KR101109060B1 - 융합 항원 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 융합 항원에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 리간드 부위, 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II, 항원 부위 및 카르복실 말단 부위를 포함하는 융합 항원에 관한 것이다. 상기 리간드 부위는 표적 세포의 수용체에 반응 또는 결합하거나, 상기 수용체를 인식할 수 있고, 상기 카르복실 말단 부위는 KDEL 서열을 갖는 폴리펩타이드를 함유하며, 상기 항원 부위는 PRRSV, 말 동맥염 바이러스, 써코바이러스 타입 II, 인간 면역결핍 바이러스, 젖산 탈수소효소 증진 바이러스, 및 시미안 출혈열 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 병원체로부터 유래한 것이다. 상기 융합 항원을 이용하여 면역 반응을 유도하는 약학적 조성물 및 방법이 또한 개시된다.

Description

융합 항원 백신{Fusion antigen used as vaccine}
본 출원은 2007년 11월 30일자로 출원된 미국출원번호 11/948,327에 대한 우선권을 함유하며, 상기 문헌은 본 출원에 참조로 삽입된다.
본 발명은 융합 항원에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 T-세포 백신으로 사용되는 융합 항원에 관한 것이다.
세포 매개성 면역 반응은 T-림프구와 T-세포가 인식하는 항원을 가진 세포 간의 직접적 상호작용에 의존한다. 바이러스는 세포 자체의 합성 기관을 이용하여 세포 내에서 복제하며, T-세포는 이러한 바이러스로 감염된 세포를 인식한다. 한편, 바이러스의 복제로부터 유래된 항원은 감염된 세포의 표면상에 존재하고(MHC Class I에 의해), 상기 감염된 세포를 세포독성 T 세포(CD8+ T-세포)가 인식하여 바이러스 복제가 끝나기 전에 세포를 사멸시킴으로써 감염을 조절하게 된다.
바이러스 감염 예방용 백신은 일반적으로 병원성이 감소되어 약독화된 살아있는 생물로서, 방어 면역을 자극한다. 약독화 생백신으로 사용되는 살아있는 바이 러스의 외래 단백질은, 바이러스가 복제하여 내생(endogenous) 가공 펩타이드를 형성시 항원제시세포(APC)의 소포체(ER) 루멘에서 인식되어 가공된다. 상기 가공에는 항원수식(antigen modification)과 적절한 소화(digestion)가 포함된다. 그러나, 특히 RNA 바이러스와 같은 약독화 생백신은 독성(toxicity) 및 병원성(virulence)을 회복하는 경향이 상당히 강하다. 예를 들면, 감염성 후두기관염 바이러스(ILTV)의 독성은 백신이나 약화된 균주에서 회복된다. 그 외에도, 바이러스는 복수의 계대 후에도 작동해야 한다. 따라서, 면역반응을 유발하는 능력이 의심받게 된다. 약독화 생백신의 개발은 시간소모적인 작업이다.
약독화 생백신의 회복을 막기 위하여, 오제스키병(Aujeszky's disease) 백신, gI 음성 백신, 및 PRV 마커 백신과 같은 유전자 결함 백신이 개발되었다.
백시나(vaccina)나 계두(fowlpox)의 바이러스 또는 세균이 항원 유전자를 전달하기 위한 벡터로 사용된다. 재조합 DNA 기술을 이용할 경우, 우수한 백신 개발을 위한 시간을 단축할 수 있고 동시에 다양한 혈청형(serotype)의 백신을 얻을 수 있다. 이러한 백신의 예로서 계두바이러스와 살모넬라 벡터 시스템 및 Syntro Vet(US) 유전자 재조합 백신을 들 수 있다. 반면, 미생물, 특히 RNA 바이러스를 벡터 백신으로 사용하는 경우, 상기 미생물은 새로운 종 또는 새로운 균주를 찾을 수 있다. 하지만, 이러한 벡터 백신은 안정성이 문제된다. 또한, 통상적인 재조합 소단위 백신들은 일반적으로 세포 매개성 면역 반응을 일으키는데 도움이 되지 못한다. 이들은 외생(exogenous) 항원으로서, 대식세포, 수지상 세포 및 B 림프구에 포식된다. 유체상 음세포작용(pinocytosis)을 거친 APC나 막-결합 수용체에 의하여 항원이 내재화(internalization)된 이후 외생 항원으로부터 면역원(immunogen) 에티토프인 펩타이드가 생성된다. 상기 펩타이드는 APC의 엔도좀(endosome) 부분에서 생성되고, 비어있는 MHC class II 분자에 의해 분류되어 MHC class II 분자와 펩타이드 간의 친화도에 근거한 펩타이드-MHC class II 복합체를 형성한다. 이후, 상기 펩타이드-MHC class II 복합체는 APC의 표면으로 이동되어 CD+4 T-세포에 의해 인식된다. 하지만, CD8+ T-세포에 의해 인식되는 소단위 형태의 단백질은 백신으로 사용되기에는 효율적이지 못하다. 왜냐하면 상기 단백질은 일단 투여되면 엔도좀 부분에서 내재화되어 심하게 분해되거나 MHC class I 경로와 상호작용하지 못하는 경향이 있기 때문이다. 나아가, CD+4 세포(Th 세포)는 각각 Th1 및 Th2 헬퍼 T-세포에 의하여 체액성 면역과 세포 매개성 면역 반응 모두를 활성화시킬 수 있다. Th1 및 Th2 세포들은 체액성 면역과 세포 매개성 면역 반응의 균형을 위해 서로를 조절한다.
T-세포, B-세포, 수지상 세포, 단핵세포, 또는 대식세포와 같은 면역 세포를 감염시키는 바이러스가 발견되어 연구되었다. 이러한 돼지 감염 바이러스의 예로 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스, 써코바이러스 타입 II, 및 인간 감염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스를 들 수 있다. 상기 바이러스들은 항원제시세포에서 항원인 외래 단백질을 인식하는 능력을 멈추게 한다. 면역세포들은 면역 반응을 유발할 수 없어 바이러스를 보유한다. 이러한 종류의 바이러스에 의해 감염된 동물들은 다른 병원체에 의해 쉽게 2차 감염이 된다. 안타깝게도 바이러스-감염 면역 세포를 표적하는 유용한 백신이 여전히 부족한 상황이다.
특히, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 매년 축산업에 상당한 손해를 끼치고 있다. 상기 바이러스는 대식세포(폐포 및 비장 내), 뇌 소교세포(microglia) 및 단핵세포를 감염시키며, 감염된 동물의 혈액 및 기관에 존재한다. 항체들은 상기 바이러스에 거의 영향을 못주고 심지어 바이러스의 돌연변이를 촉진한다. 항체 의존적 증강(ADE)의 메커니즘에 있어서, 항체의 사용은 더욱 심한 감염을 야기한다. 돼지의 약 50 내지 80%가 상기 바이러스에 감염된다. 일반적으로 상기 바이러스에 의해 감염된 동물은 심각한 증상은 없지만, 감염 동물의 면역이 감소한다. 이는 체중 감소와 2차 감염으로 인한 사멸율의 증가로 이어진다. PRRSV는 RNA 바이러스이다. 돼지 뿐만 아니라 오리들도 PRRSV에 의해 감염될 수 있다. PRRSV에 대한 약독화 생백신이 개발되었지만, 상기 생백신에서 바이러스의 돌연변이가 종종 일어난다. 다행스럽게도, HIV 백신 개발에 관한 최근 보고들은 세포독성 T-세포(CTL)가 HIV 감염을 조절하는데 필수적임을 강하게 시사하고 있다(Hanne G-S et al 2000, Journal of virology, vol. 74, No. 4. p. 1694-1703). 안전하고 효율적인 PRRS 백신의 개발이 절실히 요구된다.
그러므로, 전술한 문제점과 단점을 극복하기 위하여, 특히 바이러스 감염을 막기 위한 T-세포 백신의 개발이 필요하다.
본 발명은 리간드 부위, 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II, 항원 부위 및 카르복실 말단 부위를 포함하는 융합 항원을 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복실 말단 부위를 함유하는 표적 세포 특이적 융합 항원을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복시 말단 부위로 이루어지는 표적 세포 특이적 융합 항원을 제공한다.
나아가, 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 함유하는 표적 세포 특이적 융합 항원을 제공한다. 상기 항원 부위는 말 동맥염 바이러스(equine arteritis virus), 써코바이러스 타입 II, 인간 면역결핍 바이러스, 젖산 탈수소효소 증진 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 병원체(pathogen)로부터 유래한다.
아울러, 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복시 말단 부위로 이루어지는 표적 세포 특이적 융합 항원을 제공한다. 상기 항원 부위는 말 동맥염 바이러스(equine arteritis virus), 써코바이러스 타입 II, 인간 면역결핍 바이러스, 젖산 탈수소효소 증진 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 병원체로부터 유래한다.
본 발명은 융합 항원 백신에 관한 것으로서, 본 발명의 백신은 PRRS 바이러스 감염을 사라지게 하고, PRRS 바이러스로부터 유도되는 부작용을 줄이며, 세포면역 메터니즘을 유도하는 바, 동물을 면역화하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
정의
본 명세서에 사용된 용어들은 일반적으로 기술분야에서의 통상의 의미를 갖는다. 특정 용어들은 뒤에서 또는 명세서 중간에 검토되는데, 이는 당업자에게 부수적 가이드를 제공하기 위함이다. 편의를 위하여, 특정 용어들은 예를 들면 이탤릭체 및/또는 따옴표를 사용하여 부각될 수 있다. 상기 부각으로 인해 용어의 범주나 의미가 달라지는 것이 아니며, 부각 여부에 관계없이 동일한 의미를 갖는다. 동 일한 것이라도 하나 이상의 방식으로 불릴 수 있다. 결론적으로, 특정 용어에 대한 대체 용어나 동의어가 사용될 수 있으나, 이로 인하여 특별한 차이가 있는 것은 아니다. 본 명세서에서 특정 용어에 대한 동의어가 사용되지만, 이러한 사용으로 다른 동의어의 사용을 제외시키는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 일례의 용어들은 단순히 예시적인 것에 불과한 것으로서, 이로 인하여 본 발명이나 예시된 용어의 범주와 의미를 제한하는 것은 아니다. 이와 유사하게 명세서에 기재된 다양한 구체예에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 어긋나는 경우에는 본 명세서가 정리할 것이다.
본 명세서에 사용된 “약”은 일반적으로 특정 수치 또는 범주의 20 퍼센트 이내를 의미하며, 바람직하게는 10 퍼센트 이내, 보다 바람직하게는 5 퍼센트 이내를 의미한다. 본 명세서에 제시된 수치는 달리 언급이 없으면 약을 의미하는 것으로 추정할 수 있다.
본 발명은 항원 부위; 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 표적 세포의 소포체(ER) 막에 융합 항원이 머물 수 있게 하는 카르복실 말단 부위를 포함하는 표적 세포 특이적 융합 항원을 제공한다.
본 명세서에 사용된 “융합 항원(fusion antigen)” 은 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 재조합 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 융합 항원은 직 접적으로 면역 반응을 유발하기 위한 에피토프(epitope) 및 매개 전달(mediating delivery), 운송(transporting), 처리(processing), 및 발현과 같은 면역 반응을 증진시키기 위한 기타 부위 또는 다기능을 갖춘 기타 부위를 포함한다.
바람직하게는, 표적 세포는 항원 제시 세포이다. 보다 바람직하게는, 표적 세포는 T-세포, B-세포, 수지상 세포, 단핵세포 및 대식세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 “항원 부위(antigen moiety)”는 면역 반응을 일으킬 수 있는 펩타이드 단편을 의미한다. 본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 상기 항원 부위는 에피토프(epitope)이다. 본 발명에 따르면, 상기 항원 부위는 면역 반응을 상당히 활성화할 수 있는 병원종(pathogenic species)의 단백질이다. 예를 들면, 이러한 단백질에는 외피 단백질(coat protein), 핵단백질 또는 세포막 단백질이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항원 부위는 면역반응을 유발하는 능력을 증진시키기 위해, 보다 간편하게 제조하기 위해, 및 보다 쉽게 전달하기 위해 당업자에 의해 개질된 재조합 단백질뿐만 아니라 병원종으로부터 직접 클로닝된 펩타이드일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 부위는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 써코바이러스(circovirus) 타입 II, 또는 인간 면역결핍 바이러스로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 부위는 PRRSV ORF 1, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 하나의 구체예에 있어서, 상기 항원 부위는 PRRSV ORF 1b, 또는 M12 코로나-유사 도메인이다. 보다 심한 면역 반응을 유발하기 위하여, 상기 항원 부위는 적어도 하나의 항원 단위를 포함하 며, 인접한 항원 단위는 교량 영역(bridge region)에 의해 연결된다. 본 발명에 따르면, 상기 교량 영역은 면역계가 인식하는 것을 막기 위하여 면역 반응을 거의 유발하지 않는 작은 펩타이드 단편일 수 있다.
본 명세서에 사용된 “리간드 부위(ligand moiety)”은 일반적으로 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나, 상기 수용체를 인식할 수 있는 모든 분자를 의미한다. 상기 수용체들의 예로써 항체 수용체, 성장인자 수용체, 림포카인(lymphokine) 수용체, 호르몬 수용체 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 몇몇 구체예에 있어서, 상기 리간드 부위에 결합하는 수용체는 TGFα 수용체, IL2 수용체, IL4 수용체, IL 수용체, IGF1 수용체, CD4 수용체, IL18 수용체, IL12 수용체, EGF 수용체, LDL 수용체 및 α2-매크로글로불린 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 리간드 부위는 표적 세포의 세포막에 결합하는 능력이 있어 융합 항원이 표적 세포에 부착하게 한다. 면역계는 융합 항원이 표적 세포상의 수용체에 결합함으로써 개시된다. 바람직하게는, 상기 리간드 부위는 슈도모나스 외독소 A(Pseudomonas exotoxin A; PE) 결합 도메인 I이다. 슈도모나스 외독소 A(PE)는 613개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 상기 PE 분자에 대한 X선 결정학(crystallography) 연구와 돌연변이 분석 결과는 PE가 세 개의 도메인으로 구성됨을 보여준다: 아미노 말단 세포 수용체 결합 도메인(도메인 I); 중간 전위 도메인(middle translocation domain)(도메인 II); 카르복실 말단 활성 도메인(도메인 III)(US특허 5,705,163 참조).
본 명세서에 사용된 “슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I"은 슈도모나스 외 독소 A의 아미노 말단 세포 수용체 결합 도메인이나 이와 동등한 기능을 갖는 단편과 동일한 서열을 갖는 펩타이드 단편을 의미한다. 상기 슈도모나스 외독소 A의 아미노 말단 세포 수용체 결합 도메인은 도메인 Ia과 도메인 Ib로 명명된 2개의 하위 도메인을 포함한다. 도메인 Ia와 도메인 Ib의 배열은 세포 표면상의 LDL 수용체 또는 α2-매크로글로불린 수용체에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용된 “슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 II"는 슈도모나스 외독소 A의 중간 전위 도메인이나 이와 동등한 기능을 갖는 단편과 동일한 서열을 갖는 펩타이드 단편을 의미한다. 상기 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II는 융합 항원을 표적 세포의 세포질로 전위시키는 능력을 가지고 있다. 융합 항원은 표적 세포막에 부착한 후 표적세포로 전위된다.
본 명세서에 사용된 “융합 항원이 표적 세포의 소포체(ER)막에 머물수 있게 하는 카르복실 말단 부위”는 융합 항원이 소포체 막에 결합하게 하고, 글리코실화(glycosylation)를 위해 융합 항원을 소포체 루멘에 머물게 하여 외래 단백질과 유사하게 보이도록 하는 펩타이드 단편을 의미한다. 본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 상기 카르복실 말단 부위는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단 방향으로 다음의 아미노산 잔기를 포함한다:
R1-R2-R3-R4-(R5)n
R1은 양전하를 띠는 아미노산 잔기이고;
R2는 음전하를 띠는 아미노산 잔기이며;
R3은 음전하를 띠는 아미노산 잔기이고;
R4는 L이며;
R5는 양전하를 띠는 아미노산 잔기이며;
n은 0 또는 1이다.
바람직하게는, 상기 카르복실 말단 부위는 KDEL 계열 단백질 중 하나이다. 본 명세서에 사용된 “KDEL 계열(family) 단백질”은 세포의 소포체 막에 결합하는 유사한 카르복실 말단을 가지며, 나아가 상기 단백질이 소포체 루멘 내에 머물게하는 능력을 갖는 일군(群)의 단백질을 의미한다. 일반적으로, 카르복실 말단은 4 내지 16개의 잔기 길이를 갖는다. 미국특허번호 5,705,163에 검토된 바와 같이, KDEL 계열 단백질의 카르복실 말단에 있는 아미노 잔기, 특히 마지막 5개 아미노산의 아미노 잔기가 중요하다. 다른 분자들에 존재하고 특정 생물학적 기능을 수행하는 유사 서열에 관한 연구에서 알려진 바와 같이, 새롭게 형성된 단백질을 소포체에 머물게 하는 서열은 Lys Asp Glu Leu(KDEL)(서열번호 9)이다. 이러한 발견들은 본 발명에 따른 융합 항원의 카르복실 말단에 존재하는 서열이 인지 서열(recognition sequence) 형태로 작용하여 융합 항원이 세포 내부에서 소포체로 전위되는 것과 루멘에 머물게 하는 것을 돕는다는 것을 보여준다. 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 카르복실 말단 부위는 KDEL 서열(서열번호 9)을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 상기 카르복실 말단 부위는 KKDL-RDEL-KDEL(서열번호 5), KKDELRDELKDEL(서열번호 6), 또는 KKDELRVELKDEL(서열번호 7), 또는 KKDEL-RXEL-KDEL 서열을 포함한다(단, 상기 서열 중 R은 D 또는 V임).
본 발명은 MHC class I 분자와 결합하여 T-세포에 의해 인식되도록 하기 위하여, 융합 항원이 표적 세포의 소포체에서 가공되도록 하는 카르복실 말단 부위를 설계하는데 특징이 있다. 본 발명에 따른 융합 항원은 세포 매개성 면역 반응을 유발하는데 유용하다.
본 발명에 따르면, 융합 항원은 동물의 면역화(immunization)에 사용된다. 본 발명의 목적은 융합 항원 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 데 있다. 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 T-세포 백신이다.
본 명세서에 사용된 “T-세포 백신”은 세포 매개성 면역 반응을 활성화시킴으로써 대상(subject)의 감염을 예방할 수 있는 백신을 의미한다. 상기 T-세포 백신의 결정적 역할은 세포독성 T-세포(또한, 세포독성 T 림프구, CD8+T-세포, 및 CTL로 알려짐)와 기억(memory) T-세포(Tcm 및 Tem)이다.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는 동물의 면역화 방법을 제공한다:
(a) 항원 부위, 표적 세포상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위, 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II, 및 융합 항원이 표적 세포의 소포체 막에 머물 수 있게 하는 카르복실 말단 부위를 포 함하는 표적 세포 특이적 융합 항원을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 융합 항원을 동물에게 접종하는 단계.
상기 방법 중 단계 (b)에서, 융합 항원의 접종은 당업자에게 알려진 어떤 방법으로 수행하여도 무방하다. 예를 들면, 주사(injection) 또는 경구 백신(oral vaccine)의 형태로 융합 항원을 전달할 수 있다. 필요한 경우 예방 접종(booster shot)을 추가할 수 있다. 바람직하게는, 감염되기 전에 접종을 수행한다. 더 좋은 면역성을 얻기 위하여, 상기 융합 항원을 새로 태어난 동물이나 심지어 배아에 접종할 수 있다.
본 발명에 따르면, 면역 반응 과정 중 다음의 작용이 일어난다:
(c) 융합 항원을 표적 세포에 부착시키기 위해, 표적 세포막이 리간드 부위에 결합한다;
(d) 융합 항원이 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II에 의해 표적 세포의 세포질로 전위된다;
(e) 융합 항원이 소포체 루멘에 머물게 하기 위하여, 표적 세포의 소포체 막이 융합 항원의 카르복실 말단 부위에 결합한다;
(f) 항원 부위가 소포체 루멘에서 가공된다.
(g) 상기 가공된 항원 부위가 MHC class I 분자와 결합한다;
(h) 상기 가공된 항원 부위가 MHC class I 분자에 의하여 표적 세포 표면으로 이동한다;
(i) MHC class I 분자에 의해 이동한 상기 가공된 항원 부위가 면역 메시지 를 얻기 위하여 CD8+ T-세포에 의해 인식된다; 및
(j) 상기 면역 메시지가 동물의 면역화를 위하여 기억 T-세포에 의해 저장된다.
작용 (c)에서, 융합 항원이 표적 세포에 부착되도록 융합 항원의 리간드 부위가 융합 항원이 표적 세포 막 상의 수용체에 결합하게 한다.
작용 (d)에서, 융합 항원이 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II에 의해 표적 세포의 세포질로 전위된다. 상기 전위로 융합 항원이 표적 세포로 들어가게 된다.
작용 (e)에서, 융합 항원의 가공을 위해 융합 항원이 소포체 루멘에 머물게 하기 위해서, 카르복실 말단 부위가 표적세포의 소포체 막에 결합한다.
작용 (f)에서, 항원 부위가 소포체 루멘에서 가공된다. 상기 가공은 소포체 루멘 내의 효소에 의한 글리코실화 및 적절한 소화와 같은 항원 개질(modification)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
작용 (g)에서, 상기 가공된 융합 항원은 MHC class I 분자에 결합할 수 있다. MHC class I 분자 자체는 불완전한 폴딩(folding) 단백질로 많은 샤페론(chaperone)에 결합한다. 가공된 융합 항원은 펩타이드-결합 틈새(cleft)에 결합하여 폴딩을 완성하고 샤페론의 방출을 자극한다.
작용 (h)에서, 상기 가공된 항원 부위는 MHC class I 분자에 의해 표적 세포 표면에 제시된다. 폴딩된 MHC class I 분자와 가공된 항원 부위가 세포 표면으로 전달된다.
작용 (i)에서, MHC class I 분자에 의해 이동된 가공된 항원 부위는 세포 독성 T-세포의 인식과 또한 기억 T-세포로의 메세지 저장을 위한 면역 메시지를 얻기 위하여, CD8+ T-세포에 의해 인식된다. 상기 기억 T-세포의 예로서 Tcm과 Tem 세포가 있다.
작용 (j)에서, 면역 메시지가 동물의 면역화를 위해 기억 T-세포에 의해 저장된다. 융합 항원으로 면역화된 동물이 동일한 항원에 다시 감염되는 경우, 기억 T-세포는 단시간에 강한 면역 반응을 유발한다. T-세포 백신은 표적 세포의 소포체 루멘에서 가공될 수 있는 내생 가공 항원을 제공한다.
하나의 관점에서, 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복실 말단 부위를 함유하는 표적 세포 특이적 융합 항원에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복실 말단 부위로 이루어지는 표적 세포 특이적 융합 항원에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복실 말단 부위를 함유하는 표적 세포 특이적 융합 항원에 관한 것이다. 상기 항원 부위는 말 동맥염 바이러스(equine arteritis virus), 써코바이러스 타입 II, 인간 면역결핍 바이러스, 젖산 탈수소효소 증진 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 병원체(pathogen)에서 유래한 것이다.
나아가, 또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 항원 부위; (b) 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복실 말단 부위로 이루어지는 표적 세포 특이적 융합 항원에 관한 것이다. 상기 항원 부위는 말 동맥염 바이러스(equine arteritis virus), 써코바이러스 타입 II, 인간 면역결핍 바이러스, 젖산 탈수소효소 증진 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 병원체에서 유래한 것이다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 항원 부위는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) ORF1b로부터 유래한다. 상기 항원 부위는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 항원 부위는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 단편의 번역 산물인 폴리펩타이드를 포함한다. 나아가, 본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 항원 부위는 PRRSV Nsp10 및 Nsp11로부터 유래한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 리간드 부위는 슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 카르복실 말단 부위는 KKDELRXELKDEL 아미노산 서열(단, X는 V 또는 D임)을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 카르복실 말단 부위는 제한효소 부위 연결기(restriction site linker)를 통하여 항원 부위에 연결될 수 있다.
또한, 다른 관점에서, 본 발명은 위에서 언급한 융합 항원과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 (a) PRRSV ORF1b 유래의 항원 부위; (b) 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복실 말단 부위를 포함하는 제1 융합 단백질을 함유한다. 상기 약학적 조성물은 표적 세포 특이적 제2 융합 항원을 추가로 포함할 수 있는데, 상기 제2 융합 단백질은 (a) PRRSV ORF7 유래의 항원 부위; (b) 표적 세포 상의 수용체에 반응 또는 결합하거나 상기 수용체를 인식할 수 있는 수 있는 리간드 부위; (c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및 (d) KDEL 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 카르복실 말단 부위를 포함한다.
또한, 다른 관점에서, 본 발명은 병원체 감염 억제를 위한 동물에서의 면역 반응 유도 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 위에서 언급한 약학적 조성물 중 하나를 제조하는 단계; 및 (b) 융합 항원을 동물에게 접종하여, 면역반응이 항원 부위 유래 병원체를 억제하게 하는 단계. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 방법은 특히 항원 제시 세포를 표적하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 상기 표적 세포는 T-세포, B-세포, 수지상 세포, 단핵세포 및 대식세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
하기에 본 발명의 구체예에 따른 예시적 기구, 장치, 방법 및 결과가 제시되어 있으나, 이로써 본 발명의 범주가 제한되는 것은 아니다. 실시예에 제목 또는 소제목이 사용되나, 이로써 본 발명의 범주가 제한되어서는 안된다. 나아가, 특정 이론이본 명세서에 제시되어 있지만, 이로 인하여 본 발명의 범주가 제한되서는 안된다.
실험 방법
플라스미드 제조
pPE-M12-K13
플라스미드 pPE-M12-K13은 항원 부위로서 코로나 유사 도메인 M12, 리간드 부위 및 전위 부위로서 PE(△III), 및 카르복실 말단 부위로서 K13을 함유하고 있다. 상기 M12 도메인 서열은 PRRSV ORF1b 유전자 내에 위치해 있다. 상기 PRRSV ORF1b 서열은 EMBL/GenBank 데이터베이스 acession no. M96262로부터 추출되었다. 서브클론된 M12 단편은 PRRSV Nsp10(C-말단 도메인 서열) 및 Nsp11(N-말단 도메인 서열)로부터 유래하였다. PRRSV M12(또는 ORF1b 서브클론된 단편) 항원 부위는 표 1에 기재된 특이적 프라이머를 이용하여 합성되었다. pPE-M12-K13 플라스미드를 제조하기 위하여, 10805~11297 뉴클레오티드의 PRRSV ORF1b DNA 단편을 AatII 및 EcoRI 부위로 삽입하여 pPE-K13 플라스미드로 서브클론하였다. 도 1a는 M12 및 K13의 단백질 단편을 나타내며, 제한 효소 부위는 진하게 나타내었다. 도 1a 단백질 단편에 상응하는 3글자 아미노 서열을 도 1b(서열번호 1)에 나타내었고, K13 서열은 밑줄과 진한색으로 나타내었으며, 제한효소 부위와 Xho1과 K13 서열간의 짧은 교량(bridge)은 진한 이탤릭체로 표시하였다. 도 2는 M12(즉, PRRS Nsp10 및 Nsp11 유전자)와 K13을 포함하는 M12-K13 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)를 나타낸다. 도 3은 pPE-K13 플라스미드를 나타내고, 도 4는 M12 도메인(즉, 코로나 유사 도메인)을 포함하는 pPE-M12-K13 플라스미드를 나타낸다.
pPE-K13
pPE-K13 플라스미드는 리간드 부위와 전위 부위로서 PE(△III) 및 카르복실 말단 부위로서 K13을 함유하고 있다(도 3). 도 3에서 PE로 표시한 PE(△III)는 슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I과 전위 도메인 II를 포함하였다. pPE(△III) 플라스미드는 미국특허공개번호 2004/0247617에 이미 기술된 방법에 따라 제조하였다.
K13 카르복실 말단 부위는 AAAAAAGACGAACTGAGAGA TGAACTGAAAGACGAACTG(서열번호 8)에 의해 코딩되는 KKDELRVELKDEL 펩타이드 서열(서열번호 7)을 포함한다. 상기 K13 단편은 전술한 미국특허공개에 기재된 방법을 조금 변형하여 제조하였다. 요약하면, SalI 부위-KKDELRVELKDEL-정지코돈-XhoI-EcoRI 서열을 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드를 연속적인 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여 합성하였다. 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 SalI 및 EcoRI으로 절단하고 나서 젤 전기영동과 전기용출(electroelution)에 의해 정제하였다. 상기 정제된 SalI-EcoRI DNA 단편을 pPE에 라이게이션하여 pPE-K13 플라스미드를 형성하였다.
pPE-DgD-K13
PE-DgD-K13을 코딩하는 플라스미드를 미국 특허출원번호 10/457,574에 기재된 방법을 약간 변형하여 제조하였다. 요약하면, pET15-H6-PE(△III) PRRS7-DgD 및 pPE-K13 두 개의 플라스미드를 PstI 및 XhoI으로 절단하여 각각 PE(△III)PRRS7-DgD를 함유하는 단편과 카르복실 말단 부위를 함유하는 단편을 생성하였다. 상기 두 개의 단편을 정제하고 T4 리가아제(ligase)에 의해 라이게이션하여 pET23-H6-PE(△III)-DgD-K13(pPE-DGDK13 또는 pPE-DgD-K13으로 명명)을 제조하였다. pET23-K3, pET-K13, 또는 pPE(△III)-K13 플라스미드 모두 KDEL 서열을 포함한다.
pPE-ORF5-K13
PE-ORF5-K13을 코딩하는 플라스미드를 이전에 기술한 방법에 따라 제조하였 다. 요약하면, PRRSV ORF5 유전자를 pPE(△III)-K13에 삽입하여 pPE-ORF5-K13을 제조하였다.
융합 항원 발현 및 정제
융합 단백질인 PE-ORF5-K, PE-DgD-K13 또는 PE-M12-K13의 발현을 위한 융합 항원 플라스미드로 형질전환된 E.coli(BL21(DE3)pLys 세포)를 앰피실린(100~500 ppm)을 함유하는 루리아 버타니 배지에서 37℃ 하에서 배양하였다. E.coli 배양이 초기 log phase(A600=0.1~0.4)에 도달한 후, 유도를 위해 이소프로필-1-티올-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종농도 0.5mM으로 배양에 첨가하였다. 2시간 후에 세포를 회수하고, 즉시 -70 ℃에 보관하였다. 융합 항원은 종래 기술된 요소 추출법(Liao et al., 1995, Appl. Microbiol Biotechnol. 43:498-507)에 의해 부분적으로 정제하였다. 변성 조건하에서, 6His tag을 함유하는 상기 융합 항원 분자들을 eNi-NTA 매트릭스(Ni-NTA 아가로스; QiagenTMInc. CA)와의 결합을 개선하기 위하여 완전히 노출시켰다. 정제 효율은 비특이적 결합 가능성을 낮춤으로써 최대화되었다. 변성조건하에서 E.coli 세포 배양으로부터 6His 태그를 갖는 융합 항원을 정제하는 방법은 다음과 같다.
50% Ni-TNA 슬러리 1mL을 4 mL의 용해물(lysate)에 첨가하고, 용해물-수지 혼합물을 형성하기 위하여 상온에서 60분 동안 천천히 교반(예를 들면, 200 rpm)하여 혼합하였다. 상기 용해물-수지 혼합물을 하단부 마개가 부착된 빈 컬럼에 조심 스럽게 로딩하였다. 그리고 나서 유출액(flow-through solution)을 회수하기 위하여, 하단부 마개를 제거하였다. 상기 컬럼을 4 mL의 세척 버퍼(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCL, 8 M 요소, pH 5.9)로 2회 세척하였다. 0.5 mL, pH 5.9 용출 버퍼(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8M 요소, pH 5.9)로 4회, 0.5mL, pH 4.5의 용출 버퍼(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8M 요소, pH 4.5)로 4회 용출시켜 단백질을 회수하였다. 회수된 분획을 모아 SDS-PAGE 젤 전기영동에 의하여 분석하였다. 표준 BSA 단백질을 이용하여 정량 분석을 수행하였다.
프라이머 서열번호 서열
*M12-F1 10 5‘-TGG CCG GTG GTG TCA ACC CAG AAC AAT GAA AAg TGG CCG GAT CGT CTG-3'
*M12-F2 11 5'-CAG TTT GCC AAA CTC CCA ATA GAA CTT GCA CCA CAC TGG CCG GTG GTG TCA-3'
M12-F3 12 5'-AAC TTG GGT TTT TAT TTT TCA CCT GAC TTG ACA CAG TTT GCC AAA CTC-3'
M12-F4 13 5'-GGG TCG AGC TCT CCG CTC CCG AAG GTC GCA CAC AAC TTG GGT TTT TAT-3'
M12-F5 14 5'-TCT CTC CGC GCC ATT TGT GCT GAT CTG GAA GGG TCG AGC TCT CCG-3'
M12-F6 15 5'-GAT AAA TTT CGT GCC ACA GAC AAG CGT GTT GTA GAT TCT CTC CGC GCC ATT-3'
M12-F7 16 5'-ACG GTT GCT CAG GCT CTG GGC AAC GGG GAT AAA TTT CGT GCC-3'
M12-F8 17 5'-CCC CCC GAC GTC AAT AAC AAA GAA TGC ACG GTT GCT CAG GCT-3'
M12-R1 18 5'-GCG GCT GTA TTT GTC GAG AGG GCG AAG GCT GGC AAC CAG ACG ATC CGG CCA-3'
M12-R2 19 5'-AGG GCC CAC CAT ATA GCC GGC ACC GAT GCA CGC GCG GCT GTA TTT GTC-3'
M12-R3 20 5'-GTA TGA CAC GAC CCC TGG AGT GCC CAG AAA CAC CGA AGG GCC CAC CAT ATA-3'
M12-R4 21 5'-AGC CTC GCC CTT AAC AAA CTT TGT GAG ATA GTA TGA CAC GAC CCC-3'
M12-R5 22 5'-TCG GCC GGT ACT GAA GAC CGT TTC CGG AAG CAC TTG AGC CTC GCC CTT AAC-3'
M12-R6 23 5'-G ATA TTC ACG GCA GTCTAC CTC AAT TCG GCC GGT ACT GAA-3'
M12-R7 24 5'-A CGC AGC AAC TTc TCG CTC ACG ATC ATC AAG ATA TTC ACG GCA GTC-3'
M12-R8 25 5'-TTT TTT CTC GAG GAA TTC GTG TGG GAG GGA CGC AGC AAC TTC TCG-3'
*M12-F1 및 M12-R1은 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 첫 번째 쌍을 의미한다;
M12-F2 및 M12-R2는 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 두 번째 쌍을 의미한다.
실시예 1: PRRSV 융합 항원에 의한 세포 매개성 면역 반응의 유도
본 발명은 동물에서의 세포 매개성 면역 반응을 유도하는 특성을 갖는 PRRS 바이러스 단백질 내의 항원 또는 에피토프 영역을 밝히고, 상기 항원을 이용하여 면역계를 유도함으로써 충분한 양의 IFNγ 및 TNFα를 생산하고, T 세포 면역 및 세포독성 T 세포 경로를 활성화함으로써, 동물을 면역화하기 위한 백신인 융합 항원을 생성하는데 초점을 맞추고 있다. 융합 항원 PE-DgD-K13(또는 PE-PRRSV ORF7) 및 PE-M12-K13은 세포 매개성 면역 메커니즘을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 면역화된 마우스 실험 모델에서, 비장 세포는 PE-DgD-K13 및/또는 PE-M12-K13에 의한 유도된 세포 면역 메커니즘을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. PE-M12-K13 및 PE-DgD-K13으로 각각 면역화된 마우스는 대조군과 비교하여 볼 때, IFNγ와 TNFα의 분비를 증가시켰다. ORF5와 ORF6 N-말단-K13을 포함하는 융합 항원 PE-PQGAB-K13은 IFNγ와 TNFα 분비 유도에 있어 거의 영향을 주지 않았다(도 5 및 6).
ORF1b 유전자는 증식 이전의 바이러스의 복제에서 중요한 역할을 한다. 융합 항원 PE-DgD-K13 또는 PE-DgD-K3 및 PE-M12-K13 또는 PE-M12-K3은 PRRSV 백신으로서 가장 중요한 주성분일 것이다.
종래 PRRSV 연구 및 혈액 샘플 테스트에 따르면, PE-DgD-K3은 새끼 돼지의 면역 보호를 활성화시키고, 새끼 돼지를 바이러스 감염으로부터 예방할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 2: PRRS 융합 항원의 투여량
1 mg의 항원을 1, 2 또는 5주령의 새끼 돼지에 총 3회의 면역화로 투여하였다. 마지막 면역화 후 2주째에 특이적 항체인 IgG, IgA, 및 IgM의 항체가(antibody titer)를 측정하였다. 상기 항체가가 2회 면역화 후 피크에 도달할 수 있음이 밝혀졌다. 3회 면역화 후 항체가는 2회 면역화의 것과 많은 차이를 보이지 않았다.
새끼 돼지에 융합 항원 PE-M12-K13을 포함하는 백신 조성물 0.05~0.5 mg, 바람직하게는 0.1~0.3 mg을 투입시, 2차 면역화 후 충분한 항체 반응이 유도되었고, 항체는 3차 면역화 후 피크에 도달하였다.
실시예 3: PE-M12-K13 및 기타 융합 항원을 혼합한 백신 조성물에 의한 PRRS 바이러스 보호
동물
SPF 농장에서 주기적으로 PRRSV 검사를 받고 RT-PCR에 의해 바이러스가 없다고 밝혀진 돼지를 선별하였다. 실험에 앞서, 상기 SPF 농장의 암퇘지에 대하여 바이러스 감염이 없는 것을 확인하였다. 또한, index-RRRS 진단 시약 테스트 결과, SPF 암퇘지는 음성을 나타내었다.
RNA 추출
동물에서의 PRRSV의 존재를 탐지하기 위하여, 혈장 부분을 모아 RT-PCR 용 NUCLEOSPIN RNA IITM 키트(Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 요약하면, 350 μL의 RA1 용액과 3.5 μL의 β-머캡토-에탄올을 100 μL의 혈장 부분에 첨가하였다. 점도가 감소하고 여과에 의해 용해물이 맑아지면, 이 후, 상기 용해물을 70% 에탄올 350 μL와 혼합하였다. 원심분리에 의해 NucleospinTM RNA 컬럼에 RNA를 흡착시키고, 이후 세척하였다. DNA 절단을 위해 상기 컬럼에 95 μL의 DNase 용액을 적용하였다. 수차례 세척 및 원심분리를 반복한 후, 60 μL의 RNase가 없는 물로 RNA를 용출하였다.
바이러스의 RT-PCR 검출
동물에서의 PRRSV RNA의 존재를 검출하기 위하여 원스텝 RT-PCR 키트(Qiagen Inc. Calif.)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 293bp 단편을 합성하기 위하여, 정방향 프라이머 5‘-CCA GCC AGT CAA TCA GCT GTG-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5’-GCG GAT CAG GCG CAC-3'(서열번호 4)를 제조하였다. 아가로스 젤 전기영동에 의한 RT-PCR의 검출한계는 약 PRRSV 10 copy였다(TCID50/mL).
면역화(immunization)
SPF 농장내의 3~4마리의 암퇘지로부터 새로 태어난 새끼 돼지를 선발하고, 각각을 동정하며, 무게를 측정하고, 성별을 확인하였다. 새끼 돼지들을 무작위로 6개군으로 나누었고, 각 군에는 각 암퇘지로부터 5 또는 6마리의 새끼돼지를 포함하도록 하였다. 체중에 근거하여, 새끼 돼지에게 하나 이상의 융합 항원(즉, 조합 또는 비조합) 또는 부형제를 포함하는 백신 조성물을 접종하였다. 면역화는 1 mL의 ISA206(SEPPIC, France)에 유화된 융합 항원 1 mL(1회 투여당 50~100 μg의 각 항원 성분 포함)를 함유하는 백신 조성물 2 mL을 각각 4일째와 18일째의 젖먹이 단계에 근육내 주사하여 2회 수행하였다. 대조군은 면역화 없이 양육시켰다. 젖을 떼는 단계(약 3~4주령)에서, 각 군을 에어콘과 순환장치가 갖취진 개별 분리실로 옮겼다.
PRRSV 면역테스트
마지막 백신접종 후 2주째에 새끼 돼지를 케타마인(100 mg, 근육내 주사)과 2% 리도카인(1 mL, 비강내 점적)으로 기침-반사를 억제한 후 비강내로 PRRSV로 면역 테스트를 하였다. MD1 PRRSV 균주 1 mL 당 1×107 50% 조직 배양 감염 투여량(TCID50)을 함유하는 접종물 1 mL를 비강내 경로로 투여하였다. 각 군당 5마리의 새끼돼지들을 면역 테스트하였다.
바이러스 면역 테스트 후 RT-PCR
바이러스 면역 테스트 후 혈액 내의 PRRSV 수치를 검출하기 위하여, 이차 면역화 후 2주째에 새끼돼지의 혈액 백혈구 샘플(전혈로부터 분리된 부은 cord 층)을 RT-PCR로 분석하였다. 상기 샘플은 PRRSV 검출을 위해 면역 테스트 후 3, 7 및 14일에 다시 RT-PCR로 분석하였다.
결과
바이러스 면역 테스트 이전에, 모든 새끼 돼지들은 PRRSV에 대한 RT-PCR 혈액 샘플 테스트에서 음성을 나타내었다. 따라서, PRRSV 면역 테스트 이전에 대조군에서는 어떠한 바이러스 감염도 일어나지 않았다. PRRSV 면역 테스트 5일 후(DPI-5), 대조군의 새끼 돼지들이 혈액 샘플에서 바이러스 감염을 보이기 시작했다. PRRSV 면역 테스트 약 2주후, 대조군의 모든 새끼 돼지들이 바이러스 감염을 나타내었다(표 2, BK-1 내의 5마리 중 5마리; BK-2 내의 6마리 중 6마리). 바이러스 감염은 오랫동안 검출되었다. 새끼돼지 혈액 샘플이 PRRSV 면역 테스트 2주 후 바이러스 감염을 갖는지 여부는 백신의 효율을 평가하는데 있어 중요한 지수였다. 바이러스 감염이 없다는 것은 백신이 효율적임을 나타내는 것이다. 특히, PE-M12-K13, PE-ORF5-K13 및 PE-DgD-K13의 혼합물을 함유하는 백신 조성물을 접종한 군은 단지 6마리 중 1마리만이 혈액 샘플에서 PRRSV 양성으로 나타났다. PE-M12-K13으로 접종한 몇몇 군은 표 2에 나타낸 바와 같이, 바이러스 면역 테스트 후 14일째에 바이러스 감염이 사라지기 시작했다.
표 2는 각 군의 PRRSV 면역 테스트 후의 결과를 나타낸다. PE-M12-K13으로 접종한 새끼 돼지들은 3마리 중 1마리가 PRRSV 면역 테스트 후 7일째에 바이러스 감염을 나타내었지만, 21일째에는 사라졌다. PE-M12-K13, PE-DgD-K13 및 PE-ORF5-K13의 혼합 조성물 접종시, 면역 테스트 후 7일째에 6마리 중 1마리가 바이러스 감염을 나타내었고, 21일째에 사라졌다. PPE-DgD-K13(또는 -K3) 및 PE-M12-K13(또는 -K3)은 동물 보호에 있어 효과적이지만, PE-ORF5-K13(또는 -K3)은 이 경우 추가적 보호에 기여하지 않는 것으로 보인다.
SPF 새끼돼지 모델에서 PRRSV 면역 테스트 후 바이러스 감염 검증 결과
실험 번호 백신 조성물 새끼 돼지 수 DPI-2 DPI-7 DPI-14 DPI-21
No. 1 *BK-1 5 1 3 5 2
No. 1 PE-M12-K13 5 2 1 1 0
No. 2 BK-2 6 1 3 6 4
No. 2 PE-DgD-K13, PE-M12-K13, PE-ORF5-K13 6 0 1 1 0
*“BK"는 백신 접종하지 않은 대조군을 의미한다.
실시예 4: PRRSV 면역 테스트에 의한 폐 발병기전
ANOVA 테스트에 의해 백신 접종한 군과 백신 접종하지 않은 군 간의 간질성 폐렴 지수의 차이에서의 통계적 유의성을 결정하였다. 통계 분석 결과 하나의 단일 PE-PRRSV 융합 단백질인 PE-M12-K13을 함유하는 백신 조성물로 접종한 동물들은 폐 조직 절개에서 약한 정도의 간질성 폐렴 심각도를 나타내었다.
하나 이상의 단일 PRRSV 융합 항원을 포함한 백신 조성물과 관련하여, PE-DgD-K13 및 PE-M12-K13의 혼합물을 포함하는 백신조성물에 관한 연구 결과, 상기 조성물이 폐 증후군으로부터 보호하는데 효과적임을 보여주었다.
결론적으로, PE-M12-K13을 포함하는 백신 조성물은 다음의 특징을 가진다는 것이 증명되었다:
I. 효과적인 바이러스 감염 사라짐 작용을 가짐
II. 다른 PRRSV 구조 단백질을 함유하고 있지 않은 백신 조성물은 PRRS 바이러스에 의해 유도되는 부작용을 줄이는데 효과적이었다.
III. 세포 면역 메커니즘을 유도하는 능력. ORF1b를 이용함으로써, 융합 단백질 항원 PE-M12-K13이 생성되었고, 바이러스 감염을 제거하는데 효과적인 사이토카인 INFγ와 TNFα가 생성되도록 동물을 유도하는데 효율적임을 보여주었다.
전술한 본 발명의 예시적 구체예는 단순히 예시하기 위한 목적에서 제시한 것으로 본 발명을 특정 형태로 제한하기 위한 것이 아니다. 이런 관점에서 다양한 변형이 가능할 것이다.
구체예와 실시예는 본 발명의 원리와 이들의 적용을 설명하여 당업자가 본 발명과 다양한 구체예를 이용하도록 선택되고 기재되었으며, 특정용도로 적절히 변형될 수 있다. 구체예에 대한 대안 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 한, 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 명세서와 예시적 구체예보다는 청구범위에 의해 한정될 것이다.
도 1a는 PRRSV ORF 1b가 클로닝된 Nsp 11 단편(10805~11297개의 뉴클레오티드, 위쪽) 및 K13이 합쳐진 Nsp10 및 Nsp11 단백질 단편의 상응하는 아미노산 서열(아래쪽)을 나타낸 것이다.
도 1b는 도 1a(서열번호 1)의 단백질 단편에 상응하는 3글자 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 M12-K13 DNA 단편(서열번호 2)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 플라스미드 pPE-K13 지도를 나타낸 것으로, 지도 내의 PE는 PE(△III)을 나타낸다.
도 4는 플라스미드 pPE-M12-K13 지도를 나타낸 것으로, PE는 PE(△III)을 나타낸다.
도 5는 면역 마우스의 비장세포(spleenocyte)에서 융합 항원인 PE-M12-K13 및 PE-DgD-K13에 의한 항원-특이적 IFNγ 분비의 유도를 나타낸 것이다.
도 6은 면역 마우스의 비장세포(spleenocyte)에서 융합 항원 PE-M12-K13 및 PE-DgD-K13에 의한 항원-특이적 TNFα 분비의 유도를 나타낸 것이다.
<110> HealthBanks.Co., Ltd. <120> FUSION ANTIGEN USED AS VACCINE <130> 8fpi-10-05 <150> US <151> 2007-11-30 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRRSV ORF1b M12 domain (partial Nsp10 and Nsp11) plus K13 <400> 1 Asp Val Asn Asn Lys Glu Cys Thr Val Ala Gln Ala Leu Gly Asn Gly 1 5 10 15 Asp Lys Phe Arg Ala Thr Asp Lys Arg Val Val Asp Ser Leu Arg Ala 20 25 30 Ile Cys Ala Asp Leu Glu Gly Ser Ser Ser Pro Leu Pro Lys Val Ala 35 40 45 His Asn Leu Gly Phe Tyr Phe Ser Pro Asp Leu Thr Gln Phe Ala Lys 50 55 60 Leu Pro Ile Glu Leu Ala Pro His Trp Pro Val Val Ser Thr Gln Asn 65 70 75 80 Asn Glu Lys Trp Pro Asp Arg Leu Val Ala Ser Leu Arg Pro Leu Asp 85 90 95 Lys Tyr Ser Arg Ala Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Met Val Gly Pro Ser 100 105 110 Val Phe Leu Gly Thr Pro Gly Val Val Ser Tyr Tyr Leu Thr Lys Phe 115 120 125 Val Lys Gly Glu Ala Gln Val Leu Pro Glu Thr Val Phe Ser Thr Gly 130 135 140 Arg Ile Glu Val Asp Cys Arg Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Glu Arg 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for RT-PCR detection of PRRSV in blood sample <400> 3 ccagccagtc aatcagctgt g 21 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RT-PCR detection of PRRSV in blood sample <400> 4 gcggatcagg cgcac 15 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a carboxyl terminal moiety sequence of the PRRSV fusion antigens in Examples <400> 5 Lys Lys Asp Leu Arg Val Glu Leu Lys Asp Glu Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a carboxyl terminal moiety sequence of the PRRSV fusion antigens in Examples <400> 6 Lys Lys Asp Glu Leu Arg Asp Glu Leu Lys Asp Glu Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a carboxyl terminal moiety sequence of the PRRSV fusion antigens in Examples <400> 7 Lys Lys Asp Glu Leu Arg Val Glu Leu Lys Asp Glu Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a carboxyl terminal moiety sequence of the PRRSV fusion antigens in Examples 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Claims (26)

  1. 하기 a) 내지 d)를 모두 포함하고, 표적 세포인 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)에 특이적인 융합 항원:
    a) 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRSV) ORF 1b에서 유래한 항원 부위;
    b) 슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I;
    c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및
    d) 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 카르복실 말단 부위.
  2. 하기 a) 내지 d)를 모두 포함하고, 표적 세포인 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)에 특이적인 융합 항원:
    a) 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRSV) ORF 1b에서 유래한 것으로서, 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 갖는 DNA 단편의 번역 산물인 폴리펩티드를 포함하는 항원 부위;
    b) 슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I;
    c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및
    d) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열 및 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 카르복실 말단 부위.
  3. 제 1항 및 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 부위는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 항원.
  4. 삭제
  5. 제 1항 및 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카르복실 말단 부위는 제한효소 부위 연결기를 통하여 항원 부위에 연결된 것을 특징으로 하는 융합 항원.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 하기 a) 내지 d)를 모두 포함하고, 표적 세포인 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)에 특이적인 융합 항원:
    a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 항원 부위;
    b) 슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I;
    c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및
    d) 서열번호 6로 기재되는 아미노산 서열, 서열번호 7으로 기재되는 아미노산 서열 및 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 카르복실 말단 부위.
  15. 제 1항 및 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포는 수지 세포, 대식세포, B-세포 및 단핵구로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 융합 항원.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제 1항 및 제 14항 중 어느 한 항의 융합 항원과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, PRRSV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 하기 a) 내지 d)를 모두 포함하고 표적 세포인 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)에 특이적인 제 2의 융합 항원을, 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
    a) PRRSV ORF7에서 유래한 항원 부위;
    b) 슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I;
    c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및
    d) 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 카르복실 말단 부위.
  22. 삭제
  23. 제 1항 및 제 14항 중 어느 한 항의 융합 항원과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 인간을 제외한 동물에서 PRRSV 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학적 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 융합 항원은 B-세포, 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포로 이루어진 항원 제시 세포군에서 선택된 어느 하나의 표적 세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  25. 제 23항에 있어서, 하기 a) 내지 d)를 모두 포함하고 표적 세포인 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)에 특이적인 제 2의 융합 항원을, 추가적으로 포함하는 약학적 조성물:
    a) PRRSV ORF7에서 유래한 항원 부위;
    b) 슈도모나스 외독소 A 결합 도메인 I;
    c) 슈도모나스 외독소 A 전위 도메인 II; 및
    d) 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 카르복실 말단 부위.
  26. 제 25항에 있어서, 융합 항원 및 제 2의 융합 항원은 B-세포, 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포로 이루어진 항원 제시 세포군에서 선택된 어느 하나의 표적 세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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