CN103122355A - 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 - Google Patents
重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组耐热醛酮还原酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用，所述重组耐热醛酮还原酶基因具有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列90%以上同源性；本发明所涉及的重组耐热醛酮还原酶具有高活性、热稳定性好，60℃处理 15小时后仍较为稳定，残余相对酶活高达99%；本发明的重组耐热醛酮还原酶高效高选择性地制备手性醇类化合物；由于本发明的重组耐热醛酮还原酶具有较高的热稳定性，可以回收利用，并且反应体系中只需要额外添加少量的辅酶，极大地降低了生产的成本，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，在合成药物手性中间体方面具有很好的工业应用前景。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种重组耐热醛酮还原酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用。
（二）背景技术
单一构型手性药物及其中间体的合成与药理学研究是现代有机合成工业和医药工业中的一个热点研究领域。手性药物己成为国际新药研究与开发的新方向之一。手性醇是各种药物合成过程中的重要中间体，其合成成为热门的研究课题。
酮还原酶是普遍存在于自然界中的一类氧化还原酶，能使含羰基物质（如酮酯、酮酸等）不对称还原生成手性醇，广泛应用于医药、化学、农药等领域。选用酮还原酶催化生成手性醇，具有比化学法更高的化学、立体和区域选择性，反应条件更温和、更绿色环保。
嗜热菌来源的酶对高温、高压、高盐度等具有耐受性，同时还能经受常见的变性剂和有机试剂的作用而不至失活。所以嗜热菌来源的酮还原酶引起了越来越广泛的关注。这类酮还原酶易纯化、易于工业操作，可能对某些条件复杂或高应用价值的反应具有催化作用，工业前途广阔。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种重组耐热醛酮还原酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明涉及一种重组耐热醛酮还原酶基因，所述重组耐热醛酮还原酶基因具有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列90%以上同源性，优选所述基因 核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述重组耐热醛酮还原酶基因还包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸序列取代、缺失或添加获得的核苷酸序列。
进一步，SEQ ID No.1所示核苷酸序列全长为927bp，其编码序列从第一个碱基起至第924碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，该序列无内含子。
所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列为：
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgctgta taaagaactg 120
ggtcgtaccg gcgaagaaat tccggcactg ggtctgggta cctggggtat cggcggtttt 180
gaaacgccgg attatagccg cgatgaagaa atggtggaac tgctgaaaac cgcaattaaa 240
atgggttaca cccatatcga tacggcggaa tattacggcg gtggccacac ggaagaactg 300
attggcaaag ccatcaaaga ttttcgtcgc gaagatctgt tcattgtgag caaagtttgg 360
ccgacccatc tgcgtcgcga tgatctgctg cgttctctgg aaaacaccct gaaacgcctg 420
gatacggatt atgttgatct gtacctgatt cactggccga atccggaaat cccgctggaa 480
gaaaccctga gtgcgatggc cgaaggtgtg cgtcagggcc tgattcgcta tatcggcgtt 540
agcaactttg atcgtcgcct gctggaagaa gccattagca aatctcagga accgatcgtg 600
tgcgatcagg ttaaatataa cattgaagat cgtgatccgg aacgcgatgg tctgctggaa 660
ttctgtcaga aaaatggcgt gaccctggtt gcatacagtc cgctgcgtcg cacgctgctg 720
agcgaaaaaa ccaaacgtac gctggaagaa atcgcgaaaa atcatggtgc caccatttac 780
cagatcatgc tggcatggct gctggcgaaa ccgaacgtgg ttgccattcc gaaagcaggc 840
cgtgtggaac acctgcgcga aaatctgaaa gcgacggaaa tcaaactgtc tgaagaagaa 900
atgaaactgctggatagtctgggctaa 927
本发明提供一种由所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶。
进一步，所述重组耐热醛酮还原酶具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，优选所述重组耐热醛酮还原酶的氨基酸序列为 SEQ ID No.2所示。
由于密码子的兼并性，编码SEQ ID No.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1，如：不同于SEQ ID No.1，但编码的氨基酸序列与SEQ ID No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或者是在保持由该重组耐热醛酮还原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中 SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。
所述氨基酸序列SEQ.ID NO ：2为：
Met Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Arg Thr Gly Glu Glu Ile Pro Ala Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gly Thr Trp Gly Ile Gly Gly Phe Glu Thr Pro Asp Tyr Ser
20 25 30
Arg Asp Glu Glu Met Val Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Lys Met Gly
35 40 45
Tyr Thr His Ile Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Gly Gly Gly His Thr Glu
50 55 60
Glu Leu Ile Gly Lys Ala Ile Lys Asp Phe Arg Arg Glu Asp Leu Phe
65 70 75 80
Ile Val Ser Lys Val Trp Pro Thr His Leu Arg Arg Asp Asp Leu Leu
85 90 95
Arg Ser Leu Glu Asn Thr Leu Lys Arg Leu Asp Thr Asp Tyr Val Asp
100 105 110
Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Asn Pro Glu Ile Pro Leu Glu Glu Thr
115 120 125
Leu Ser Ala Met Ala Glu Gly Val Arg Gln Gly Leu Ile Arg Tyr Ile
130 135 140
Gly Val Ser Asn Phe Asp Arg Arg Leu Leu Glu Glu Ala Ile Ser Lys
145 150 155 160
Ser Gln Glu Pro Ile Val Cys Asp Gln Val Lys Tyr Asn Ile Glu Asp
165 170 175
Arg Asp Pro Glu Arg Asp Gly Leu Leu Glu Phe Cys Gln Lys Asn Gly
180 185 190
Val Thr Leu Val Ala Tyr Ser Pro Leu Arg Arg Thr Leu Leu Ser Glu
195 200 205
Lys Thr Lys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Ala Lys Asn His Gly Ala Thr
210 215 220
Ile Tyr Gln Ile Met Leu Ala Trp Leu Leu Ala Lys Pro Asn Val Val
225 230 235 240
Ala Ile Pro Lys Ala Gly Arg Val Glu His Leu Arg Glu Asn Leu Lys
245 250 255
Ala Thr Glu Ile Lys Leu Ser Glu Glu Glu Met Lys Leu Leu Asp Ser
260 265 270
Leu Gly Gln
275
本发明提供一种含有所述重组耐热醛酮还原酶基因的重组载体。
所述重组载体可通过本领域常规方法将本发明的重组耐热醛酮还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒为 pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将重组耐热醛酮还原酶基因产物和表达载体pET28a均分别用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的重组耐热醛酮还原酶基因的重组表达质粒 pET28a- tadh2。
本发明还提供一种含有所述重组耐热醛酮还原酶基因或所述重组载体的重组基因工程菌。
进一步，所述重组基因工程菌可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的重组耐热醛酮还原酶基因可被有效表达即可。较佳的，宿主菌是大肠杆菌，更佳的为重组大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。本发明的重组表达转化体（即重组基因工程菌）可以按照本领域的常规方法制备而得，一般将前述重组载体 pET28a- tadh2转化至 E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的重组基因工程菌株，即 E.coli BL21(DE3)/ pET28a- tadh2。
本发明所述重组耐热醛酮还原酶基因在制备重组耐热醛酮还原酶中的应用为：构建含重组耐热醛酮还原酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至所述宿主体内，将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化得到含重组耐热醛酮还原酶的菌体细胞。
此外，本发明还提供一种由所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用：所述应用是在pH值为6.0~9.0的缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以重组耐热醛酮还原酶为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD +构成反应体系进行生物转化反应，反应完全后，将反应液后处理获得所述光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为酮酯、芳香酮酯、酮酸或脂肪醛酮。
进一步，所述反应液后处理方法为：反应完全后，将反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去溶剂，获得所述光学活性手性醇。
进一步，所述重组耐热醛酮还原酶是以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液冻干后的酶粉作为酶源，以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞为催化剂时，所述催化剂的质量用量以菌体细胞的干重计为 1~10 g/L（即酶源的用量为1～ 50U/L反应体系），优选5 g/L。
进一步，本发明所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用优选按如下方法进行：在pH值为6.0~9.0的缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干后的酶粉作为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系，在20~ 50℃进行生物转化反应，反应完全后，将反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去溶剂，获得所述光学活性手性醇；所述底物为酮酯、芳香醛酮或脂肪醛酮，优选酮酯或脂肪醛酮，最优选为酮酯。
所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，所述底物优选如下：酮酯、脂肪族酮及其他含酮基化合物或醛类化合物，更优选为苯甲酰甲酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯或2,2,2-三氟苯乙酮等。
更进一步，所述的应用推荐按如下步骤进行：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干获得的酶粉作为酶源，悬浮于pH值6.0~9.0的缓冲溶液中，分别加入底物、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系，在20~ 50℃下磁力搅拌5~36h，反应结束后，反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去溶剂（或用其它方法蒸干溶剂即可），获得所述光学活性手性醇；所述底物为4-甲基-2-戊酮、环戊酮、2,2,2-三氟苯乙酮、五氟苯乙酮、丙醛、异丁醛、异戊醛、苯甲醛、3-甲氧基苯甲醛、4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、2-甲基乙酰乙酸乙酯、丙酮酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯，优选为苯甲酰甲酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯4-氯乙酰乙酸乙 酯、乙酰乙酸乙酯或2,2,2-三氟苯乙酮；所述萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、正己烷或氯仿；所述底物的初始浓度为1～ 100g/L反应体系（优选5~10g/L），所述酶源的用量为1～ 50U/L反应体系（优选20U/L），所述葡萄糖与底物的质量比为1~2:1（优选2:1），所述葡萄糖脱氢酶的用量为1～ 50U/L反应体系（优选30U/L），所述辅酶NADP+或辅酶NAD+的终浓度为0.1~1.0mmol/L反应体系（优选0.25~1 mmol/L反应体系）。
本发明所述含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞制备方法为：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌株（E.coli BL21(DE3)/pET28a- tadh2）接种至含30μg/ml卡那霉素的 LB培养基中培养，在37℃、180r/min下震荡培养12h，然后将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含30μg/ml卡那霉素的 LB培养基中，在37℃、180r/min下震荡培养至培养液的光密度 OD600达到 0.5~ 0.7(优选0.6)时，向培养液中加入终浓度为 0.1~1mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基 -β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)，25℃、100r/min下继续诱导 8~24小时（优选15h），将诱导培养液离心，获得菌体细胞。将菌体细胞重新悬浮于预冷的Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl浓度为10～100mM，pH6.0~8.0，优选20Mm，pH8.0)后进行细胞超声破碎，离心收集上清液，再冻干（-80℃干燥48h）就能得到本发明的重组耐热醛酮还原酶的酶粉，即酶源。
本发明由所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用中所述反应液的 pH为 6~ 9，通过使用磷酸盐缓冲液进行控制。所述的磷酸盐缓冲液较佳的如磷酸 -磷酸钾或磷酸 -磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05-0.2mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。反应过程中也可以滴加碱液，如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等的水溶液以维持反应液 pH恒定在 pH 6-9的范围。
本发明中，优选重组耐热醛酮还原酶的酶粉为反应催化剂，需要加入辅酶 NADP+或NAD+ 的用量较佳的不超过 1.0mmol/L，能达到极其优良的效果。如果用静息细胞作催化剂则不需要加入辅酶，只需要利用细胞内所含的辅酶即可。
本发明所述重组耐热醛酮还原酶的酶活力单位的定义为：每分钟消耗1mmol底物所需要的酶量为一个酶活单位（1U）。
本发明中，所述的生物转化反应的温度较佳的为 20～ 50℃。所述的生物转化反应的时间以反应完全为准，一般为 5~36小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明所涉及的重组耐热醛酮还原酶具有高活性、热稳定性好，60℃处理 15小时后仍较为稳定，残余相对酶活高达99%；（2）本发明的重组耐热醛酮还原酶高效高选择性地制备手性醇类化合物，可以在葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸脱氢酶条件下构建辅酶NADPH或NADH循环再生系统，能大大降低反应过程中辅酶的消耗；（3）由于本发明的重组耐热醛酮还原酶具有较高的热稳定性，可以回收利用，并且反应体系中只需要额外添加少量的辅酶（辅酶的质量用量为底物质量的1/1000，辅酶在反应体系中的浓度不超过1Mm），极大地降低了生产的成本，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，在合成药物手性中间体方面具有很好的工业应用前景。
（四）附图说明
图 1、为pET28a-- tadh2质粒经限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切后产物电泳结果图，泳道1和3分别为核酸Markerλ-Hind Ⅲ和DL 2000， 泳道2为重组质粒pET28a- tadh2双酶产物，可以看到两条带，其中小片段在800bp上下，与目的基因大小一致；大片段为线性的pET28a。
图 2、目的基因表达产物的SDS-PAGE电泳图，泳道2为低分子蛋白Marker ，泳道1 为BL21/ pET28a-tadh2诱导表达后细胞破碎上清，在29.0kDa附近有一条明显诱导的蛋白表达条带，与推测的重组蛋白理论相对分子质量（31.49kDa ）一致。
图3、重组质粒pET28a--tadh2的构建示意图。
图4、重组耐热醛酮还原酶催化苯甲酰甲酸乙酯制备s-扁桃酸乙酯的液相色谱图，a为扁桃酸乙酯标准品，b为产物s-扁桃酸乙酯。
图5、EOPB反应后液相色谱图：12.655分钟的峰为R-EHPB，峰面积为295743，13.910分钟的峰为S-EHPB，峰面积为208899。
图6、丙酮酸乙酯反应后液相色谱图：9.63分钟的峰为R-乳酸乙酯，峰面积为93256；10.786分钟的峰为S-乳酸乙酯，峰面积为28313。
图7、实施例7中反应液的液相色谱图，8.158分钟的峰为S型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯R-乳酸乙酯，峰面积为89473；8.442分钟的峰为R型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯，峰面积为27709。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下列实施例中材料的来源为：
表达质粒 pET28a购自Novagen公司。
E.coli DH5α和 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
Clone EZ重组克隆试剂盒购自 GenScript公司。
LB培养基终浓度组成为：100ml蒸馏水中，加入1g氯化钠、1g蛋白胨和0.5g酵母提取物，自然pH值。
实施例 1 重组耐热醛酮还原酶基因的高效表达基因和表达载体的 人工构建
通过对genebank的检索与分析确定本发明的重组耐热醛酮还原酶基因（tadh2）DNA序列。在保证重组耐热醛酮还原酶的氨基酸序列不变的情况下，将编码重组耐热醛酮还原酶基因的密码子，全部换成在大肠杆菌中使用频率最高的密码子，改建的由重组耐热醛酮还原酶基因序列推断出的DNA序列如序列表SEQ ID NO ：1所示，在金斯瑞生物科技基因合成序列为SEQ ID NO: 1所示的tadh2 DNA。然后将合成的tadh2 DNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pET28a中，并经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)基因工程菌中高效表达。
将上述人工合成的重组耐热醛酮还原酶DNA序列（tadh2）用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切，用割胶回收的方法，回收约800bp大小的 DNA片段；用同样的限制性内切酶酶切pET28a质粒载体，酶切产物用AxyPrep PCR纯化试剂盒回收；将回收的800bp目的DNA片段与pET28a载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从E.coli DH5α受体菌中提取BamHⅠ和NotⅠ质粒，进行双酶切检测鉴定，阳性克隆转化E.coli BL21(DE3)表达菌株中。重组载体的构建过程见图3所示，具体实验方法如下：
按照超纯水，人工合成重组耐热醛酮还原酶DNA序列和pET28a质粒、酶切缓冲液、限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ的顺序加到PCR管中，用枪头吸打几次，充分混匀后，用小型离心机离心（3000rpm，1 min）将管壁上的液体集中于管底，37℃水浴4h后，95℃水浴10分钟终止酶切。切取含目的条带的胶块后以AxyPrep DNA胶回收试剂盒纯化回收800bp目的DNA片段。由于经BamHⅠ和NotⅠ酶切的pET28a载体，切掉的片段只有34bp，AxyPrep PCR纯化试剂盒只能回收长度大于75bp的DNA片段，所以同样可以使用该试剂盒选择性地回收酶切后的线性载体。
酶切体系（50μL）：
将上述酶切体系用质量浓度0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，分析双酶切结果，结果见图1所示，泳道1和3分别为核酸Markerλ-Hind Ⅲ和DL 2000，泳道2为重组质粒pET28a- tadh2双酶产物，可以看到两条带，其中小片段在800bp上下，与目的基因大小一致；大片段为线性的pET28a。其中800bp左右的片段是需回收的tadh2基因目的片段，较大的片段是线性pET28a。
将双酶切回收的tadh2基因目的片段与线性pET28a(+)按如下比例配成连接体系，置于PCR仪16℃恒温16h，得到重组质粒pET28a-tadh 2。
连接体系（10μL）：
在含50μL感受态细胞（E.coli DH5α）的EP管中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，转入42℃水浴中热击90s，快速转至冰浴中2min，取出后加入500μL 无抗性LB培养基，37℃，180r/min摇床培养1h后涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养16h后挑取单菌落，活化培养后使用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒进 行双酶切检测鉴定阳性克隆。将含有阳性克隆的E.coli DH5α菌株于8%（体积浓度）甘油中，-20℃冰箱保存。
同样方式构建含有pET28a-tadh2的表达菌株E.coli BL21- pET28a-tadh2（DE3），置于终浓度为8%（体积）甘油中，-20℃冰箱保存。
实施例 2 重组基因工程菌的培养及重组耐热醛酮还原酶酶粉制备
取实施案例1中得到的表达菌株E.coli BL21- pET28a-tadh2（DE3），分别接种于两个5mL含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基的试管中，37℃，180r/min培养12h后，将培养液以体积比1：100的比例接种于新鲜的100mL含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养1.5~2h，至菌液OD600约为0.6，再加入24mg/mL的IPTG溶液至IPTG终浓度为0.5mmol/L，25℃、100r/min诱导培养12h，然后4℃，4000r/m离心20min后弃上清，用蒸馏水悬浮菌体（即沉淀）洗涤，同样条件下离心，即得到重组耐热醛酮还原酶的菌体细胞。
将菌体细胞重新悬浮于20mL 预冷的Tris-HCl(20mM，pH 8.0)缓冲液后进行细胞超声破碎，工作条件为功率80W，工作5秒，间歇5秒，共进行20min，此过程中细胞始终保持在冰浴中，防止蛋白热变性，破碎混合液10000r/mim离心10分钟，得到上清液，即酶液，沉淀用20mlTris-HCl(20mM，pH 8.0)缓冲液溶解，用于后续电泳检测。
本实验中表达的目标蛋白大小在31kDa左右，根据目的蛋白大小，分离胶选用10% SDS-PAGE，浓缩胶采用5%SDS-PAGE。
电泳参数：样品上样10μL，Marker上样10μL，浓缩胶电压50V，分离胶电压200V。
电泳完毕后，取出胶加入适量考马斯亮蓝染色液在脱色摇床染色2h后更换脱色液，每2h更换一次，最后脱色过夜，观察电泳结果。
结果如图2所示，重组质粒pET28a-SDR3转化大肠杆菌BL21(DE3)， 经IPTG诱导后，细胞裂解液上清有一条明显的分子量在30kD左右的蛋白条带，大约为29kDa（泳道1所示），目的基因tadh2在大肠杆菌成功的异源表达。结果表明：在29.0kDa附近有一条明显诱导的蛋白表达条带，与推测的重组蛋白理论相对分子质量（31.49kDa ）一致。
将上述酶液经过70℃热处理5分钟后，10000r/mim离心10分钟，取上清液在-80℃冷冻干燥48h，得到重组耐热醛酮还原酶干酶粉0.1g。
实施例3 重组耐热醛酮还原酶活力测定和酶的热稳定性
酶活测定依据Vallee&Hoch法：在340nm还原型辅酶NAD(P)H有明显吸收而氧化型辅酶NAD(P)+无吸收，因此在氧化还原反应中，辅酶被氧化或还原会引起340nm吸光度的变化。故可通过测定反应过程中340nm出辅酶吸光度的变化来衡量氧化还原酶的活力。
酶活单位的定义为：每分钟消耗1mmol底物所需要的酶量为一个酶活单位（1U）。
测定方法如下：在1.5ml EP管中加10μl 二甲基亚砜（DMSO），用于底物助溶；分别加底物2-5μL（保持摩尔浓度为20mM）（底物见表1所示），混匀；加20μL 10mg/ml的NADH溶液（终浓度0.25mM），混匀；加20mM pH8.0的Tris-Hcl缓冲液至1ml，混匀，制成待测液；将上述1ml待测液加入到比色皿，放入分光光度计中；加10μL酶液（将实施例2制备的酶粉用超纯水配制成1mg/ml的酶液），迅速在340 nm 读取吸光值。3分钟后再记录一次吸光值，相对酶活力按公式（1）计算，结果见表1所示。
相对酶活力(U)=（ΔOD340×V×1000） /（6220×L×Δt） 公式（1）；
ΔOD340: 吸光度变化；V: 反应体系总体积(1mL)；Δt:反应时间(3min)； e: 摩尔吸光系数， 6.22 mL/(mol·cm)；L: 石英比色杯光程(1cm)。
重组耐热醛酮还原酶（tadh2）对各种测定的酮类均有一定的作用，其中丙醛、2,2,2-三氟苯乙酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯和2-氧代-4-苯基丁酸乙酯是其较好的底物。重组耐热醛酮还原酶（tadh2）对2,2,2-三氟苯乙酮酶活为0.57U/mL，以该化合物为100%活性参照底物，标注对各底物的相对活性如表1。由表可见重组耐热醛酮还原酶（tadh2）对含苯环的酮催化作用较强，对酮酯（酸）类底物的活性很高，而对脂肪族酮、环酮活性相对较低。
表1重组耐热醛酮还原酶相对活性
酶的热稳定性：在20 mM Tris–HCl pH8.0缓冲液中，将重组耐热醛酮 还原酶酶液0.5ml（将实施例2制备的酶粉用超纯水配制成1 mg/ml的酶液）分别在不同温度（60℃-90℃，5℃为间隔）温浴15小时后，70℃测残留的相对酶活。TADH2经60℃、15小时温浴后残留相对酶活99%，85℃、15小时温浴后残留相对酶活63%，经90℃温浴酶活才明显下降。
37℃温浴7天，TADH2酶活残留59%；55℃温浴24小时，TADH2酶活残留87%。
热稳定性研究表明，该重组耐热醛酮还原酶在70℃下保温15min处理，较为稳定，残余相对酶活达99%，当温度高于90℃后，酶活急剧下降。结合酶热处理的结果选取70℃、15min处理的酶液作为不对称还原的催化剂。
实施例 4重组耐热短链脱氢酶催化苯甲酸甲酰乙酯的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热短链脱氢酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，10mg底物苯甲酸甲酰乙酯，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 30℃，磁力搅拌下反应 22h。反应结束后反应液用2ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel OD-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=93/7，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（s-扁桃酸乙酯）的 ee值。液相色谱图见图4所示，12.187分钟的峰为R-扁桃酸乙酯，峰面积为36588;13.843分钟的峰为S-扁桃酸乙酯，峰面积为35443321。结果如下：转化率 99％,；ee值97.9％。将剩余部分上层正己烷溶液用氮气吹扫除去正己烷，获得s-扁桃酸乙酯。
实施例 5重组耐热醛酮还原酶催化2,2,2-三氟苯乙酮的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，9mg底物2,2,2-三氟苯乙酮，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 37℃，磁力搅拌下反应 24h。反应结束后反应液用2ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel IC,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=97/3，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（2,2,2-三氟苯乙醇）的 ee值。液相色谱图见图5所示，结果如下：转化率 68％；ee值99.8％。将剩余部分上层正己烷溶液用氮气吹扫除去正己烷，获得单一手性的2,2,2-三氟苯乙醇，产率为56%。
实施例 6重组耐热醛酮还原酶催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，9.8微升底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 37℃，磁力搅拌下反应 12h。反应结束后反应液用2ml乙酸乙酯进行萃取，取小部分上层乙酸乙酯溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel IC,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=95/5，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（R-EHPB）的 ee值。液相色谱图见图6所示，12.790分钟的峰为R-EHPB，峰面积为583978：14.187分钟的峰为S-EHPB峰面积为77648。结果：转化率 95％；ee值76.5％。
实施例 7重组耐热醛酮还原酶催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，10微升底物丙酮酸乙酯，20mg葡萄糖和 0.5μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 30℃，磁力搅拌下反应 24h。反应结束后，取0.2ml反应液用1ml乙酸乙酯进行萃取，取0.ml上层乙酸乙酯溶液用氮气吹扫除去乙酸乙酯，再加入1ml正己烷混合均匀后用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel AS-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=98/2，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV215nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯）的 ee值。液相色谱图见图7所示，8.158分钟的峰为S型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯R-乳酸乙酯，峰面积为89473；8.442分钟的峰为R型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯，峰面积为27709。转化率 90％；ee值52.7％。
实施例 8重组耐热醛酮还原酶全细胞催化苯甲酸甲酰乙酯的不对称还原
取 20mg(反应体系中初始酶活30U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的菌体细胞悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.04mg(反应体系中初始酶活40U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，20mg底物苯甲酸甲酰乙酯，40mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 35℃，磁力搅拌下反应 20h。反应结束后反应液用4ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel OD-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=93/7，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（s-扁桃酸乙酯）的 ee值。结果：转化率 98％； ee值＞98.5％。
应理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgctgta taaagaactg 120
ggtcgtaccg gcgaagaaat tccggcactg ggtctgggta cctggggtat cggcggtttt 180
gaaacgccgg attatagccg cgatgaagaa atggtggaac tgctgaaaac cgcaattaaa 240
atgggttaca cccatatcga tacggcggaa tattacggcg gtggccacac ggaagaactg 300
attggcaaag ccatcaaaga ttttcgtcgc gaagatctgt tcattgtgag caaagtttgg 360
ccgacccatc tgcgtcgcga tgatctgctg cgttctctgg aaaacaccct gaaacgcctg 420
gatacggatt atgttgatct gtacctgatt cactggccga atccggaaat cccgctggaa 480
gaaaccctga gtgcgatggc cgaaggtgtg cgtcagggcc tgattcgcta tatcggcgtt 540
agcaactttg atcgtcgcct gctggaagaa gccattagca aatctcagga accgatcgtg 600
tgcgatcagg ttaaatataa cattgaagat cgtgatccgg aacgcgatgg tctgctggaa 660
ttctgtcaga aaaatggcgt gaccctggtt gcatacagtc cgctgcgtcg cacgctgctg 720
agcgaaaaaa ccaaacgtac gctggaagaa atcgcgaaaa atcatggtgc caccatttac 780
cagatcatgc tggcatggct gctggcgaaa ccgaacgtgg ttgccattcc gaaagcaggc 840
cgtgtggaac acctgcgcga aaatctgaaa gcgacggaaa tcaaactgtc tgaagaagaa 900
atgaaactgc tggatagtct gggctaa 927
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Met Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Arg Thr Gly Glu Glu Ile Pro Ala Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gly Thr Trp Gly Ile Gly Gly Phe Glu Thr Pro Asp Tyr Ser
20 25 30
Arg Asp Glu Glu Met Val Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Lys Met Gly
35 40 45
Tyr Thr His Ile Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Gly Gly Gly His Thr Glu
50 55 60
Glu Leu Ile Gly Lys Ala Ile Lys Asp Phe Arg Arg Glu Asp Leu Phe
65 70 75 80
Ile Val Ser Lys Val Trp Pro Thr His Leu Arg Arg Asp Asp Leu Leu
85 90 95
Arg Ser Leu Glu Asn Thr Leu Lys Arg Leu Asp Thr Asp Tyr Val Asp
100 105 110
Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Asn Pro Glu Ile Pro Leu Glu Glu Thr
115 120 125
Leu Ser Ala Met Ala Glu Gly Val Arg Gln Gly Leu Ile Arg Tyr Ile
130 135 140
Gly Val Ser Asn Phe Asp Arg Arg Leu Leu Glu Glu Ala Ile Ser Lys
145 150 155 160
Ser Gln Glu Pro Ile Val Cys Asp Gln Val Lys Tyr Asn Ile Glu Asp
165 170 175
Arg Asp Pro Glu Arg Asp Gly Leu Leu Glu Phe Cys Gln Lys Asn Gly
180 185 190
Val Thr Leu Val Ala Tyr Ser Pro Leu Arg Arg Thr Leu Leu Ser Glu
195 200 205
Lys Thr Lys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Ala Lys Asn His Gly Ala Thr
210 215 220
Ile Tyr Gln Ile Met Leu Ala Trp Leu Leu Ala Lys Pro Asn Val Val
225 230 235 240
Ala Ile Pro Lys Ala Gly Arg Val Glu His Leu Arg Glu Asn Leu Lys
245 250 255
Ala Thr Glu Ile Lys Leu Ser Glu Glu Glu Met Lys Leu Leu Asp Ser
260 265 270
Leu Gly Gln
275
Claims (10)
1.一种重组耐热醛酮还原酶基因，其特征在于所述基因具有与SEQ IDNo.1所示核苷酸序列90%以上同源性。
2.如权利要求1所述重组耐热醛酮还原酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
3.一种由权利要求1或2所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶。
4.如权利要求3所述重组耐热醛酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
5.一种含有权利要求1所述重组耐热醛酮还原酶基因的重组载体。
6.一种含有权利要求1或5所述重组耐热醛酮还原酶基因或重组载体的重组基因工程菌。
7.一种由权利要求1所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：以前手性羰基化合物为底物，以重组耐热醛酮还原酶为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系进行生物转化反应，反应完全后，将反应液后处理获得所述光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为酮酯、芳香酮酯、酮酸或脂肪醛酮。
8.如权利要求7所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述重组耐热醛酮还原酶是以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液冻干后的酶粉作为酶源。
9.如权利要求8所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或将菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干获得的酶粉作为酶源，悬浮于pH值6.0~9.0的缓冲溶液中，分别加入底物、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系，在20~ 50℃下磁力搅拌5~36h，反应结束后，反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，氮气吹扫除去溶剂，获得所述光学活性手性醇；所述底物为4-甲基-2-戊酮、环戊酮、2,2,2-三氟苯乙酮、五氟苯乙酮、丙醛、异丁醛、异戊醛、苯甲醛、3-甲氧基苯甲醛、4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、2-甲基乙酰乙酸乙酯、丙酮酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯；所述萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、正己烷或氯仿；所述底物的初始浓度为1～ 100g/L反应体系，所述酶源的用量为1～ 50U/L反应体系，所述葡萄糖与底物的质量比为1~2:1，所述葡萄糖脱氢酶的用量为1～ 50U/L反应体系，所述辅酶NADP+或辅酶NAD+的终浓度为0.1~1.0mmol/L反应体系。
10.如权利要求8~9之一所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的所述含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞按如下方法制备：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌接种至含30μg/ml卡那霉素的 LB培养基中培养，37℃、180r/min震荡培养12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含30μg/ml卡那霉素的 LB培养基中，37℃、180r/min震荡培养至培养液的OD600达到 0.5~ 0.7时，向培养液中加入终浓度为 0.1~1mmol/L的IPTG，25℃、100r/min继续诱导培养 8~24小时，将诱导培养液离心，取菌体细胞，即为酶源。
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