FI79120B - Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. - Google Patents

Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. Download PDF

Info

Publication number
FI79120B
FI79120B FI840090A FI840090A FI79120B FI 79120 B FI79120 B FI 79120B FI 840090 A FI840090 A FI 840090A FI 840090 A FI840090 A FI 840090A FI 79120 B FI79120 B FI 79120B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
fragment
encoding
gene
hybrid protein
region
Prior art date
Application number
FI840090A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI840090A (fi
FI79120C (fi
FI840090A0 (fi
Inventor
John R Murphy
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Publication of FI840090A publication Critical patent/FI840090A/fi
Publication of FI840090A0 publication Critical patent/FI840090A0/fi
Publication of FI79120B publication Critical patent/FI79120B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI79120C publication Critical patent/FI79120C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/685—Alpha-melanotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/69—Beta-melanotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/31—Linker sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Amplifiers (AREA)
  • Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
  • Secondary Cells (AREA)

Description

79120
Fuusioitu geeni ja menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hybridiproteiinin valmistamiseksi
Keksinnön kohteena on yhdistelmä-DNA-tekniikan 5 käyttö hybridiproteiinimolekyylien valmistamiseksi. Tällaisia molekyylejä voidaan käyttää sairaustilojen hoitoon.
Kirjallisuus sisältää monia esimerkkejä fuusioituneista geeneistä, jotka koodaava hybridiproteiineja. Esimerkiksi Villa-Komaroff et ai., (1978) P N A S USA 75, 10 ss. 3727 - 3731 kuvaa fuusioitunutta geeniä, joka on valmistettu eukaryoottisesta rakennegeenistä, joka on yhdistetty solulimattomaan bekteerigeeniin. Tämä fuusioitunut geeni koodaa hybridiproteiinia, joka siirtyy ulos soluli-masta.
15 Hybridiproteiineja on tehty myös menetelmillä, esim.
kahden erilaisen proteiinimolekyylin kytkeminen, joihin ei sisälly yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. On esimerkiksi ehdotettu muodostettaviksi kytkemällä terapeuttisia hybridi-proteiineja, jotka koostuvat toksiinista, joka on kytketty 20 ligandiin, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan valittuun luokkaan soluja. Eräästä yrityksestä tällaisen hybridiproteiinin valmistamiseksi, jonka ovat esittäneet Chang et ai. (1977), J. Biol. Chem. 252, ss. 1515 - 1522, oli tuloksena hybridi, joka koostui difteriatoksiini-A-ketjusta 25 kytkettynä ihmisen istukka-laktogeenihormoniin disulfidi-sidoksen välityksellä. Vaikka hybridiproteiini sitoutui laktogeenireseptoreita sisältäviin soluihin, se ei estänyt proteiinisynteesiä näissä soluissa.
On esitetty myös hybridiproteiini, joka koostuu 30 risiini-A-toksiinista kytkettynä ihmisen koriongonadotro-piinihormonin β-ketjuun samanlaisen disulfidisidoksen välityksellä; vaikka sillä sanotaan olevan spesifisyyttä, sen sitomiskykyä ei ole esitetty, ja tarvittiin äärimmäisen suuria pitoisuuksia proteiinisynteesin merkitseväksi estä-35 miseksi rotan Leydig-kasvainsoluissa, mikä tekee vaikeaksi 2 79120 erottaa "ei-spesifisen" sisääntulon, jonka aiheuttaa en-dosytoosi, ja "spesifisen" sisääntulon välillä, jonka aiheuttaa hybridin myrkyllisen osan siirtyminen kohdesolu-jen solulimamembraanin poikki [Oeltman et ai. (1979), J.
5 Biol. Chem. 254, ss. 1028 - 1032]. Sama puute havaittiin hybridissä, joka koostui difteria-A:sta, joka oli kytketty insuliiniin käyttäen kystamiinia silloitusaineena [Mis-kimins et ai. (1979) Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, ss. 143 - 151]. On myös valmistettu hybridi, joka koostuu 10 risiini-A:sta, joka on kytketty orvaskesikasvutekijään (EGF) heterofunktionaalisen silloitusaineen avulla, mutta EFG:n antamat sitoutumisominaisuudet eivät rajoitu spesifisiin soluihin, vaan käsittävät laajan valikoiman solu-tyyppejä [Cawley et ai (1980) Cell, 22, ss. 563 - 570].
15 Nyt on keksitty, että voidaan valmistaa parempi difteriatoksiini/hormoni-hybridiproteiini, jossa proteiini syntetisoidaan yksinkertaiseksi yksiköksi; ts. osasia ei liitetä yhteen silloittamalla vaan peptidisidoksilla. Keksintö tulee parhaiten ymmärretyksi viittaamalla piir-20 roksiin, joista kuva 1 on kaavamainen esitys difteriatoksiinimole-kyylistä; kuva 2 on kaavamainen esitys keksinnön mukaisesti valmistetusta hybridiproteiinimolekyylistä; 25 kuva 3 on pilkontakartta, joka osoittaa difteria- tox-operonin sijainnin ja suuntauksen korynefaagin pto* 3,9 kb:n BamH-I-pilkontafragmentilla (mukaanlukien paikka, NRU I, jota ei löytynyt villintyyppisellä tox-alleelillä, vaan ainoastaan mutantti-tox228-alleenilla, kuten seuraa-30 vassa yksityiskohtaisemmin selostetaan); ja kuva 4 on kaavamainen esitys keksinnön mukaisesta fuusioidusta geenistä, joka koodaa hybridiproteiinia (gee-nifragmentit on merkitty koodatun proteiinin fragmentteja vastaavasti).
3 79120
Keksinnön kohteena on fuusioitu geeni, jolle on tunnusomaista, että se sisältää difteriatoksiinia koodaavan geenifragmentin yhdistettynä geenifragmenttiin, joka koodaa soluspesifistä polypeptidiligandia, jolloin tämä fuusioitu 5 geeni koodaa hybridiproteiinia ja jolloin difteriatoksii-nigeenifragmentti sisältää alueen, joka koodaa difteria-toksiinin hydrofobista johtofragmenttia, alueen, joka koodaa difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivista fragmenttia A, alueen, joka koodaa proteaasiherkkää silmukkaa 10 1χ difteriatoksiinin fragmentin A vieressä, ja ainakin osan fragmentin B hydrofobista aluetta koodaavasta alueesta, kuitenkin ilman aluetta, joka koodaa fragmentin B yleistä eukaryoottista sitoutumiskohtaa, jolloin mainittu polypeptidiligandia koodaava geenifragmentti koodaa maini-15 tun ligandin osaa, joka aikaansaa mainitun hybridiproteii-nin sitoutumisen selektiivisesti solujen ennalta määrättyyn luokkaan.
Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä hybridipro-teiinin valmistamiseksi siten, että edellä määritelty 20 fuusioitu geeni liitetään kloonausvektoriin, jolla transformoidaan isäntäsolu ja isäntäsolua viljellään hybridi-proteiinin tuottamiseksi.
Kuvaan 1 viitaten koostuu difteriatoksiinimolekyyli useista funktionaalisista "alueista", jotka voidaan karak-25 terisoida molekyylin aminopäätteisestä päästä lähtien hydrofobiseksi johtosignaalisekvenssiksiksi s, entsymaattisesti aktiiviseksi fragmentiksi A, 14 aminohapon avoimeksi proteaasiherkäksi disulfidisilmukaksi (DSL) 1: , joka sisältää pilkonta-alueen, ja fragmentiksi B, joka sisältää 30 hydrofobisen alueen h. DSLrksi 12 ja karboksipäätteiseksi pääksi, täydennykseksi a.
Prosessi, jolla difteriatoksiini myrkyttää herkkiä eukaryoottisia soluja, käsittää ainakin seuraavat vaiheet: (i) difteriatoksiini sitoutuu spesifisiin reseptoreihin 35 herkän solun pinnalla; 4 79120 (ii) kun toksiinimolekyyli on sitoutuneena reseptoriinsa, se siirtyy endosyyttisen rakkulan sisään; (iii) joko ennen endosyyttiseen rakkulaan siirtymistä tai sen sisällä toksiinimolekyyli katkeaa (tai prosessoi- 5 tuu) kohdassa, joka on 47 000 daltonin alueella N-päättei-sestä päästä; (iv) kun endosyyttisen rakkulan pH laskee arvoon alle 6, toksiinin rakennevälimuoto, sen vielä ollessa sitoutunut reseptoriinsa, liittyy membraaniin; 10 (v) membraaniin upotettuna hydrofobinen alue h muodostaa huokosen; (vi) tapahtuu proteolyyttinen pilkonta l1:ssä, fragmentin A ja B välissä; (vii) sen jälkeen fragmentti A tai polypeptidi, joka 15 sisältää fragmentin A, vapautuu soludispersioon: (viii) fragmentin A katalyttinen aktiivisuus, ts. piden-nystekijän 2 nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi - adeno-siini-difosfaatti-ribosylaatio, aiheuttaa myrkytetyn solun kuoleman. On ilmeistä, että fragmentin A yhden ainoan mole- 20 kyylin tuominen soludispersioon on riittävä tappamaan solun.
Keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiinit sisältävät peräkkäisessä järjestyksessä alkaen hybridipro-teiinin aminopäätteisestä päästä, seuraavat peptidifrag-25 mentit, jotka ovat liittyneet yhteen peptidisidoksin: a) difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivisen fragmentin A (ilman johtofragmenttia s, joka leikkautuu proteiinin erittymisen aikana), b) fragmentin, joka sisältää pilkonta-alueen lx difteria-30 toksiinin fragmentin A vieressä, c) fragmentin, joka sisältää difteriatoksiinin fragmentista B ainakin sen osan, joka koodaa tox-operonin fragmenttia B koodaavan geenifragmentin osaa, joka on 12 :n ja aseman välissä, joka sijaitsee noin 90 emäsparia ylävirtaan 35 tox2 2 8 -alleelin NRU I-kohdan asemasta tox-operonilla, ja 5 79120 d) fragmentin, joka käsittää soluspesifisen polypeptidi-ligandin osan, joka osa sisältää ainakin osan polypeptidi-ligandin sitornisalueesta, jolloin sitomisalueen osa pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen selektiivi-5 sesti ennalta määrättyyn soluluokkaan, johon difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivinen fragmentti A hyökkää. Hybridiproteiiniin sisällytetty tarpeellinen toksiinimole-kyylin osa on kuvattu molekyylien osana viivojen y ja x välissä kuviossa 1. Edullisesti hybridiproteiini sisältää 10 myös toksiinimolekyylin proteaasiherkän DSL:n 12 , ts. siihen on sisällytetty myös molekyylin osa viivojen x ja z välissä. Viiva z on edullisesti kohdassa, joka on 47 aminohapon päässä B' :n karboksipäätteisestä päästä, ts. 12:n päässä, ei lähempänä, sen takaamiseksi, että fragmen-15 tin B yleinen eukaryoottinen sitomiskohta sulkeutuu pois, niin että sitoutumista säätelee soluspesifisen ligandin sitomisalue. On esitetty, että vähän enemmän kuin puolet osasesta B täytyy olla mukana, jotta molekyyli toimisi tehokkaana toksiinina.
20 Viitaten kuvaan 2, keksinnön mukaisesti valmistetun hybridiproteiinimolekyylin kaavamaiseen esitykseen, on difteriatoksiinimolekyylin y - z-osa liittynyt peptidisi-doksella soluspesifisen polypeptidiligandin fragmenttiin r, ts. polypeptidiin, joka selektiivisesti sitoutuu ennalta 25 määrättyyn solujen luokkaan, joihin difteriatoksiinimolekyylin entsymaattisesti aktiivisen fragmentin A on määrä hyökätä. Fragmentti r voi käsittää koko ligandin tai ligandin osan, joka sisältää ligandin koko sitomisalueen tai sitomisalueen tehokkaan osan.
30 Kun käytetty ligandi on suuri, on toivottavaa, että ligandista sisällytetään hybridiproteiiniin niin vähän sitomattomasta osasta kuin mahdollista, niin että molekyylin sitova alue sijaitsee lähellä fragmentin B hydrofobista aluetta h. On myös toivottavaa sisällyttää hybridimolekyy-35 liin kaikki tai suurin osa ligandimolekyylin sitovasta 6 79120 alueesta. Kun kysymyksessä on α-melanosyyttiä stimuloiva hormoni (MSH), joka on pieni 13 aminohappoa käsittävä peptidi, tai β MSH, joka sisältää 17 aminohappoa, voidaan käyttää molekyylien osaa, joka sisältää 9 aminohappoa 5 molekyylin karboksipäätteisessä päässä, tai koko molekyyliä.
Alueet soluspesifisten ligandien sisällä, joilla alueilla sitova alue sijaitsee, ovat tunnettuja joukolle tällaisia ligandeja. Lisäksi viimeaikaiset edistysaskeleet 10 kiintofaasi-polypeptidisynteeseissä voivat tehdä tähän teknologiaan perehtyneille mahdolliseksi määrittää käytännöllisesti katsoen minkä tahansa tällaisen ligandin sitova alue syntetisoimalla ligandin eri fragmentteja ja testaamalla niitä kyvyn suhteen sitoutua hyökkäyksen kohteeksi 15 joutuvien solujen luokkaan.
Keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiini-molekyylit ovat itse asiassa myrkyttömiä kaikille nisäkäs-soluille lukuunottamatta erikoisluokan soluja, joihin ligandin sitova alue sitoutuu. Siten nämä hybridiproteiinit 20 ovat paljon spesifisempiä kuin monet muut terapeuttisesti aineet, esim. yleiset solymyrkylliset syövän vastaiset lääkeaineet.
Keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiinit, joiden osat ovat liittyneet toisiinsa peptidisidoksilla, 25 ovat myös parempia kuin silloitetut hybridit, koska keksinnön mukaisesti valmistettuja proteiineja voidaan aikaansaada homogeenisenä näytteenä, jossa kaikki identtiset molekyylit ovat tehokkaita ja selektiivisiä solujen tietylle luokalle.
30 Solujen, joihin keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiinit sitoutuvat ja hyökkäävät, erikoisluokan määrää spesifinen polypeptidiligandi, jolla on hybridimo-lekyylin sitova alue. Voidaan käyttää mitä tahansa solu-spesifistä polypeptidiligandia, jolla on sitova alue, joka 35 on spesifinen hyökkäyksen alaiseksi joutuvien solujen 7 79120 erikoisluokalle. Polypeptidihormonit ovat käyttökelpoisia tällaisia ligandeja. Esimerkiksi hybridit, jotka on tehty käyttäen a- tai β-MSHtn sitovan alueen osaa, sitoutuvat selektiivisesti melanosyytteihin tehden hybridit käyttö-5 kelpoisiksi melanooman hoidossa. Muut ligandit antavat erilaisia spesifisyyksiä; esimerkiksi aineen P sitova alue tunnistaa reseptoreita kivun esiintymiseen osallistuvien neuronien pinnoilla, niin että hybridejä, jotka on tehty käyttäen ainetta P, voidaan käyttää tällaisten neuronien 10 hävittämiseen kroonisen kivun helpottamiseksi. Näitä hybridejä voidaan käyttää myös hermojärjestelmän alueiden kartoittamiseen, jotka alueet sisältävät aineen P reseptoreita. Muita käyttökelpoisia spesifisesti sitovia ligandeja ovat semotostatiini, interleukiini I, interleukiini 15 II ja interleukiini III. Interleukiini II on erityisen tärkeä, mikä johtuu sen osasta allergisissa reaktioissa ja autoimmuunisairauksissa, kuten lupuksessa, johon liittyy aktivoituja T-soluja. Koska kaikki interleukiinit ovat spesifisiä T-soluille, niitä käyttäen tehtyjä hybridejä 20 voitaisiin lisäksi käyttää immuunisysteemiin liittyvien syöpien hoitoon ja estämään siirrettyjen elinten hylkimistä. Muita käyttökelpoisia polypeptidiligandeja, joilla on soluspesifisiä sitovia alueita, ovat stimuloiva rakkula-hormooni (spesifinen munasarjasoluille); lutenisoiva hor-25 moni (spesifinen munasarjasoluille); stimuloiva tyroidi-hormoni (spesifinen tyroidisoluille); vasopressiini (spesifinen kohtusoluille, sekä myös rakko- ja suolisoluille); prolaktiini (spesifinen rintasoluille); ja kasvuhormoni (spesifinen tietyille luusoluille).
30 Näitä hybridiproteiineja valmistetaan käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikkaa, joka käsittää halutun fuusioidun geenin muodostamisen, joka koodaa hybridiproteiinia, ja tämän fuusioidun geenin ekspressoinnin tavanomaisia menettelytapoja käyttäen. Viitaten kuvaan 3 sallii difteria-35 tox-operonin sijainti ja suuntaus korynefagin β* °x+ 3,9 8 79120 kb:n BamHI-pilkontafragmentilla tox-operonin pilkonnan halutussa kohdassa ja operonin halutun osasen yhdistämisen geenin halutun osan kanssa valikoitua polypeptidiligandia varten. Yksityiskohtaisemman kuvauksen tox-operonista ja 5 selostuksen fragmentin A kloonaamiseksta on esittänyt Leong et ai. (1983) Science 220, s. 515. Fragmentti A, joka oli kloonattu kuten siinä selostettiin plasmidin pDT201 valmistamiseksi, talletettiin kokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, MD, toukokuussa 1983, ja sille on 10 annettu ATCC-talletusnumero 39 359.
Viitaten kuviin 3 ja 4, on difteria tox-operonin (kuva 3) osa, jota käytetään fuusioidun geenin (kuva 4) valmistamiseen, joka koodaa keksinnön mukaisesti valmistettavia hybridiproteiineja, edullisesti osa, joka on 15 esitetty katkoviivoin, jotka rajaavat fragmentin D; ts. tox-geenin osa ensimmäisestä Sau 3AI-kohdasta SPH I-koh-taan. Fragmentti D sisältää siten 831 emäsparin (bp) gee-nifragmentin, joka koodaa fragmenttia A (sisältäen raken-negeeniä edeltävän 177 bp:n sekvenssin, joka sisältää 20 promoottorin ja osan, joka koodaa signaalisekvenssiä S kuvassa 1); geenifragmentin osan, joka koodaa fragmentin B hydrofobista aluetta; ja geenifragmentin, joka koodaa DSL:n 12 .
Kuten kuvassa 3 on esitetty, fragmenttia A koodaavan 25 geeni fragmentin ensimmäiset 177 emäsparia tox-promoottorin edessä sisältävät jonkin verran DNA:ta, joka ei ole tox-operonin osa. Tämä DNA on asiaankuulumaton ja ei trans-kriboidu; se otetaan mukaan ainoastaan koska fragmenttia A koodaavan geenifragmentin alussa oleva Sau 3AI-kohta on 30 sopivin pilkontakohta lähellä tox-promoottoria (joka on kuvattu viivana heti vasemmalle Hind III:sta).
Tulisi olla mahdollista saada fragmentti D leikkaamalla se yksinkertaisesti tox-operonista pilkkomalla kohdissa Sau 3AI ja SPH I. Vaihtoehtoisesti geenifragmentit 35 voidaan liittää yhteen seuraavasti. Ensin valmistetaan 9 79120 geenifragmentti, joka koodaa fragmenttia A. Seuraavaksi valmistetaan geenifragmentti, joka koodaa suurimman osan fragmentista B, kohdasta Sau 2AI kohtaan Sau 3AI (B' kuvassa 3). Geenifragmentti, joka koodaa fragmenttia B’, on 5 kloonattu plasmidissa pUC8 plasmidin pDT301 valmistamiseksi ja se talletettiin kokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, MD, toukokuussa 1983 ja sille annettiin ATCC-talletusnumero 39 360. Fragmentista B' lohkaistaan entsyymillä Ball31 noin 200 emäsparia, NRU I-kohdan asemaan 10 tox2 2 8 : 11a (villintyyppisellä tox-alleelilla ei ole NRU-kohtaa), niin että saadaan B" (kuva 3). Fragmentit A ja B" yhdistetään, fragmentti, joka koodaa 12:ta yhdistetään fragmenttiin B" ja fragmentti, joka koodaa polypeptidili-gandin haluttua osaa, yhdistetään 12:een.
15 Edellä esitetyssä kaaviossa fragmenttia B' koodaava geenifragmentti katkaistaan edullisesti tarkasti NRU I-kohdasta, mutta se voidaan myös katkaista mistä tahansa kohdasta 90 bp NRU I:n edessä olevan kohdan ja 12:ta koo-daavan alueen pään välillä (ts. 208 bp:n alueella 90 bp:n 20 NRU I:n edessä olevan kohdan ja 12 :ta koodaavan alueen alun välissä). Vaihtoehtoisesti B':tä koodaava fragmentti voitaisiin katkaista l2:ta koodaavan alueen (129 bp ala-virtaan NRU I:stä) karboksipäätteisestä päästä, jossa tapauksessa synteettisen l2:ta koodaavan alueen yhdistä-25 minen on tarpeeton. On ilmeistä, että kun B':tä koodaava aluen katkaistaan ja siihen yhdistetään synteettinen 12:ta koodaava fragmentti, niin yleensä NRU I:n ja SPH I:n välissä on pieni määrä emäspareja, joita ei ole läsnä fuusioidussa geenissä, niin että täsmällisesti sanoen kaikkea 30 kuvan 3 D:stä tai kaikkea kuvien 1 ja 2 y - z:stä ei välttämättä sisällytetä.
Eräs vaihtoehtoinen menettelytapa, joka on vähemmän edullinen kuin edellä esitetty kaavio, on yhdistää ligandia koodaava geenifragmentti suoraan B":hen käyttämättä l2:ta 35 koodaavaa fragmenttia.
79120 ίο
Fuusioitu geeni, joko sisällyttäen tai jättäen pois 12:ta koodaava fragmentti, voidaan vaihtoehtoisesti tehdä käyttäen B":tä koodaavaa geenifragmenttia mutantti tox2 2 8 -alleelista mieluummin kuin villintyyppistä alleelia.
5 tox2 2 8 -alleelia, joka sisältää NRU I-kohdan, on helppo käsitellä niin, että saadaan B":tä koodaava fragmentti. tox2 2 a-alleelia ovat selostaneet Uchida et ai., Jour. Biol. Chem. 248 (1973), s. 3838.
Yksityiskohtaisemmin voidaan keksinnön mukaisia 10 hybridiproteiineja koodaavia geenejä valmistaa seuraavasti.
Vektorit
Edullisia vektoreita ovat plasmidit pUC7, pUC8, pUC9 ja pBR322. pUC-plasmidit, joita ovat kuvanneet Viera et ai., Gene 19 (1982), s. 259, ovat erityisen sopivia 15 kaksoisdigestointikloonausta varten, joka menetelmä mahdollistaa fuusioitujen geenien tekemisen yksiselitteisesti.
Fuusioitu geeni
Seuraavassa on kulkukaavio difteriatoksiini-MSH-fuusioitujen geenien rakentamiseksi, jotka sisältävät 20 proteaasiherkän silmukan 12 tox-sekvenssien ja ligandi (tässä tapauksessa MSH-) sekvenssien välissä.
11 79120 (i) pDT201 Sau3Al puhdistetaan Sau3Al-2 -^ digestointi (Fragmentti A) (ii) pDT301 Hind III ^ Bal31 Pst 1 ^ Sau3Al 5 diges- kat- linkke- digestointi tointi kaisu rit uudelleenkloonaus valikoidaan sini-Sau3Al-Pstl set pesäkkeet puhdistetaan 10 pUC8:ssa * X-G:llä oikea- ^ Sau3Al-Pstl ta lukusuun- (Fragmentti taa varten B") (iii) proteaasiherkän silmukan kloonaus Pstl-EcoRl- 15 12 (Pstl-silmukka-Eco-Rl)_^ kohtiin pUC9:llä ja in vitro-synteesi fragmentin puhdistus (iv) kloonataan (ii) Sau3Al-Pstl ja (iii) Pstl-Eco BamHl-EcoRl-kohtiin pUC8:lla (Sau 3Al-fragmentti 20 B"-silmukka-EcoR) (v) kloonataan (iv) Sau3Al-EcoRl ja MSH-sekvenssi BamHl-kohtaan pUC8:lla (Sau3Al-fragmentti B"-silmukka-MSH-BamHl) 25 (vi) kloonataan (i) Sau3Ai-fragmentti A-Sau3Al ja (v) Sau3Al-fragmentti B"-silmukka-MSH-BamHl-kohtaan pUC8:lla (Sau3Al-fragmentti A-fragmentti B"-sil-mukka-MSH-BamHl).
30
Viitaten edellä esitettyyn kulkukaavioon valmistetaan ja puhdistetaan ensin vaiheessa (i) fragmentin A koodaava geenifragmentti, kuten edellä mainitussa julkaisussa Science on selostettu. Vaiheessa (ii) saadaan frag- 12 79120 menttia B" koodaava fragmentti katkaisemalla suurempi fragmenttia B' koodaava alue käyttäen entsyymiä Bal31.
Kuten kuvassa 3 on esitetty, on fragmenttia B' koodaava geenifragmentti 1023 emäsparin alue kahden Sau2Al-5 kohdan välissä, joista ensimmäinen on DNA-sekvenssillä, joka koodaa kolmatta arginiiniä lx :ssä, ja joista toinen on 49 emäsparia ennen tox-rakennegeenin päätä. Geenifrag-mentti, joka koodaa B':tä, on kuten edellä mainittiin kloonattu pUC8:aan. Plasmidi, jolla on tämä fragmentti 10 samassa suuntauksessa kuin lac Z-geenissä, on nimetty pDT301:ksi (lac Z- ja B'-geenit ovat koodikaavan ulkopuolella pDT301:llä).
Viitaten jälleen edellä esitettyyn kulkukaavioon, pDT301 avataan HindiII-digestiolla ja sitten B':tä koodaava 15 fragmentti katkaistaan altistamalla se eksonukelaasille
Bal31 vaihteleviksi ajanjaksoiksi. Syntyneiden lyhennettyjen geenifragmenttien (jotka ovat eripituisia) päät liitetään sitten tylppäpäisesti EcoRl- ja Pstl-linkkereillä ja fragmenttia digestoidaan sitten SauRl:llä. Tästä on 20 tuloksena fragmenttia B' koodaavien geenifragmenttien heterogeeninen (koon suhteen) populaatio.
Nämä osaset kloonataan sitten uudelleen pUC8:n joko BamHl-Pstl- tai BamHl-EcoRl-kohtiin. Kloonaaminen näihin kohtiin tekee mahdolliseksi valikoida ainoastaan kloonit, 25 joissa on BamHl (Sau3Al) toisessa päässä ja Pstl tai EcoRl toisessa päässä. Myös kloonaus kaksoisdigestoidussa pUC8:ssa sallii ainoastaan yhden fragmentin suuntautumisen ja sinisten pesäkkeiden (niiden, jotka ekspressoivat lac Z:n) valikoiminen X-G-levyillä vahvistaa koodikanavan 30 sisäisen liitoksen lyhennetyn B':tä koodaavan alueen ja lac Z:n välissä. Edullisia klooneja ovat ne, joissa B':tä koodaava alue on 830 bp pitkä, ts. geeniä on lyhennetty 200 bp, asemaan NRU I tox2 2 8 : 11a.
13 791 20
Seuraava vaihe (III) on proteaasiherkkää silmukkaa 12 koodaavan geenifragmentin in vitro synteesi. Tämä suoritetaan tavanomaisen kiintofaasi-oligonukleotidisynteesin avulla. Tämän fragmentin sekvenssi mukaanluettuina Pstl-5 ja EcoRl-linkkerit, jotka liitetään synteesin jälkeen, on esitetty seuraavassa: _ Cys-Arg-Ala-Ile-Asp-Gly-Asp-Val-Thr-Phe-Cys- TGC-AGA-GCT-ATA-GAC-GGT-GAT-GTA-ACT-TTT-TGC 10 Pstl- EcoRl- linkkeri linkkeri
Seuraavana vaiheena (iv) on kloonata B":tä koodaa-va fragmentti vaiheesta (ii) ja l2:ta koodaava fragmentti 15 vaiheesta (iii) BamHl-EcoRl-kohtiin pUC8:lla.
Seuraavaksi aikaansaadaan haluttu fragmentti, joka koodaa osaa soluspesifisestä ligandista, joko luonnon lähteestä tai oligonukleotidisynteesillä. Esimerkiksi geeni-fragmentteja, jotka koodaavat a- ja β-MSHin spesifisiä 20 sitomisosia, voidaan syntetisoida tavanomaisen kiintofaasi -oiigonukleotidisynteesin kautta.
Näiden geeniosasten DNA-sekvenssit yhdessä sopivien linkkereiden kanssa on esitetty seuraavassa: 25 a-MSH:
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val _AGC-TAT-AGC-TAG-GAA-CAT-TTT-AGA-TGC-GGX-AAA-CCX-GTX_
T C T G C C G
30 EcoRl- lopetuskodoni & linkkeri BamHl-linkkeri 14 79120 β-MSH:
Asp-Glu-Gly-Pro-Tyr-Met-Glu-His-Phe-
_GAT-GAA-GGT-CCA-TAT-ATG-GAG-CAC-TTT
5 CGXXC ATC
Arg-Trp-Gly-Ser-Pro-Pro-Lys-Asp AGA-TGG-GGT-TCT-CCG-CCG-AAA-GAT__
G X X X X TC C
10 EcoRl- lopetuskodoni & linkkeri BamHl-linkkeri pUC8:n ainoat Pstl- ja EcoRl-kohdat mahdollistavat 15 sen, että voidaan subkloonata edellä esitetyistä synteettisistä MSH-sekvensseistä alavirtaan 12:ta koodaavasta fragmentista.
Lopuksi (vaihe vi) fragmenttia A koodaava geeni-fragmentti yhdistetään geenifragmenttiin, joka koodaa B"-20 l2-MSH:ta, geenifuusion saattamiseksi täydelliseksi kuten kuvassa 4 on esitetty (merkitty koodattuina proteiinifragmentteina, jolloin saatu geeni koodaa hybridiproteiinia, joka selektiivisesti sitoutuu ja hyökkää solujen valittuun luokkaan (tässä tapauksessa melanosyytteihin).
25 Toinen esimerkki sopivasta polypeptidiligandista on aine P, jonka hyödyllisyys on selostettu edellä- Yhdistetty geeni, joka sisältää aineen P geenin eikä a- tai β-MSH-ggeniä, tehdään pääasiallisesti kuten edellä on hahmoteltu. Aineen P geeni syntetisoidaan käyttäen tavan-30 omaista kiintofaasi-oligonukleotidisynteesiä. Aineen P geenin sekvenssi on
CGTCCTAAACCTCAGCAGTTCTTCGGTCTGATG
15 791 20
Kuten edellä esitetystä on selvää, täytyy geneettisen sekvenssin osan polypeptidiligandia varten olla riittävä tekemään mahdolliseksi sen, että vastaava aminohapposekvenssi saa aikaan hybridiproteiinin sitoutumisen 5 solujen ennalta määrättyyn luokkaan. Edullisesti geeni polypeptidihormonia varten sisältää kaiken tai suurimman osan geneettisestä sekvenssistä ligandin sitovaa aluetta varten.
Yleensä, kuten edellä esitetyissä esimerkeissäkin, 10 käsittelyprosessit toteutetaan käyttäen kloonausvektorei-ta, esim. faageja tai plasmideja. Geneettinen aines, joka koodaa polypeptidiligandin sitovaa aluetta, voi olla joko kloonattu DNA tai synteettinen oligonukleotidisekvenssi, sen mukaan kumpi on sopivampi kulloinkin käytettyä ligan-15 digeeniä varten. Yleensä fuusioitu geeni sijaitsee kloo-nausvektorilla, esim. plasmidilla tai faagilla, jotka käytetään transformoimaan viljeltyjä mikro-organismeja. Hyb-ridiproteiini kootaan sitten talteen solujen kasvualustoista käyttäen tavanomaisia menetelmiä.
20 Keksinnön mukaisesti valmistettuja hybridiproteii- neja annetaan nisäkkäälle, esim. ihmiselle, joka kärsii sairaustilasta, esim. syövästä, jolle on ominaista, että läsnä on ei-toivottuja soluja, joihin polypeptidiligandi voi selektiivisesti sitoutua. Annetun proteiinin määrä 25 vaihtelee sairauden lajin, sairauden laajuuden ja sairaudesta kärsivän nisäkkään koon ja lajin mukaan. Yleensä määrät ovat samalla alueella kuin annokset, joita käytetään muille solumyrkyille, joita käytetään syövän hoidossa, vaikkakin tietyissä tapauksissa tarvitaan pienempiä 30 määriä, mikä johtuu hybridiproteiinien spesifisyydestä.
16 791 20
Hybridiproteiineja voidaan antaa käyttäen mitä tahansa tavanomaista menetelmää; esim. ruiskeena tai ajoi-tetusti vapauttavan siirrännäisen kautta. MHS-hybridien tapauksessa voidaan käyttää paikallisia voiteita primää-5 risten syöpäsolujen tappamiseen, ja ruiskeita tai siirrännäisiä voidaan käyttää haarapesäkesolujen tappamiseksi. Hybridiproteiinit voidaan yhdistää minkä tahansa myrkyttömän, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

Claims (14)

17 791 20
1. Fuusioitu geeni, tunnettu siitä, että se sisältää difteriatoksiinia koodaavan geenifragmentin 5 yhdistettynä geenifragmenttiin, joka koodaa soluspesifistä polypeptidiligandia, jolloin tämä fuusioitu geeni koodaa hybridiproteiinia ja jolloin difteriatoksiinigeenifrag-mentti sisältää alueen, joka koodaa difteriatoksiinin hydrofobista johtofragmenttia, alueen, joka koodaa difteria-10 toksiinin entsymaattisesti aktiivista fragmenttia A, alueen, joka koodaa proteaasiherkkää silmukkaa lx difteriatoksiinin fragmentin A vieressä, ja ainakin osan fragmentin B hydrofobista aluetta koodaavasta alueesta, kuitenkin ilman aluetta, joka koodaa fragmentin B yleistä eu-15 karyoottista sitoutumiskohtaa, jolloin mainittu polypeptidiligandia koodaava geenifragmentti koodaa mainitun li-gandin osaa, joka aikaansaa mainitun hybridiproteiinin sitoutumisen selektiivisesti solujen ennalta määrättyyn luokkaan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioitu geeni, tunnettu siitä, että fragmentin B hydrofobista aluetta koodaava alue käsittää 12-koodausalueen.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen fuusioitu geeni, tunnettu siitä, että polypeptidiligandi 25 on a- tai β-melanosyyttiä stimuloiva aine.
4. Kloonausvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukaisen fuusioidun geenin.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukaisen kloonausvektorin 30 käyttö aminohapposekvenssin ilmaisuun tavanomaisella menetelmällä . ie 79120
6. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hybri-diproteiinin valmistamiseksi, joka proteiini käsittää pep-tidisidoksin yhteenliitettyjä proteiinifragmentteja, jolloin se käsittää, peräkkäisessä järjestyksessä alkaen hyb- 5 ridiproteiinin aminopäätteisestä päästä, a) difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivisen fragmentin A, b) fragmentin, joka sisältää pilkonta-alueen lx difteriatoksiinin fragmentin A vieressä, 10 c) fragmentin, joka sisältää ainakin osan difteria- toksiinin fragmentin B hydrofobisesta alueesta, eikä sisällä mainitun fragmentin B yleistä eukaryoottista sito-miskohtaa, ja d) framgentin, joka sisältää osan soluspesifisestä 15 polypeptidiligandista, jolloin tämä osa sisältää ainakin osan polypeptidiligandia sitovasta alueesta, jolloin tämän sitovan alueen osa pystyy aikaansaamaan hybridiprote-iinin sitoutumisen selektiivisesti ennalta määrättyyn solujen luokkaan, joihin vaikutetaan entsymaattisesti aktii-20 visella fragmentilla A, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen a):ta, b):tä, c):tä ja d):tä koodaava fuusioitu geeni liitetään kloonausvektoriin, isäntäsolu transformoidaan tällä kloonausvektorilla ja isäntäsolua viljellään 25 hybridiproteiinin tuottamiseksi.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fragmenttia c) koodaa fragmenttia B koodaavan geenifragmentin osa lx :n ja NRU I-kohdan aseman välissä.
8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hybridiproteiini sisältää lisäksi fragmentin 12 fragmenttien c) ja d) välissä.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidiligandi on hor-35 moni. i9 791 20
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnett u siitä, että polypeptidihormonin alue on a- tai β-melanosyyttiä stimuloivan hormonin alue, joka pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen pahan- 5 laatuisiin melanosyyttisoluihin.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on aineen P osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen kipureseptorineuroneihin.
12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on interleukiini l:n osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridi-proteiinin sitoutumisen T-soluihin.
13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on interleukiini II:n osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridi-proteiinin sitoutumisen T-soluihin.
14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on 20 interleukiini III:n osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen T-soluihin. 20 791 20
FI840090A 1982-05-12 1984-01-11 Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. FI79120C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37738682A 1982-05-12 1982-05-12
US37738682 1982-05-12
PCT/US1983/000723 WO1983003971A1 (en) 1982-05-12 1983-05-12 Hybrid proteins
US8300723 1983-05-12

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI840090A FI840090A (fi) 1984-01-11
FI840090A0 FI840090A0 (fi) 1984-01-11
FI79120B true FI79120B (fi) 1989-07-31
FI79120C FI79120C (fi) 1989-11-10

Family

ID=23488913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI840090A FI79120C (fi) 1982-05-12 1984-01-11 Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4675382A (fi)
EP (1) EP0108146B1 (fi)
JP (3) JP2534222B2 (fi)
AT (1) ATE25197T1 (fi)
AU (1) AU573529B2 (fi)
DE (1) DE3369466D1 (fi)
ES (1) ES522315A0 (fi)
FI (1) FI79120C (fi)
IT (1) IT1203672B (fi)
NO (1) NO176575C (fi)
NZ (1) NZ204229A (fi)
WO (1) WO1983003971A1 (fi)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5080898A (en) * 1982-05-12 1992-01-14 The University Hospital Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand
FR2549855B1 (fr) * 1983-07-29 1987-03-27 Grp Genie Genetique Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues
DE3346953A1 (de) * 1983-12-24 1985-08-14 Organogen Medizinisch-Molekularbiologische Forschungsgesellschaft mbH, 6900 Heidelberg Cardiodilatin, ein neues peptidhormon und verfahren zu seiner herstellung
ATE68703T1 (de) * 1984-02-08 1991-11-15 Cetus Corp Toxinkonjugate.
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
NZ212312A (en) * 1984-06-07 1988-09-29 John Richard Murphy Hybrid protein comprising fragments of diphtheria toxin and part of cell-specific ligand; and fused gene therefor
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5807715A (en) * 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) * 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US6103243A (en) * 1985-05-15 2000-08-15 Biotechnology Australia Pty, Ltd Oral vaccines
IL78775A (en) * 1985-05-15 1992-06-21 Biotech Australia Pty Ltd Oral vaccines
US5169939A (en) * 1985-05-21 1992-12-08 Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College Chimeric antibodies
US5011684A (en) * 1985-09-05 1991-04-30 Beth Israel Hospital Association Lysing or blocking unwanted cells with IL-2 receptor-specific binding substance
US5336489A (en) * 1985-09-05 1994-08-09 The Beth Israel Hospital Association Treatment of allograft rejection with IL-2 receptor-specific cytotoxins
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
EP0246307B1 (en) * 1985-11-13 1994-02-02 University Hospital The Cys codon-modified dna
US4962188A (en) * 1985-12-06 1990-10-09 Cetus Corporation Recombinant ricin toxin A chain conjugates
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US5082927A (en) * 1986-09-24 1992-01-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selectively cytotoxic IL-4-PE40 fusion protein
US6051405A (en) * 1986-09-24 2000-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL84285A (en) * 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5149788A (en) * 1987-05-19 1992-09-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Purification of chimeric proteins containing an IL-2 moiety by receptor-affinity chromatography
US5270199A (en) * 1987-08-20 1993-12-14 The Children's Medical Center Corporation Human mannose-binding protein
EP0375736B1 (en) * 1987-08-20 1998-05-13 Children's Medical Center Corporation Nucleic acid fragments encoding mannose binding fragments of human mannose binding protein
US5792458A (en) * 1987-10-05 1998-08-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mutant diphtheria toxin conjugates
JP2518911B2 (ja) * 1987-10-23 1996-07-31 森永乳業株式会社 ｃ―ｆｍｓ癌原遺伝子の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物および方法
US5084556A (en) * 1987-10-23 1992-01-28 Genetics Institute, Inc. Composition of M-CSF conjugated to cytotoxic agents and a method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene
US6004781A (en) * 1988-01-22 1999-12-21 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding Ig-CD4 fusion proteins
IL106992A (en) * 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
US5827934A (en) * 1988-03-08 1998-10-27 The University Of Wyoming Cytotoxic diphtheria toxin fragments
US5372812A (en) * 1988-04-04 1994-12-13 The General Hospital Corporation Composition and method for acceleration of clot lysis
US5582862A (en) 1988-04-04 1996-12-10 General Hospital Corporation Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin
US5290914A (en) * 1988-04-28 1994-03-01 Mycogen Corporation Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins
JPH03504248A (ja) * 1988-05-19 1991-09-19 ザ・ベス・イスラエル・ホスピタル・アソシエーション 外来抗原に対する寛容の誘発
US5152980A (en) * 1988-05-19 1992-10-06 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen IL-2 receptor-binding substances
US5260422A (en) * 1988-06-23 1993-11-09 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US6106840A (en) 1988-06-23 2000-08-22 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5194425A (en) * 1988-06-23 1993-03-16 Anergen, Inc. Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5468481A (en) * 1988-06-23 1995-11-21 Amergen, Inc. MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity
JPH03500415A (ja) * 1988-07-05 1991-01-31 アムジエン・インコーポレーテツド インターロイキン２類似体
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5135736A (en) * 1988-08-15 1992-08-04 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5609869A (en) * 1988-08-19 1997-03-11 The General Hospital Corporation Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use
US5811265A (en) * 1988-08-19 1998-09-22 The General Hospital Corporation Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use
US5632991A (en) * 1988-11-14 1997-05-27 Brigham & Women's Hospital Antibodies specific for E-selectin and the uses thereof
JPH02169521A (ja) * 1988-12-22 1990-06-29 Ajinomoto Co Inc 自己免疫疾患治療剤
DE4004573A1 (de) * 1989-02-17 1990-08-23 Tanabe Seiyaku Co Neues versuchstier und seine herstellung
US5621078A (en) * 1989-03-22 1997-04-15 Merck & Co., Inc. Modified pseudomonas exotoxin PE40
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
DE69027210T2 (de) * 1989-04-21 1997-01-23 Us Health Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein
IE901736L (en) * 1989-05-17 1990-11-17 Fuller H B Licensing Financ Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion
CA2063271A1 (en) * 1989-07-14 1991-01-15 Subramonia Pillai Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US6207798B1 (en) 1989-08-03 2001-03-27 Merck & Co., Inc. Modified PE40 toxin fusion proteins
JPH05500611A (ja) * 1989-08-23 1993-02-12 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション 非ヒト霊長類ｃｄ４ポリペプチド、グリコシル化可能なヒトｃｄ４分子、その断片、その融合タンパク質、その遺伝子配列および使用
JPH05502880A (ja) * 1989-12-22 1993-05-20 セラジェン・インコーポレーテッド トランスロケーション領域および細胞結合領域を有するハイブリッド分子
US5340935A (en) * 1990-01-05 1994-08-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. DNAS encoding proteins active in lymphocyte-medicated cytotoxicity
ATE200493T1 (de) * 1990-03-02 2001-04-15 Boston Medical Ct Corp Verbesserte chimäre toxine
US5110912A (en) * 1990-03-02 1992-05-05 Seragen, Inc. Purification of il-2-containing hybrid compounds
US5137877B1 (en) * 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
CA2083487A1 (en) * 1990-06-13 1991-12-14 John R. Murphy Chimeric toxins with improved inter-domain geometry
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
NO175188C (no) * 1990-06-27 1994-09-14 Sjur Olsnes Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidkonjugat med evne til å trenge inn i cellecytosol
US5273889A (en) * 1990-08-22 1993-12-28 University Of Saskatchewan Gamma-iterferon-leukotoxin gene fusions and uses thereof
US5238823A (en) * 1990-08-22 1993-08-24 Veterinary Infectious Disease Organization Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof
US5594107A (en) * 1990-08-22 1997-01-14 University Of Saskatchewan Chimeric protein comprising an RTX-family cytotoxin and interferon-2 or interferon
WO1992004455A1 (en) * 1990-08-29 1992-03-19 Genetics Institute, Inc. Multidomain hematopoiesis stimulators
WO1992006117A1 (en) * 1990-09-28 1992-04-16 Seragen, Inc. Inhibiting unwanted immune responses
JPH05502463A (ja) * 1990-09-28 1993-04-28 オーソ・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン ハイブリツド成長因子
US5328984A (en) * 1991-03-04 1994-07-12 The United States As Represented By The Department Of Health & Human Services Recombinant chimeric proteins deliverable across cellular membranes into cytosol of target cells
EP0668774A1 (en) * 1991-05-03 1995-08-30 Seragen, Inc. Interleukin receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
AU665360B2 (en) * 1991-07-05 1996-01-04 Seragen, Inc. Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
US6146850A (en) * 1991-11-04 2000-11-14 Xoma Corporation Proteins encoding gelonin sequences
US5621083A (en) * 1991-11-04 1997-04-15 Xoma Corporation Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
US5837491A (en) * 1991-11-04 1998-11-17 Xoma Corporation Polynucleotides encoding gelonin sequences
US5571507A (en) * 1992-02-25 1996-11-05 Seragen, Inc. Methods of treating diabetes
GB9219562D0 (en) 1992-03-11 1992-10-28 Prendergast Kennet F Anti-viral peptides
AU683413B2 (en) * 1992-04-13 1997-11-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies specific for carcinoma-associated antigens
DK96493D0 (da) * 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
US5804452A (en) * 1995-04-27 1998-09-08 Quidel Corporation One step urine creatinine assays
WO1997013410A1 (en) * 1995-10-13 1997-04-17 Boston Medical Center Corporation Hybrid molecules containing amidated polypeptide binding ligands
PT871490E (pt) * 1995-12-22 2003-07-31 Bristol Myers Squibb Co Ligantes de hidrazona ramificada
EP0833666B1 (en) * 1996-04-10 2003-12-10 Sangstat Medical Corporation Cytomodulating conjugates of members of specific binding pairs
AU734997B2 (en) * 1996-09-20 2001-06-28 General Hospital Corporation, The Composition and method for enhancing fibrinolysis using antibodies to alpha-2-antiplasmin
AU6587998A (en) * 1997-03-27 1998-10-20 Demeter Biotechnologies, Ltd. Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
US6635740B1 (en) 1997-03-27 2003-10-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
US7741435B2 (en) * 1997-07-09 2010-06-22 Advanced Targeting Systems, Inc. Substance P-saporin (SP-SAP) conjugates and methods of use thereof
US6251866B1 (en) 1997-08-05 2001-06-26 Watson Laboratories, Inc. Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor
US6680058B1 (en) 1997-09-03 2004-01-20 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals
US6399575B1 (en) * 1998-11-10 2002-06-04 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to the central nervous system
JP2003514871A (ja) * 1999-11-24 2003-04-22 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション 潜伏ウイルス感染についてのアッセイおよび治療
PL211872B1 (pl) * 2000-03-31 2012-07-31 Purdue Research Foundation Kompozycja farmaceutyczna
EP1303625A2 (en) * 2000-07-14 2003-04-23 Zycos Inc. Alpha-msh related compounds and methods of use
US20050053606A1 (en) * 2000-09-11 2005-03-10 KUFE Donald W. MUC1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom
WO2002058450A2 (en) * 2000-12-22 2002-08-01 Dana-Faber Cancer Institute, Inc. Regulation of cell growth by muc1
EP1386157A4 (en) * 2001-04-06 2005-06-22 Univ Rochester SUPPRESSION OF ANDROGEN RECEPTOR TRANSACTIVATION BY NEW PATHWAYS TO RA AND RA CO-ACTIVATORS AND REPRESSORS
GB0112687D0 (en) * 2001-05-24 2001-07-18 Microbiological Res Authority Pharmaceutical use of secreted bacterial effector proteins
EP1409551A4 (en) * 2001-06-21 2004-10-13 Uab Research Foundation CHEMICAL CAPSIDE PROTEINS AND USES THEREOF
US20040002058A1 (en) * 2001-06-21 2004-01-01 Uab Research Foundation Chimeric capsid proteins and uses thereof
US20030124742A1 (en) * 2001-08-22 2003-07-03 Prakash Ramesh K. Conjugates targeted to target receptors
EP2168598A1 (en) * 2001-09-28 2010-03-31 Purdue Research Foundation Method of Treatment Using Ligand-Immunogen Conjugates
US6846484B2 (en) 2001-12-28 2005-01-25 Regents Of The University Of Minnesota DTAT fusion toxin
US20080090770A1 (en) * 2003-04-11 2008-04-17 Belmares Michael P Modulation of Muc1 Mediated Signal Transduction
US20060257428A1 (en) * 2003-08-22 2006-11-16 Harley John B Assays and therapies for latent viral infection
WO2005042573A1 (en) 2003-10-24 2005-05-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulation of the interaction of muc1 with muc1 ligands
US7585942B2 (en) * 2003-11-25 2009-09-08 Anjin Corporation Diphtheria toxin variant
CA2556729A1 (en) * 2004-02-23 2005-09-09 Genzyme Corporation Muc1 antagonist enhancement of death receptor ligand-induced apoptosis
EP2583678A3 (en) 2004-06-24 2013-11-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
EP3520806B1 (en) 2006-09-07 2024-03-20 Scott & White Memorial Hospital Methods and compositions based on diphtheria toxin-interleukin-3 conjugates
WO2008097844A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-14 Dana -Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by muc1 and bh3- containing proapoptotic proteins
WO2008097840A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of muc1 by hsf1 and stat3
US8821880B2 (en) 2008-10-29 2014-09-02 China Synthetic Rubber Corporation Methods and agents for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma
US9072766B2 (en) 2010-11-18 2015-07-07 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods of treating obesity by inhibiting nicotinamide N-methyl transferase (NNMT)

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4201770A (en) * 1973-05-07 1980-05-06 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4302386A (en) * 1978-08-25 1981-11-24 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4082613A (en) * 1976-04-23 1978-04-04 The Regents Of The University Of Minnesota Process for the production of insulin by genetically transformed fungal cells
JPS5470384A (en) * 1977-08-22 1979-06-06 Inst Obu Kiyansaa Risaachi Roi High molecular complex
US4336336A (en) * 1979-01-12 1982-06-22 President And Fellows Of Harvard College Fused gene and method of making and using same
JPS5616418A (en) * 1979-07-20 1981-02-17 Teijin Ltd Antitumor protein complex and its preparation
JPS5686121A (en) * 1979-12-14 1981-07-13 Teijin Ltd Antitumor proten complex and its preparation
FR2493846A1 (fr) * 1980-11-10 1982-05-14 Delbarre B Derives du 4h-benzo(4,5)cyclohepta(1,2-b)furanne, leur procede de preparation et leur application en tant que medicaments
US4394443A (en) * 1980-12-18 1983-07-19 Yale University Method for cloning genes
FR2504010B1 (fr) * 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation

Also Published As

Publication number Publication date
JPS59500814A (ja) 1984-05-10
NO840089L (no) 1984-01-11
NO176575C (no) 1995-04-26
FI840090A (fi) 1984-01-11
US4675382A (en) 1987-06-23
AU573529B2 (en) 1988-06-16
EP0108146A1 (en) 1984-05-16
ES8407097A1 (es) 1984-08-16
NO176575B (no) 1995-01-16
WO1983003971A1 (en) 1983-11-24
AU1706283A (en) 1983-12-02
IT8367525A0 (it) 1983-05-12
NZ204229A (en) 1986-01-24
EP0108146B1 (en) 1987-01-28
FI79120C (fi) 1989-11-10
ATE25197T1 (de) 1987-02-15
FI840090A0 (fi) 1984-01-11
EP0108146A4 (en) 1984-05-03
JP2534222B2 (ja) 1996-09-11
DE3369466D1 (en) 1987-03-05
JPH08228777A (ja) 1996-09-10
JPH06239896A (ja) 1994-08-30
IT1203672B (it) 1989-02-15
ES522315A0 (es) 1984-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI79120B (fi) Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein.
US5080898A (en) Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand
JP2534221B2 (ja) 牛のプレ成長および成長ホルモン
US5889149A (en) Purified PDGF AB isoform and method of making it
FI100253B (fi) Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi
NL8900178A (nl) Groei regulerende clycoproteinen.
JPH02501112A (ja) 免疫親和性による精製方法
EP0246307B1 (en) Cys codon-modified dna
JPS61219395A (ja) ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途
WO1991007418A1 (en) Chimeric mouse-human a10 antibody with specificity to a human tumor cell antigen
JPH05500310A (ja) 融合蛋白質の製造方法
WO1985002198A1 (en) Microbial expression of type i transforming growth factor, polypeptide analogs thereof and hybrid egf/tgf polypeptides
JP2771220B2 (ja) 植物性リボソーム不活化タンパク質をコードするヌクレオチド配列
JPH01503513A (ja) 血小板関連増殖調節剤
WO1991009952A1 (en) Lipoprotein signal peptide fused to antigenic polypeptides
US5411732A (en) Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefore
Boado et al. Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor
CA1217156A (en) Hybrid proteins
AU611048B2 (en) Genetic expression of somatostatin as hybrid polypeptide
US5166316A (en) Physiologically active peptides and a method of producing peptides
CA2083487A1 (en) Chimeric toxins with improved inter-domain geometry
JPS60246322A (ja) ヒトインタ−ロイキン−２に対する抗体
JPS63245691A (ja) ヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質およびその製造方法
JPS61501168A (ja) 生長因子における改良
NZ227372A (en) Murine monoclonal antibodies to human ifnalpha

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired

Owner name: PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE