FI100253B - Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi - Google Patents

Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI100253B
FI100253B FI860541A FI860541A FI100253B FI 100253 B FI100253 B FI 100253B FI 860541 A FI860541 A FI 860541A FI 860541 A FI860541 A FI 860541A FI 100253 B FI100253 B FI 100253B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
hybrid protein
diphtheria toxin
cell
fragment
sequence
Prior art date
Application number
FI860541A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI860541A0 (fi
FI860541A (fi
Inventor
John R Murphy
Original Assignee
Seragen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seragen Inc filed Critical Seragen Inc
Publication of FI860541A0 publication Critical patent/FI860541A0/fi
Publication of FI860541A publication Critical patent/FI860541A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI100253B publication Critical patent/FI100253B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Description

100253
Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi
Keksinnön kohteena on hybridiproteiini joka sisäl-5 tää vähintään sellaisen osan polypeptiligandin sitoutumis- alueesta, joka mahdollistaa hybridiproteiinin sitoutumisen selektiivisesti eläinsoluun, sekä menetelmä sen valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä plasmideja. Keksinnön kohteena on myös menetelmä soluryhmän leimaamiseksi in 10 vitro hybridiproteiinia käyttäen.
Tämä keksintö liittyy yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttöön hybridiproteiinimolekyylien tuottamiseen.
Kirjallisuudessa esitetään useita esimerkkejä fuusioiduista geeneistä, jotka koodaavat hybridiproteiineja. 15 Esimerkiksi Villa-Komaroff et ai. [P.N.A.S. U.S.A. 75 (1978) 3727 - 3731] kuvaavat fuusioitua geeniä, joka koostuu ei-sytoplasmiseen bakteerigeeniin fuusioidusta euka-ryoottisesta rakennegeenistä. Fuusioitu geeni koodaa hybridiproteiinia, joka kuljetetaan ulos sytoplasmasta.
20 Hybridiproteiineja on tehty myös muilla menetelmil lä (esimerkiksi yhdistämällä kaksi erilaista proteiinimo-lekyyliä), joissa ei käytetä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. On esimerkiksi ehdotettu, että muodostettaisiin yhteenliittämisen kautta terapeuttisia hybridiproteiineja, jotka koos-25 tuvat toksiinimolekyylien osista yhdistettyinä ligandiin, jolla on kyky sitoutua spesifisesti valittuun soluryhmään. Eräs yritys tällaisen hybridiproteiinin valmistamiseksi, jota kuvaavat Chang et ai. [J. Biol. Chem. 252 (1977) 1515 - 1522] , johti hybridiin, joka koostui difteriatoksiinin : 30 A-ketjusta liittyneenä ihmisen istukan laktogeenihormoniin disulfidisillan muodostaman ristisidoksen kautta. Hybridi- ’ proteiini, vaikka se sitoutuikin laktogeenireseptoreja si- 't>'' sältäviin soluihin, ei estänyt proteiinisynteesiä maini- '···' tuissa soluissa.
2 100253
Hybridiproteiinia, joka koostuu risiinitoksiinin A-ketjusta, joka on liittynyt ihmisen sikiön suonikalvon gonadotropiinihormoniin samalla tavalla disulfidisillan muodostaman ristisidoksen kautta, on myös kuvattu; vaikka 5 sen sanotaan olevan spesifinen, sen sitoutumiskapasiteet- tia ei ole kuvattu. Lisäksi tarvittiin äärimmäisen suuria pitoisuuksia proteiinisynteesin estämiseksi merkittävästi rotan Leydig- kasvainsoluissa, mikä teki vaikeaksi erottaa toisistaan "epäspesifinen", endosytoosin aiheuttama soluun 10 tulo ja "spesifinen" tulo, jonka aiheuttaa hybridin toksi sen osan kuljetus kohdesolujen sytoplasman kalvon läpi. [Oeltman et ai., J. Biol. Chem. 254 (1979) 1028 - 1032]. Sama epäkohta havaittiin hybridiproteiinissa, joka koostuu difteria A:sta, joka on yhdistetty insuliiniin käyttäen 15 kystamiinia silloitusaineena [Miskimins et ai., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 91 (1979) 143 - 151]. Hybridi, joka koostuu risiini A-.sta, joka on liitetty epidermaaliseen kasvutekijään (EGF) heterobifunktionaalisen silloittajan avulla, on myös valmistettu, mutta EGF:n antamat sitoutu-20 misominaisuudet eivät rajoitu tiettyihin soluihin, vaan kattavat ennemminkin suuren joukon erilaisia solutyyppejä !"/, [Cawley et ai, Cell 22 (1980) 563 - 570].
Keksintö koskee yleisesti ilmaistuna fuusioidun geenin koodaamaa hybridiproteiinia; hybridiproteiini voi- 25 daan leimata ja käyttää sitä diagnostisissa menettelyissä, '·”* esimerkiksi kuvauksessa in vivo ja in vitro. Fuusioitu geeni sisältää ensimmäisen jakson, joka koodaa difte- riatoksiinimolekyylin fragmenttia, joka antaa hybridipro- teiinille kyvyn tunkeutua solun sytoplasman kalvon läpi 30 mutta tekee hybridistä kyvyttömän tappamaan solu, fuusioi- tuna toiseen jaksoon, joka koodaa polypeptidiligandin ..· * osaa, joka tekee mahdolliseksi hybridiproteiinin sitoutu- • · : ‘ misen selektiivisesti soluun. Keksinnön mukaiselle hybri- '«·<' diproteiinille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuk- «:··; 35 sessa 1 esitetään.
100253 3
Ensimmäinen jakso koodaa difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivista A-fragmenttia vain osittain, edullisimmin ei ollenkaan.
Ensimmäinen sekvenssi koodaa edullisesti sellaista 5 osaa difteriatoksiinin B-fragmentista, joka riittää anta maan hybridiproteiinille kyvyn läpäistä solun sytoplasman kalvo; tämä jakso koodaa edullisesti B-fragmentin koko amfipaattista aluetta ja ainakin osaa hydrofobisesta alueesta. Ensimmäinen jakso ei saisi koodata koko B-fragment-10 tia sen varmistamiseksi, että hybridiproteiinin sitoutu mista ohjaa spesifisesti polypeptidiligandi eikä difteriatoksiinin yleinen sitoutumisalue.
Keksinnön mukaiset hybridiproteiinit voidaan leimata esimerkiksi radionuklidillä, väriaineella tai ydinmag-15 neettisen resonanssin (NMRm) suhteen aktiivisella ryhmäl lä, kuten 13C:llä. Hybridiproteiini sitoutuu selektiivisesti niihin kohdesoluihin, joiden suhteen polypeptidiligandi on spesifinen, ja menee sitten soluihin ja jää sinne, mikä tekee mahdolliseksi kuvaustutkimukset in vivo ja in vitro.
;·· 20 Keksintö on helpoimmin ymmärrettävissä piirrosten ·: avulla, joissa : .·. kuvio 1 on kaavamainen esitys difteriatoksiinimole- t t ,···. kyylistä.
Kuvio 2 on restriktiokartta, joka osoittaa difte-25 ria-tox-geenin sijainnin ja orientaation corynefaagi- II» ’ · β tox:n 3,9 kiloemäksen BamHI-restriktiofragmentilla.
Kuvio 3 on tox228-alleelin ja sitä reunustavien alueiden nukleotidisekvenssi, aminohapporyhmät on esitetty nukleotidien yläpuolella; B"-alue on merkittyjen Sau3AI- • 4 • 30 ja Nrul- kohtien välinen alue (kuvio 3 on sovellutus Kac- . zorekin et ai. kuviosta 1 [Science 221 (1983) 855]).
Kuvio 4 on kaavamainen esitys plasmidista, joka • · sisältää B-fragmenttia koodaavan jakson.
Kuvio 5 on kaavio liittäjistä, joita voidaan käyt-35 tää tässä kuvattujen fuusioitujen geenien valmistukseen.
4 « « 4 100253
Kuviot 6 ja 7 ovat kaavamaisia esityksiä plasmi-deista, jotka sisältävät B-fragmentin osia koodaavia jaksoja.
Kuvio 8 on kaavamainen esitys plasmidista, joka 5 sisältää alfa-MSH:ta koodaavan jakson.
Kuviot 9 ja 10 ovat kaavamaisia esityksiä tässä kuvattuja fuusioituja geenejä sisältävistä plasmideista.
Viitataksemme kuvioon 1, difteriatoksiinimolekyyli koostuu useista funktionaalisista "alueista", joita voi-10 daan luonnehtia, molekyylin aminoterminaalisesta päästä alkaen, hydrofobiseksi esisignaalijaksoksi s, entsymaattisesti aktiiviseksi A-fragmentiksi, 14-aminohaposta koostuvaksi, paljastetuksi, proteaasiherkäksi disulfidisilmukak-si (DSL) lj, joka sisältää pilkkoutumiskohdan, ja B-frag-15 mentiksi, joka sisältää lipidiin liittyvät alueet, ts.
amfipaattisen alueen ja hydrofobisen alueen; DSL l2:n ja karboksyyliterminaaliseksi pääksi a. DSL lx sisältää kolme arginiiniryhmää; A-fragmentin ja B-fragmentin välissä oleva Sau3Al-kohta (katso kuvio 2) on sellaisessa difte- • 20 riatoksiinigeenin kohdassa, joka vastaa kauimmaista ar- *; giniiniryhmää eteenpäin näistä kolmesta.
• * t * : Prosessi, jolla difteriatoksiini myrkyttää herkät · eukaryoottiset solut sisältää ainakin seuraavat vaiheet: '! (i) difteriatoksiini sitoutuu herkän solun pinnalla ole- ;; 25 viin spesifisiin reseptoreihin; (ii) ollessaan sitoutunee- '·’· na reseptoriinsa toksiinimolekyyli tunkeutuu endosyytti- rakkulan sisään; (iii) joko ennen tunkeutumista tai en-dosyyttirakkulan sisällä toksiinimolekyyli voi pilkkoutua (eli tulla prosessoiduksi) jostakin kohdasta i alueella, : 30 joka on 47 000 daltonin päässä N-terminaalisesta päästä; (iv) endosyyttirakkulan pH:n laskiessa alle 6:een toksii-’ nin pilkottu muoto, joka vielä on sitoutuneena resepto- *,/, riinsa, insertoituu spontaanisti punasolun soluliman kal- '··/] voon; (v) jouduttuaan kalvon sisään lipidiin liittyvät j··: 35 alueet muodostavat kalvon; (vi) tapahtuu proteolyyttinen
« « I
• f « 4 · 100253 5 katkeaminen l^ssä, A- ja B-fragmenttien välissä; (vii) sen jälkeen A-fragmentti tai A-fragmentin sisältävä polypepti-di vapautuu sytosoliin; (viii) A-fragmentin katalyyttinen vaikutus, ts. nikotiiniamidiadeniinidinukleotidista riip-5 puva pidennystekijä 2:n adenosiinidifosfaattiribosylaatio, aiheuttaa myrkyttyneen solu kuoleman. On ilmeistä, että sytosoliin päässyt yksi A-fragmenttimolekyyli riittää tappamaan solun.
Viitataksemme kuvioihin 1 ja 2, keksinnön mukainen 10 hybridiproteiini ei edullisesti sisällä ollenkaan difte riatoksiinin A-fragmenttia ja sisältää B-fragmentista osan y-z tai y-x (kuvio 1). Osaa y-z koodaa sekvenssi Sau3Al -Nrul (kuvio 2) , ja osaa y-x, joka sisältää l2:n, koodaa sekvenssi Sau3Al - Sphl. Hybridiproteiini sisältää edulli-15 simmin osan y-z sen takaamiseksi, ettei mukaan tule yhtään B-fragmentin yleistä sitoutumisaluetta. Lisäksi voidaan käyttää mitä tahansa B-fragmentin osaa, jota koodaa sekvenssi Sau3Al:stä kohtaan, joka on korkeintaan 180 emäspä-ria taaksepäin Nrul-sta. Tätä lyhyempi osa, esimerkiksi 20 jakson Sau3Al Clal koodaama osa, on liian lyhyt huokosen -· muodostuksen aiheuttamiseksi, eikä sellaista voida siksi : käyttää. B-fragmentin osia, joita koodaa jakso, joka lop puu Sphl:n jälkeen, ei tulisi käyttää, jotta estettäisiin difteriatoksiinin sitoutumiskohtien mukaantulo.
25 Polypeptidin mukanaan tuoma hybridiproteiinin osa voi koostua koko ligandista tai sellaisesta ligandin osasta, joka sisältää ligandin koko sitoutumisalueen tai si-toutumisalueen vaikuttavan osan.
Kun käytettävä ligandi on suuri, on toivottavaa, . ’· 30 että mukana on niin vähän kuin mahdollista ligandin sitou- : : tumatonta osaa, niin että molekyylin sitoutumisalue si- j·] * joittuu lähelle B-fragmentin hydrofobista aluetta. On myös ‘... toivottavaa, että mukana on ligandin koko sitoutumisalue ;·, tai suurin osa siitä, α-melanosyyttejä stimuloivan hormo- '!“ 35 nin (MSH), pienen, 13 aminohaposta koostuvan peptidin, tai 6 100253 β-MSH:n, joka sisältää 17 aminohappoa, ollessa kyseessä voidaan käyttää molekyylin yhdeksästä karboksyylipään aminohaposta koostuvaa osaa, joka sisältää reseptoris-pesifisen sitoutumisalueen, tai koko molekyyliä.
5 Soluspesifisten ligandien alueet, joissa sitoutu- misalue sijaitsee tunnetaan nykyään joukolle tällaisia ligandeja. Lisäksi viimeaikaiset edistysaskeleet kiinteä-faasipolypeptidisynteesin alalla voivat tehdä mahdolliseksi tätä tekniikkaa taitaville määrittää käytännöllisesti 10 katsoen minkä tahansa tällaisen ligandin sitoutumisalue syntetisoimalla erilaisia ligandin fragmentteja ja tutkimalla niistä kyky sitoutua siihen soluryhmään, joka on määrä leimata.
Detektoitavissa oleva merkkiaine, joka kiinnitetään 15 hybridiproteiinimolekyyliin, voi olla mikä tahansa ta vanomainen diagnostiseen leimaamiseen käytettävä atomi tai molekyyli; esimerkkejä ovat radioaktiiviset merkkiaineet, kuten 125I-pitoiset yhdisteet, teknetiumisotoopit, NMR-ak-tiiviset ryhmät ja fluoresoivat värit. Edullisimpia merk-20 kiaineita ovat hydrofobiset merkkiaineet, kuten fluoresoi vat värit (tavanomaisimmat fluoresoivat värit sattuvat olemaan hydrofobisia), jotka sisällytetään kohdesolujen sytoplasmakalvoon, kuten jäljempänä selvitetään tarkemmin. Merkkiaineet voidaan liittää hybridiproteiiniin tavanomai-; 25 sin leimausmenetelmin. Merkkiaineita käytetään sellainen määrä (esimerkiksi yksi tai kaksi molekyyliä proteiinimo-lekyyliä kohden), joka ei häiritse hybridiproteiinimole-kyylin sitoutumis- tai soluuntunkeutumistoimintoja.
Keksinnön mukaista leimattua hybridiproteiinia voi- I | •'· 30 daan käyttää diagnostisesti halutun kohdesoluryhmän lei- maamiseen. Polypeptidin ligandiosan spesifinen sitoutumis- ./ ‘ alue sitoutuu selektiivisesti kyseessä oleviin soluihin, « · ja ne ottavat sitten vastaan leimatun molekyylin en- • dosytoosin kautta, ja sen jälkeen merkkiaine siirtyy koh- *!'· 35 desolujen solukalvoon ja/tai sytoplasmaan.
« « « » « « 100253 7
Keksinnön mukaiselle menetelmälle soluryhmän leimaamiseksi in vitro on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 14 esitetään.
Prosessi, jolla keksinnön mukainen leimattu hybri-5 diproteiini voidaan sisällyttää soluun, voidaan esittää lyhyesti seuraavasti. Kohdesolut ottavat vastaan leimatun hybridiproteiinin reseptorivälitteisen endosytoosin kautta endosyyttirakkulaan; sen jälkeen muodostuu pH-ero en-dosyyttirakkulan kalvon poikki tuloksena solun ATP:sta 10 riippuvasta protonipumpusta. pH-ero kalvon poikki aiheut taa hybridiproteiinin, lipidiin liittyvä osa ja merkkiaine mukaan luettuina, sijoittumisen endosyyttirakkulan kalvon tasoon. Hybridiproteiinin hydrofobinen luonne saa proteiinin jäämään kalvoon, suojatuksi nopealta entsymaattiselta 15 hajoamiselta, joka tapahtuisi, jos leimattu proteiini oli si endosyyttirakkulan sytoplasmassa tai ontelossa.
Sijoituttuaan endosyyttirakkulan kalvon tasoon leimattu hybridiproteiini voi "toimia" seuraavasti. Endosyyt-tirakkula, joka kuroutuu sytoplasmakalvosta, tulee solun 20 sytoplasmaan ja voi sulautua lysosomiin, johon leimattu hybridiproteiini tulee sisällytetyksi. Endosyyttirakkula voi vaihtoehtoisesti kiertää takaisin solun-sytoplasmakal-voon. Kummassakin tapauksessa merkkiaine jää kohdesolun sisälle.
25 Keksinnön mukaiset hybridiproteiinit, joissa frag mentit liittyvät yhteen peptidisidoksin, ovat ylivoimaisia silloitettuihin hybrideihin nähden, koska keksinnön mukaiset proteiinit voivat olla homogeenisena näytteenä, jossa kaikki toistensa kanssa samanlaiset molekyylit ovat selek- * i i '' 30 tiivisiä tietyn soluryhmän suhteen.
< i i . v Sen soluryhmän, johon keksinnön mukaiset 4 « hybridiproteiinit sitoutuvat ja jonka ne leimaavat, määrää ,··· se polypeptidiligandi, joka tuo mukanaan hybridimolekyylin # *!*. sitoutuvan alueen. Voidaan käyttää mitä tahansa solus- 35 pesifistä ligandia, jolla on sitoutumisalue, joka on spe-
« · I
» · « · 100253 8 sifinen sen tietyn soluryhmän, joka on määrä leimata, suhteen. Polypeptidihormonit ovat tällaisia käyttökelpoisia ligandeja. Hybridiproteiinit, jotka valmistetaan käyttämällä a- tai β-MSH-.n sitoutumisaluetta, voivat esimerkiksi 5 sitoutua selektiivisesti melanosyytteihin, mikä tekee hyb rideistä käyttökelpoisia melanooman diagnosointiin ja me-lanoomaetäpesäkkeiden sijaintikohtien detektointiin in vivo ja in vitro. Muilla ligandeilla saadaan aikaan erilaisia spesifisyyksiä; aine P:n sitoutumisalue esimerkiksi 10 tunnistaa neuronien, jotka liittyvät kivun välittymiseen, pintareseptorit, niin että hybridejä, jotka on valmistettu aine P:tä käyttäen, voidaan käyttää kartoitettaessa niitä hermoston alueita, jotka sisältävät aine P:n reseptoreja. Muihin käyttökelpoisiin spesifisesti sitoutuviin ligandei-15 hin kuuluvat somatostatiini, interleukiini I, interleukii- ni II ja interleukiini III. Interleukiini II on erityisen tärkeä, koska se liittyy allergisiin reaktioihin ja autoimmuunisairauksiin, joissa aktivoidut T-solut ovat mukana, kuten systeeminen lupus erytmatosis (SLE). Muita käyt-20 tökelpoisia polypeptidiligandeja, joissa on soluspesifisiä sitoutuvia alueita, ovat follikkelia stimuloiva hormoni (spesifinen munasoluille); luteinisoiva hormoni (spesifinen munasoluille); kilpirauhasta stimuloiva hormoni (spesifinen kilpirauhassoluille), vasopressiini (spesifinen 25 kohtusoluille samoin kuin virtsarakko- ja suolis- tosoluille); prolaktiini (spesifinen rintasoluille); ja kasvuhormoni (spesifinen tietyille luusoluille).
Keksinnön mukaiset hybridiproteiinit valmistetaan ’ käyttämällä yhdistelmä-DNA-menetelmiä, joissa muodostetaan 3 0 haluttu fuusioitu geeni, joka koodaa hybridiproteiinia, ja « .···. ilmentämällä sitten fuusioitu geeni tavanomaisin menette- • ; lyin. Keksinnön mukaiselle hybridiproteiinin valmistus menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuk- «· · i V sessa 15 esitetään.
100253 9
Viitataksemme kuvioihin 2 ja 3, difteriä-toxopero-nin sijainti ja orientaatio corynefaagi ptoxt:n 3,9 ke:n BamHI- restriktiofragmentissa tekee mahdolliseksi tox-ope-ronin katkaisun halutusta kohdasta ja operonin halutun 5 osan fuusioimisen valittua polypeptidiligandia vastaavan geenin haluttuun osaan.
Edullisia vektoreita tarpeellisten geenifuusioiden toteuttamiseksi ovat plasmidit pUC7, pUC8, pUC9 ja pBR322. pUC-plasmidit, joita kuvaavat Viera et ai. [Gene 19 (1982) 10 259] (joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä), ovat eri tyisen hyvin soveltuvia kaksoispilkkomiskloonaukseen, menettelyyn, joka sallii fuusioitujen geenien suoran valmistuksen.
Keksintöön liittyvät geenifuusiot tehdään seuraa-15 vasti. Ensin irrotetaan osaa B' koodaava jakso (kuvio 2), joka sisältää B-fragmentin kaikki aminohapot 17 C-terminaalista aminohappoa lukuun ottamatta, tox228-alleelista ja sijoitetaan se plasmidiin. Tämä jakso (Sau3Al - Sau3Al, kuvio 2) sisältää restriktioendonukleaasikohdat Clal ja 20 Sphl (jotka ovat läsnä sekä villin tyypin tox-alleelissa että tox228-alleelissa) ja restriktioendonukleaasikohdan Nrul (joka on vain tox228-alleelissa) . Osaa B' koodaava jakso kloonattiin pUC8:n BamHI-kohtaan, jolloin saatiin pDT301 (kuvio 4) . pDT301 talletettiin the American Type 25 Culture Collectioniin, Rockville, MD, 11. toukokuuta 1983, ja sille annettiin ATCC-numero 39360.
pDT301:n sisältämää B'-osaa koodaavaa jaksoa muunnetaan sitten Nrul- tai Sphl-restriktiokohdasta, jotta tehtäisiin mahdolliseksi lukukehyksessä tapahtuva fuusio : 30 popyleptidiligandin sitoutumisaluetta koodaavan geenisek- venssin kanssa. Kun käytetään Nrul-kohtaa, tuloksena oleva ' fuusiotuote koodaa B-fragmentin osaa B" (y - z kuviossa ... 1), joka sisältää B-fragmentin amfipaattiset ja hydrofobi- • ·' set alueet, mutta ei l2:a. Kun käytetään Sphl-kohtaa, saa- 35 tava fuusiotuote koodaa B-fragmentin osaa y - x (kuvio l), 100253 10 ts. 12 on mukana. Clal- kohtaa ei käytetä, koska tuloksena oleva fuusiotuote koodaisi sellaista B-fragmentin osaa, josta puuttuu hydrofobinen alue ja joka on siten kykenemätön aiheuttamaan huokosen muodostumista kohdesoluissa.
5 Alla olevaan taulukkoon l on koottu edellä mainit tujen restriktiofragmenttien koodaamien B-fragmenttiin liittyvien proteiinien ominaisuudet.
koodattujen disul- aminohappojen amfipaatti- hydrofobi- fidi-10 fragmentti lukumäärä nen alue nen alue silta
Sau3AL-l (3' ) 342 + + +
Sau3Al-SohI 291 + + + 15 ,
Sau3AL-Hrul (3' ' ) 236 + +
Sau3Al-Clal 96 .+ - ~ ·: '· 20 ..· Viitataksemme kuvioon 5, osaa B' koodaavaa jaksoa muunne- taan joko Nrul- tai Sphl-restriktiokohdasta tuomalla siihen synteettinen oligonukleotidi, joka sisältää ainutkertaisen Pstl-restriktiokohdan, jota seuraa Cyskodoni ja 25 luennan lopetuskodoni. Tämä muuntaminen tekee mahdollisek si lukukehyksessä tapahtuvan fuusion peptidiligandin si-:·, toutumisaluetta koodaavaan geenisekvenssiin.
» » I
Kuviot 6 ja 7 valaisevat plasmideja, jotka on valmistettu tekemällä edellä mainitut muuntamiset. Kuvio 6 i '· 30 valaisee pDT331:ä, joka sisältää B-fragmenttia koodaavan : ' : jakson Sau3Al - Sph ja Sphl-Pstl-Cys-Stop-Sma -liittäjän, t<’/; joka näkyy kuvion 5 yläosassa. Kuvio 7 valaisee pDT32l:ä, .. . joka sisältää B-fragmenttia koodaavan jakson Sau3Al - Nrul « · · * ' ja Nrul-Pst-Cys-Stop-Sma -liittäjän, joka näkyy kuvion 5 35 alareunassa.
100253 11 pDT331:n ja pDT321:n Pstl-kohdat voivat toimia kohtina lukukehyksessä tapahtuvalle peptidiligandin sitoutu-misaluetta koodaavan sekvenssin, esimerkiksi melanosyytte-jä stimuloivaa hormonia (MSH) koodaavan sekvenssin, inser-5 tiolle. Tämä jakso, jossa on Pstl-restriktiokohdat kummas sakin päässä ja luennan lopetuskodoni 5'-päässä, on:
GCAAGTTATAGCATGGAACATTTTAGATGGGGAAAACCTGTATAGCTGCA
ACGTCGTTCAATATCGTACCTTGTAAAATCTACCCCTTTTGGACATATCG
10 Tätä sekvenssiä kloonattuna pUC8:aan, jolloin saadaan pMSHlo; valaistaan kuviossa 8.
Keksinnössä käytetyn fuusioidun geenin valmistamiseksi edellä kuvattu MSH:ta koodaava sekvenssi voidaan 15 kloonata pDT331:n Pstl-kohtaan oikeassa orientaatiossa.
MSH-sekvenssin insertiolla pDT331:een saadaan pDTM331, jota valaistaan kuviossa 9. Sijoitettaessa MSH-sekvenssi pDT321:een saadaan pDTM321, jota valaistaan kuviossa 10. Molemmat plasmidit koodaavat hybridiproteiineja, jotka 20 pystyvät sitoutumaan spesifisesti ja muodostamaan huokosia melanosyytteihin.
pDTM331 on talletettu the American Type Culture Collectioniin, ja sille on annettu ATCC-numero 53145. Hakija tietää velvollisuutensa korvata nämä viljelmät vas-25 taavilla, jos ne kuolevat ennen tässä julkistetun patentin voimassaoloajan loppumista, ja velvollisuutensa ilmoittaa ATCC:lie tämän patentin julkistamisesta, jona hetkenä talletetusta viljelmästä tehdään yleisön saatavissa oleva. Siihen asti talletetun viljelmän saa the Commisioner of 30 Patents 37 CFR §1.14:n ja 35 US §112:n ehtojen mukaisesti.
Toinen esimerkki soveltuvasta polypeptidiligandista on aine P (aine P:n käyttökelpoisuutta kuvataan edellä) . ... Fuusioitu geeni, joka sisältää aine P:tä vastaavan geenin ' ‘ a- tai β-MSH-geenin sijasta, valmistetaan periaatteessa 35 edellä kuvatulla tavalla. Aine p -geeni voidaan synte- 100253 12 tisoida käyttämällä tavanomaista kiinteäfaasioligonukleo-tidisynteesiä. Aine P -geenisekvenssi on-.
CGTCCTAAACCTCAGCAGTTCTTCGGTCTGATG.
5
Kuten edellä esitetystä käy ilmi, polypeptidiligan-dia koodaavan geenisekvenssin osan tulee olla riittävä sen mahdollistamiseksi, että vastaava aminohapposekvenssi saa aikaan hybridiproteiinin sitoutumisen valittuun soluryh-10 mään. Geeni sisältää edullisesti ligandin sitoutumisaluet- ta vastaavan geenisekvenssin kokonaan tai suurimmaksi osaksi.
Kuten yllä olevissa esimerkeissäkin, manipulointi-toimenpiteet tehdään yleensä käyttämällä kloonausvektorei-15 ta, esimerkiksi faageja tai plasmideja. Polypeptidiligan- din sitoutumisaluetta koodaava geenimateriaali voi olla joko kloonattua DNA:ta tai synteettinen oligonukleoti-. disekvenssi. Fuusioitu geeni on yleensä kloonausvektoris- ; sa, esimerkiksi plasmidissa tai faagissa, jolla transfor- : 20 moidaan viljelmässä olevat mikroorganismit tai hiiva- tai nisäkäsisäntäsolut. Hybridiproteiini kerätään sitten talteen solujen kasvualustasta tavanomaisin menetelmin.
Keksinnön mukaisten hybridiproteiinien puhdistus voidaan käytettävästä polypeptidiligandista riippumatta 25 tehdä affiniteettikromatografiän avulla käyttämällä difte riatoksiinin B-fragmentin vastaista monoklonaalista vasta-ainetta.
* * ... Kuten edellä mainittiin, leimattujen hybridiprote iinien tärkein diagnostinen käyttötarkoitus on etäpesäke-: '· 30 kohtien detektointi in vivo ja in vitro käyttämällä ta- ’«<tj vanomaisia soluvärjäys- ja leimausmenetelmiä. Tällainen detektointi voisi olla erityisen arvokasta kirurgiassa, .. . koska se antaa kirurgin tarvitsemaa tietoa siitä, kuinka ' ’ paljon kudosta tulee poistaa esimerkiksi melanoomaetä- 35 pesäkesoluja poistettaessa.

Claims (18)

100253
1. Hybridiproteiini, joka sisältää vähintään sellaisen osan polypeptiligandin sitoutumisalueesta, joka 5 mahdollistaa hybridiproteiinin sitoutumisen selektiivises ti eläinsoluun, tunnettu siitä, että mainittu osa on sitoutunut difteriatoksiinimolekyylin sellaiseen osaan, joka tekee hybridiproteiinista kykenevän tunkeutumaan solun sytoplasmakalvon läpi, edellyttäen että mainittu dif-10 teriatoksiinimolekyylin osa ei sisällä entsymaattisesti aktiivista osaa fragmentista A eikä difteriatoksiinin y-leistä sitoutumisaluetta, ja hybridiproteiini on mahdollisesti leimattu.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hybridiproteiini, 15 tunnettu siitä, että difteriatoksiinin osa sisäl tää difteriatoksiinimolekyylin fragmentin A entsymaattisesti inaktiivisen osan tai ei lainkaan fragmenttia A.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hybridiproteiini, tunnettu siitä, että difteriatoksiinin osa sisäl-20 tää amfipaattisen alueen sekä hydrofobisen alueen difte- riatoksiinista. '-· 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hybridiproteiini, tunnettu siitä, että hybridiproteiinia koodaa fuu-siogeeni, joka käsittää 25 ensimmäisen sekvenssin, joka koodaa sellaista dif teriatoksiinimolekyylin osaa, joka tekee hybridiproteii-nista kykenevän tunkeutumaan solun sytoplasmakalvon läpi, .*:· edellyttäen että mainittu difteriatoksiinimolekyylin osa • · ei sisällä entsymaattisesti aktiivista osaa fragmentista A '· ‘ 30 eikä difteriatoksiinin yleistä sitoutumisaluetta sekä . toisen sekvenssin, joka koodaa vähintään osaa sei- « « laisesta polypeptidiligandin sitoutumisaluetta, joka mah-dollistaa hybridiproteiinin sitoutumisen selektiivisesti - 4 « soluun. 100253
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen hybridiproteiini, tunnettu siitä, että fuusioidun geenin ensimmäinen sekvenssi sisältää tox228-geenin sekvenssin Sau3Al - Nrul tai Sau3Al - Sphl (kuva 2) .
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen hybridiproteiini, tunnettu siitä, että fuusioidun geenin ensimmäinen sekvenssi sisältää lisäksi difteriatoksiinin disulfidisil-mukkaa 12 koodaavan sekvenssin.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen hybridiproteiini, 10 tunnettu siitä, että fuusioidun geenin ensimmäinen sekvenssi sisältää sellaisen osan fragmenttia B koodaavas-ta alueesta, joka ulottuu lx:ä koodaavalla alueella olevasta Sau3Al-kohdasta pisteeseen, joka on korkeintaan 180 emäsparia taaksepäin asemasta, joka vastaa tox228-alleelin
15 Nrul-kohtaa (kuva 2).
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen hybridiproteiini , tunnettu siitä, että solu pystyy ottamaan hybridiproteiinin sisäänsä endosytoosin avulla.
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen hybridipro- 20 teiini, tunnettu siitä, että se on leimattu ha vaittavissa olevalla leimalla.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen hybridiproteii ni, tunnettu siitä, että leimalla on kyky sijoittua yhdessä hybridiproteiinin kanssa solun sytoplasmakal- 2. voon.
11. Jonkin patenttivaatimuksista 1 - 10 mukainen hybridiproteiini, tunnettu siitä, että polypepti-diligandi on hormoni.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen hybridiproteii- 30 ni, tunnettu siitä, että hormoni on a- tai β-me- ,,, lanosyyttejä stimuloiva hormoni. e < ,,,, 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen hybridiproteii- i ni, tunnettu siitä, että polypeptidiligandi on 1 ‘ alfa-melanosyyttejä stimuloiva hormoni, jota koodaa ku- 35 viossa 8 esitetty Pst-Pst restriktiofragmentti. 100253
14. Menetelmä soluryhmän leimaamiseksi in vitro, tunnettu siitä, että vaatimuksen 9 mukainen hyb-ridiproteiini saatetaan kosketuksiin solujen kanssa siten, * että leima voidaan sisällyttää solujen sytoplasmaan sillä 5 tavoin, että leiman omaavat solut ovat erotettavissa lei- maamattomista soluista.
15. Menetelmä hybridiproteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että isäntäsolu transformoidaan vaatimuksen 4 mukaista hybridiproteiinia koodaavalla fuu- 10 siogeenillä ja viljellään sopivassa alustassa ja hybridi- proteiini otetaan talteen kasvualustasta.
16. Kuvion 4 mukainen plasmidi pDT301.
17. Kuvion 10 mukainen plasmidi pDTM321.
18. Kuvion 9 mukainen plasmidi pDTM331. i 1 « < , · « I I I n N t « i « « i t « « 100253
FI860541A 1984-06-07 1986-02-06 Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi FI100253B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61819984A 1984-06-07 1984-06-07
US61819984 1984-06-07
PCT/US1985/001081 WO1986000090A1 (en) 1984-06-07 1985-06-07 Hybrid protein and fused gene encoding gene
US8501081 1985-06-07

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI860541A0 FI860541A0 (fi) 1986-02-06
FI860541A FI860541A (fi) 1986-02-06
FI100253B true FI100253B (fi) 1997-10-31

Family

ID=24476731

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI860541A FI100253B (fi) 1984-06-07 1986-02-06 Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0185076B1 (fi)
JP (2) JP2510984B2 (fi)
AT (1) ATE79136T1 (fi)
AU (1) AU592310B2 (fi)
CA (1) CA1339359C (fi)
DE (1) DE3586456T2 (fi)
ES (2) ES8708014A1 (fi)
FI (1) FI100253B (fi)
NO (1) NO176807C (fi)
NZ (1) NZ212312A (fi)
WO (1) WO1986000090A1 (fi)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU570762B2 (en) * 1983-12-23 1988-03-24 Australian National University, The Cloning of cdna for il-3
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
AU577856B2 (en) * 1985-01-17 1988-10-06 Immunex Corporation Cloning and characterization of the human interleukin 1 gene
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
DE3856559T2 (de) * 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5132405A (en) * 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ATE87007T1 (de) * 1987-05-29 1993-04-15 Sagami Chem Res Fusionsprotein, enthaltend lymphotoxin.
JP2878341B2 (ja) * 1989-03-03 1999-04-05 学校法人藤田学園 人工機能性ポリペプチド
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
JPH05502880A (ja) * 1989-12-22 1993-05-20 セラジェン・インコーポレーテッド トランスロケーション領域および細胞結合領域を有するハイブリッド分子
JP3311346B2 (ja) * 1990-03-02 2002-08-05 ボストン・メディカル・センター・コーポレーション 改良されたキメラ毒素
US5837491A (en) * 1991-11-04 1998-11-17 Xoma Corporation Polynucleotides encoding gelonin sequences
US5621083A (en) 1991-11-04 1997-04-15 Xoma Corporation Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
US6146850A (en) 1991-11-04 2000-11-14 Xoma Corporation Proteins encoding gelonin sequences
US5777078A (en) * 1993-04-28 1998-07-07 Worcester Foundation For Experimental Biology Triggered pore-forming agents
CA2160909A1 (en) * 1993-04-28 1994-11-10 Hagan Bayley Cell-targeted lytic pore-forming agents
US6635740B1 (en) 1997-03-27 2003-10-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
WO1999005167A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 University Of Massachusetts Designed protein pores as components for biosensors
US6680058B1 (en) 1997-09-03 2004-01-20 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU573529B2 (en) * 1982-05-12 1988-06-16 President And Fellows Of Harvard College Hybrid proteins
US4468382A (en) * 1982-07-15 1984-08-28 New England Medical Center, Inc. Polypeptide-toxin hybrid protein

Also Published As

Publication number Publication date
WO1986000090A1 (en) 1986-01-03
EP0185076B1 (en) 1992-08-05
FI860541A0 (fi) 1986-02-06
DE3586456D1 (de) 1992-09-10
AU4491685A (en) 1986-01-10
EP0185076A1 (fi) 1986-06-25
AU592310B2 (en) 1990-01-11
DE3586456T2 (de) 1993-03-25
ES8801376A1 (es) 1987-12-16
EP0185076A4 (fi) 1987-11-09
NO176807B (no) 1995-02-20
NZ212312A (en) 1988-09-29
FI860541A (fi) 1986-02-06
ES8708014A1 (es) 1987-09-01
ES557103A0 (es) 1987-12-16
CA1339359C (en) 1997-08-26
JP2510984B2 (ja) 1996-06-26
ES543938A0 (es) 1987-09-01
NO860421L (no) 1986-02-06
ATE79136T1 (de) 1992-08-15
JPS61502304A (ja) 1986-10-16
JPH06205684A (ja) 1994-07-26
NO176807C (no) 1995-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI100253B (fi) Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi
EP0108146B1 (en) Fused genes encoding hybrid proteins, cloning vectors containing them and the use thereof
US5965406A (en) Recombinant DNAS encoding three-part hybrid proteins
US6022950A (en) Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
AU657087B2 (en) Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5080898A (en) Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand
WO1988005077A1 (en) A method of modifiying the metabolism of eukaryotic cells upon incorporation therein of foreign sequences of nucleic acids by means of an internalizing vector
EP0246307B1 (en) Cys codon-modified dna
KR940004077B1 (ko) 재조합 인히빈
US5242798A (en) Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
US4900811A (en) Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
EP0135277A1 (en) Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
CA1217156A (en) Hybrid proteins
CA2083487A1 (en) Chimeric toxins with improved inter-domain geometry
US5166316A (en) Physiologically active peptides and a method of producing peptides
EP0880583A1 (en) Estrogen response element binding proteins and nucleotides encoding therefor

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: SERAGEN, INC.

FG Patent granted

Owner name: SERAGEN, INC.