NO176807B

NO176807B - Sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, samt fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen; vektor og sammensmeltet gen

Info

Publication number: NO176807B
Application number: NO860421A
Authority: NO
Inventors: John R Murphy
Original assignee: Seragen Inc; John R Murphy
Priority date: 1984-06-07
Filing date: 1986-02-06
Publication date: 1995-02-20
Also published as: NO860421L; JPH06205684A; JPS61502304A; AU592310B2; NO176807C; AU4491685A; WO1986000090A1; EP0185076A4; ES543938A0; ATE79136T1; EP0185076B1; ES8801376A1; JP2510984B2; FI860541A; EP0185076A1; CA1339359C; ES557103A0; FI860541A0; DE3586456D1; ES8708014A1

Abstract

Et sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, idet det sammensmeltede gen inkluderer en første sekvens. som koder for et fragment av difteri-toksin-molekylet som gjør at hybridproteinet blir i stand til å trenge gjennom den cytoplasmiske membran i en celle og ute av stand til å drepe cellen, sammensmeltet til en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand som er effektiv til å gjøre at hybridproteinet binder seg selektivt til cellen.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av rekombinant-DNA-teknikker for fremstilling av hybrid-protein-molekyler.

Mer spesielt vedrører oppfinnelsen et sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, omfattende en første sekvens som koder for et fragment av difteritoksin-molekylet, sammensmeltet med en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand, noe som er nærmere beskrevet i krav 1.

Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen, idet genet er som beskrevet ovenfor og fremgangsmåten er nærmere beskrevet i krav 6.

Endelig vedrører oppfinnelsen en vektor som angitt i krav 12.

Litteraturen inneholder mange eksempler på sammensmeltede gener som koder for hybridproteiner. Eksempelvis beskriver Villa-Komaroff et al. (1978) i P.N.A.S. U.S.A.75, 3727-3731 et sammensmeltet gen bygd opp av et eukaryotisk strukturelt gen sammensmeltet til et ikke-cytoplasmisk bakteriegen. Det sammensmeltede gen koder for et hybridprotein som transporteres ut av cytoplasmaet.

Hybridproteiner er også laget ved andre metoder (for eksempel kobling av to forskjellige proteinmolekyler) som ikke involverer rekombinant-DNA-teknikker. Det er for eksempel foreslått å danne, ved kobling, terapeutiske hybridproteiner som består av deler av toksin-molekyler koblet til en ligand med evne til spesifikt å binde seg til en utvalgt klasse celler. Ett forsøk på

å lage et slikt hybridprotein, som er rapportert av Chang et al.

(1977) i J. Biol. Chem. 252, 1515-1522, resulterte i et hybrid

som bestod av difteri-toksin A-kjede koblet til human placental-laktogen-hormon ved tverrbinding via en disulfidbinding. Hybridproteinet inhiberte ikke proteinsyntese i disse celler, selv om det bandt seg til celler som inneholdt laktogen-reseptorer.

Et hybridprotein bestående av ricintoksin-A-kjeden koblet

til 3-kjeden i human-chorionisk gonadotropin-hormon ved likeledes å tverrbinde via en disulfidbinding er også blitt rapportert; skjønt det sies å ha spesifisitet, er dets bindingskapasitet ikke rapportert. Videre var det nødvendig med ekstremt høye konsentra-sjoner for signifikant å inhibere proteinsyntese i Leydig-tumor-

celle hos rotte, hvilket gjorde det vanskelig å skjelne mellom

"ikke-spesifikk" inngang forårsaket av endocytose og "spesifikk" inngang forårsaket av transport av den toksiske del av hybridet over den cytoplasmiske membran i målcellene (Oeltman et al. [1979] i J. Biol. Chem., 254, 1028-1032). Den samme mangel ble funnet i et hybridprotein bestående av difteri A koblet til insulin ved anvendelse av cystamin som tverrbindingsmiddel (Miskimins et al.

[1979] i Biochem. Biophys. Res. Commun., 91, 143-151). Et hybrid bestående av ricin A koblet til epidermal vekstfaktor (EGF) ved hjelp av en heterobifunksjonell tverrbinder er også laget, men de bindingskarakteristika som tilveiebringes av EGF er ikke begrenset til spesifikke celler, men omfatter snarere et stort utvalg av celletyper (Cawley et al. [1980] Cell, 22, 563-570).

Foreliggende oppfinnelse dreier seg generelt om et sammensmeltet gen og fremstilling av det hybridprotein som det koder for; hybridproteinet kan merkes og anvendes i diagnostiske metoder, for eksempel ved avbildning in vivo og in vitro. Det sammensmeltede gen inkluderer en første sekvens som koder for et fragment i difteri-toksin-molekylet som gjør hybridproteinet i stand til å trenge gjennom den cytoplasmiske membran i cellen, men ute av stand til å drepe cellen, smeltet til en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand som er effektiv til å muliggjøre at hybridproteinet binder seg selektivt til cellen.

Det henvises forøvrig til krav 1.

I foretrukne utførelsesformer utkoder første sekvens mindre enn alt, og helst intet, av det enzymatisk aktive fragment A i difteri-toksin. Fortrinnsvis utkoder den første sekvens en del av fragment B i difteri-toksin tilstrekkelig til å muliggjøre at hybridproteinet trenger gjennom den cytoplasmiske membran i cellen; fortrinnsvis koder denne sekvns for hele den amfipatiske domene og minst en del av den hydrofobe domene i fragment B. Den første sekvens bør ikke kode for hele fragment B, for å sikre at binding av hybridproteinet blir spesifikt dirigert av polypeptidliganden og ikke av den generaliserte bindingsdomene i difteritoksin.

Hybridproteinene som her beskrives kan merkes, for eksempel med et radionukleotid, et farvestoff eller en kjernemagnetisk resonans (NMR)-rapportørgruppe, for eksempel <13>C. Hybridproteinet binder seg selektivt til målcellene som polypeptidliganden er spesifikk for, og kommer så inn i, og blir innfanget i, cellene, hvilket forenkler bildelagingsstudier in vivo og in vitro.

Oppfinnelsen vil bli bedre forstått under betraktning av tegningene, hvor: Fig. 1 er en skjematisk oppstilling av difteri-toksinmolekylet. Fig. 2 er et restriksjonskart som viser lokaliseringen og orienteringen tii difteri- tox-genet på 3,9 kb BamH-I-restrik-

tox

sjonsfragmentet til corynephage 3

Fig. 3 er den nukleotide sekvens for tox 228-allele- og flankeregionene, med aminosyrerester vist over nukleotider; B<1>'-regionen er regionen mellom de merkede Sau3AI- og Nrul-punkter (fig. 3 var tilpasset fra fig. 1 til Kaczorek et al.

[1983] Science 221, 855). Fig. 4 er en skjematisk representasjon av et plasmid inne-holdende den sekvens som koder for Fragment B. Fig. 5 er et diagram for linkere (bindeledd) som kan anvendes for å fremstille sammensmeltede gener som her beskrevet. Fig. 6 og 7 er skjematiske representasjoner av plasmider som inneholder sekvenser som koder for deler av Fragment B. Fig. 8 er en skjematisk representasjon av et plasmid som inneholder en sekvens som koder for a-MSH. Fig. 9 og 10 er skjematiske representasjoner for plasmider som inneholder sammensmeltede gener som her beskrevet.

Med henvisning til fig. 1 består difteri-toksinmolekylet av flere funksjonelle "domener" åom kan karakteriseres, idet man be-gynner ved aminoterminalenden til molekylet, som hydrofob leder-signalsekvens s, enzymatisk aktivt Fragment A, den 14 aminosyre-eksponerte protease-sensitive disulfid-loop (DSL) l^, innehold-ende en spaltningsdomene, og Fragment B, som inkluderer de lipid-assosierende regioner, dvs. en amfipatisk domene og en hydrofob domene: DSL ; og karboksyterminal-ende a. DSL inneholder tre argininrester; Sau3Al-punktet mellom Fragment A og Fragment B (se fig. 2) er i en posisjon på difteri-toksin-genet som tilsvarer argininresten lengst nedstrøms av de tre.

Fremgangsmåten ved hvilken difteri-toksin intoksikerer sensitive eukaryote celler involverer minst de følgende trinn: (i) difteri-toksin binder seg til spesifikke reseptorer på overflaten av en sensitiv celle; (ii) mens det er bundet til sin reseptor, blir toksinmolekylet internalisert i en endocytisk vesikkel; (iii) enten før internalisering, eller inne i den endocytiske vesikkel, kan toksinmolekylet bli kløvet (eller viderebe-arbeidet) ved et punkt i regionen 47 000 dalton fra N-terminal-enden; (iv) etter hvert som pH-verdien til den endocytiske vesikkel avtar til under 6, føyer den viderebearbeidede form av toksin, selv om den fremdeles er bundet til sin reseptor, seg spontant inn i den endosomale membran; (v) straks etter innleiring i membranen danner de lipid-assosierende regioner en pore; (vi) en proteolytisk kløvning i mellom Fragment A og B, inntreffer; (vii) deretter frigjøres Fragment A, eller et poly-peptid som inneholder Fragment A, inn i cytosolen; (viii) den katalytiske aktivitet for Fragment A, dvs. den nikotinamid-adenin-dinukleotid-avhengige adenosin-difosfat-ribosylering for forlengelsesfaktor 2, forårsaker døden hos den intoksikerte celle. Det er tydelig at et enkelt molekyl i Fragment A innført i cytosolen er tilstrekkelig til å drepe cellen.

Under henvisning til figurene 1 og 2 inneholder det hybrid-protein som her er beskrevet, fortrinnsvis intet av Fragment A

i difteri-toksin, og inneholder delen av fragment B fra y til z eller fra y til x (fig. 1). y-z-delen utkodes av Sau3Al- Nrul-sekvensen (fig. 2) og y-x-delen, som inkluderer l2r utkodes av Sau3Al-Sphl-sekvensen. Det foretrekkes helst at hybridproteinet inneholder y-z, for å sikre at intet av den generaliserte bindingsdomene i Fragment B er inkludert. I tillegg kan enhver del av Fragment B som utkodes av en sekvens fra Sau3Al til et punkt ikke mer enn 180 basepar oppstrøms fra Nrul anvendes. En del som er kortere enn dette, f.eks. den som utkodes av Sau3Al- Clal, er for kort til å bevirke poredannelse og kan derfor ikke anvendes. Deler av Fragment B som utkodes av en sekvens som ender nedstrøms for Sphl bør ikke anvendes, for å unngå å inkludere difteri-toksinbindingspunktene.

Den del av hybridproteinet som det bidras med av polypeptidliganden kan bestå av hele liganden, eller en del av liganden som inkluderer hele bindingsdomenen til liganden, eller en effektiv del av bindingsdomenen.

Når den ligand som anvendes er stor, er det ønskelig at

så lite som mulig av den ikke-bindende del av liganden inklude-res, slik at bindingsdomenen i molekylet er beliggende nær den hydrofobe domene hos Fragment B. Det er også ønskelig å inkludere alt eller det meste av bindingsdomenen i ligandmolekylet.

I tilfellet av a-melanocytt-stimulerende hormon (MSH) kan et

lite peptid med 13 aminosyrer, eller Ø-MSH, som inneholder 17 aminosyrer, idet delen av molekylet består av 9 aminosyrer ved karboksyterminalenden i molekylet., som inneholder den reseptor-spesifikke bindingsdomene, anvendes, eller hele molekylet kan anvendes.

Regionene inne i cellespesifikke ligander i hvilke bindingsdomenen er lokalisert, er nå kjent for en rekke slike ligander. Videre kan nylige fremskritt i fastfase-polypeptidsyntese gjøre det mulig for fagmannen på dette fagområde å bestemme bindingsdomenen til praktisk talt hvilken som helst slik ligand, ved å syntetisere varierende fragmenter av liganden og teste dem med hensyn på evne til å binde seg til den klasse av celler som skal merkes.

Den påvisbare merkelapp som festes på hybridproteinmoleky-let kan være hvilket som helst konvensjonelt atom eller molekyl som anvendes for diagnostisk merking; eksempler er radioaktive merkelapper som f.eks. 12 5I-holdige forbindelser, technitium-isotoper, NMR-rapportørgrupper, samt fluorescerende farvestoffer. De mest foretrukne merkelapper er hydrofobe merkelapper, for eksempel fluorescerende farvestoffer (de fleste konvensjonelle fluorescerende farvestoffer er tilfeldigvis hydrofobe) som inkorporeres i den cytoplasmiske membran hos målceller, hvilket skal forklares mer detaljert nedenunder. Merkelapper kan festes på hybridproteinet ved hjelp av konvensjonelle-merkingsteknikker. Merkelapper vil bli anvendt i en mengde, (f.eks. ett eller to merkingsmolekyler pr. proteinmolekyl) som ikke interfererer med bindings- eller cellegjennomtrengnings-funksjonene til hybrid-proteinmolekylet.

Det merkede hybridprotein som her er beskrevet kan anvendes diagnostisk for å merke en ønsket klasse av målceller. Den spesifikke bindingsdomene hos polypeptidliganddelen binder seg selektivt til slike celler, og det merkede molekyl tas så opp av cellene via endocytose, og merkelappen blir etterpå levert til cellemembranen og/eller cytoplasmaet i målcellene.

Den fremgangsmåte ved hvilken et merket hybridprotein frem-stilt i henhold til oppfinnelsen kan inkorporeres i celler kan oppsummeres som folger. Det merkede hybridprotein tas opp av målceller via reseptor-mediert endocytose inn i en endocytisk vesikkel; deretter etableres et pH-differensial over membranen i den endocytiske vesikkel som et resultat av cellens ATP-avhengige protonpumpe. pH-differensialet over membranen forårsaker at hybridproteinet inklusive dets lipid-assosierende del og dets merkelapp blir innføyd i planet i membranen til den endocytiske vesikkel. Den hydrofobe natur av hybridproteinet forårsaker at det forblir i membranen, beskyttet mot den hurtige enzymatiske nedbrytning som ville inntreffe hvis det merkede protein skulle oppholde seg i cytoplasmaet eller i den endocytiske vesikkels lumen.

Etter innføyning av den endocytiske vesikkel i planet til membranen kan det merkede hybridprotein "trafikkere", som føl-ger. Den endocytiske vesikkel, som knoppskyter fra den cytoplasmiske membran, kommer inn i cytoplasmaet i cellen og kan så gå opp i et lysosom, som det merkede hybridprotein inkorporeres i. Alternativt kan den endocytiske vesikkel resirkulere til cellens cytoplasmiske membran. I hvert tilfelle forblir merkelappen fanget i målcellen.

Hybridproteinene som fremstilles i henhold til oppfinnelsen,

i hvilke fragmenter er forenet via peptidbindinger, er overlegne i forhold til tverrbundne hybrider, fordi proteinene her kan tilveiebringes i en homogen prøve, i hvilken alle de identiske molekyler er selektive for en spesiell klasse av celler.

Den spesifikke klasse av celler som blir bundet og merket av de her beskrevne hybridproteiner bestemmes av den spesifikke polypeptidligand som tar opp bindingsdomenen i hybridmolekylet. Enhver cellespesifikk polypeptidligand kan anvendes som har en bindingsdomene som er spesifikk for en spesiell klasse av celler som skal merkes. Polypeptidhormoner er anvendelige sådanne ligander. Hybridproteiner laget ved anvendelse av bindingsdomenen til a- eller ( 3- MSH, for eksempel, kan selektivt binde seg til melanocytter, idet de gjør hybridene nyttige i diagnose av melanom og in vivo- og in vitro-påvisning av metastic melanoma loci. Andre ligander gir ulike spesifisiteter; for eksempel gjenkjenner bindingsdomenen til substans P reseptorer på overflaten av neuroner som er involvert i overføring av smerte, slik at hybrider som er laget under anvendelse av substans P kan anvendes for å kartlegge arealer i nervesystemet som inneholder substans P-reseptorer. Andre spesifikt bindende ligander som kan anvendes inkluderer somatostatin, interleukin I, interleukin II og interleukin III. Interleukin II er av spesiell betydning på grunn av sin rolle i allergiske reaksjoner og autoimmune sykdommer som for eksempel systemisk Lupus Erythmatosis (SLE), hvor aktiverte T-celler er involvert. Andre nyttige polypeptidligander som har cellespesifikke bindingsdomener er follikel-stimulerende hormon (spesifikt for eggceller); luteiniserende hormon (spesifikt for eggceller); thyroid-stimulerende hormon (spesifikt for thyroidceller); vaso-pressin (spesifikt for livmorceller såvel som blære- og innvoll-celler); prolaktin (spesifikt for brystceller); og veksthormon (spesifikt for visse benceller).

Hybridproteinene blir i henhold til oppfinnelsen laget ved anvendelse av rekombinant-DNA-teknikker som innebærer å danne det ønskede sammensmeltede gen som koder for hybridproteinet, og deretter utkode det sammensmeltede gen, under anvendelse av konvensjonelle metoder. Under henvisning til fig. 2 og 3 tillater lokaliseringen og orienteringen av difteri- tox-operonet på 3,9

kb BamH-I-restriksjonsfragmentet til corynephage Ø<tOX+> tox-operonet å bli kløvet ved en ønsket lokalisering, og den ønskede del av operonet å bli sammensmeltet med den ønskede del av genet for en utvalgt polypeptidligand.

De foretrukne vektorer for utførelse av de nødvendige genfusjoner er plasmidene pUC7, pUC8, pUC9, og pBR322. pUC-plasmidene, beskrevet av Viera et al. (1982) i Gene 1_9, 259 (herved in-korporert ved henvisning) er spesielt godt egnet for dobbelt-spaltingskloning, en metode som gjør det mulig å lage de sammensmeltede gener utvetydig.

Genfusjoner lages som følger:

For det første kuttes en sekvens som koder for B' (fig. 2), som inkluderer alle, så nær som de C-terminale 17 aminosyrer i frag-22 8

ment B, fra tox -allelet og innføyes i et plasmid. Denne sekvens (Sau3Al-Sau3Al, fig. 2) bærer restriksjons-endonuklease-punktene Clal og Sphl (som er til stede på både vill-type- tox-allele og tox 22 8-allele) , og restriksjons-endonukleasepunktet Nrul (som er unik for tox 228-allele). Den B<1->utkodende sekvens ble klonet inn i BamHl-punktet til pUC8 slik at man fikk pDT301 (fig. 4). pDT30l ble deponert i American Type Culture Collection, Rockville, MD den 11. mai 1983 og fikk ATCC-tilgjengelighetsnummer 39360.

Den B<1->utkodende sekvens i pDT30l modifiseres deretter ved Nrul-eller Sphl-restriksjonspunktet for å gjøre i-ramme-fusjonen med en gensekvens som koder for bindingsdomenen til en polypeptidligand lettere. Hvis Nrul-punktet anvendes, koder den resulterende fusjon for B''-delen i Fragment B (fra y til z i fig. 1), hvilket inkluderer de amfipatiske og hydrofobe domener i fragment B, men ikke %^ * Hvis Sphl-punktet anvendes, koder den resulterende fusjon for delen av Fragment B fra y til x i fig. 1; dvs. at £2 er inkludert. Clal-punktet ble ikke anvendt fordi den resulterende fusjon ville kode for en del av Fragment B som mangler

den hydrofobe domene ville således ikke være i stand til å forår-sake poredannelse i målceller.

Tabell 1 nedenunder oppsummerer egenskapene til de Fragment B-relaterte proteiner som utkodes av de ovennevnte restriksjons-fragmenter.

Under henvisning til fig. 5 modifiseres den B<1->utkodende sekvens ved enten Nrul- eller Sphl-restriksionspunktet ved inn-føring av et syntetisk oligonukleotid som koder for et unikt Pstl-restriksjonspunkt fulgt av et Cys-kodon og et translaterende stopp-kodon. Denne modifikasjon tillater i-ramme-fusjon med en gen-sekvens som koder for bindingsdomenen til en peptidligand.

Fig. 6 og 7 illustrerer plasmider laget ved utførelse av de ovenstående modifikasjoner. Fig. 6 illustrerer pDT331, som inneholder den fragment-B-utkodende sekvens fra Sau3Al til Sphl og Sphl- Pstl-Cys-Stop- Sma^linkeren som er vist ved toppen av fig. 5. Fig. 7 illustrerer pDT321, som inneholder den fragment B-utkodende sekvens fra Sau3Al til Nrul og Nrul- Pst-Cys-Stop-Sma-linkeren som er vist ved bunnen av fig. 5.

Pstl-punktene til pDT331 og pDT321 kan tjene som punktene for i-ramme-innføyning av en gensekvens som koder for en peptidligand-bindingsdomene, for eksempel den sekvens som koder for melanocyttstimulerende hormon (MSH). Denne sekvens, med Pstl-restriks jonspunkter ved hver ende, og et translaterende stopp-kodon ved 5<1->enden er:

Denne sekvens, klonet i pUCB slik at den gir pMSHIO, er illustrert i fig. 8.

For å lage et sammensmeltet gen i henhold til oppfinnelsen kan den MSH-utkodende sekvens, som er angitt ovenfor, klones inn i Pstl-punktet til pDT331 eller pDT321 i den korrekte ori-entering. Innføyning av MSH-sekvensen i pDT33l gir pDTM331, illustrert i fig. 9. Innføyning av MSH-sekvensen i pDT321 gir pDTM321, illustrert i fig. 10. Begge plasmider koder for hybridproteiner som kan binde seg selektivt til og danne porer i melanocytter.

pDTM331 er deponert hos American Type Culture Collection

(12. juni.1985) og har fått ATCC-tilgjengelighetsnummer ATCC 5314 5. Søkeren erkjenner sitt ansvar med å erstatte disse kul-turer hvis de skulle dø før slutten av gyldighetstiden for et patent som måtte følge av denne søknad, og sitt ansvar til å opplyse ATCC om utstedelse av et slikt patent, ved hvilket tids-rom deponeringen vil bli gjort tilgjengelig for almenheten.

Inntil dette tidspunkt vil deponeringen bli gjort tilgjengelig for Commissioner of Patents i henhold til 37 CFR §1.14 og 35 USC §112.

Et annet eksempel på en egnet polypeptidligand er substans P (nytten av substans P er beskrevet ovenfor). Et sammensmeltet gen som inneholder substans P-genet, snarere enn det a- eller /3-MSH-genet, blir grunnleggende laget som angitt ovenfor. Substans P-genet kan bli syntetisert under anvendelse av konvensjonell fastfase-oligonukleotid-syntese. Substans P-gen-sekvensen er:

Som tydelig fremgår av ovenstående, må den del av den genetiske sekvens som koder for polypeptidliganden være tilstrekkelig til å muliggjøre at den tilsvarende aminosyresekvens bringer hybridproteinet til å binde seg til den utvalgte klasse av celler. Fortrinnsvis inkluderer genet alt eller mesteparten av den genetiske sekvens for bindingsdomenen til liganden.

Generelt, som i ovenstående eksempler, utføres de manipule-rende operasjoner ved anvendelse av kloningsvektorer; f.eks. fager eller plasmider. Det genetiske materiale som koder for bindingsdomenen til polypeptidliganden kan enten være klonet DNA eller en syntetisk oligonukleotid-sekvens. Generelt vil det sammensmeltede gen være beliggende på en kloningsvektor, f.eks. et plasmid eller en fag, som anvendes for å transformere dyrke-de mikroorganismer eller gjær eller pattedyrvertsceller. Hybridproteinet innhøstes deretter fra kulturmediene til cellene under anvendelse av konvensjonelle teknikker.

Rensning av hybridproteinene i henhold til oppfinnelsen, uten hensyntagen til den polypeptidligand som er anvendt, kan utføres via affinitetskromatografi, ved anvendelse av et mono-klonalt antistoff mot difteri-toksin Fragment B.

Som omtalt ovenfor, vil en hoveddiagnostisk anvendelse av de merkede hybridproteiner være påvisning in vivo og in vitro av metastatiske loci., under anvendelse av konvensjonelle celle-farvnings- og merketeknikker. En slik påvisning kunne være av spesiell verdi i kirurgi, ved at kirurgen tilveiebringes den in-formasjon som er nødvendig for å vite hvor meget vev han skal kutte ut når han fjerner for eksempel metastatiske melanomceller.

Andre utførelsesformer er innen de følgende krav.

Claims

1. Sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, karakterisert ved at det omfatter en første sekvens som koder for et fragment av difteritoksin-molekylet (vist i sin helhet i fig. 3), hvilket fragment gjør hybridproteinet i stand til å trenge gjennom den cytoplasmiske membran i en celle, sammensmeltet med en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand som er effektiv til å gjøre det mulig for hybridproteinet å binde seg selektivt til cellen, forutsatt at (a) når den første sekvens er Sau3AI-Nrul-restriksjonsfragmentet i difteri- tox228-allele og det fragment som koder disulfid-loop lz i difteritoksin, koder den annen sekvens ikke for a-eller /3-melanocytt-stimulerende hormon; og (b) det sammensmeltede gen koder ikke for en enzymatisk aktiv del av fragment A.

2. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1, karakterisert ved at den første sekvens koder for en del av fragment B i difteritoksin som er tilstrekkelig til å muliggjøre at hybridproteinet trenger gjennom den cytoplasmiske membran i cellen og ikke koder for den generaliserte bindingsdomene i fragment B.

3. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den første sekvens omfatter Sau3Al- Nrul-sekvensen eller Sau3Al- Sphl-sekvensen til tox<228->genet, illustrert som segment B" i fig. 2.

4. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1 eller 3, karakterisert ved at den første sekvens inkluderer den sekvens som koder for den amfipatiske domene og den hydrofobe domene i difteritoksin-molekylet (som skjematisk vist i fig. 1), og eventuelt at den første sekvens ytterligere omfatter en sekvens som koder for disulfid-loop l2.

5. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1, karakterisert ved at den første sekvens koder for alt av den amfipatiske domene og minst en del av den hydrofobe domene i fragment B i difteritoksin, idet den første sekvens inkluderer minst den del av fragment B-utkodingsregionen fra Sau3Al-punktet i den £1-utkodede region til et punkt ikke mer enn 180 basepar oppstrøms fra den posisjon som tilsvarer Nrul-punktet på tox-<228->allelen.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen, hvor det sammensmeltede gen omfatter en første sekvens som koder for et fragment av difteritoksin-molekylet som gjør hybridproteinet i stand til å gjennomtrenge den cytoplasmiske membran i en celle, sammensmeltet med en andre sekvens som koder en del av en polypeptidligand som er effektiv til å muliggjøre hybridproteinet å binde seg selektivt til cellen, forutsatt at (a) når den første sekvens er Sau3AI-Nrul-restriksjonsfragmentet i difteri- tox228-allele og det fragment som koder disulfid-loop £2 i difteritoksin, koder den annen sekvens ikke for a- eller /3-melanocytt-stimulerende hormon; og (b) det sammensmeltede gen ikke koder for en enzymatisk aktiv del av difteritoksin fragment A, karakterisert ved følgende trinn: å omdanne en vertscelle med det sammensmeltede gen, og å dyrke den således omdannede vertscelle i miljø under betingelser som er egnet til å bevirke ekspresjon av det sammensmeltede gen, og eventuelt det ytterligere trinn å feste en detekterbar merking på hybridproteinet, samt eventuelt også det trinn å isolere hybridproteinet fra miljøet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at merkingen er et fluorescerende farvestoff.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at hybridproteinet som bærer det fluorescerende farvestoff har evne til å bli innføyd i den cytoplasmiske membran i cellen.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at hybridproteinet har evne til å bli tatt opp av cellen ved endocytose.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at polypeptidliganden er et polypeptidhormon.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at hormonet er interleukin I, interleukin II, interleukin III eller a- eller /3-hCG.

12. Vektor, karakterisert ved at den omfatter og er istand til å uttrykke et sammensmeltet gen som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 5.

13. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at polypeptidliganden er et polypeptidhormon.

14. Sammensmeltet gen som angitt i krav 14, karakterisert ved hormonet er interleukin I, interleukin II, interleukin III eller a- eller /3-hCG.

15. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1, karakterisert ved at den første sekvens koder mindre enn alt eller intet av fragment A i difteritoksin.