CN102731661B

CN102731661B - 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的多重表位融合抗原及其制备的试剂盒

Info

Publication number: CN102731661B
Application number: CN201210241270.2A
Authority: CN
Inventors: 黄洪涛; 严俊; 姚静; 石延宾; 张宪; 胡伟; 江雨丽; 李小鱼; 魏勇
Original assignee: CHONGQING NOVEAGENE BIOTECH Co Ltd
Current assignee: Chongqing Novegent Biotech Co ltd
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN102731661A

Abstract

本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的多重表位融合抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及该多重表位融合抗原的制备方法，及检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的试剂盒。本发明制备的多重表位融合抗原纯度高，稳定性好，而且制备工艺简单，成产成本低，所述试剂盒的检测灵敏度高，安全性强。

Description

一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的多重表位融合抗原及其制备的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的多重表位融合抗原及其制备的试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称猪蓝耳病，是80年代末出现的一种新的猪传染性疾病，其病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)。1987年美国首先报道了该病的发生，其症状主要表现为怀孕母猪发生流产、早产、死胎和木乃伊等严重的繁殖障碍，仔猪呼吸系统症状和断奶前死亡率增高，育成猪呼吸困难，发育迟缓，公猪性欲减退精液品质下降等。1991年欧洲爆发了毁灭性流行，造成了近百万头猪死亡。中国于1996年由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪场中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒，确认了本病在国内的发生和流行。2003年起许多专家都惊呼“全国猪场一片蓝”，猪繁殖与呼吸综合征病毒的高感染率是一个不争的事实。更为令人担忧的是，2006年夏季，中国中南部爆发了高致病型猪繁殖与呼吸综合征，之后蔓延到全国各个省市。高致病型猪繁殖与呼吸综合征的特点是能使不同年龄和不同品种的猪都感染发病，且发病率高、病死率高、治愈率低。2007年，国内共有26个省份发生了高致病型猪繁殖与呼吸综合征，发病猪数量达30多万头，许多发病猪场的死淘率甚至达到100%。直至今日，疫病形势依然严峻，高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒已经成为猪的三大致死性病原之首，严重地影响了国内畜牧业生产。

由于目前还没有有效的治疗手段，所以对于猪繁殖与呼吸综合征，尤其是高致病型猪繁殖与呼吸综合征，及时、正确的诊断是预报疫情、控制流行态势、防止疫病爆发的首要环节。

猪繁殖与呼吸综合征病毒为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子直径50～65nm，核衣壳25～35nm，表面有明显的纤突，核衣壳呈立体对称的二十面体。该病毒属于套式病毒目（Nidovirales），动脉炎病毒科（Arterivirus）。猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组全长约15.4kb，包括9个开放阅读框架（OpenReading Frame，ORF），分别编码病毒复制所需要的酶（ORF1a和ORF1b）和7个结构蛋白（ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7）。ORF1a和ORF1b占基因组全长的3/4,编码的多聚蛋白pp1a和pp1ab最终可水解为14个非结构蛋白(Nonstructural Protein,NSP)。这些NSP编码病毒RNA复制酶，是病毒产生的唯一的非结构性蛋白，参与病毒复制。按照欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒Lelystad株各非结构蛋白划分,Nsp7的起止位置为Ser2083～Glu2351。北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株Nsp7的起止位置为Ser2200～Glu2458氨基酸。我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒主要是北美洲型,主要为高致病性HuN4株，由于HuN4株较VR-2332株在Nsp2处存在30个氨基酸的缺失,所以HuN4株Nsp7的起止位置为Ser2170～Glu2428。Nsp7共259个氨基酸,由777个碱基编码。研究显示Nsp7可诱导机体产生高水平的抗体,并能维持较长时间,说明Nsp7与机体免疫应答关系密切。ORF5编码主要的囊膜糖蛋白GP5，ORF2～ORF4分别编码次要结构蛋白GP2a、GP2b、GP3和GP4，GP5与ORF6编码的基质蛋白M形成二聚体，核衣壳蛋白（N蛋白）由ORF7编码。其中，N蛋白在病毒粒子中含量较高，是病毒的优势结构蛋白，约占病毒蛋白总量的20%～40%，同时抗原性最强且具有较好的保守性。猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后机体首先产生的是针对N蛋白抗体，并且在体内持续时间最长，因而该蛋白已被作为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的诊断抗原。

猪繁殖与呼吸综合征的诊断技术包括以下几种：(1)临床症状及病理变化：即通过临床表现及组织病理改变进行诊断，如发热、咳嗽、呼吸急促等呼吸系统症状，耳部肢体发绀，繁殖猪早产、流产泌乳不足，公猪精液品质下降，仔猪易死亡等。该方法并非特异性诊断方法。(2)病毒的分离培养和检查：通过细胞培养观察病毒诱导的细胞病变。该方法需要特定的实验条件，且实验周期长。(3)分子或细胞生物学诊断：采用PCR、原位核酸杂交、间接免疫荧光试验、间接免疫过氧化物酶试验等直接检测感染病猪中的猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸或抗原。但分子生物学检测操作复杂繁琐，对仪器设备、实验室条件、以及实验人员的技术要求高，检测成本亦相应增加，因此难以在基层单位大规模开展；此外，猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗原变异性的特点，也使得传统的单一抗原检测难以达到预期目的。(4)免疫学诊断：常用的方法如免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接荧光抗体试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、血清中和试验（SN）等。其中ELISA在国内外被广泛应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测。主要原因是由于它有明显优于其它几种方法的优点：操作简单，稳定性好，可自动显示结果，特异性敏感性高。对实验室及仪器设备的要求相对较低，易于实现高通量检测，是适于在基层单位推广的检测方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因结构和抗原性比较复杂，并且具有抗原变异性的特点，使得单一抗原检测或通过单一抗原检测抗体均难以达到理想的灵敏度。全病毒作为包被抗原的优点是抗原制作方法比较简单，缺点是病毒纯化工艺复杂，费时、费力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA检测时有较强的背景反应和非特异性反应，以及不同批次差异较大，有散毒的隐患等。使用完整的病毒颗粒作为标准抗原虽然可具备理想的灵敏度，抗原制作方法也比较简单，但是需要进行病毒培养、灭活、以及灭活后的验证等复杂工艺，费时、费力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA检测时有较强的背景反应和非特异性反应，以及不同批次差异较大，具有潜在病毒传播风险的隐患等，这些缺点使得该方法并不适合产业化开发；此外，完整的病毒颗粒作为抗原检测抗体，还容易出现假阳性结果。利用基因工程技术制备重组抗原代替全病毒抗原进行ELISA检测，可避免使用全病毒抗原检测的不足，其优点在于目的蛋白的反应特异性高，且一旦技术路线成熟，可大量稳定的制备。构建多重表位融合抗原是目前检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体最为理想的策略。

基于技术领域现有技术，在对猪繁殖与呼吸综合征病毒各蛋白氨基酸序列进行了充分的生物信息学分析的基础上，我们采用多重表位融合抗原（Multiple-epitope fusion antigen,MEFA）技术，选取了Nsp7与N蛋白部分残基作为抗原优势表位进行融合抗原的设计与制备，这两部分均可诱导机体产生高水平的抗体,并能维持较长时间。以此多重表位融合抗原作为捕获抗原建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法，再经过条件的优化使得在达到一定产能（4,8000头份/周）的前提下，该方法所需的各组分都具备了相当的稳定性，从而成功研制出了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的多重表位融合抗原（Multiple-epitope fusion antigen,MEFA）。

本发明所提供的多重表位融合抗原，命名为NSP7-N1，具有序列表中SEQ IDNQ:1的氨基酸残基序列。

序列表中的SEQ ID No:1由301个氨基酸残基组成，氨基((N)端第1个氨基酸残基为起始氨基酸甲硫氨酸（M）；第2～260位为猪繁殖与呼吸综合征病毒基因中ORF1a部分核苷酸残基序列编码的非结构蛋白7(Nonstructural Protein7,NSP7)氨基酸序列；第261～265位柔性氨基酸连接序列（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）；第266～301位为ORF7部分核苷酸残基序列编码的N蛋白部分氨基酸残基序列。

编码上述多重表位融合抗原的核苷酸序列也属于本发明的保护范围，具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID No：2由903个核苷酸碱基组成，其编码序列为：自5’端第1～3核苷酸编码氨基端第1位的甲硫氨酸；第4～780位核苷酸编码具有序列表SEQ ID NQ：1中第2～260位的NSP7氨基酸序列；第781～795位核苷酸编码具有序列表SEQ ID NQ：1中连接NSP7与N蛋白残基序列的连接序列；第796～903位核苷酸编码具有序列表SEQ ID NQ：1中N蛋白部分氨基酸残基序列。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述多重表位融合抗原的方法。

本发明所提供的表达上述多重表位融合抗原的方法，包含步骤：1)克隆或合成多重表位融合抗原的基因序列；2)酶切克隆的多重表位融合抗原的基因序列，连接经酶切的表达载体，构建多重表位融合抗原的重组表达载体；3)将重组表达载体导入宿主菌，表达多重表位融合抗原融合蛋白；4)纯化所述融合蛋白，获得所述多重表位融合抗原。

其中步骤1）所述多重表位融合抗原的基因序列如SEQ ID NO:2所示，可以将SEQ ID No：2通过全基因合成，构建重组表达载体，将重组表达载体导入宿主细胞，表达得到多重表位融合抗原NSP7-N1。用于构建所述重组表达载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pGEX-4T-2，pET-3a,pET-28a,pET-30a,pET-28b，pET-28c或pET-42a优选为pET-42a。

以pET-42a为表达载体，构建的含有所述多重表位融合抗原（MEFA）基因的重组表达载体为pET-42a-NSP7-N1。

上述重组表达载体均可按照常规方法（分子克隆：实验手册（New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989））构建。所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为BL21(DE3),BL21(AI),BL21(DE3)plysS,ER2529,E2566,Novablue(DE3),Rosetta(DE3),Rosetta(DE3)plys,BL21(DE3)codon plus等,优选为BL21(DE3)codon plus。

可采用构建工程菌所用的常规培养条件对工程菌进行培养，当所述工程菌为重组大肠杆菌时，步骤3）需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.3～1.0mmol/L,优选为0.6mmol/L，诱导温度为24～37℃，优选为30℃低温诱导，诱导时间为2～6小时，优选为3.5小时。

上述制备方法中，步骤4）还包括采用GST亲和层析纯化，其中采用的亲和层析纯化介质优选为快流速GST标签(GSTrap Fast Flow)。

上述制备方法中，步骤4）还包括采用His亲和层析纯化，其中采用的亲和层析纯化介质优选为快流速组氨酸标签(Histrap Fast Flow)。

上述制备方法中，步骤4）还包括脱盐柱(Desalting)处理。

上述的步骤具体包括以下步骤:

①将含目的NSP7-N1重组融合蛋白的破菌上清用快流速GST凝胶初纯化，采用洗脱液(50mmo1/L Tris-HCl,l0mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.0)连续洗脱并收集目的NSP7-N1重组蛋白峰；

②初纯化的NSP7-N1重组蛋白用快流速组氨酸标签亲和层析柱再次纯化，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱收集后者；

③用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50Mm Tris-HC1,pH8.0；

④脱盐后NSP7-N1重组蛋自内加入带有His标签的重组EK酶，重组EK酶与NSP7-N1重组蛋自量比为1:1000，置于4℃低速摇床24～48小时；

⑤再次用快流速组氨酸标签亲和层析柱纯化及去除重组EK酶，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱，40mM洗下蛋白即为所需NSP7-N1重组蛋白。

上述制备方法中，采用Lowry法(Folin酚法)测定NSP7-N1重组蛋白浓度，采用高效液相色谱法(HPLC)测定NSP7-N1重组蛋白纯度。

本发明还有一个目的是提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其包含上述的多重表位融合抗原。该试剂盒，还进一步包括以下组分：抗原包被板、阴性对照和阳性对照、样本稀释液、冲洗缓冲液、酶标抗体工作液、底物液、终止液。

本发明采用的是重组表达的多重表位融合抗原作为捕获抗原，结合了全病毒和重组表达蛋白作为捕获抗原的优点，同时有效弥补了二者的缺点。该抗原的特征是融合了2种免疫原性强、保守性好的病毒蛋白表位，可有效捕获猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后与机体免疫应答关系密切的、表达水平高、应答持续时间长的特异性抗体，可有效控制低漏检风险，提高检测的准确性。本发明制备的多重表位融合抗原纯度高，有更好的稳定性，而且上述的纯化工艺简单，成产成本低。

本发明采用优选的间接ELISA方法进行产业化，产品产业化的关键问题是在达到一定产能的前提下，所生产出来的产品是否具有满足实际使用所要求的稳定性。以每周4,8000头份/周的产能生产出来的产品，抽样后进行加速破坏的实验结果表明，该试剂盒在37℃保存1周后，其检测信噪比无明显下降。

附图说明

图1为NSP7-N1重组蛋白纯化图。

图2：多重表位融合重组抗原有效性初步验证结果。左侧前6孔为抗原包被组（coated with antigen），后6孔为无抗原包被的空白对照(blank)，每个样本双复管检测，抗原包被组和空白对照（无抗原包被）组的对应位置为相同的阳性样本和检测条件。

图3：巴马香猪减毒疫苗的抗体应答动力学结果。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆：实验手册（New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989）和现代免疫学实验技术（沈关心周汝麟主编）中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。

材料和来源：

全基因合成及测序工作由Invitrogen公司完成。

菌株BL21codon plus(DE3)，DH5α购自Novagen公司；

pET42a(+)购自Novagen公司；

限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ，pfu DNA聚合酶，T-DNA连接酶购自promega公司；

DL2000DNA Marker，DNA胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒及蛋白质Marker购自Tiangen生物科技有限公司；

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体购自上海硕博生物科技有限公司；

HRP标记的羊抗猪IgG来源于美国KPL公司；

法国LSI猪蓝耳病毒抗体ELISA诊断试剂盒购自广州凯来动物药品有限公司；

Lowry法蛋白测定试剂盒购于上海美季生物技术有限公司；

纯化所用层析柱及填料购自Amersham公司；

肠激酶(EK酶)购自重庆紫禾医药技术开发有限公司；

其它试剂均为国产化学分析纯。

实施例1多重表位融合抗原（MEFA）NSP7-N1的设计及其编码基因的克隆

1、多重表位融合抗原NSP7-N1的设计

根据NCBI提供是在线数据库检索可获得猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列（GenBank：JQ663567.1）、NSP7氨基酸残基序列（NCBI ReferenceSequence:NP_740601.1）、核衣壳蛋白N的氨基酸残基序列（GenBank:AAY53878.1）。其中NSP7由ORF1a核苷酸部分残基编码，按照欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒Lelystad株各非结构蛋白划分，Nsp7氨基酸编码序列的起止位置为Ser2083～Glu2351。北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株Nsp7氨基酸序列的起止位置为Ser2200～Glu2458。我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒主要为北美洲型高致病性HuN4株，较VR-2332株在Nsp2处存在30个氨基酸的缺失。本发明选取HuN4株Nsp7氨基酸序列的起止位置为Ser2170～Glu2428，共259个氨基酸作为本发明的融合表位抗原片段，由777个核苷酸编码。核衣壳蛋白N由ORF7核苷酸序列编码，起止位置为Met4996～Ala5118，依照保守性和抗原性较强的氨基酸序列为依据，选取Qln5016～Pro5051作为本发明的融合表位抗原片段，共36个氨基酸残基，由108个核苷酸编码。在Nsp7蛋白与N蛋白之间由-Gly261-Gly-Gly-Gly-Ser265-柔性氨基酸序列连接。本发明的多重表位融合抗原命名为NSP7-N1，共301个氨基酸残基（SEQ ID NQ:1）。

将此序列相对应的核苷酸序列（GenBank获取）提交Graphical codon usageanalyzer(http://guca.schoedl.del)综合分析，参照密码子偏嗜分析图，对柱高值低于50的，即在大肠杆菌中表达中使用频率偏低的密码子，进行同义密码子置换优化（如同义密码子表达频率均低于50，选取阈值为35）。优化后，其相对应的核苷酸序列为SEQ ID NQ:2。将编码NSP7-N1的序列SEQ ID NQ:2两端分别添加限制性酶切位点SalⅠ、BamHⅠ，其中BamHⅠ酶切位点后加入GATGATGATGATAAG核苷酸序列，其编码的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys氨基酸序列为EK酶的识别位点。全序列委托上海英骏生物工程有限公司进行全基因合成。本发明的编码多重表位融合抗原的核苷酸序列如SEQ ID NQ:2所示。

2、多重表位融合抗原NSP7-N1重组质粒构建

将pET42a载体与合成的NSP7-N1全基因序列经SalⅠ/BamHⅠ双酶切消化4小时后，用T4DNA连接酶4℃过夜连接。取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5α菌200u1，冰浴，吸取l ul连接产物加入管中，转化DH5α菌，轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800u1室温的2×YT培养液混匀，37℃摇床220rpm振荡培养1小时。分别将50ul、200ul及剩下的全部转化菌液涂于3个含卡那霉素抗性的2×YT培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养。用碱裂解法提取质粒，取质粒用SalⅠ/BamHⅠ双酶切4小时。酶切后，取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳图可见与设计值924bp一致的片断。

实施例2NSP7-N1重组蛋白的诱导表达及鉴定

常规方法（分子克隆：实验手册（New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989））转化BL21codon plus(DE3)工程菌，取重组pET42a-NSP7-N1质粒转化BL21codon plus(DE3)菌，涂布于含氯霉素抗性与卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养，培养温度30℃，测细菌OD值达0.6～0.8时加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导，按时间点1，2，4，6小时收集诱导的细菌进行SDS-PAGE鉴定。结果表明，IPTG诱导的工程细菌出现分子量约为34kD的特异性蛋白条带，与预期pET42a-NSP7-N1的表达产物的分子量值相符，约占细菌总蛋白的35%。再将IPTG诱导3.5小时的BL21codon plus(DE3)重组菌用裂菌液破菌，离心后分别取上清和沉淀电泳，未诱导的菌液和诱导3.5小时的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照重组蛋白条带相对应的位置发现特异蛋白条带，而沉淀无此蛋白条带，证实重组融合蛋白为可溶性表达。

实施例3NSP7-N1重组蛋白的纯化

转化pET42a-NSP7-N1重组质粒的工程细菌经0.6mmol/L的IPTG诱导表达后使用GSTrap F.F.初纯化，使用GSTrap F.F.的结合缓冲液(20mmol/L sodiumphosphate，0.15M NaCl，pH7.3)重悬后冰上超声破菌，4℃高速离心，留上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脱液(50mmol/L，Tris-HC1，10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.0)洗脱，收集洗脱蛋白。将含目的蛋白的洗脱峰用His-结合缓冲液(20mmol/l，sodium phosphate，0.5M NaCl，pH7.4)按1：9的体积比稀释后上HisTrap HP再次纯化，His-结合缓冲液平衡后用His-洗脱缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaC1，0.5M咪唑，pH7.4)，先10%缓冲液洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100%缓冲液将目的蛋白洗下。再用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50Mm Tris-HC1,pH8.0。将获得的纯化重组蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割缓冲液(50mmol/LTris-HCl，pH8.0)，按EK酶与蛋白1:1000的质量比加入加入带有His标签的EK酶，4℃低速摇床(60r/分钟)切割12小时左右。切割后用His-结合缓冲液稀释后HisTrap HP纯化，分别收集穿透峰、10%缓冲液洗脱和100%缓冲液洗脱的蛋白，17.5%SDS-PAGE电泳进行鉴定。pET42a-NSP7-N1表达的融合蛋白是以GST-NSP7-N1形式存在，经EK酶切后可得到NSP7-N1目的蛋白。

实施例4NSP7-N1重组蛋白的浓度、纯度鉴定

1、Lowry法(Folin-酚试剂法)测定NSP7-N1蛋白质含量

表1：制备标准曲线（单位：ml）

在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A260值与A280值。根据公式，蛋白浓度C=(1.45×A280－0.75×A260)×稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25～150μg范围，按照上表的操作程序反应，测定处650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得浓度为1.250g/L。

2、纯化产物经高效液相色谱法（HPLC）进行纯度测定

纯化的GST-NSP7-N1经HPLC检测纯度为92.5%，每升诱导菌获得37.5mg融合蛋白。经EK酶切割后的纯化NSP7-N1蛋白检测纯度为98.5%，每升诱导菌可获得7.6mg左右，见图1。

实施例5对NSP7-N1重组蛋白的有效性鉴定

1、Western blot方法进行免疫反应特异性鉴定

取纯化的NSP7-N1重组蛋白行15%SDS-PAGE电泳，对其进行Western Blot分析，PRRSV抗体购自上海硕博生物科技有限公司，选用Millipore ImmobilonWestern Chemiluminescent HRP Subscrate系统显色，结果显示抗原-抗体结合处可见清晰目的条带。

2、ELISA方法对NSP7-N1重组蛋白抗原的有效性鉴定

以纯化的抗原作为捕获抗原进行包被，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性样本，同时设置不包被该抗原的对照，以此验证该抗原的有效性。在获得纯化的多重表位融合抗原后，检测了12例猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性样本，对该抗原的有效性进行了初步的验证。结果显示（如图2），12例样本所表现出来的阳性信号均与该多重表位融合重组抗原有关，初步证明了该抗原的有效性。

实施例6NSP7-N1重组蛋白抗原稳定性

采用冻干保存的方式在4℃的条件下保存180天，其检测值降低<5%，而用校准品稀释液（0.01mol/L PBS pH7.2，0.1%BSA，0.1%Proclin-300）保存一个月即降低20%以上，6个月减少60%以上，说明长期保存宜采用冻干的形式。此外，在冻干品用校准品稀释液溶解后，7天内降低<10%，因此在这期间可用于定量检测。

实施例7试剂盒的制备及检测试剂盒稳定性优化及生产条件下的验证

本发明提供的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，包含上述的纯化的多重表位融合抗原，抗原包被板、阴性对照和阳性对照、样本稀释液、冲洗缓冲液、酶标抗体工作液、底物液、终止液（各溶液的配制方法及来源如下），其中，阴性对照和阳性对照、样本稀释液、冲洗缓冲液在加入适当的防腐剂（含BSA、抑肽酶aprotinin、EDTA、庆大霉素、叠氮钠）后即具备了相当的稳定性，而终止液为2M的硫酸，密闭保存亦比较稳定。

阴性对照：使用同类产品（美国IDEXX和法国LSI的PRRSV抗体检测试剂盒）和本试剂盒检测阴性的猪血清或血浆样本，无疫苗接种史和感染史。

阳性对照：使用本试剂盒检测阳性的猪血清或血浆样本，并且OD450检测值在0.9±0.2范围内。

样本稀释液：0.5%BSA，PBS配制。

冲洗缓冲液：PBST(10×)。

酶标抗体工作液：羊抗猪IgG原液（购自美国KPL公司）以样本稀释液稀释3000倍。

底物液：购自美国KPL公司。

终止液：2M H₂SO₄。

表2：PBS及PBST的配制

PBS(10×,pH7.4),1L

超纯水溶解，以NaOH或HCl调节pH至7.4，容量瓶定容。

PBST(10×,pH7.4),1L

超纯水溶解，以NaOH或HCl调节pH至7.4，容量瓶定容。

在对稳定性进行了优化后，将优化后的试剂盒与未优化的检测组分同时置于37℃孵育不同时间，检测相同的阳性对照（PC）和阴性对照（NC），每次检测同时设置临时配制临时使用的标准条件，再通过比较对照组、实验组与标准条件的检测信噪比的变化来考察试剂盒稳定性的变化，结果见表3。结果显示，经稳定性优化后的试剂盒，其检测信噪比与标准条件（现配制现使用）相比，基本上没有损失。并且该优化条件已经过产能为4,8000头份/周的生产条件验证。

表3：试剂盒加速破坏实验（37℃孵育）的检测信噪比变化

	对照组	实验组
			37℃，2h	106.0%	97.5%
37℃，4d	28.1%	97.1%
			37℃，7d	19.1%	108.2%

以现配制现使用的检测条件为参照，计算对照组和实验组PC/NC比值与该参照的百分比。结果显示，未引入任何保护性因素的对照组，其检测信噪比在37℃/4d、37℃/7d仅保留了28.1%和19.1%，而引入保护性因素后的实验组检测信噪比基本没有损失。

实施例8间接ELISA方法的建立和结果判定

本发明以该多重表位融合重组抗原为捕获抗原建立检测抗体的间接ELISA方法，优化了抗原包被、封闭、阳性对照稀释度、样本孵育、酶标抗体孵育、显色等检测条件，最终建立了比较理想的间接ELISA方法。主要条件如下：

包被：多重表位融合抗原以50mM的碳酸盐缓冲液（pH9.3）稀释至5μg/mL，每孔加入100μL，4℃孵育过夜；

封闭：1%酪蛋白，300μL/孔，37℃孵育2h；

样本孵育：猪血清或血浆样本以0.5%酪蛋白稀释40倍，100μL/孔，室温孵育30min；

酶标抗体孵育：HRP标记的羊抗猪IgG以PBST按照1:3000稀释成酶标抗体工作液，100μL/孔，室温孵育30min；

显色条件：单组分TMB溶液，100μL/孔，室温孵育10min后加入2M硫酸终止显色，50μL/孔。酶标仪检测A(450)。

每次实验设置两个阴性对照（NC1、NC2）和两个阳性对照（PC1、PC2）。实验结束后首先计算两个阴性对照的A(450)均值（NC）和两个阳性对照的A(450)均值（PC），然后计算待测样本的IRPC值：

NC=(A(450)NC1+A(450)NC2)/2

PC=(A(450)PC1+A(450)PC2)/2

阳性对照A(450)均值大于0.5（即PC>0.5），阳性对照A(450)均值与阴性对照A(450)均值的比值大于4（即PC/NC>4），判定实验有效，反之实验无效，需重复。在实验有效的前提下，待测样本的IRPC>20为阳性样本，反之为阴性样本。

实施例9性能评价

1、减毒疫苗的抗体应答动力学

初生的巴马香猪（第三军医大学实验动物中心）在出生20天后接种减毒疫苗，每周采血1次检测抗体，在明显阳性后2周采血1次，连续观察210天。观察减毒疫苗的抗体应答动力学情况。巴马香猪在接种减毒疫苗后的2周后，其血清检测的S/P值即开始增加，3周后S/P均值超过判定标准，随后急剧上升至平台期，并持续至210天，结果见图3。

2、临床灵敏度和特异性

对经法国LSI试剂盒检测的样本262例进行检测，考察本试剂盒的临床灵敏度和临床特异性，具体结果见表3。

表4：本发明产品的临床灵敏度和临床特异性

表4说明：总样本量为262例，本发明检测结果阳性标本98例，阴性标本164例；LSI产品检测结果阳性标本94例，阴性标本168例。其中，本发明检测的4例阴性标本经LSI检测为阳性，而LSI检测的8例阴性标本经本发明检测为阳性。

结论：以法国LSI产品为参照，本发明研制的产品临床灵敏度达到95.74%，临床特异性达到95.23%。

目前市场上的主流产品都是以重组蛋白作为捕获抗原，如美国IDEXX公司推出的第二代猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测产品（HerdCheck2XR ELISA）即以N蛋白作为捕获抗原，法国LSI的产品是以GP蛋白为捕获抗原。但是利用单一的重组蛋白作为捕获抗原只能检测针对该蛋白或多肽的抗体，而不同病毒蛋白在机体内的抗体应答动力学不尽相同，因此在特定时间进行检测总是存在一定的漏检风险。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的多重表位融合抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的核苷酸序列基因片段。

3.一种宿主菌，其特征在于，具有如权利要求2所述的重组表达载体。

4.一种制备权利要求1所述的多重表位融合抗原的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1) 克隆或合成多重表位融合抗原的基因序列；

2) 酶切克隆的多重表位融合抗原的基因序列，连接经酶切的表达载体，构建多重表位融合抗原的重组表达载体；

3) 将重组表达载体导入宿主菌，表达多重表位融合抗原融合蛋白；

4) 纯化所述融合蛋白，获得所述多重表位融合抗原。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.3～1.0 mmol/L，诱导温度为24～37℃，诱导时间为2～6小时。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4）进一步包含以下步骤：

1）采用GST亲和层析进行初纯化；

2）采用His亲和层析纯化；

3）脱盐柱处理；

4）采用Lowry法测定重组蛋白浓度；

5）采用高效液相色谱法测定重组蛋白纯度。

7.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的多重表位融合抗原。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还进一步包括以下组分：

抗原包被板、阴性对照和阳性对照、样本稀释液、冲洗缓冲液、酶标抗体工作液、底物液、终止液。