CN103709058A

CN103709058A - 一种左旋肉碱的合成方法

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Publication number: CN103709058A
Application number: CN201310664505.3A
Authority: CN
Inventors: 陶军华; 李斌; 邓阳生; 唐苏苏; 鞠鑫
Original assignee: SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Current assignee: SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103709058B

Abstract

本发明涉及一种左旋肉碱的合成方法，在25~35℃下，将底物4-氯乙酰乙酸乙酯溶解在磷酸盐缓冲液中，然后在酮还原酶、辅酶和异丙醇的作用下，底物在pH为6~7的条件下反应20~50小时，生成(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯；将氢氧化钠溶解在质量比为25%的三甲胺水溶液中形成混合溶液，然后在-5~5℃下，将混合溶液缓慢滴加到(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中，于-5~5℃下反应20~30小时，停止反应，调节pH为5~7，然后经离心、超滤、树脂纯化得到左旋肉碱。本发明改进了生产流程，提高了底物浓度，降低了酶用量，使得生产成本降低，提高了产品的市场竞争力。

Description

一种左旋肉碱的合成方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地涉及一种左旋肉碱的合成方法。

背景技术

左旋肉碱，又名L-肉碱，商品名又称胃康素、维生素Bt，英文名为L-Carnitine，化学名为：(R)-3-羟基-4-三甲铵丁酸内盐或β-羟基-γ-三甲铵丁酸内盐，分子式为C₇H₁₅NO₃，分子量：161.20。

左旋肉碱是一种广泛存在于肌体组织内的特殊氨基酸，是人类及动物必需的营养物质。它的基本功能是辅助长链脂肪酸穿透线粒体内膜进行氧化的载体。临床上用于肉碱缺乏症和长期肾透析病人肉碱缺乏症，也可广泛用于各种缺血性心脏病的治疗，对于休克、急慢性心功能不全、心肌炎、心律失常都有较好作用；肉碱还可用于肝病患者的辅助治疗用于手术或胃肠瘘恶性肿瘤接受全肠外营养支持的病人和新生儿。近几年左旋肉碱在营养保健、减肥健美、提高运动能力、恢复疲劳以及食品添加剂和饲料添加剂等领域得到广泛的应用，具有很高的实用价值。

文献报道的左旋肉碱的合成方法主要涉及：

（1）肉浸膏生物提取法，存在含量偏低，与副产物胆碱难分离，步骤复杂，成本高，收率低的缺点；

（2）在化学合成法中，分别以环氧氯丙烷和4-氯乙酰乙酸乙酯为起始原料的生产方法居多；如1988年日本专利（JP63185947）报道的以(S)-(+)-环氧丙烷为起始原料，与三甲胺成季铵盐反应制的3-氯-2-羟丙基三甲胺卤化物，再经氰化为3-氰基-2-羟基丙基三甲胺卤化物，最后水解及离子交换得到左旋肉碱。但该类方法具有需要剧毒的氰化物或者利用昂贵的金属催化剂，且光学纯度较低(<98%)等缺点（类似专利有：日本专利JP18635947，中国专利201210089733.8、201010580516.X等）。

而以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料的中国专利201010198458.4，其先经手性催化剂及高压氢化得到4-氯-3-羟基丁酸乙酯，再与三甲胺成季铵盐反应制得L-肉碱粗品，经离子交换纯化得到左旋肉碱纯品。但该类方法需要手性催化剂及高压氢化等苛刻反应条件和设备，加大了生产的成本。

（3）不同起始原料的生物合成法，如DL-肉毒碱酶法拆分，β-脱氢肉毒碱的酶法转化，以及反式巴豆甜菜碱和γ-丁基甜菜碱的酶法制备等，由于生产成本高，难以广泛使用；以及以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料的发酵法，但是转化率和产率都较低（中国专利200810121542.9）。

经过文献检索发现，以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料经酶转化法生产左旋肉碱关键中间体(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯已经有较多报道。例如中国专利201310132479.x利用重组大肠杆菌表达的酮还原酶来制备(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的方法；但是其存在如下问题：1、底物浓度低；2、酶投量高；3、其只能生成左旋肉碱的关键中间体，还需提取之后，经过后续反应才能得到左旋肉碱，对溶剂的使用和生产成本高，产品缺乏市场竞争力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低的左旋肉碱的合成方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种左旋肉碱的合成方法，其合成路线和步骤如下：

（1）、在25～35℃下，将底物4-氯乙酰乙酸乙酯溶解在磷酸盐缓冲液中，然后在酮还原酶、辅酶和异丙醇的作用下，所述的底物在pH为6～7的条件下反应20～50小时，生成(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯；

（2）、将氢氧化钠溶解在质量比为25%的三甲胺水溶液中形成混合溶液，然后在-5～5℃下，将所述的混合溶液缓慢滴加到步骤（1）生成的(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中，于-5～5℃下反应20～30小时，停止反应，调节pH为5～7，然后经离心、超滤、树脂纯化得到所述的左旋肉碱；

其中，在起始的反应体系中，所述的底物浓度为40～120g/L，所述的底物、酮还原酶、辅酶的质量比为300～500:8～12:1。

优选地，步骤（1）中，所述的底物先溶解在甲苯中，然后再加入所述的磷酸盐缓冲液混合均匀。

优选地，所述的磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.08～0.12mol/L，pH为6～7。

优选地，所述的辅酶为NAD⁺。

优选地，所述的底物、氢氧化钠、三甲胺的摩尔比为0.8～1.3:1.2～1.9:1。

优选地，步骤（2）中，控制所述的混合溶液缓慢滴加到步骤（1）生成的(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中的时间为3～5小时。

优选地，步骤（2）中，反应停止后，采用质量分数为30%～36%的盐酸调节pH为5～7。

优选地，在起始的反应体系中，所述的底物浓度为60～120g/L。

反应所用的物质除酮还原酶外，其余原料均为常见并可市购获得的，酮还原酶为苏州汉酶生物技术有限公司生产和销售的产品。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明方法通过在一个容器中完成从4-氯乙酰乙酸乙酯到左旋肉碱的合成，减少了生产步骤，提高了底物浓度，降低了酶用量，使得生产成本降低，提高了产品的市场竞争力，并且，本发明的反应条件温和，反应步骤简单易操作。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。

实施例1酮还原酶的制备

从甘油管或转化平板将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到4mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜（35℃，220rpm）。从过夜培养物以1/100接种量转接50mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，35℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6～0.8，加入IPTG于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10mL磷酸缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎15分钟，离心，上清液预冻过夜，冻干24h～40h，即得冻干粉状的酮还原酶。

实施例2

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（1.5g，9.11mmol）加至50mL圆底烧瓶中，加入20mL磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，然后依次加入3mL异丙醇、45mg酮还原酶粉及4.5mg NAD⁺干粉，在30℃下磁力搅拌，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应30h后，转化率大于99%，终止反应待用。

2）将氢氧化钠（0.73克，18.2mmol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（1.44mL，10.9mmol）配置成混合溶液，于0～5℃下缓慢滴加到上述酶反应后的水溶液中，约3小时加完，继续于0～5℃下搅拌反应24小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约3.68mL盐酸（浓度为36%）中和至pH=5，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（1.16克），收率79%。光学纯度99.5%。

实施例3

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（5g，30.35mmol）加至100mL圆底烧瓶中，加入40mL磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，然后依次加入5mL异丙醇、100mg酮还原酶粉及10mg NAD⁺干粉，于30℃下搅拌，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应48h后，GC检测转化率大于99%，终止反应待用。

2）将氢氧化钠（2.43克，60.7mmol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（21.3mL，36.12mmol）配置成混合溶液，于0～5℃下缓慢滴加到上述酶反应后的水溶液中，约3小时加完，继续于0～5℃下搅拌反应24小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约12.3mL盐酸（浓度为36%）中和至pH=6，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（3.83克），收率78.4%。光学纯度99.5%。

实施例4

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（12g，72.9mmol）加至250mL圆底烧瓶中，加入40mL甲苯，搅拌至完全溶解；加入96mL磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，于30℃下搅拌；然后依次加入12mL异丙醇、360mg酮还原酶粉及36mg NAD⁺干粉，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应48h后，GC检测转化率99.6%，终止反应待用。

2）将氢氧化钠（4.4克，109mmol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（52mL，87.2mmol）配置成混合溶液，于0～5℃下缓慢滴加到上述酶反应后的水溶液中，约3小时加完，于0℃下搅拌反应24小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约25.7mL盐酸（浓度为30%）中和至pH=7，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（9.32克），收率79.3%。光学纯度99.5%。

实施例5

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（40g，0.243mol）加至1L圆底烧瓶中，加入40mL甲苯，搅拌至完全溶解；加入320mL磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，于30℃下搅拌；然后依次加入40mL异丙醇、800mg酮还原酶粉及80mg NAD⁺干粉，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应24h后，GC检测转化率99.6%，终止反应待用。

2）将氢氧化钠（14.6克，0.365mol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（115mL，0.195mol）配置成混合溶液，于0～5℃下缓慢滴加到上述酶反应后的水溶液中，约3小时加完，继续于0℃下搅拌反应24小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约61mL盐酸（浓度为36%）中和至pH=5，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（30.9克），收率79.1%。光学纯度99.5%。

实施例6

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（100g，0.607mol）加至3L圆底烧瓶中，加入100mL甲苯，搅拌至完全溶解；加入800mL磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，于30℃下搅拌；然后依次加入100mL异丙醇、2g酮还原酶粉及0.2g NAD⁺干粉，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应24h后，GC检测转化率99.6%，终止反应待用。

2）将氢氧化钠（36.4克，0.91mol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（286mL，0.484mol）配置成混合溶液，于-3～0℃下缓慢滴加到上述酶反应后的水溶液中，约3小时加完，继续于-3℃～0℃下搅拌反应24小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约152ml盐酸（浓度为36%）中和至pH=6，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（77.5克），收率79.1%。光学纯度99.5%。

实施例7

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（150g，0.911mol）加至5L圆底烧瓶中，加入150mL甲苯，搅拌至完全溶解；加入1200mL磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，于30℃下搅拌；然后依次加入150mL异丙醇、3g酮还原酶粉及0.3g NAD⁺干粉，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应24h后，GC检测转化率99.6%，终止反应待用。

2）将上述酶反应后的水溶液，于-5℃～-3℃下缓慢滴加到配置好的氢氧化钠（54.7克，1.367mol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（430mL，0.73mol）的混合溶液，约5小时加完，继续于-5℃～-3℃下搅拌反应28小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约227ml盐酸（浓度为30%）中和至pH=7，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（117.3克），收率79.7%。光学纯度99.5%。

实施例8

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（1.5kg，9.11mol）加至30L反应釜中，加入1.5L甲苯，搅拌至完全溶解；加入12L磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，于30℃下搅拌；然后依次加入1.5L异丙醇、30g酮还原酶粉及3g NAD⁺干粉，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应24h后，GC检测转化率99.5%，终止反应待用。

2）将上述酶反应后的水溶液,于-5℃～-3℃下缓慢滴加到配置好的氢氧化钠（0.55公斤，13.67mol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（4.3L，7.3mol）的混合溶液，约5小时加完，继续于-5℃～-3℃下搅拌反应28小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约2.27L盐酸（浓度为36%）中和至pH=5，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（1.18公斤），收率79.8%。光学纯度99.5%。

实施例9

1）将4-氯乙酰乙酸乙酯（15kg，91.1mol）加至500L反应釜中，加入15L甲苯，搅拌至完全溶解；加入120L磷酸盐缓冲液(0.1M,pH6.5)，于30℃下搅拌；然后依次加入15L异丙醇、300g酮还原酶粉及30g NAD⁺干粉，开始反应；同时采用滴定仪将pH维持在6.5。GC监控，反应24h后，GC检测转化率99.5%，终止反应待用。

2）将氢氧化钠（5.5公斤，136.7mol）和质量比为25%的三甲胺水溶液（43L，73mol）配制成混合溶液，于-3～0℃下缓慢滴加到上述酶反应后的水溶液中，约4小时加完，继续于-5℃～-3℃下搅拌反应28小时后，HPLC检测转化率>99%，反应停止。加入约22.7L盐酸（浓度为30%）中和至pH=7，经离心、超滤、树脂纯化得到纯品L-肉碱（11.5公斤），收率78.3%。光学纯度99.5%。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种左旋肉碱的合成方法，其特征在于：其合成路线和步骤如下：

2.根据权利要求1所述的左旋肉碱的合成方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的底物先溶解在甲苯中，然后再加入所述的磷酸盐缓冲液混合均匀。

3.根据权利要求1所述的左旋肉碱的合成方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.08～0.12mol/L，pH为6～7。

4.根据权利要求1所述的左旋肉碱的合成方法，其特征在于：所述的辅酶为NAD⁺。

5.根据权利要求1所述的左旋肉碱的合成方法，其特征在于：所述的底物、氢氧化钠、三甲胺的摩尔比为0.8～1.3:1.2～1.9:1。

6.根据权利要求1所述的左旋肉碱的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，控制所述的混合溶液缓慢滴加到步骤（1）生成的(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中的时间为3～5小时。

7.根据权利要求1所述的左旋肉碱的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，反应停止后，采用质量分数为30%～36%的盐酸调节pH为5～7。

8.根据权利要求1所述的左旋肉碱的合成方法，其特征在于：在起始的反应体系中，所述的底物浓度为60～120g/L。