NO176807B - Sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, samt fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen; vektor og sammensmeltet gen - Google Patents
Sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, samt fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen; vektor og sammensmeltet gen Download PDFInfo
- Publication number
- NO176807B NO176807B NO860421A NO860421A NO176807B NO 176807 B NO176807 B NO 176807B NO 860421 A NO860421 A NO 860421A NO 860421 A NO860421 A NO 860421A NO 176807 B NO176807 B NO 176807B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- sequence
- fragment
- hybrid protein
- fused gene
- stated
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 8
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 claims description 8
- 101800001751 Melanocyte-stimulating hormone alpha Proteins 0.000 claims description 6
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 claims description 3
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 claims description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 3
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 101800000992 Melanocyte-stimulating hormone beta Proteins 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 10
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N α-msh Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101800002949 Diphtheria toxin fragment B Proteins 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000637 Melanocyte-Stimulating Hormone Substances 0.000 description 1
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102400000740 Melanocyte-stimulating hormone alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710200814 Melanotropin alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710129905 Melanotropin beta Proteins 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000002002 Neurokinin-1 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010040718 Neurokinin-1 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004576 Placental Lactogen Human genes 0.000 description 1
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 1
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 1
- 102100032709 Potassium-transporting ATPase alpha chain 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010083204 Proton Pumps Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 101150017997 Tox gene Proteins 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 231100000568 intoxicate Toxicity 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 108010019492 placental lactogen receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/25—Shigella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
Abstract
Et sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, idet det sammensmeltede gen inkluderer en første sekvens. som koder for et fragment av difteri-toksin-molekylet som gjør at hybridproteinet blir i stand til å trenge gjennom den cytoplasmiske membran i en celle og ute av stand til å drepe cellen, sammensmeltet til en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand som er effektiv til å gjøre at hybridproteinet binder seg selektivt til cellen.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av rekombinant-DNA-teknikker for fremstilling av hybrid-protein-molekyler.
Mer spesielt vedrører oppfinnelsen et sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, omfattende en første sekvens som koder for et fragment av difteritoksin-molekylet, sammensmeltet med en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand, noe som er nærmere beskrevet i krav 1.
Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen, idet genet er som beskrevet ovenfor og fremgangsmåten er nærmere beskrevet i krav 6.
Endelig vedrører oppfinnelsen en vektor som angitt i krav 12.
Litteraturen inneholder mange eksempler på sammensmeltede gener som koder for hybridproteiner. Eksempelvis beskriver Villa-Komaroff et al. (1978) i P.N.A.S. U.S.A.75, 3727-3731 et sammensmeltet gen bygd opp av et eukaryotisk strukturelt gen sammensmeltet til et ikke-cytoplasmisk bakteriegen. Det sammensmeltede gen koder for et hybridprotein som transporteres ut av cytoplasmaet.
Hybridproteiner er også laget ved andre metoder (for eksempel kobling av to forskjellige proteinmolekyler) som ikke involverer rekombinant-DNA-teknikker. Det er for eksempel foreslått å danne, ved kobling, terapeutiske hybridproteiner som består av deler av toksin-molekyler koblet til en ligand med evne til spesifikt å binde seg til en utvalgt klasse celler. Ett forsøk på
å lage et slikt hybridprotein, som er rapportert av Chang et al.
(1977) i J. Biol. Chem. 252, 1515-1522, resulterte i et hybrid
som bestod av difteri-toksin A-kjede koblet til human placental-laktogen-hormon ved tverrbinding via en disulfidbinding. Hybridproteinet inhiberte ikke proteinsyntese i disse celler, selv om det bandt seg til celler som inneholdt laktogen-reseptorer.
Et hybridprotein bestående av ricintoksin-A-kjeden koblet
til 3-kjeden i human-chorionisk gonadotropin-hormon ved likeledes å tverrbinde via en disulfidbinding er også blitt rapportert; skjønt det sies å ha spesifisitet, er dets bindingskapasitet ikke rapportert. Videre var det nødvendig med ekstremt høye konsentra-sjoner for signifikant å inhibere proteinsyntese i Leydig-tumor-
celle hos rotte, hvilket gjorde det vanskelig å skjelne mellom
"ikke-spesifikk" inngang forårsaket av endocytose og "spesifikk" inngang forårsaket av transport av den toksiske del av hybridet over den cytoplasmiske membran i målcellene (Oeltman et al. [1979] i J. Biol. Chem., 254, 1028-1032). Den samme mangel ble funnet i et hybridprotein bestående av difteri A koblet til insulin ved anvendelse av cystamin som tverrbindingsmiddel (Miskimins et al.
[1979] i Biochem. Biophys. Res. Commun., 91, 143-151). Et hybrid bestående av ricin A koblet til epidermal vekstfaktor (EGF) ved hjelp av en heterobifunksjonell tverrbinder er også laget, men de bindingskarakteristika som tilveiebringes av EGF er ikke begrenset til spesifikke celler, men omfatter snarere et stort utvalg av celletyper (Cawley et al. [1980] Cell, 22, 563-570).
Foreliggende oppfinnelse dreier seg generelt om et sammensmeltet gen og fremstilling av det hybridprotein som det koder for; hybridproteinet kan merkes og anvendes i diagnostiske metoder, for eksempel ved avbildning in vivo og in vitro. Det sammensmeltede gen inkluderer en første sekvens som koder for et fragment i difteri-toksin-molekylet som gjør hybridproteinet i stand til å trenge gjennom den cytoplasmiske membran i cellen, men ute av stand til å drepe cellen, smeltet til en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand som er effektiv til å muliggjøre at hybridproteinet binder seg selektivt til cellen.
Det henvises forøvrig til krav 1.
I foretrukne utførelsesformer utkoder første sekvens mindre enn alt, og helst intet, av det enzymatisk aktive fragment A i difteri-toksin. Fortrinnsvis utkoder den første sekvens en del av fragment B i difteri-toksin tilstrekkelig til å muliggjøre at hybridproteinet trenger gjennom den cytoplasmiske membran i cellen; fortrinnsvis koder denne sekvns for hele den amfipatiske domene og minst en del av den hydrofobe domene i fragment B. Den første sekvens bør ikke kode for hele fragment B, for å sikre at binding av hybridproteinet blir spesifikt dirigert av polypeptidliganden og ikke av den generaliserte bindingsdomene i difteritoksin.
Hybridproteinene som her beskrives kan merkes, for eksempel med et radionukleotid, et farvestoff eller en kjernemagnetisk resonans (NMR)-rapportørgruppe, for eksempel <13>C. Hybridproteinet binder seg selektivt til målcellene som polypeptidliganden er spesifikk for, og kommer så inn i, og blir innfanget i, cellene, hvilket forenkler bildelagingsstudier in vivo og in vitro.
Oppfinnelsen vil bli bedre forstått under betraktning av tegningene, hvor: Fig. 1 er en skjematisk oppstilling av difteri-toksinmolekylet. Fig. 2 er et restriksjonskart som viser lokaliseringen og orienteringen tii difteri- tox-genet på 3,9 kb BamH-I-restrik-
tox
sjonsfragmentet til corynephage 3
Fig. 3 er den nukleotide sekvens for tox 228-allele- og flankeregionene, med aminosyrerester vist over nukleotider; B<1>'-regionen er regionen mellom de merkede Sau3AI- og Nrul-punkter (fig. 3 var tilpasset fra fig. 1 til Kaczorek et al.
[1983] Science 221, 855). Fig. 4 er en skjematisk representasjon av et plasmid inne-holdende den sekvens som koder for Fragment B. Fig. 5 er et diagram for linkere (bindeledd) som kan anvendes for å fremstille sammensmeltede gener som her beskrevet. Fig. 6 og 7 er skjematiske representasjoner av plasmider som inneholder sekvenser som koder for deler av Fragment B. Fig. 8 er en skjematisk representasjon av et plasmid som inneholder en sekvens som koder for a-MSH. Fig. 9 og 10 er skjematiske representasjoner for plasmider som inneholder sammensmeltede gener som her beskrevet.
Med henvisning til fig. 1 består difteri-toksinmolekylet av flere funksjonelle "domener" åom kan karakteriseres, idet man be-gynner ved aminoterminalenden til molekylet, som hydrofob leder-signalsekvens s, enzymatisk aktivt Fragment A, den 14 aminosyre-eksponerte protease-sensitive disulfid-loop (DSL) l^, innehold-ende en spaltningsdomene, og Fragment B, som inkluderer de lipid-assosierende regioner, dvs. en amfipatisk domene og en hydrofob domene: DSL ; og karboksyterminal-ende a. DSL inneholder tre argininrester; Sau3Al-punktet mellom Fragment A og Fragment B (se fig. 2) er i en posisjon på difteri-toksin-genet som tilsvarer argininresten lengst nedstrøms av de tre.
Fremgangsmåten ved hvilken difteri-toksin intoksikerer sensitive eukaryote celler involverer minst de følgende trinn: (i) difteri-toksin binder seg til spesifikke reseptorer på overflaten av en sensitiv celle; (ii) mens det er bundet til sin reseptor, blir toksinmolekylet internalisert i en endocytisk vesikkel; (iii) enten før internalisering, eller inne i den endocytiske vesikkel, kan toksinmolekylet bli kløvet (eller viderebe-arbeidet) ved et punkt i regionen 47 000 dalton fra N-terminal-enden; (iv) etter hvert som pH-verdien til den endocytiske vesikkel avtar til under 6, føyer den viderebearbeidede form av toksin, selv om den fremdeles er bundet til sin reseptor, seg spontant inn i den endosomale membran; (v) straks etter innleiring i membranen danner de lipid-assosierende regioner en pore; (vi) en proteolytisk kløvning i mellom Fragment A og B, inntreffer; (vii) deretter frigjøres Fragment A, eller et poly-peptid som inneholder Fragment A, inn i cytosolen; (viii) den katalytiske aktivitet for Fragment A, dvs. den nikotinamid-adenin-dinukleotid-avhengige adenosin-difosfat-ribosylering for forlengelsesfaktor 2, forårsaker døden hos den intoksikerte celle. Det er tydelig at et enkelt molekyl i Fragment A innført i cytosolen er tilstrekkelig til å drepe cellen.
Under henvisning til figurene 1 og 2 inneholder det hybrid-protein som her er beskrevet, fortrinnsvis intet av Fragment A
i difteri-toksin, og inneholder delen av fragment B fra y til z eller fra y til x (fig. 1). y-z-delen utkodes av Sau3Al- Nrul-sekvensen (fig. 2) og y-x-delen, som inkluderer l2r utkodes av Sau3Al-Sphl-sekvensen. Det foretrekkes helst at hybridproteinet inneholder y-z, for å sikre at intet av den generaliserte bindingsdomene i Fragment B er inkludert. I tillegg kan enhver del av Fragment B som utkodes av en sekvens fra Sau3Al til et punkt ikke mer enn 180 basepar oppstrøms fra Nrul anvendes. En del som er kortere enn dette, f.eks. den som utkodes av Sau3Al- Clal, er for kort til å bevirke poredannelse og kan derfor ikke anvendes. Deler av Fragment B som utkodes av en sekvens som ender nedstrøms for Sphl bør ikke anvendes, for å unngå å inkludere difteri-toksinbindingspunktene.
Den del av hybridproteinet som det bidras med av polypeptidliganden kan bestå av hele liganden, eller en del av liganden som inkluderer hele bindingsdomenen til liganden, eller en effektiv del av bindingsdomenen.
Når den ligand som anvendes er stor, er det ønskelig at
så lite som mulig av den ikke-bindende del av liganden inklude-res, slik at bindingsdomenen i molekylet er beliggende nær den hydrofobe domene hos Fragment B. Det er også ønskelig å inkludere alt eller det meste av bindingsdomenen i ligandmolekylet.
I tilfellet av a-melanocytt-stimulerende hormon (MSH) kan et
lite peptid med 13 aminosyrer, eller Ø-MSH, som inneholder 17 aminosyrer, idet delen av molekylet består av 9 aminosyrer ved karboksyterminalenden i molekylet., som inneholder den reseptor-spesifikke bindingsdomene, anvendes, eller hele molekylet kan anvendes.
Regionene inne i cellespesifikke ligander i hvilke bindingsdomenen er lokalisert, er nå kjent for en rekke slike ligander. Videre kan nylige fremskritt i fastfase-polypeptidsyntese gjøre det mulig for fagmannen på dette fagområde å bestemme bindingsdomenen til praktisk talt hvilken som helst slik ligand, ved å syntetisere varierende fragmenter av liganden og teste dem med hensyn på evne til å binde seg til den klasse av celler som skal merkes.
Den påvisbare merkelapp som festes på hybridproteinmoleky-let kan være hvilket som helst konvensjonelt atom eller molekyl som anvendes for diagnostisk merking; eksempler er radioaktive merkelapper som f.eks. 12 5I-holdige forbindelser, technitium-isotoper, NMR-rapportørgrupper, samt fluorescerende farvestoffer. De mest foretrukne merkelapper er hydrofobe merkelapper, for eksempel fluorescerende farvestoffer (de fleste konvensjonelle fluorescerende farvestoffer er tilfeldigvis hydrofobe) som inkorporeres i den cytoplasmiske membran hos målceller, hvilket skal forklares mer detaljert nedenunder. Merkelapper kan festes på hybridproteinet ved hjelp av konvensjonelle-merkingsteknikker. Merkelapper vil bli anvendt i en mengde, (f.eks. ett eller to merkingsmolekyler pr. proteinmolekyl) som ikke interfererer med bindings- eller cellegjennomtrengnings-funksjonene til hybrid-proteinmolekylet.
Det merkede hybridprotein som her er beskrevet kan anvendes diagnostisk for å merke en ønsket klasse av målceller. Den spesifikke bindingsdomene hos polypeptidliganddelen binder seg selektivt til slike celler, og det merkede molekyl tas så opp av cellene via endocytose, og merkelappen blir etterpå levert til cellemembranen og/eller cytoplasmaet i målcellene.
Den fremgangsmåte ved hvilken et merket hybridprotein frem-stilt i henhold til oppfinnelsen kan inkorporeres i celler kan oppsummeres som folger. Det merkede hybridprotein tas opp av målceller via reseptor-mediert endocytose inn i en endocytisk vesikkel; deretter etableres et pH-differensial over membranen i den endocytiske vesikkel som et resultat av cellens ATP-avhengige protonpumpe. pH-differensialet over membranen forårsaker at hybridproteinet inklusive dets lipid-assosierende del og dets merkelapp blir innføyd i planet i membranen til den endocytiske vesikkel. Den hydrofobe natur av hybridproteinet forårsaker at det forblir i membranen, beskyttet mot den hurtige enzymatiske nedbrytning som ville inntreffe hvis det merkede protein skulle oppholde seg i cytoplasmaet eller i den endocytiske vesikkels lumen.
Etter innføyning av den endocytiske vesikkel i planet til membranen kan det merkede hybridprotein "trafikkere", som føl-ger. Den endocytiske vesikkel, som knoppskyter fra den cytoplasmiske membran, kommer inn i cytoplasmaet i cellen og kan så gå opp i et lysosom, som det merkede hybridprotein inkorporeres i. Alternativt kan den endocytiske vesikkel resirkulere til cellens cytoplasmiske membran. I hvert tilfelle forblir merkelappen fanget i målcellen.
Hybridproteinene som fremstilles i henhold til oppfinnelsen,
i hvilke fragmenter er forenet via peptidbindinger, er overlegne i forhold til tverrbundne hybrider, fordi proteinene her kan tilveiebringes i en homogen prøve, i hvilken alle de identiske molekyler er selektive for en spesiell klasse av celler.
Den spesifikke klasse av celler som blir bundet og merket av de her beskrevne hybridproteiner bestemmes av den spesifikke polypeptidligand som tar opp bindingsdomenen i hybridmolekylet. Enhver cellespesifikk polypeptidligand kan anvendes som har en bindingsdomene som er spesifikk for en spesiell klasse av celler som skal merkes. Polypeptidhormoner er anvendelige sådanne ligander. Hybridproteiner laget ved anvendelse av bindingsdomenen til a- eller ( 3- MSH, for eksempel, kan selektivt binde seg til melanocytter, idet de gjør hybridene nyttige i diagnose av melanom og in vivo- og in vitro-påvisning av metastic melanoma loci. Andre ligander gir ulike spesifisiteter; for eksempel gjenkjenner bindingsdomenen til substans P reseptorer på overflaten av neuroner som er involvert i overføring av smerte, slik at hybrider som er laget under anvendelse av substans P kan anvendes for å kartlegge arealer i nervesystemet som inneholder substans P-reseptorer. Andre spesifikt bindende ligander som kan anvendes inkluderer somatostatin, interleukin I, interleukin II og interleukin III. Interleukin II er av spesiell betydning på grunn av sin rolle i allergiske reaksjoner og autoimmune sykdommer som for eksempel systemisk Lupus Erythmatosis (SLE), hvor aktiverte T-celler er involvert. Andre nyttige polypeptidligander som har cellespesifikke bindingsdomener er follikel-stimulerende hormon (spesifikt for eggceller); luteiniserende hormon (spesifikt for eggceller); thyroid-stimulerende hormon (spesifikt for thyroidceller); vaso-pressin (spesifikt for livmorceller såvel som blære- og innvoll-celler); prolaktin (spesifikt for brystceller); og veksthormon (spesifikt for visse benceller).
Hybridproteinene blir i henhold til oppfinnelsen laget ved anvendelse av rekombinant-DNA-teknikker som innebærer å danne det ønskede sammensmeltede gen som koder for hybridproteinet, og deretter utkode det sammensmeltede gen, under anvendelse av konvensjonelle metoder. Under henvisning til fig. 2 og 3 tillater lokaliseringen og orienteringen av difteri- tox-operonet på 3,9
kb BamH-I-restriksjonsfragmentet til corynephage Ø<tOX+> tox-operonet å bli kløvet ved en ønsket lokalisering, og den ønskede del av operonet å bli sammensmeltet med den ønskede del av genet for en utvalgt polypeptidligand.
De foretrukne vektorer for utførelse av de nødvendige genfusjoner er plasmidene pUC7, pUC8, pUC9, og pBR322. pUC-plasmidene, beskrevet av Viera et al. (1982) i Gene 1_9, 259 (herved in-korporert ved henvisning) er spesielt godt egnet for dobbelt-spaltingskloning, en metode som gjør det mulig å lage de sammensmeltede gener utvetydig.
Genfusjoner lages som følger:
For det første kuttes en sekvens som koder for B' (fig. 2), som inkluderer alle, så nær som de C-terminale 17 aminosyrer i frag-22 8
ment B, fra tox -allelet og innføyes i et plasmid. Denne sekvens (Sau3Al-Sau3Al, fig. 2) bærer restriksjons-endonuklease-punktene Clal og Sphl (som er til stede på både vill-type- tox-allele og tox 22 8-allele) , og restriksjons-endonukleasepunktet Nrul (som er unik for tox 228-allele). Den B<1->utkodende sekvens ble klonet inn i BamHl-punktet til pUC8 slik at man fikk pDT301 (fig. 4). pDT30l ble deponert i American Type Culture Collection, Rockville, MD den 11. mai 1983 og fikk ATCC-tilgjengelighetsnummer 39360.
Den B<1->utkodende sekvens i pDT30l modifiseres deretter ved Nrul-eller Sphl-restriksjonspunktet for å gjøre i-ramme-fusjonen med en gensekvens som koder for bindingsdomenen til en polypeptidligand lettere. Hvis Nrul-punktet anvendes, koder den resulterende fusjon for B''-delen i Fragment B (fra y til z i fig. 1), hvilket inkluderer de amfipatiske og hydrofobe domener i fragment B, men ikke %^ * Hvis Sphl-punktet anvendes, koder den resulterende fusjon for delen av Fragment B fra y til x i fig. 1; dvs. at £2 er inkludert. Clal-punktet ble ikke anvendt fordi den resulterende fusjon ville kode for en del av Fragment B som mangler
den hydrofobe domene ville således ikke være i stand til å forår-sake poredannelse i målceller.
Tabell 1 nedenunder oppsummerer egenskapene til de Fragment B-relaterte proteiner som utkodes av de ovennevnte restriksjons-fragmenter.
Under henvisning til fig. 5 modifiseres den B<1->utkodende sekvens ved enten Nrul- eller Sphl-restriksionspunktet ved inn-føring av et syntetisk oligonukleotid som koder for et unikt Pstl-restriksjonspunkt fulgt av et Cys-kodon og et translaterende stopp-kodon. Denne modifikasjon tillater i-ramme-fusjon med en gen-sekvens som koder for bindingsdomenen til en peptidligand.
Fig. 6 og 7 illustrerer plasmider laget ved utførelse av de ovenstående modifikasjoner. Fig. 6 illustrerer pDT331, som inneholder den fragment-B-utkodende sekvens fra Sau3Al til Sphl og Sphl- Pstl-Cys-Stop- Sma^linkeren som er vist ved toppen av fig. 5. Fig. 7 illustrerer pDT321, som inneholder den fragment B-utkodende sekvens fra Sau3Al til Nrul og Nrul- Pst-Cys-Stop-Sma-linkeren som er vist ved bunnen av fig. 5.
Pstl-punktene til pDT331 og pDT321 kan tjene som punktene for i-ramme-innføyning av en gensekvens som koder for en peptidligand-bindingsdomene, for eksempel den sekvens som koder for melanocyttstimulerende hormon (MSH). Denne sekvens, med Pstl-restriks jonspunkter ved hver ende, og et translaterende stopp-kodon ved 5<1->enden er:
Denne sekvens, klonet i pUCB slik at den gir pMSHIO, er illustrert i fig. 8.
For å lage et sammensmeltet gen i henhold til oppfinnelsen kan den MSH-utkodende sekvens, som er angitt ovenfor, klones inn i Pstl-punktet til pDT331 eller pDT321 i den korrekte ori-entering. Innføyning av MSH-sekvensen i pDT33l gir pDTM331, illustrert i fig. 9. Innføyning av MSH-sekvensen i pDT321 gir pDTM321, illustrert i fig. 10. Begge plasmider koder for hybridproteiner som kan binde seg selektivt til og danne porer i melanocytter.
pDTM331 er deponert hos American Type Culture Collection
(12. juni.1985) og har fått ATCC-tilgjengelighetsnummer ATCC 5314 5. Søkeren erkjenner sitt ansvar med å erstatte disse kul-turer hvis de skulle dø før slutten av gyldighetstiden for et patent som måtte følge av denne søknad, og sitt ansvar til å opplyse ATCC om utstedelse av et slikt patent, ved hvilket tids-rom deponeringen vil bli gjort tilgjengelig for almenheten.
Inntil dette tidspunkt vil deponeringen bli gjort tilgjengelig for Commissioner of Patents i henhold til 37 CFR §1.14 og 35 USC §112.
Et annet eksempel på en egnet polypeptidligand er substans P (nytten av substans P er beskrevet ovenfor). Et sammensmeltet gen som inneholder substans P-genet, snarere enn det a- eller /3-MSH-genet, blir grunnleggende laget som angitt ovenfor. Substans P-genet kan bli syntetisert under anvendelse av konvensjonell fastfase-oligonukleotid-syntese. Substans P-gen-sekvensen er:
Som tydelig fremgår av ovenstående, må den del av den genetiske sekvens som koder for polypeptidliganden være tilstrekkelig til å muliggjøre at den tilsvarende aminosyresekvens bringer hybridproteinet til å binde seg til den utvalgte klasse av celler. Fortrinnsvis inkluderer genet alt eller mesteparten av den genetiske sekvens for bindingsdomenen til liganden.
Generelt, som i ovenstående eksempler, utføres de manipule-rende operasjoner ved anvendelse av kloningsvektorer; f.eks. fager eller plasmider. Det genetiske materiale som koder for bindingsdomenen til polypeptidliganden kan enten være klonet DNA eller en syntetisk oligonukleotid-sekvens. Generelt vil det sammensmeltede gen være beliggende på en kloningsvektor, f.eks. et plasmid eller en fag, som anvendes for å transformere dyrke-de mikroorganismer eller gjær eller pattedyrvertsceller. Hybridproteinet innhøstes deretter fra kulturmediene til cellene under anvendelse av konvensjonelle teknikker.
Rensning av hybridproteinene i henhold til oppfinnelsen, uten hensyntagen til den polypeptidligand som er anvendt, kan utføres via affinitetskromatografi, ved anvendelse av et mono-klonalt antistoff mot difteri-toksin Fragment B.
Som omtalt ovenfor, vil en hoveddiagnostisk anvendelse av de merkede hybridproteiner være påvisning in vivo og in vitro av metastatiske loci., under anvendelse av konvensjonelle celle-farvnings- og merketeknikker. En slik påvisning kunne være av spesiell verdi i kirurgi, ved at kirurgen tilveiebringes den in-formasjon som er nødvendig for å vite hvor meget vev han skal kutte ut når han fjerner for eksempel metastatiske melanomceller.
Andre utførelsesformer er innen de følgende krav.
Claims (15)
1. Sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, karakterisert ved at det omfatter
en første sekvens som koder for et fragment av difteritoksin-molekylet (vist i sin helhet i fig. 3), hvilket fragment gjør hybridproteinet i stand til å trenge gjennom den cytoplasmiske membran i en celle, sammensmeltet med
en annen sekvens som koder for en del av en polypeptidligand som er effektiv til å gjøre det mulig for hybridproteinet å binde seg selektivt til cellen, forutsatt at (a) når den første sekvens er Sau3AI-Nrul-restriksjonsfragmentet i difteri- tox228-allele og det fragment som koder disulfid-loop lz i difteritoksin, koder den annen sekvens ikke for a-eller /3-melanocytt-stimulerende hormon; og (b) det sammensmeltede gen koder ikke for en enzymatisk aktiv del av fragment A.
2. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1, karakterisert ved at den første sekvens koder for en del av fragment B i difteritoksin som er tilstrekkelig til å muliggjøre at hybridproteinet trenger gjennom den cytoplasmiske membran i cellen og ikke koder for den generaliserte bindingsdomene i fragment B.
3. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den første sekvens omfatter Sau3Al- Nrul-sekvensen eller Sau3Al- Sphl-sekvensen til tox<228->genet, illustrert som segment B" i fig. 2.
4. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1 eller 3, karakterisert ved at den første sekvens inkluderer den sekvens som koder for den amfipatiske domene og den hydrofobe domene i difteritoksin-molekylet (som skjematisk vist i fig. 1), og eventuelt at den første sekvens ytterligere omfatter en sekvens som koder for disulfid-loop l2.
5. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1, karakterisert ved at den første sekvens koder for alt av den amfipatiske domene og minst en del av den hydrofobe domene i fragment B i difteritoksin, idet den første sekvens inkluderer minst den del av fragment B-utkodingsregionen fra Sau3Al-punktet i den £1-utkodede region til et punkt ikke mer enn 180 basepar oppstrøms fra den posisjon som tilsvarer Nrul-punktet på tox-<228->allelen.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen, hvor det sammensmeltede gen omfatter
en første sekvens som koder for et fragment av difteritoksin-molekylet som gjør hybridproteinet i stand til å gjennomtrenge den cytoplasmiske membran i en celle, sammensmeltet med
en andre sekvens som koder en del av en polypeptidligand som er effektiv til å muliggjøre hybridproteinet å binde seg selektivt til cellen,
forutsatt at (a) når den første sekvens er Sau3AI-Nrul-restriksjonsfragmentet i difteri- tox228-allele og det fragment som koder disulfid-loop £2 i difteritoksin, koder den annen sekvens ikke for a- eller /3-melanocytt-stimulerende hormon; og (b) det sammensmeltede gen ikke koder for en enzymatisk aktiv del
av difteritoksin fragment A,
karakterisert ved følgende trinn: å omdanne en vertscelle med det sammensmeltede gen, og å dyrke den således omdannede vertscelle i miljø under
betingelser som er egnet til å bevirke ekspresjon av det sammensmeltede gen, og eventuelt
det ytterligere trinn å feste en detekterbar merking på
hybridproteinet, samt eventuelt også
det trinn å isolere hybridproteinet fra miljøet.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at merkingen er et fluorescerende farvestoff.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at hybridproteinet som bærer det fluorescerende farvestoff har evne til å bli innføyd i den cytoplasmiske membran i cellen.
9. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at hybridproteinet har evne til å bli tatt opp av cellen ved endocytose.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at polypeptidliganden er et polypeptidhormon.
11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at hormonet er interleukin I, interleukin II, interleukin III eller a- eller /3-hCG.
12. Vektor,
karakterisert ved at den omfatter og er istand til å uttrykke et sammensmeltet gen som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 5.
13. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at polypeptidliganden er et polypeptidhormon.
14. Sammensmeltet gen som angitt i krav 14, karakterisert ved hormonet er interleukin I, interleukin II, interleukin III eller a- eller /3-hCG.
15. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1, karakterisert ved at den første sekvens koder mindre enn alt eller intet av fragment A i difteritoksin.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61819984A | 1984-06-07 | 1984-06-07 | |
PCT/US1985/001081 WO1986000090A1 (en) | 1984-06-07 | 1985-06-07 | Hybrid protein and fused gene encoding gene |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO860421L NO860421L (no) | 1986-02-06 |
NO176807B true NO176807B (no) | 1995-02-20 |
NO176807C NO176807C (no) | 1995-05-31 |
Family
ID=24476731
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO860421A NO176807C (no) | 1984-06-07 | 1986-02-06 | Sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, samt fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen; vektor og sammensmeltet gen |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0185076B1 (no) |
JP (2) | JP2510984B2 (no) |
AT (1) | ATE79136T1 (no) |
AU (1) | AU592310B2 (no) |
CA (1) | CA1339359C (no) |
DE (1) | DE3586456T2 (no) |
ES (2) | ES8708014A1 (no) |
FI (1) | FI100253B (no) |
NO (1) | NO176807C (no) |
NZ (1) | NZ212312A (no) |
WO (1) | WO1986000090A1 (no) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU570762B2 (en) * | 1983-12-23 | 1988-03-24 | Australian National University, The | Cloning of cdna for il-3 |
US5668255A (en) * | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
AU577856B2 (en) * | 1985-01-17 | 1988-10-06 | Immunex Corporation | Cloning and characterization of the human interleukin 1 gene |
US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
US5132405A (en) * | 1987-05-21 | 1992-07-21 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
US5091513A (en) * | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
DE3856559T2 (de) * | 1987-05-21 | 2004-04-29 | Micromet Ag | Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung |
US5258498A (en) * | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
ATE87007T1 (de) * | 1987-05-29 | 1993-04-15 | Sagami Chem Res | Fusionsprotein, enthaltend lymphotoxin. |
JP2878341B2 (ja) * | 1989-03-03 | 1999-04-05 | 学校法人藤田学園 | 人工機能性ポリペプチド |
AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
WO1991009871A1 (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-11 | Seragen Incorporated | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
ES2155821T5 (es) * | 1990-03-02 | 2008-04-16 | Boston Medical Center Corporation | Toxinas quimericas mejoradas. |
US5621083A (en) * | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
US6146850A (en) * | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
WO1994025616A1 (en) * | 1993-04-28 | 1994-11-10 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Cell-targeted lytic pore-forming agents |
US5777078A (en) * | 1993-04-28 | 1998-07-07 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Triggered pore-forming agents |
US6635740B1 (en) | 1997-03-27 | 2003-10-21 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
AU8586298A (en) | 1997-07-25 | 1999-02-16 | University Of Massachusetts | Designed protein pores as components for biosensors |
US6680058B1 (en) | 1997-09-03 | 2004-01-20 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU573529B2 (en) * | 1982-05-12 | 1988-06-16 | President And Fellows Of Harvard College | Hybrid proteins |
US4468382A (en) * | 1982-07-15 | 1984-08-28 | New England Medical Center, Inc. | Polypeptide-toxin hybrid protein |
-
1985
- 1985-06-05 NZ NZ212312A patent/NZ212312A/xx unknown
- 1985-06-05 ES ES543938A patent/ES8708014A1/es not_active Expired
- 1985-06-07 AU AU44916/85A patent/AU592310B2/en not_active Ceased
- 1985-06-07 WO PCT/US1985/001081 patent/WO1986000090A1/en active IP Right Grant
- 1985-06-07 DE DE8585903136T patent/DE3586456T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-07 CA CA000483407A patent/CA1339359C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-07 AT AT85903136T patent/ATE79136T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-07 EP EP85903136A patent/EP0185076B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-07 JP JP60502723A patent/JP2510984B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-02-06 NO NO860421A patent/NO176807C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-02-06 FI FI860541A patent/FI100253B/fi active IP Right Grant
- 1986-10-01 ES ES557103A patent/ES8801376A1/es not_active Expired
-
1993
- 1993-12-01 JP JP5302099A patent/JPH06205684A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO860421L (no) | 1986-02-06 |
JPH06205684A (ja) | 1994-07-26 |
JPS61502304A (ja) | 1986-10-16 |
AU592310B2 (en) | 1990-01-11 |
NO176807C (no) | 1995-05-31 |
AU4491685A (en) | 1986-01-10 |
WO1986000090A1 (en) | 1986-01-03 |
EP0185076A4 (no) | 1987-11-09 |
ES543938A0 (es) | 1987-09-01 |
ATE79136T1 (de) | 1992-08-15 |
EP0185076B1 (en) | 1992-08-05 |
ES8801376A1 (es) | 1987-12-16 |
JP2510984B2 (ja) | 1996-06-26 |
FI860541A (fi) | 1986-02-06 |
EP0185076A1 (no) | 1986-06-25 |
CA1339359C (en) | 1997-08-26 |
ES557103A0 (es) | 1987-12-16 |
FI860541A0 (fi) | 1986-02-06 |
DE3586456D1 (de) | 1992-09-10 |
ES8708014A1 (es) | 1987-09-01 |
DE3586456T2 (de) | 1993-03-25 |
FI100253B (fi) | 1997-10-31 |
NZ212312A (en) | 1988-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO176807B (no) | Sammensmeltet gen som koder for et hybridprotein, samt fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som kodes av et sammensmeltet gen; vektor og sammensmeltet gen | |
EP0108146B1 (en) | Fused genes encoding hybrid proteins, cloning vectors containing them and the use thereof | |
US6022950A (en) | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region | |
US5965406A (en) | Recombinant DNAS encoding three-part hybrid proteins | |
EP0439954A2 (en) | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region | |
Fiddes et al. | The cDNA for the β-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3′-untranslated region | |
CA1339208C (en) | Fusion proteins containing a hinge region for enhanced cleavage | |
JP2665359B2 (ja) | 免疫親和性による精製方法 | |
US5080898A (en) | Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand | |
JP2670001B2 (ja) | ヒト−レラキシン遺伝子 | |
WO1987002987A1 (en) | Cys codon-modified dna | |
CN116102663A (zh) | 一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用 | |
IE57651B1 (en) | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria | |
CN112251444B (zh) | 一种改造的amh基因序列及利用其制备amh的方法 | |
JP2671260B2 (ja) | ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法 | |
Bousfield et al. | Evidence for two folding domains in glycoprotein hormone alpha-subunits | |
CA1217156A (en) | Hybrid proteins | |
CN116120467A (zh) | 含有猴痘病毒e8l抗原的融合蛋白及其制备方法 | |
CN116240182A (zh) | 荧光素酶信号肽的应用及含有荧光素酶信号肽的融合蛋白及其制备方法 | |
Nascimento et al. | Isolation and partial characterization of the Asp-B10, Tyr-B25-des-(B26-B30)-proinsulin analog from inclusion bodies in Escherichia coli | |
JPH0959299A (ja) | 融合MutSタンパク質及びその製造方法 | |
JPS59501243A (ja) | ベクタ− |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |