CN102321594B

CN102321594B - 一种叔醇水解酯酶、编码基因、载体及应用

Info

Publication number: CN102321594B
Application number: CN2011102454274A
Authority: CN
Inventors: 王秋岩; 金鹏; 杜鹏飞; 熊小龙; 吴慧丽
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2011-08-25
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2031-08-25
Also published as: CN102321594A

Abstract

本发明提供了一种叔醇水解酯酶及其编码基因，以及含有该编码基因的载体和利用该载体转化获得的重组基因工程菌及其应用。所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列。本发明的酯酶易于原核表达，可以采用本发明中所述的重组载体、菌株及制备方法高效生产本发明酯酶；而且，本发明酶的制备方法简便高效，易于大量表达，适于工业化生产。

Description

一种叔醇水解酯酶、编码基因、载体及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种叔醇水解酯酶及其编码基因，以及含有该编码基因的载体和利用该载体转化获得的重组基因工程菌及其应用。

(二)背景技术

酯酶是一种能水解脂肪酸酯产生游离脂肪酸，将油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。酯酶作为一类重要的生物催化剂，因其具有选择性高、催化反应条件温和、无污染等特点，其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，酯酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，因此该酶的应用前景十分广阔。

近年来，将生物催化剂应用于有机相中催化化学反应已经成为生物催化领域中的研究热点。因其在有机相中催化具有诸多优点：如底物在有机相中溶解度高；产物易于回收；在有机相中能促进反应热力学平衡向正向移动；酶作为生物催化剂具有高度的区域选择性和立体选择性，在有机相中可一定程度上提升酶的立体选择性；生物催化酶在有机相中热稳定性增强，因而可以提高反应温度增加反应速度等等。酯酶作为一类广泛应用于医药、食品、化工等行业的重要生物催化剂，在有机相中的生物催化具有极其重要的应用，例如在有机相中低水环境下能催化合成难溶于水的医药中间体和精细化工品，能运用在一些重要药物中间体的手性拆分中等等。然而，大多数的生物催化酶在有机溶剂中酶活性会受到极大影响，使其难以实现规模化的工业生产。在有机介质中维持较高的酯酶活性及酯酶催化底物的广泛性，是当今生物催化过程中面临的难题。因此，开发高活性、有机溶剂稳定性强的酯酶具有巨大的应用潜能。

叔醇底物是一类非常有价值的手性平台基化合物，可以广泛的用于药物中间体的合成，但是手性叔醇类底物具有较强的空间位阻，因此其化学合成工艺构建是十分具有挑战的，目前在大量合成高纯度的手性叔醇工艺开发上，尤其是绿色环保的工艺，仍然具有十分迫切的需要。近年来，人们发现具备GGG(A)X结构域特征的酯酶，因为在活性中心特异的苷氨酸侧链，可以提供一个较大的底物结合位点，能够高效的催化含有手性叔醇酯底物的水解，因此该类酯酶催化的手性叔醇酯底物的工艺具备广阔的应用前景。

(三)发明内容

本发明提供了一种叔醇水解酯酶、编码基因及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种叔醇水解酯酶EstC23，所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列。所述保守性变异多肽，是指记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失或插入附加氨基酸序列，但不足以改变其性能，仍具有酯酶活性。

优选的，所述叔醇水解酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MSQQQLESIIQMLKSQPIAGKPSIAETRAGFEQMAAMFPVEADVKSEPVNAGGVKSEWVTAPGADPGRAVLYLHGGGYVIGSISTHRSFAGRISRAAKARVLVIDYRLAPEHPFPAAVEDSVAAYRWMLSTGLKPSRIAVAGDSAGGGLTVATLVAIRDAKLPVPAAGVALSPWVDMEGVGDSMKTKAAVDPMVQKDGLIEMAKAYLGGKDPRTPLAAPLYADLAGLPPLLIQVGTAETLLDDSTRLAERARKAGVKVTLEPWENMVHVFQIFASILDEGQQAIDKIGAFIRANAE.。

本发明中所述酯酶与常规酯酶相比，具备活性高、耐受有机溶剂稳定性好，并且pH耐受范围广等特征。

本发明还涉及一种所述叔醇水解酯酶的编码基因。

优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

atgtcacaac aacagcttga atcaattatc cagatgctca agtcgcagcc tatcgcgggc

aaaccctcga ttgcggagac ccgcgcggga tttgagcaga tggccgcgat gtttccggtc

gaggctgacg tgaagagcga gccggtcaat gcgggcggcg tcaagtcaga atgggtgacg

gcgccgggcg cggacccggg ccgcgcggtg ctttacctgc acggtggcgg ctacgttatc

ggctcgatca gtacgcatcg ctcgttcgcg ggacgaatct cgcgcgctgc caaagcgcga

gtgctggtga tcgactaccg gctcgcgcct gagcatccgt ttcccgcagc ggtcgaggat

tccgtcgccg catatcgctg gatgctctcg accgggttga agccctcgcg aatcgcagtc

gcgggagact ccgccggtgg cggtctgacg gttgcgacgc tggtcgcgat tcgcgatgcg

aagcttccag ttccggccgc gggtgtggcg ctgtcgccgt gggtcgatat ggaaggagtc

ggcgattcga tgaagacgaa ggcggctgtc gatccgatgg tccagaaaga cggcctgatc

gagatggcaa aggcttatct cggcggcaag gatccgcgca cgccgctcgc cgcgccgctc

tatgccgacc tcgccggtct cccgccgctg ctgatccagg tcggcaccgc ggagactctg

ctcgacgact cgacgcggct agcggagcgc gcgcgcaagg cgggagtgaa ggtaacgctg

gaaccgtggg aaaatatggt ccacgtcttc cagatcttcg cgtcgattct cgacgaaggg

cagcaggcga tcgacaaaat tggagcgttc atccgcgcca acgccgagta a。

编码本发明酯酶EstC23蛋白质的核苷酸序列可以编码包括在一个或者多个位置上的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或者添加在内的EstC23蛋白质，且不破坏由其编码的EstC23蛋白质的酯酶活性。例如通过修饰所述的核苷酸序列可以得到编码与上述EstC23蛋白质基本相同的蛋白质的DNA，通过定向诱变、易错PCR、DNA重组、DNA杂交等技术从而使一个、多个或者部分氨基酸片段涉及到缺失、取代、插入或者添加，通过公知的突变处理可以获得如上所述进行了修饰的DNA。

在适合的异源表达宿主中以多拷贝表达经历了如上所述的进行修饰获得的DNA，可以获得编码与EstC23蛋白质基本相同的蛋白。众所周知的是蛋白质的氨基酸序列与编码它的核苷酸序列可以在菌种、菌株、突变株或者变株之间稍有不同，因此编码基本上相同蛋白质的核苷酸可以在埃希氏大肠杆菌的菌种、菌株、突变株或者变株中实现表达并获得基本上相同的蛋白。因此，与前述SEQ ID NO.1核苷酸序列相比具有不低于70％的同源性的DNA，以及包括不低于70％的同源性DNA的特异性杂交体可编码具有酯酶活性的蛋白质的DNA，均在本发明的保护范围之内。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明所述编码基因可用于制备重组叔醇水解酯酶。

具体的，所述应用为：构建含有所述编码基因的重组载体，将所述重组载体转入大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组叔醇水解酯酶的菌体细胞，菌体细胞经细胞碎、分离纯化获得所述重组叔醇水解酯酶。

所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及所述叔醇水解酯酶在水解结构如式(I)所示的叔醇酯中的应用；

式(I)中，

R₁为C1～C5烷基、苯基、氟苯基或噻吩基；

R₂为C1～C5烷基或三氟甲基；

R₃为乙炔基。

本发明的酯酶具备对叔醇酯底物的水解能力，对不同结构的叔醇底物具备有广泛的水解活力，具体反应式如下：

经实验证明，本发明所述叔醇水解酯酶在宿主菌中表达产量高，例如在埃希氏大肠杆菌中过表达，表达量占粗酶液上清总蛋白量的25％～35％。此外，特别是对于短碳链酯酶底物活性很高，在pH8.0，25℃条件下，对pNP-butyrat酶活达254U/mg，特别是在低温下，如5～10℃之间，该酯酶的活力能保持在127～165U/mg。与常规酯酶相比，具有很好的耐有机溶剂稳定性，例如在浓度50％(v/v)的正己烷中孵育一周后，相对活性一直稳定在200～300％之间(对照为未经过正己烷保温的同等条件下得酶活力)。在20％的苯、甲苯、对二甲苯、丙酮、甲醇、乙醇、DMF及DMSO中相对活性提高50～100％且稳定性很好，25℃孵育一周活性很稳定，特别是在50％的正己烷中活性提升至200～300％，25℃孵育一周很稳定。

本发明的酯酶具有高表达量，高活性及耐有机溶剂稳定性，特别是在强疏水性有机溶剂中具备高稳定性和活力提升特性，同时本发明酯酶可以水解叔醇酯底物，在轻工、化工、医药、食品等行业中的酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面有应用价值。

本发明的高表达、高活性、耐有机溶剂的酯酶的制备方法及酶学表征：

(1)、本发明所述酯酶EstC23基因全长的获取。采用宏基因组功能筛选技术从土壤环境宏基因组文库中筛选，成功获得SEQ ID NO.1所示的酯酶EstC23核苷酸全长序列。

(2)、含目的基因的表达载体系统的构建。将步骤(1)中所述的酯酶EstC23基因克隆至表达载体，如pET21a。

(3)、将步骤(2)中含酯酶EstC23基因的重组载体转入异源表达宿主细胞中，如(Escherichia coli)BL21(DE3)，在适合表达酯酶的条件下，培养重组宿主细胞。

(4)、从步骤(3)的培养物中分离纯化出本发明中所述的高表达、高活性、耐有机溶剂的酯酶EstC23。

(5)、通过如上制备方法，对获得的酯酶EstC23进行进一步酶学特征表征，包括底物特异性、最适温度和热稳定性、最适pH、pH稳定性、以及有机溶剂的稳定性等。

本发明的有益效果主要体现在：本发明的酯酶易于原核表达，可以采用本专利中所述的重组载体、菌株及制备方法高效生产本发明酯酶；而且，本发明酶的制备方法简便高效，易于大量表达，适于工业化生产。

(四)附图说明

图1为酯酶EstC23的表达纯化结果(M：marker；SL：菌体破碎液上清；F：与镍柱孵育后滤出液；0：不含咪唑的洗脱缓冲液滤出液；10：含10mM咪唑的洗脱缓冲液滤出液；20：含20mM咪唑的洗脱缓冲液滤出液；30：含30mM咪唑的洗脱缓冲液滤出液含；50：含50mM咪唑的洗脱缓冲液滤出液；500：含500mM咪唑的缓冲液洗脱下来的EstC23纯蛋白)。

图2为酯酶EstC23在25℃，50mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中对pNP系列底物的酶解活性。

图3为酯酶EstC23以pNP-butyrate(C4)为底物，不同反应温度和相对酶活性关系图。

图4为酯酶EstC23不同反应pH缓冲液和相对酶活性关系图；(○)：20mM的Na₂HPO₄-Citric acid(3.0～8.0)；(△)：50mM的Tris-HCl(8.0～10.0)；(□)：20mM的Glycine-NaOH(10.0～12.0)。

图5为酯酶EstC23在不同pH缓冲液中处理后剩余相对酶活性关系图；(○)：20mM的Na₂HPO₄-Citric acid(3.0～8.0)；(△)：50mM的Tris-HCl(8.0～10.0)；(□)：20mM的Glycine-NaOH(10.0～12.0)。

图6为酯酶EstC23对乙酸芳樟酯水解薄层色谱图(1：对照品乙酸芳樟酯；2：对照品芳樟醇；3：对照反应体系中未加酶液的乙酸芳樟酯；4：加入酶液的反应5h后样品；5：为加入酶液反应10h样品)。

图7为酯酶EstC23分别在25℃(△)，30℃(○)，35℃(□)，40℃(◇)下孵育180min后剩余相对酶活性关系图。

图8为酯酶EstC23分别在浓度为20％，50％(v/v)的苯(□)，甲苯(△)，对二甲苯(◇)，正己烷(○)中孵育1h，48h，7d后剩余相对酶活性关系图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：酯酶EstC23基因全长的获取

从贵州铜仁梵净山采取的地表下30cm处土壤样品，采用Mo BioPower Soil DNA isolation kit(M)(Carlsbad，CA)试剂盒提取样品总DNA，使用Copy Control Fosmid Library production kit(Epicentre，USA)建库试剂盒构建环境宏基因组文库。对文库DNA进行酯酶筛选，选用平板底物透明圈法，筛选平板中加有1％的聚乙烯醇乳化三丁酸甘油酯底物，涂板孵化后挑取具有水解三丁酸甘油酯呈透明圈的阳性克隆，诱导Fosmid高拷贝表达，提取Fosmid重组质粒。用内切酶Sau3A I(TakaRa BiotechnologyCo.，Dalian，China)不完全酶切(1k-5kbp)阳性克隆质粒，将酶切回收产物连接到经内切酶BamH I(TakaRa Biotechnology Co.，Dalian，China)酶切的pBluescript SK⁽⁺⁾(Stratagene，CA)载体中，转化至大肠杆菌中(Escherichia coli DH5α)。并涂布在酯酶筛选平板上。获得仍具有脂水解活性的亚克隆，并采用M13通用引物对其进行测序分析，确定本发明中所述的酯酶EstC23全长基因序列。

实施例2：含酯酶EstC23目的基因的表达载体系统的构建

根据酯酶EstC23全长基因序列，设计扩增出完整编码阅读框的两端引物(上游引物EC23F：5′-CCGGAATTCATGTCACAACAACAGC-3′下游引物EC23R：5′-CCGCTCGAGCTCGGCGTTG-3)，在上下游引物上分别加入限制性内切酶位点(本发明中所述表达载体为pET21a，根据此载体选取上游酶切位点为EcoR I，下游为Xho I)。使用含本发明中所述的酯酶基因序列的质粒，经PCR扩增后，对扩增获得的酯酶EstC23核苷酸片段(SEQ ID NO.1)进行双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上(载体pET21a经EcoR I、Xho I双酶切)，转化至E.coil DH5α中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达载体，再转入表达宿主E.coil BL21(DE3)中。

实施例3：酯酶EstC23的表达及纯化制备

将实施例2中获得的酯酶表达系统E.coil BL21(DE3)/pET21a/EstC23，接种至100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养。取10ml过夜培养的菌液加入至1L 100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养，OD₆₀₀达到0.6时加入终浓度为0.15mM的诱导剂IPTG，15℃培养20h左右，离心收集菌体，菌体用60ml Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液重悬，超声破碎60min(破碎时菌体置于冰水混合物中降温)。离心后去上清，含酯酶蛋白的上清用0.45μm的醋酸纤维素滤膜过滤，随后进行镍柱亲和层析纯化，获得本发明中所述的酯酶EstC23纯酶(氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)。

实施例4：酯酶EstC23的活性测定

根据酯酶的有关测定方法，采用比色测定法进行酯酶EstC23的活力测定。以p-nitrophenyl-acetate(pNPC2)，butyrate(pNPC4)，caproate(pNPC6)，caprylate(pNPC8)，decanoate(pNPC10)和laurate(pNPC12)(Sigma，USA)作为底物，以单位质量的酶液在单位时间内生成产物的速率计算酶活力。其具体方法如下：

pNP底物溶于乙腈中，浓度为10mM。配置pH8.0，500mM的Tris-HCl缓冲液，使用时稀释10倍。

取两组1.5ml离心管，分别是对照管和样品管。对照管中加入425μl去离子水和50μl 500mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，再分别加入25μlpNP系列底物(10mM)溶液。使用岛津的紫外可见光分光光度计(ShimadzuUV-2550)，在405nm波长下测定pNP系列各种底物自分解速率。样品管中加入415μl去离子水，加入50μl 500mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，分别加入25μl的pNP系列底物(10mM)溶液，加入10μl新鲜酶液(0.05mg/ml)，立即混匀，在相同条件下测定酶催化反应速率。

酶活计算公式：

U＝[1000x(△A V/tε)x 10^-3]/M

U为样品酶活U/mg，△A为样品酶液反应的吸光值减去对应酶液空白对照的吸光值，V为反应体系的体积L，t为反应时间min，ε为摩尔吸光系数6.22×10³L/(mol·cm)，M为反应体系中加入的酶量mg。

本发明酯酶对pNP系列底物的催化活性见图2所示，对短碳链底物表现出高活性，特别是对pNPC4的酶活高达254U/mg。

实施例5：酯酶EstC23耐有机溶剂稳定性的测定

为测定酯酶EstC23对有机溶剂的稳定性，使用一定浓度的不同有机溶剂，与酶液共保温特定时间长度，测定保温后酶相对活力，使用未与有机溶剂保温的同等条件下测定的酶活力作为对照。

样品对照：在pH8.0，25℃条件下，10μl的酶液(0.05mg/ml)加入至500μl的反应体系中(含50mM的Tris-HCl缓冲液，25μl的10mM的pNPC4)，在405nm波长下测定酶促反应速率K1。相同条件下测定底物pNPC4在不加酶液情况下的自分解速率K2，得到样品对照△K＝K1-K2。

将样品稀释至0.1mg/ml，分别加入有机溶剂丙酮、甲醇、乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、DMF、DMSO，每种有机溶剂与酶液混合的终浓度分别为20％和50％两个浓度梯度。混匀后25℃，180rpm震荡孵育。分别在1h，48h，7d时间段取样，与样品对照测定酶活相同的测定条件下，分别测定酶在有机溶剂中孵育后的活性，酯酶EstC23在各种不同浓度的有机溶剂中孵育不同时间后，测定的相对酶活性如图8所示。

从实验结果得出，酯酶EstC23对正己烷、苯类、丙酮、DMF及DMSO稳定性很高，在这些20％和50％浓度的有机溶剂中长时间很稳定并且活性有明显提升，孵育7d，在两个浓度的正己烷中最稳定且活性能提高至200％-300％，在20％的苯类中活性能提升至150％-200％，在50％的苯类中活性稳定在90％以上。在20％的DMF和DMSO中活性能维持在110％以上。

实施例6：酯酶EstC23的酶解最适pH测定和pH稳定性测定

为测定酯酶EstC23的酶解最适pH，采用pNPC4为底物，在25℃，pH3.0-12.0范围内的缓冲液中测定本发明酶对底物pNPC4的酶促反应速率。不同pH缓冲液配置：3.0-8.0(Na₂HPO₄-Citric acid)，8.0-10.0(Tris-HCl)，10.0-12.0(Glycine-NaOH)。以测定的酶活力最高的pH条件下的做对照，设其相对活性为100％，不同反应pH与酶解活性关系，见图4所示。本发明酯酶的酶解最适pH在9.5～10.0，并在pH7.0-12.0范围内均有活性。

为测定酯酶EstC23的pH稳定性，0.9mg/ml的酶液分别与pH值从3.0～8.0(Na₂HPO₄-Citric acid)，8.0～10.0(Tris-HCl)，10.0～12.0(Glycine-NaOH)范围内的缓冲液混合，25℃下孵育20min。在25℃，50mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，以pNPC4为底物测定酯酶EstC23的酶解活性作为对照，设为100％，以相同的条件测定在各种不同pH缓冲液中孵育后酯酶的剩余活性。不同pH值下处理后剩余相对酶解活性关系如图5所示，酯酶EstC23在pH3.0～12.0范围内pH稳定性较强，相对剩余活性都在50％以上。

实施例7：酯酶EstC23的最适酶解温度测定

为测定酯酶EstC23的最适酶解温度，采用pNP-butyrate为底物，按上述的测定方法，在50mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，分别在5℃，10℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，60℃下测定酯酶EstC23对pNPC4的酶解活性，以在此条件中测得的最高活性做对照，相对酶活力设为100％，反应温度和相对酶解活性关系见图3所示。本发明酯酶在4～60℃范围内有活性，且在较低温度5～10℃下还能保持50％左右的活性，最适酶解温度为40～45℃。

为测定酯酶EstC23的热稳定性，0.9mg/ml的纯酶分别在25℃，30℃，35℃，40℃下孵育180min，分别在不同的时间段取样，以pNPC4为底物在25℃，50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中测定EstC23剩余相对酶活，如图7所示。EstC23在40℃下酶活性半衰期约为35min，分别在25℃和30℃条件下孵育180min仍能保持90％和85％以上的酶活性。

实施例8：酯酶EstC23对叔醇酯底物水解的测定

为测定酯酶EstC23对叔醇酯底物的水解能力，采用乙酸芳樟酯(II)(Aladdin，China)为底物。对照试管中为50mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液和15mg/ml的乙酸芳樟酯；样品管中为50mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，15mg/ml的乙酸芳樟酯和2mg/ml的新鲜酶液。25℃，200rpm下震荡孵育，反应5h，10h分别取样，加入3倍体积的无水乙醇终止反应，离心去除沉淀。然后进行薄层色谱分析，采用GF₂₅₄硅胶板，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(10∶1)，显色剂为香草醛(5g/L)的浓硫酸-乙醇(4∶1)溶液。薄层色谱分析结果见图6所示，反应5h明显能看出大部分乙酸芳樟酯被水解为芳樟醇，说明酯酶EstC23具有水解叔醇酯底物的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 一种叔醇水解酯酶、编码基因、载体及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 891

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgtcacaac aacagcttga atcaattatc cagatgctca agtcgcagcc tatcgcgggc 60

aaaccctcga ttgcggagac ccgcgcggga tttgagcaga tggccgcgat gtttccggtc 120

gaggctgacg tgaagagcga gccggtcaat gcgggcggcg tcaagtcaga atgggtgacg 180

gcgccgggcg cggacccggg ccgcgcggtg ctttacctgc acggtggcgg ctacgttatc 240

ggctcgatca gtacgcatcg ctcgttcgcg ggacgaatct cgcgcgctgc caaagcgcga 300

gtgctggtga tcgactaccg gctcgcgcct gagcatccgt ttcccgcagc ggtcgaggat 360

tccgtcgccg catatcgctg gatgctctcg accgggttga agccctcgcg aatcgcagtc 420

gcgggagact ccgccggtgg cggtctgacg gttgcgacgc tggtcgcgat tcgcgatgcg 480

aagcttccag ttccggccgc gggtgtggcg ctgtcgccgt gggtcgatat ggaaggagtc 540

ggcgattcga tgaagacgaa ggcggctgtc gatccgatgg tccagaaaga cggcctgatc 600

gagatggcaa aggcttatct cggcggcaag gatccgcgca cgccgctcgc cgcgccgctc 660

tatgccgacc tcgccggtct cccgccgctg ctgatccagg tcggcaccgc ggagactctg 720

ctcgacgact cgacgcggct agcggagcgc gcgcgcaagg cgggagtgaa ggtaacgctg 780

gaaccgtggg aaaatatggt ccacgtcttc cagatcttcg cgtcgattct cgacgaaggg 840

cagcaggcga tcgacaaaat tggagcgttc atccgcgcca acgccgagta a 891

<210> 2

<211> 296

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Ser Gln Gln Gln Leu Glu Ser Ile Ile Gln Met Leu Lys Ser Gln

1 5 10 15

Pro Ile Ala Gly Lys Pro Ser Ile Ala Glu Thr Arg Ala Gly Phe Glu

20 25 30

Gln Met Ala Ala Met Phe Pro Val Glu Ala Asp Val Lys Ser Glu Pro

35 40 45

Val Asn Ala Gly Gly Val Lys Ser Glu Trp Val Thr Ala Pro Gly Ala

50 55 60

Asp Pro Gly Arg Ala Val Leu Tyr Leu His Gly Gly Gly Tyr Val Ile

65 70 75 80

Gly Ser Ile Ser Thr His Arg Ser Phe Ala Gly Arg Ile Ser Arg Ala

85 90 95

Ala Lys Ala Arg Val Leu Val Ile Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His

100 105 110

Pro Phe Pro Ala Ala Val Glu Asp Ser Val Ala Ala Tyr Arg Trp Met

115 120 125

Leu Ser Thr Gly Leu Lys Pro Ser Arg Ile Ala Val Ala Gly Asp Ser

130 135 140

Ala Gly Gly Gly Leu Thr Val Ala Thr Leu Val Ala Ile Arg Asp Ala

145 150 155 160

Lys Leu Pro Val Pro Ala Ala Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Asp

165 170 175

Met Glu Gly Val Gly Asp Ser Met Lys Thr Lys Ala Ala Val Asp Pro

180 185 190

Met Val Gln Lys Asp Gly Leu Ile Glu Met Ala Lys Ala Tyr Leu Gly

195 200 205

Gly Lys Asp Pro Arg Thr Pro Leu Ala Ala Pro Leu Tyr Ala Asp Leu

210 215 220

Ala Gly Leu Pro Pro Leu Leu Ile Gln Val Gly Thr Ala Glu Thr Leu

225 230 235 240

Leu Asp Asp Ser Thr Arg Leu Ala Glu Arg Ala Arg Lys Ala Gly Val

245 250 255

Lys Val Thr Leu Glu Pro Trp Glu Asn Met Val His Val Phe Gln Ile

260 265 270

Phe Ala Ser Ile Leu Asp Glu Gly Gln Gln Ala Ile Asp Lys Ile Gly

275 280 285

Ala Phe Ile Arg Ala Asn Ala Glu

290 295

Claims

1.一种叔醇水解酯酶，其特征在于叔醇水解酯酶氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。

2.一种权利要求1所述叔醇水解酯酶的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

4.含有权利要求3所述编码基因的重组载体。

5.一种利用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.权利要求3所述编码基因在制备重组叔醇水解酯酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：构建含有权利要求3所述编码基因的重组载体，将所述重组载体转入大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组叔醇水解酯酶的菌体细胞，菌体细胞经细胞碎、分离纯化获得所述重组叔醇水解酯酶。

8.权利要求1所述叔醇水解酯酶在水解乙酸芳樟酯中的应用。