세포 표면 발현 벡터 시스템은 외래 단백질인 SHL62 리파아제 효소를 세포 외막 표면 밖으로 효율적으로 발현시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 효소 활성 측정

본 실시예에서는 전술한 실시예 5에 따라 세포 표면에 발현된 외래 단백질인 SHL62 리파아제의 활성을 측정하였다. 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 효소 활성 측정은 합성기질을 사용하여 측정하는 p-NPC (p-nitrophenyl caprylate) 방법과 오일을 사용하여 측정하는 pH-STAT 방법을 이용하여 다음과 같이 수행하였다.

먼저 p-NPC 분석과 관련하여, 합성 기질을 사용하여 효소 활성을 측정하기 위하여 기질 혼합액으로 파라-니트로페닐 카프릴레이트(p-NPC, p-nitrophenyl caprylate, 10 mM)와 에탄올 및 트리스-염산(Tris-HCl, 100 mM, pH 8.0) 완충용액을 10:40:950의 비율로 섞어 총 1 ㎖을 사용하였다. 이 혼합액에 건조된 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 효소의 적당량을 넣고 충분히 섞어준 후 30℃에서 3분간 반응시키고 효소반응에 의해서 생성된 파라-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 405 ㎚ 파장의 흡광도로 측정하여 정량하였다. 효소활성 1 유닛(unit)은 1분 동안 1 μM의 파라-니트로페놀을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

또한, pH-STAT 방법과 관련해서, 오일을 사용하여 효소 활성을 측정하기 위하여 pH-STAT 방법은 기질 혼합액으로는 1% 올리브 오일과 1% 아라비아 검(gum arabic)의 용액을 최고속도에서 2분 동안 워링 블렌더 (Waring blender (model 51BL31)로 혼합하여 기질 용액을 제조하였다. 기질 용액 20 ㎖에 적당량의 건조된 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 효소를 넣은 후 10 mM NaOH 용액으로 pH 8.0으로 조정하였다. 30℃에서 5분 동안 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제 효소에 의해 생성된 유리 지방산(free fatty acid)양을 pH를 8.0으로 조정하기 위하여 넣은 NaOH 양으로 환산 할 수 있다. 효소활성 1 유닛(unit)은 1분 동안 1μmol의 지방산 생성을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

본 실시예에 따른 p-NPC 분석 결과와 pH-STAT 분석 결과는 각각 도 3의 A와 도 3의 B에 도시되어 있다. p-NPC 분석과 pH-STAT 분석에 따라, 대장균 표면에 발현된 SHL62 리파아제 효소의 활성을 분석한 결과 대장균에 각각 단위 그램 세포 건조 중량당 168.2 U 그리고 25.7U로 발현되어, 종래 Narita 등이 보고한(Narita, J., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 70 (5): 564-572, 2006) 대장균 표면에 발현된 Candida antarctica lipase B의 효소 활성(세포 건조 중량당 4.6 U)에 비하여 현저히 높은 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서 세포 표면 발현 시스템 제작을 위하여 사용한 고정용 모체 EstAβ8이 다른 고정용 모체 시스템을 이용한 것보다 효과적으로 리파아제의 효소 활성을 개선하는데 유용한 세포 발현 시스템임을 확인하였다.

계속해서, 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 효소 활성은 할로 (Halo)형성과 프로테아제 접근성 분석(protease accessibility assay)을 통하여 확인하였다. 프로테아제의 고분자 물질은 세포 외막을 통하여 세포 내부를 통과하지 못하므로 세포 표면에 외래 단백질이 발현되면 프로테아제에 의해서 세포 표면에 발현된 외래 단백질이 분해되어 효소의 기능적 활성이 저해된다(Rizos, K. et al., Infect. Immun. 71 (11): 6320-6328, 2003; Rodriguez-Ortega, MJ. et al., Nat. Biotechnol. 24 (2): 191-197, 2006).

프로테아제 접근성 분석과 관련해서, 실시예 3에서 준비한 배양세포를 트리뷰티린 고형 배지에 스파팅하여 균체 주변에 투명환 형성을 관찰하였고, 한편으로 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액 1 ㎖로 현탁하여 흡광도(O. D. 600 ㎚)를 10으로 조정하여 프로테아제 K (20 ㎎/㎖) 5 ㎕을 넣은 후 실온에서 1시간 반응 후 5 ㎕의 200 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF, phenylmethylsulfonylfluoride)를 처리하여 프로테아제 K의 반응을 억제하였다. 이렇게 처리된 세포를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 세 번 씻은 후에 상기에서 설명한 것처럼 효소 활성을 측정하고, 실시예 5에 제시된 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅 절차에 따라 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 기능적 발현을 확인하였다.

프로테아제 접근성 분석 결과는 도 3의 C, D, E에 도시되어 있다. 프로테아제 K를 처리한 후 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 활성은 프로테아제 K를 처리하지 않은 세포 표면의 SHL62 리파아제 비해 90% 이상이 감소된 것을 확인할 수 있었고, SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅을 통하여 SHL62 리파아제와 EstAβ8 융합한 단백질의 양이 감소된 것을 확인할 수 있다. 그러므로 상기의 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 본 발명의 세포 표면 발현 시스템으로 대단히 많은 부분의 양이 세포 외부에 발현된 것을 알 수 있었다.

실시예 7: 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 다양한 온도, pH , 합성 기질 선호도에 대한 특성 실험

상기 실시예 3에 따라 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제의 다양한 온도 변화 (10℃~70℃)에 따른 효소 활성은 p-nitrophenyl caprylate(p-NPC)를 이용하였으며, 최적 활성 온도를 구하였다. 또한 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해 10℃에서 60℃의 다양한 온도에서 30분간 방치한 뒤 30℃에서 동일한 방법으로 효소의 잔존 활성을 측정하였다. pH에 대한 특성을 조사하기 위하여 다양한 범위의 pH 완충 용액을 사용하여, 최적 pH를 위하여 또한 p-NPC 측정법을 수행하여 잔존 활성을 측정하였다. pH 범위를 달리하여 사용된 완충 용액은 각각 KH₂PO₄/K₂HPO₄(50 mM, pH 6.0-7.5), Tris-HCl(50 mM, pH 7.5-9), glycine/KCl/KOH(50 mM, pH 9-10), K₂HPO₄/K₃PO₄(50 mM, pH 11-12)이었다.

기질에 대한 선호도는 다양한 탄소 길이를 갖는 합성 기질(C₂, pNP-acetate; C₄, pNP-butyrate; C₈, pNP-caprylate; C₁₀, pNP-caprate; C₁₂, pNP-laurate)을 사용하여 SHL62 리파아제 효소의 활성을 측정하였고, 또한 탄소 길이가 긴 합성 기질(C₁₄, pNP-myristate; C₁₆, pNP-palmitate ; C₁₈, pNP-stearate)을 사용할 경우에는 효소액의 적당량을 890 ㎕ 반응 용액(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1 % gum arabic, 0.2 % deoxycholate)에 넣고 30℃에서 3분간 반응한 후 아이소프로판올 (isopropanol)로 녹인 8 mM의 기질을 100 ㎕ 넣고 다시 30℃에서 3분간 반응시켰다. 이 반응액에 0.5 ㎖의 3M HCl를 첨가하여 반응을 정지 시킨 후 원심 분리하여(12,000 rpm, 2분) 상등액 333 ㎕을 1 ㎖의 2M NaOH 용액과 섞은 후 흡광도 420 ㎚에서 효소의 활성을 측정하였다.

본 실시예에 따른 측정 결과는 도 4에 도시되어 있다. 대장균 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 40 ~ 45℃ 범위의 온도에서 최적 활성을 보여주었으며(도 4의 A), pH 8.5 ~ 10.0의 범위에서 최적 활성을 나타내어(도 4의 B), 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 상대적으로 알칼리 산도에서 안정적임을 확인하였다. 또한, 온도에 대한 안정성은 45℃까지 최고 활성에 80% 이상이 유지되며(도 4의 C), 기질에 대한 선호도는 p-nitrophenyl caprylate(C8)에 가장 높다(도 4의 D). 이 모든 결과는 종래 알려진 리파아제 효소를 MA-PVB(폴리 메타아크릴 다이비닐벤젠 (poly metaacrylate-co-divinylbenzene) 레진에 고정화 한 경우와 비교해서 기능이 향상된 본 발명의 세포 표면 발현 시스템으로 고정화 된 효소를 세포 생 촉매로 이용하여 바이오 디젤 생성에 사용될 가능성이 높음을 확인하였다.

실시예 8: 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제를 이용하여 바이오 디젤 합성

세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제를 세포 생 촉매로 이용하여 바이오 디젤 전환을 위하여 기질로서 올리브유(또는 폐유)와 메탄올을 사용하여 바이오 디젤을 생성을 확인하였다. 일반적으로 바이오 디젤을 생성할 때 오일과 메탄올과의 몰비 1:3으로 사용하지만 본 발명은 바이오 디젤의 생성율을 높이고자 오일과 메탄올의 몰비를 1:6으로 높이어 반응액에 메탄올을 나누어서 첨가하는 것이 아니라 단 한번 (one-step)방식으로 첨가하여 바이오디젤 생성율을 확인하였다.

유리 캡 튜브 (cap-tube, 30 ㎖ 부피)에 올리브 오일(3 ㎖)과 메탄올(750 ㎕) 그리고 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제 효소(50 U/1.5 ㎖)를 첨가하여 30℃에서 230 rpm에서 96 시간 동안 반응을 진행하였다. 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제 효소와 반응 용액 안에 Tris-HCl buffer(100 mM, pH 8.0)와 효과적인 혼합을 위하여 30개의 2 ㎜의 크기의 유리구슬을 넣어서 반응을 진행하였다. 우선 반응 시료를 24 시간 간격으로 수확하였다. 시간별로 얻어진 시료로부터 바이오 디젤이 생성되었는지를 박층크로마토그래피와 가스크로마토그래피로 분석하였다.

실시예 9: 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제 효소 반응산물의 박층크로마토그래피 분석

위 실시예 8을 통해서 합성된 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제 효소 반응산물을 분석하기 위해 박층 크로마토그래피 분석을 수행하였다. 일정 시간별로 효소 반응액에서 200 ㎕씩 수확하여 헥산 1 ㎖을 넣고 2분간 균일하게 섞어 준 후 원심 분리하여 추출 상등액 10 ㎕을 실리카겔 판에 가하였다. 전개용매로 헥산:에틸아세테이트:아세트산 (90:10:1)을 사용하였으며, 발색시약은 메탄올:황산 (1:1)을 사용하였다. 전개 후 실리카 판 위에 발색시약을 고루 뿌린 후 고온에서 가열하여 분석하였다. 본 실시예에 따른 박층 크로마토그래피 분석 결과는 도 5의 A에 도시되어 있다. 세포 표면 발현 시스템에 의하여 숙주 세포인 대장균의 세포 표면에서 고정, 발현된 SHL62 리파아제가 매개하여 바이오디젤이 합성되었음을 알 수 있다.

실시예 10: 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제 효소 반응산물의 기체크로마토그래피 분석

본 실시예에서는 위 실시예 8에서 정해질 절차에 따라 얻어진 효소 반응산물을 정량적으로 측정하기 위해서 기체 크로마토그래피 분석을 수행하였다. 일정 시간별로 반응물 중에서 200 ㎕씩 수확하여 헥산 1 ㎖을 넣고 2분간 균일하게 섞어 준 후 원심 분리하여 추출 상등액 1 ㎕을 기체 크로마토그래피 기기에 주입하였다. 분석 칼럼은 HP-5 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane)이며, FID 검출기를 통해 지방산 메틸 에스테르 (fatty acid methyl ester)를 분석하였다. 칼럼 분석온도와 시간 조건은 70℃에서 300℃까지 분당 10℃씩 증가시킨 후, 최종시간 3분 동안 분석해서 총 27분 동안 분석하였다. 반응 후 분석한 시료의 피크 (peak) 면적과 기준 지방산 메틸 에스테르 (standard fatty acid methyl ester)의 피크 면적을 비교하여 생성된 바이오 디젤의 최종 몰수를 사용하여 계산하였다. 본 실시예에 따른 기체 크로마토그래피 분석 결과는 도 10의 B에 도시되어 있다. 본 발명에 따른 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제를 올리브유와 메탄올로부터 바이오 디젤로 전환은 반응 96 시간에 가장 높게 89.4%가 얻어졌음을 확인할 수 있었다. 이와 같이 본 발명의 일련의 실험을 통해서 세포 표면에 발현된 SHL62 리파아제는 온도 특히 알칼리 pH 에 안정성이 뛰어나며, 바이오 디젤 생성 시 사용되는 유기용매의 메탄올에 대해서도 또한 안정성이 뛰어나다는 점을 확인할 수 있었다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Cell Surface Display of Staphylococcus haemolyticus L62 Lipase and Its Application for Transesterificatin Reaction <130> 1820 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 392 <212> PRT <213> Staphylococcus haemolyticus L62 Lipase <400> 1 Ala Thr Ile Lys Ser Asn Gln Tyr Lys Asn Lys Tyr Pro Val Val Leu 1 5 10 15 Val His Gly Phe Leu Gly Leu Val Gly Asp Asn Ala Pro Ala Leu Tyr 20 25 30 Pro Asn Tyr Trp Gly Gly Thr Lys Phe Pro Val Lys Lys Arg Leu Glu 35 40 45 Lys Leu Gly Tyr Asp Val His Glu Ala Ser Val Gly Ala Phe Ser Ser 50 55 60 Asn Tyr Asp Arg Ala Val Glu Leu Tyr His Tyr Ile Lys Gly Gly Lys 65 70 75 80 Val Asp Tyr Gly Ala Ala His Ala Ala Lys Thr Gly His Asp Arg Tyr 85 90 95 Gly Lys Phe Tyr Gln Gly Ile Met Pro Asp Trp Glu Pro Gly Lys Lys 100 105 110 Ile His Leu Ile Gly His Ser Met Gly Gly Gln Thr Ile Arg Leu Leu 115 120 125 Glu His Phe Leu Arg His Gly Asn Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Gln Lys 130 135 140 Ala His Gly Gly Glu Ile Ser Pro Leu Phe Thr Gly Gly Lys Asp Asn 145 150 155 160 Met Ile Ser Ser Ile Thr Thr Leu Ala Thr Pro His Asn Gly Thr Pro 165 170 175 Ala Ala Asp Lys Leu Gly Asn Thr Asp Phe Val Lys Val Tyr Leu Ile 180 185 190 Arg Ile Gly Arg Leu Ser Gly Asn Lys Tyr Ser His Ile Asp Leu Gly 195 200 205 Phe Ser Gln Trp Gly Phe Lys Gln Arg Pro Asp Glu Ser Tyr Ile Asp 210 215 220 Tyr Val Lys Arg Val Ala Asn Ser Lys Ile Trp Lys Thr Gln Asp Ser 225 230 235 240 Ala Val Tyr Asp Leu Thr Thr Glu Gly Ser Glu Lys Leu Asn Gln Met 245 250 255 Thr Ser Ile Asn Pro Asn Ile Val Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Leu Asp 260 265 270 Thr His Thr Gly Pro Leu Gly Asn Glu Asn Pro Asn Ile Arg Gln Phe 275 280 285 Phe Leu Phe Asp Leu Thr Ser Arg Leu Ile Gly Arg Asp Asp Asn Val 290 295 300 Asn Val Arg Lys Asn Asp Gly Ile Val Pro Val Ser Ser Ser Leu Phe 305 310 315 320 Pro Thr Asn Gln Ala Ala Lys Thr Val Gly Met Thr Ser Pro Thr Thr 325 330 335 Asp Lys Gly Ile Trp Gln Val Lys Pro Val Met Asn Gly Trp Asp His 340 345 350 Leu Asp Phe Val Gly Leu Asp Ala Thr Asp Tyr Lys Arg Ile Gly Glu 355 360 365 Glu Leu Ser Gln Phe Tyr Leu Gly Ile Ile Asn Asn Leu Ile Arg Ile 370 375 380 Glu Asp Ile Asp Gly Ile Lys His 385 390 <210> 2 <211> 1179 <212> DNA <213> Staphylococcus haemolyticus L62 Lipase <400> 2 gctactatca aaagtaatca atataaaaac aaatatccgg tagtgctagt acatggattt 60 ttaggtttag tgggtgacaa tgcaccagct ttgtatccta attattgggg tggtacgaaa 120 ttcccagtta agaaacgatt agagaaacta ggttatgacg tgcatgaagc gagtgtcggt 180 gcttttagta gtaactatga ccgcgctgta gaactgtatc attatattaa aggtggaaaa 240 gtagattatg gtgcagcaca tgctgctaaa acgggacatg atagatatgg taaattttat 300 caagggatta tgccagattg ggagccaggt aaaaagattc atttaatagg tcacagcatg 360 ggcggtcaaa cgatacgtct gcttgagcat tttttaagac atggtaatca agaagaaata 420 gattatcaaa aagcacatgg tggtgagatt tctcctttat ttacaggtgg gaaagataat 480 atgatttcat caatcacaac tttagcgacc ccacataatg gcacaccagc tgcagataaa 540 cttggtaata ctgattttgt aaaggtgtat ttaataagaa taggtcgctt aagtggaaat 600 aaatattctc atattgatct cggattttca caatggggat tcaaacaacg tccagatgaa 660 agttacattg attatgtgaa acgagttgca aatagtaaga tttggaagac tcaagatagt 720 gcagtctatg atttgacgac tgaaggttct gagaagctaa atcagatgac atcaattaat 780 cctaatattg tttatacatc ttatacggga ctagatacac atacaggacc attaggtaat 840 gagaatccta atattagaca atttttctta tttgatttaa caagtaggtt aattggtaga 900 gatgataatg taaatgtaag aaaaaatgac ggtattgtgc cagtgtcatc ttcattattc 960 cctacaaatc aagccgctaa gacggtaggg atgacttccc caactacaga taaaggtatc 1020 tggcaggtca aaccagtgat gaatggttgg gatcatttag attttgtggg attagatgca 1080 acagattata aacgtatagg tgaagaatta agtcaatttt atttaggaat tatcaataat 1140 ttaattagaa ttgaagacat agatggtata aaacattaa 1179 <210> 3 <211> 326 <212> PRT <213> Psuedomomas putida Esterase A <400> 3 Leu Ile Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Leu Leu Ser Ala Pro Trp Glu Leu 1 5 10 15 Thr Leu Leu Pro Glu Met Ala His Gly Thr Leu Arg Ala Tyr Gln Asp 20 25 30 Glu Leu Arg Ser Gln Trp Gln Ala Asp Trp Glu Asn Trp Gln Asn Val 35 40 45 Gly Gln Trp Arg Gly Phe Val Gly Gly Gly Gly Gln Arg Leu Asp Phe 50 55 60 Asp Ser Gln Asp Ser Ala Ala Ser Gly Asp Gly Asn Gly Tyr Asn Leu 65 70 75 80 Thr Leu Gly Gly Ser Tyr Arg Ile Asp Glu Ala Trp Arg Ala Gly Val 85 90 95 Ala Ala Gly Phe Tyr Arg Gln Lys Leu Glu Ala Gly Ala Lys Asp Ser 100 105 110 Asp Tyr Arg Met Asn Ser Tyr Met Ala Ser Ala Phe Val Gln Tyr Gln 115 120 125 Glu Asn Arg Trp Trp Ala Asp Ala Ala Leu Thr Gly Gly Tyr Leu Asp 130 135 140 Tyr Asp Asp Leu Lys Arg Lys Phe Ala Leu Gly Gly Gly Glu Arg Ser 145 150 155 160 Glu Lys Gly Asp Thr Asn Gly His Leu Trp Ala Phe Ser Ala Arg Leu 165 170 175 Gly Tyr Asp Ile Ala Gln Gln Ala Asp Ser Pro Trp His Leu Ser Pro 180 185 190 Phe Val Ser Ala Asp Tyr Ala Arg Val Glu Val Asp Gly Tyr Ser Glu 195 200 205 Lys Gly Ala Ser Ala Thr Ala Leu Asp Tyr Asp Asp Gln Lys Arg Ser 210 215 220 Ser Lys Arg Leu Gly Ala Gly Leu Gln Gly Lys Tyr Ala Phe Gly Ser 225 230 235 240 Asp Thr Gln Leu Phe Ala Glu Tyr Ala His Glu Arg Glu Tyr Glu Asp 245 250 255 Asp Thr Gln Asp Leu Thr Met Ser Leu Asn Ser Leu Pro Gly Asn Arg 260 265 270 Phe Thr Leu Glu Gly Tyr Thr Pro Gln Asp His Leu Asn Arg Val Ser 275 280 285 Leu Gly Phe Ser Gln Lys Leu Ala Pro Glu Leu Ser Leu Arg Gly Gly 290 295 300 Tyr Asn Trp Arg Lys Gly Glu Asp Asp Thr Gln Gln Ser Val Ser Leu 305 310 315 320 Ala Leu Ser Leu Asp Phe 325 <210> 4 <211> 981 <212> DNA <213> Pseudomonas putida Esterase A <400> 4 ctgatcgccg actacaccta ttcgctgctg tcggcgccct gggagttgac cctgctgccg 60 gaaatggccc acggcaccct gcgtgcctac caggacgaac tgcgcagcca gtggcaggcg 120 gactgggaga actggcagaa cgtcggccag tggcgcggct tcgtcggcgg cggtggccag 180 cgcctggact tcgactccca ggacagcgcc gccagcggcg acggcaatgg ctacaacctg 240 acccttggcg gcagctaccg catcgacgag gcctggcgcg ccggggtcgc cgccggtttc 300 taccggcaga agctggaagc cggcgccaag gattccgact accggatgaa cagctacatg 360 gccagcgcct tcgtgcagta ccaggaaaac cgctggtggg ccgacgcggc gttgaccggc 420 ggctacctcg actacgacga cctgaagcgc aagttcgccc tgggcggcgg cgagcgcagc 480 gagaaaggcg acaccaacgg ccacctgtgg gcgttcagcg cgcgcctggg ctacgacatc 540 gcccagcagg ccgacagtcc ctggcacctg tcgccgttcg tcagcgccga ctatgcacgg 600 gtcgaggtcg acggctattc cgagaagggc gccagcgcca ccgcgctcga ctacgacgac 660 cagaagcgca gctcgaagcg cctgggcgcc ggcctgcaag gcaagtacgc gttcggcagc 720 gatacccagc tgttcgccga gtacgcccac gaacgcgagt acgaggacga cacccaggac 780 ctgaccatgt ccctcaacag cctgccgggc aatcgcttca ccctcgaagg ctacaccccg 840 caggaccacc tcaaccgcgt ctccctcggc ttcagccaga agctggcacc ggagctgtcg 900 ctgcgcggcg gctacaactg gcgcaagggc gaggacgata cccagcagag cgtcagcctg 960 gcgctgagcc tggacttctg a 981 <210> 5 <211> 66 <212> DNA <213> pelB signal sequence <400> 5 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60 atggcc 66 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Amplifying L62 Lipase <400> 6 tggccatggc tactatcaaa agtaat 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Amplifying L62 Lipase <400> 7 caggagctca tgttttatac catctat 27

Claims

외래 단백질로서 서열식별번호:1의 아미노산 서열로 구성되는 L62 리파아제와, 세포 표면 고정 모체(cell surface anchoring motif)로서 서열식별번호:3의 아미노산 서열로 구성되는 에스터라아제 A의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 세포 표면 발현 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 L62 리파아제는 서열식별번호:2의 염기 서열로 코딩되는 핵산에 의하여 발현되는 세포 표면 발현 시스템.
제 2항에 있어서, 상기 에스터라아제 A는 서열식별번호:4의 염기 서열로 코딩되는 핵산에 의하여 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 세포 표면 발현 시스템은 그람 음성 세균인 숙주 세포의 표면에서 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현 시스템.
제 4항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 세포 표면 발현 시스템은 상기 융합 단백질을 세포 표면으로 이동시키며, 세포 외막에서 절단되는 리더 서열을 더욱 포함하는 세포 표면 발현 시스템.
제 6항에 있어서, 상기 리더 서열은 서열식별번호:5의 염기 서열로 구성되는 세포 표면 발현 시스템.
제 7항에 있어서, 상기 세포 표면 발현 시스템은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 전사조절 서열, 상기 융합 단백질의 발현 여부를 확인하는 선택 마커 서열, 및 복제개시원점을 더욱 포함하는 세포 표면 발현 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 세포 표면 발현 시스템은 재조합 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현 시스템.
제 9항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 플라스미드 재조합 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현 시스템.
외래 단백질로서 서열식별번호:1의 아미노산 서열로 구성되는 L62 리파아제와, 세포 표면 고정 모체(cell surface anchoring motif)로서 서열식별번호:3의 아미노산 서열로 구성되는 에스터라아제 A의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열로 구성되는 핵산을 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 숙주 세포에 주입하는 단계;
상기 숙주 세포를 배양하여 상기 숙주 세포의 표면에서 상기 L62 리파아제를 발현시키는 단계; 및
상기 숙주 세포의 표면에서 발현된 L62 리파아제에, 유지 또는 지방산과, 알코올을 포함하는 반응 매질을 첨가하여, 에스테르 교환 반응 또는 에스테르 반응을 유도하는 단계
를 포함하는 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 에스테르 교환 반응은, 상기 유지가 상기 반응 매질 내에 잔류하는 수분에 의한 가수분해에 의하여 상기 유지로부터 글리세롤이 제거된 뒤, 적어도 한 개의 글리세롤이 제거된 유지 또는 지방산이 알코올과 반응하여 지방산-알코올 에스테르로 전환되는 단계와, 상기 지방산-알코올 에스테르를 상기 글리세롤 성분 및 수분으로부터 분리하는 단계를 포함하는 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 알코올은 C₁ ~ C₄의 모노 알코올인 것을 특징으로 하는 지방산 에스테르를 제조하는 방법.
제 11항 또는 제12항에 있어서, 상기 유지는 식물성 오일, 동물성 지방 또는 폐유를 포함하는 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법.
제 11항 또는 제12항에 있어서, 상기 알코올과 상기 유지는 1:3 내지 1:10의 몰비로 상기 반응 매질에 첨가되는 것을 특징으로 하는 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 에스테르 반응 또는 상기 에스테르 교환 반응은 20 ~ 55℃ 범위의 온도 및 pH 7 ~ 12의 범위에서 진행되는 것을 특징으로 하는 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법.
외래 단백질로서 서열식별번호:1의 아미노산 서열로 구성되는 L62 리파아제와, 세포 표면 고정 모체(cell surface anchoring motif)로서 서열식별번호:3의 아미노산 서열로 구성되는 에스터라아제 A의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 세포 표면 발현 시스템으로 형질전환된 미생물.
제 17항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
외래 단백질로서 서열식별번호:1의 아미노산 서열로 구성되는 L62 리파아제와, 세포 표면 고정 모체(cell surface anchoring motif)로서 서열식별번호:3의 아미노산 서열로 구성되는 에스터라아제 A의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 숙주 세포에 주입하는 단계;
상기 숙주 세포를 배양하여 상기 숙주 세포의 표면에 발현된 L62 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 L62 리파아제의 제조 방법.
제 19항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 L62 리파아제의 제조 방법.