JPS61502304A - ハイブリツド蛋白質及び遺伝子をコ−ドする融合遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハイブリッド゛蛋白質及び遺伝子をコードする融合遺伝子本出願は、１９８４年 ６月７日に出願されたマーフイ（Ｍｕｒｐｈｙ）の米国特許出願第６１８，１９ ９号から１９８５年４月２５日に継続出願されたマーフイの米国特許出願第７２ ６．８０８号の一部継続出願である。

本発明は、ハイブリッド蛋白分子を調製するだめの組み換えＤＮＡ技術に関する ものである。

文献には、ハイブリッド蛋白質をコードする融合遺伝子の多数の例が存在する。

例えば、ヴイラーコマロフ（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａ−ｒｏｆｆ　）他著．　（１ ９７８）　Ｐ．　Ｎ．　Ａ．　Ｓ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　７５．　３７２７−３ ７３１は、非細胞質性細菌遺伝子と融合された真核生物構造遺伝子から成る融合 遺伝子について述べている。上記遺伝子は、細胞質外へ輸送される・・イブリッ ト゛蛋白質をコードする。

ハイブリッド蛋白質は、組み換えＤＮＡ技術を含まない他の方法（例えば、２つ の異種蛋白分子の結合）によっても調製されてきた。例えば、結合によって、あ る特定種の細胞に特異的に結合し得るリガンドに対して結合された毒素分子部位 から成る治療用・・イブリッド蛋白質を合成することが、提案されてきた。チャ ン（　Ｃｈａｎｇ）他著、（１９７７）　Ｊ．　Ｂｉａ．　Ｃｈｅｍ．　２５２ 　。

１５１５　−　１５２２　で報告された、上記ノ・イブリッド蛋白質を調製する 一つの試みとして、ヒト胎盤泌乳刺激ホルモン（　ｈｕｍａｎｐｌａｃｅｎｔａ ｌ　ｌａｃｔｏｇｅｎ　ｈｏｒｍｏｎｅ）　と、ジスルフィドゝ結合による架橋 によって結合されたジフテリア毒素Ａ　（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｏｘｉｎ　Ａ ）から成るハイブリッド分子が調製された。上記ハイブリッド蛋白質は、ラクト ゲン（　１ａｃｔｏｇｅｎ　）レセプターを有する細胞と結合したにもかかわら ず、該細胞に於ける蛋白質産生を阻害しなかった。

ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｉｏｎｉｃ　ｇｏｎａ− ｄｏｔｒｏｐｉｎ　ｈｏｒｍｏｎｅ）β鎖と、同様にジスルフイビ結合による架 橋によって結合されたりシン（　ｒｉｃｉｎ　）毒素β鎖から成るノ・イブリッ ド蛋白質も報告された：しかしながら、特異性を持つと言われながら、その結合 能力については、報告されなかった。

さらに、、ラットライデイヒ腫瘍細胞（Ｌｅｙｄｉｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ 　）に於いて、蛋白合成を明白に阻害するには，極度に高い濃度が必要とされ、 エンドサイト−シス（　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉθ）により引き起された“非特異 的な”取込みと、標的細胞の細胞質膜全通して、ハイブリッド分子の毒素領域の 輸送により引き起された取込みとを区別することを困難にした。オエルトマン（ Ｏｅｌｔｍａｎ）他，　（１９７９）　Ｊ，　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　、　２ ５４　、　１０２８−１０３２。同様な問題点が、シスタミン（　ｃｙｓｔａｍ ｉｎｅ　）を架橋剤として使用し、インシュリンに結合させたジフテリアＡ　（ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　Ａ）からなるハイブリッド蛋白質にも見られた。（ミス キミンス（Ｍｉｓｋｉｍｉｎｓ　）他＊　（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ．　、　９１　１４３−１５１　）。異種二価性架橋剤（　ｈｅｔ ｅｒｏｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｒｏｓｓ−１１ｎｋｅｒ）により、上皮 成長因子（　ｅｐｉｄθｒ−ｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　、　ＥＧＦ ’　）と結合したリシｙ　Ａ　（　ｒｉｃｉｎ　Ａ）から成る・・イブリッドも 作られたが、ＥＧＩＩ’により与えられた結合特性は、特異的な細胞に限定され るのではなく、広範な細胞種を包含するものである（コーＩＪ　−　（　Ｃａｗ ｌｅｙ　）他。

（１ｇ８Ｑ）　Ｃｅｌｌ，　２２．　５６３−５７０　）。

本発明は、概述すると、融合遺伝子および、同遺伝子のコードするハイブリッド 蛋白質に関するものである二同ノ・イブリッド蛋白質は、標識をつけ、診断法、 例えば、ｉｎ　ＶｉＶＯおよびｉｎ　ＶｉｔｒＯに於ける画像化に使用可能であ る。融合遺伝子は、ハイブリッド蛋白質に、細胞の細胞質膜の透過を可能にする が、細胞を壊死させる能力を与えない、ジフテリア毒素分子の断片をコードする 第一の塩基配列を含み、ハイブリッド蛋白質が細胞と選択的に結合可能にするの に有効であるポリペプチド・リガント”　（　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｇ ａｎｄ　）部分をコードする第二の塩基配列と融合している。

推奨される実施例においては、第一の塩基配列は、ジフテリア毒素の酵素的活性 を有するフラグメントＡの全領域より少なイ部分ｔーコードシており、全くコー ト５していないことが最も望ましい。第一の塩基配列は、ノ・イブリッド蛋白質 が細胞の細胞質膜を透過することを可能にするのに十分な、ジフテリア毒素のフ ラグメントＢの領域をコードシていることが望ましい：上記塩基配列は、フラグ メントＢの両親媒性（　ａｍｐｈｉｐａｔｉｃ　）領域の全部分、および、フラ グメントＢの疎水性領域の少なくとも一部をコードシていることが望ましい。第 一の塩基配列は、ノ・イブリッド蛋白質の結合が、ジフテリア毒素の一般的結合 領域によってではなく、ポリペプチドリガンドによって特異的に引き起されるこ とを確実にするために、フラグメントＢの全領域をコードするべきではない。

本発明のハイブリッド蛋白質は、例えば、放射性ヌクンオチド、染色、おるいは 、＋３ｃなどの核磁気共鳴検出基で標識することができる。・・イブリッド蛋白 質は、ポリにブチトリガントが特異的に認識する標的細胞に選択的に結合し、次 に、細胞内に入り捉えられ、ｉｎ　ＶｉＶＯおよび１ｎ　ｖｌｔｒｏでの画像化 研究を容易にする。

本発明は、以下の図面を参照することにより、最もよく理解されるであろう。

第１図は、ジフテリア毒素分子の模式図である。

第２図は、コリネファージ（　ｃｏｒｙｎｅｐｈａｇθ）βｔｏｘの３．９ｋｂ ＢａｍＨ−Ｉ　制ｔ’Ｕフラグメント上のジフテリア毒素分子の位置と方向を示 す、制限酵素地図である。

第３図は、上段にアミノ酸残基金示した１ｏｘ２２８　の対立遺伝子およびそれ に接する領域のヌクレオチド配列である二Ｂ″領域は、標識されたＳａｕ　３　 Ａ工切断部位と計！１切断部位との間にある領域である（第３図はカゾレク（　 Ｋａｃｚｏｒｅｋ　）他。

Ｃ１９８３）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２１　、　８５５の第１図からのものである ）。

第４図は、フラグメン）Ｂをコードする塩基配列を含有するプラスミドの模式図 である。

第５図は、本発明の融合遺伝子を調製するのに使用可能なリンカ−の図である。

第６図および第７図は、フラグメン）Ｂの一部をコードする塩基配列を含むプラ スミドの模式図である。

第８図は、アルファＭ　Ｓ　Ｈをコート゛する塩基配列を含むプラスミドの模式 図である。

第９図および第１０図は、本発明の融合遺伝子を含むプラスミドの模式図である 。

第１図について述べると、ジフテリア毒素分子は、特徴化・できる数個の機能的 ”領域（　ｄｏｍｅｉｎｓ　）”から成っており、分子のアミン末端から始めて 、疎水性リーダ−シグナル配列Ｓ、酵素的活性を持つフラグメン）Ａ、切断領域 を含みアミノ酸１４残基が露出するプロテアーゼ感受性ジスルフィド・ループ（ ＤＳＬ）１１、脂質会合部位、すなわち、両親媒性（　ａｍｐｈｉｐａｔｉｃ　 ）領域および疎水性領域を含むフラグメントＢ；ＤＳＬ１２；および、カルボキ シ末端ａである。ＤＳＬｌｌは、　アルギニン３残基を含む；フラグメントＡお よびフラグメントＢの間のＳａｕ　３Ａ１切断部位（第２図参照）は、ジフテリ ア毒素遺伝子上のアルギニン３残基のうち最も下流のアルギニン残基に対応する 位置にある。

ジフテリア毒素が感受性有核細胞を中毒させろ過８には、少なくとも以下に述べ る段階を含む＝（１）ジフテリア毒素が感受性細胞の表面上の特異的なレセプタ ーに結合する；　ｌｉ）上記レセプターに結合している際に、毒素分子がエンド サイト−シス小胞内に取り込まれる；（曲取り込みに先立って、あるいは、エン ドサイト−シス小胞内に於いて、Ｎ−末端から４７，０００ダルトンの領域中の 部位で、毒素分子が切断（ちるいはプロセッシング）されるらしい；）■エンド サイトーシス小胞のｐＨが６以下に減少するに従って、プロセッシングの行なわ れた状態の毒素が、依然としてレセプターに結合したまま、自発的にエンドゝソ ーム膜内に挿入される；（■）膜内に埋め込まれると、脂質会合領域が孔（　ｐ ｏｒｅ　）を形成する；位ｉフラグメントＡとフラグメントＢとの間の、１１の 蛋白分解的切断が起こる；　（ｖｉｉ）その後、フラグメントＡ，あるいは、フ ラグメン）Ａを含むポリペプチド鎖が、細胞質に放出される；　（ｖｉｉｉ）フ ラグメントＡの触媒活性、即ち、延長因子２のニコチンアミドアデニンジヌクレ オチビ依存性アデノシン２リン酸リボシル化が、中毒細胞の壊死を引き起す。

細胞質中に誘導されたフラグメン）Ａの単一分子が細胞を壊死させるのに有効で あることは、明白である。

第１図および第２図について述べると、本発明のハイブリッド蛋白質は、ジフテ リア毒素の７ラグメントＡは全く含まず、フラグメントＢのＹから２あるいは、 ｙからＸの部分を含むことが望ましい（第１図）６ｙ−ｚ領域は、旦ａｕ　３Ａ 　１−Ｎｒｕ１塩基配列によってコードされており（第２図）、１２を含むｙ− Ｘ領域は、Ｓａｕ　３Ａ１−ジ止１塩基配列によりコードされている。フラグメ ン）Ｂの一般的な結合領域が全く含まれないことを確実にするため、ハイブリッ ド蛋白質がｙ−ｚを含むことが最も望ましい。さらに、フラグメントＢのＳａｕ 　３Ａ１と±二１から１８０塩基対以内上流の位置までとの間の塩基配列が使用 可能である。それよりも短い部分、例えば、Ｓａｕ　３Ａ１−Ｃｌａｌによって コードされているものは、孔の形成には短かすぎ、そのため使用することはでき ない。フラグメントＢのＳｐｈｌよりも下流で終了子る塩基配列によってコード される部分は、ジフテリア毒素結合部位を含むことを避けるため、使用するべき ではない。

・・イブリッド蛋白質のポリペプチド・リガンドによる部分は、リガンド全体、 あるいは、リガンドの結合領域全体または結合領域の有効部分を含む、リガンド の一部から構成することができる。

使用されるリガンドが大きい場合には、分子の結合領域をフラグメン）Ｂの疎水 性領域に近接して位置するようにするため、リガントゝの非結合領域が可能な限 り含まれないようにすることが望ましい。また、リガンド全体の結合領域の全体 、あるいは、大部分を含むことが望ましい。アミノ酸１３残基の小ペプチドであ る、αメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、あるいは、アミノ酸１７残基から 成るβＭ　Ｓ　Ｈの場合、分子のカルボキシ末端のアミノ酸９残基からなる部分 、あるいは、分子全体を使用し得　′る。

細胞特異性リガンド内の結合領域が位置する部分は、現在多数のリガント９につ いて知られている。さらに、最近の固相ポリペプチド合成法の進歩により、当技 術に熟達した専門家は、リガンドの多数のフラグメントラ合成し、標識されるべ き細胞種への結合能を試験することにより、上記リガンドの結合領域を決定する ことが可能である。

ハイブリッド蛋白質に付着させる、検出可能な標識には、識別標識に慣習的に使 用される原子らるいは分子は全て使用可能である；例えば、１２５工を含む化合 物のような放射活性標識、テクニチウム同位体（　ｔｅｃｈｎｉｔｉｕｍ　ｔｓ ｏｔｏｐｅｓ　）、ＮＭＲ　レポーターグループ、および蛍光染色剤などでおる 。最も望ましい標識は、以下で詳述するように、標的細胞の細胞質膜中に取り込 まれる、蛍光染色剤のような疎水性標識である（大部分の慣習的な蛍光染色剤は 、偶然にも疎水性である）。標識は慣習的な標識技術により・・イブリッド蛋白 質に付着させることができる。

標識は、ハイブリッド蛋白分子の結合機能あるいは細胞透過機能を妨げない量（ 例えば、蛋白質１分子ごとに１おるいは２標識分子）で使用する。

本発明の標識されたハイブリッド蛋白質は、診断の目的で要求される標的細胞種 を標識するために使用され得る。ポリ４ブチトリガント し、次に、標識された分子がエンドサイト−シスによって細胞に取り込まれ、そ の結果として、標識が細胞膜および（または）標的細胞の細胞質に施される。

本発明の標識されたハイブリッド蛋白質が細胞内に取り込まれる過程は、以下の ように要約できる。標識されたハイブリットゞ蛋白質は、レセプターが介在する エンド９サイト−シスを経て、標的細胞に取り込まれ、エンド９サイト−シス小 胞に入る；その後、細胞のＡＴＰ依存性プロトンポンプの働きで、エンドサイト ーシス小胞の膜を隔ててｐＨに差違が生じる。その膜を隔てだｐＨの差違により 、脂質会合領域および標識を含む、・・イブリッド蛋白質のエンドサイト−シス 小胞の膜面内への挿入が起きる。ハイブリット９蛋白質の疎水的性質のため、同 ハイブリッド蛋白質は膜に留まり、標識されたこの蛋白質が細胞質中あるいはエ ンドサイト−シス小胞の内腔内に存在するとすれば起きるはずの、急速な酵素的 分解から保護される。

エンドサイト−シス小胞の膜面中への挿入後、標識された／・イブリッド蛋白質 は、以下に述べるように６移動”することができる。細胞質膜から分かれてでき るエンドサイト−シス小胞は、細胞の細胞質に入り、次に、リソシームと融合し 、その内部に標識されたハイブリッド蛋白質が取り込まれる。あるいは、れる。

どちらの場合においても、標識は標的細胞に捉えられたままである。

フラグメントがペプチド結合によって結合している、本発明のハイブリット”Ｈ 白質は、全ての同一な分子が特定の細胞種に対して選択的であるような均質な試 料として調製され得るので、架橋によるハイブリッドよりも優れている。

本発明の・・イブリッド蛋白質が結合し、標識する特異的な細胞種は、ハイブリ ッド分子の結合領域を与える特異的２＋）−？ブチビリガント９によって決定さ れる。標識されるべき個々の細胞種に特異的な結合領域を有する細胞特異性，Ｏ 　ＩＪ　ｏブチピリガントは、全て使用可能である。ポリペプチドホルモンは、 上記リガンドとして有効である。例えば、α−あるいはβ−ＭＳＨの結合領域を 使用して調製したハイブリッド蛋白質は、メラノサイトと選択的に結合し、この 選択的結合は黒色腫の診断、および、転移性黒色腫の位置のインビボおよびイン ビトロでの検出に於いて、ハイブリッド蛋白を有効にする。別のりガントは、異 なる特異性を与える；例えば、物質Ｐの結合領域は、痛みの伝達に関与するニュ ーロンの表面上のレセプターを認識し、従って物質Ｐを使用して調製したハイブ リッドは、物質Ｐレセプターを含む神経系の範囲の地図を作製することに使用で きる。

他の使用可能な特異的結合リガン１には、ソマトスタチン、インターロイキン１ １インターロイキン■、および、インターロイキン■などがある。インターロイ キン■は、アレルギー反応および、活性化されたＴ細胞が関与する全身性エリテ マトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫病における役割のため、特に重要である 。細胞特異性結合領域を有する、他の有効なホＩＪペプチドゝリガンドには、卵 胞刺激ホルモン（卵巣細胞に特異的）；黄体形成ホルモン（卵巣細胞に特異的） ；甲状腺刺激ホルモン（甲状腺細胞に特異的）；バソプレッシン（子宮細胞に加 え、膀胱および腸細胞に特異的）；プロラクチン（胸部細胞に特異的）；成長ホ ルモン（ある種の骨細胞に特異的）などがある。

本発明のハイブリッド蛋白質は、慣習的方法によって、ハイブリッド蛋白質をコ ードするめる融合遺伝子を形成させ、次に同融合遺伝子を発現させることを含む 、組み換えＤＮＡ技術の使用により調製される。第２図および第３図に関して述 べると、コリネファージ（　ｃｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ　）βｔｏｘ＋の３．　９ 　ｋｂ　ＢａｍＨペロンの要求される領域は、選択されたポＩＪ　６ブチビリガ ンドの遺伝子の要求される領域と融合されるようになる。

必要とされる遺伝子融合を行なうために望ましいベクターは、プラスミドＩ）Ｕ Ｏ３　、　ｐＵＣ８　、　ｐｔＪｃ９　、および、ｐＥＲ３２２　である。ヴイ エラ（　Ｖｉｅｒａ　）他，（１９８２）　Ｇθｎｅ　１９，　２５９　（参照 することにより本明細書の一部として含まれる）で述べられているように、ｐＵ ｃ　プラスシトは、融合遺伝子を確実に作らせる方法である、二重切断クローニ ング（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔ　ｃｌｏｎｉｒｉｇ）に特に適当である。

本発明の遺伝子融合は、以下のように行なわれる。まず、フラグメン）ＢのＣ末 端アミノ酸１７残基金除く全領域を含む、Ｂ′をコードする塩基配列（第２図） を、ｔｏｘ２２８　対立遺伝子から切り出し、プラスミドに挿入する。上記配列 （　Ｓａｕ３Ａ１＋Ｓａｕ３Ａ１，第２図）は、制限エンドヌクレアーゼ切断部 位Ｃｄａ１およびＳｐｈｌ（野生型二対立遺伝子およびｔＯｘ２２８　対立遺伝 子の双方に存在する）、および、制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｒｕｌ　（ 　ｔｏｗ２２８　対立遺伝子に特有）を有する　Ｂ′をコードする塩基配列は、 ｐｃＵ１３のＢａｍＨ１部位にクローン化され、ｐＤＴ３０１　を得る（、第４ 図）。ｐＤＴ３０１は、１９８３年５月１１日に、　メリーランド州ロックビル のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショｙ　（　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ−ｃｔｉｏｎ）に寄託し、ＡＴＣＣ受入れ 番号Ａ　３　９　３　６　０を与えられた。

ｐＤＴ３０１内のＢ′ヲコードする塩基配列は、次に、ｈｏ　ＩＪペプチドリガ ンド （　ｉｎ−ｆｌａｍｅ　）　融合を容易にするために、五二土１あるいは拒１制 限酵素切断部位で修正する。Ｎｒｕ　１部位を使用する場合には、得られる融合 遺伝子は、フラグメントＢの両親媒性領域および疎水性領域を含むが１２を含ま ない、フラグメントＢのＢ／／領域（婬１図のｙから２）をコードする。Ｓｐｈ 　１部位を使用する場合には、得られる融合遺伝子は、フラグメン）Ｂの第４図 に於けるｙからＸの領域をコードする；すなわち、１２は含まれている。Ｃｌａ 　ｉ　ｈ位は、得られる融合遺伝子がフラグメントＢの疎水性領域を欠いた領域 金コードシ、従って標的細胞で孔の形成を行なえないため、使用されない。

下に挙げる表１は、上記制限フラグメントによってコードされるフラグメントＢ 関連蛋白質の性質をまとめたものである。

垣３Ａ１−１（Ｂ’）　３４２　４　＋　＋二二３Ａ１ミ鐵ユ１．　２９１　＋ 　＋　＋ｆ！旦３Ａ、に区二旦ｔ（Ｂつ　２３６　＋　＋　−３ａｕ３Ａｌ−Ｃ ｌａｌ　９６　＋　−−第５図について述べると、Ｂ′をコードする塩基配列は 、唯一のユニ１制限部位およびそれに続（Ｃｙｓコドンおよび翻訳停止コビンを コードする合成オリゴヌクレオチド９の誘導により、Ｎｒｕ　ｌ制限部位あるい はＳｐｈ　ｌ制限部位のいずれかで修正される。上記修正により、ｋブチトリガ ントる遺伝子塩基配列との枠内融合が可能になる。

第６図および第７図は，上記修正を行なって得られたプラスミドを示したもので ある。第６図は、ｐｐ’ｒ　３３］を示したもので、Ｓａｕ．３Ａ１からＳｐｈ ｌ　までの塩基配列金コードするフラグメントＢ，および、第５図上段のと１− 二１−　Ｃｙｓ　−　Ｓｔｏｐ−Ｓｍａｌｊンカーを含む。第７図は、ｐＤＴ　 ３２１を示したもので、Ｓａｕ　３　Ａ　１からＮｒｕｌ　までの塩基配列をコ ードするフラグメントＢ、および、第５図下段に示されるＮｒｕ　ｌ　−Ｐｅｔ 　−Ｃｙｅ　−Ｓｔ６ｐ一旦リンカーを含む。

ｐＤＴ３３１およびｐＤＴ３２１の！二二１部位は、ベプチビリガンドの結合領 域をコードする遺伝子塩基配列、例えば、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ） をコードする塩基配列の、枠内挿入に使用される部位として働く。両端にユニ１ 制限酵素切断部位、５′端に翻訳停止コドンを持つ、上記塩基配列は次のとおり である： ＧＣＡＡＧＴｒＡＴＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴｒｒＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＡ ＣＣＩＧＴＡ．ＴＡＧＣＴＧＣＡＡσ■刀７℃ＡＡＴＡＴＣＧＴＡＣσｙｖＴん ｖ五ＴＣｒＡＣＣＣσＷＡＣＡＴＡＴＣＧｐＵＣ８内でｐＭＳＪＱを与えるため にクローン化された、上記塩基配列は、第８図に示されている。

本発明の融合遺伝子を調製するために、上記ＭＳＨをコート９する塩基配列は、 ｐＤＴ３３１６るいはｐＤＴ　３２１のＰｓｔ１部位内に、正しい方向でクロー ン化される。ｐＤＴ　３３１内へのＭＳＨ塩基配列の挿入は、第９図で示される ｐＤＴＭ３３１を生じる。

ｐＤＴ　３２１へのＭＳＨ塩基配列の挿入は、第１０図に示される、ｐＤＴＭ３ ２１を生じる。双方のプラスミドは、メラノサイトに選択的に結合して孔を形成 し得る・・イブリッド蛋白質をコードする。

ｐＤＴＭ３３１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（　ｔｈｅ 　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　）に 寄託され、ＡＴＣＣ受入れ番号ＡＴＣＣ４５３１４５全得た。出願人は、この出 願に対して発行される特許の期限終了前に上記培養菌が死滅した場合に交換する 、出願人の義務および、上記寄託菌が公開され得る時期などの、特許の公布を、 ＡＴＣＣに通知する義務を承認する。その時期まで、上記寄託菌は、３７　ＣＦ Ｒ　ｉｌ．１４および３５　ＵＳＣ　９１．１２に従い、特許局長官は入手でき ることとなる。

む融合遺伝子は、基本的に上に略述したように調製される。物質Ｐ遺伝子は、慣 習的な固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成し得る。物質Ｐ遺伝子塩基配 列は次のとおりである：ＣＧＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＧ ＧＴＣＴＧＡＴＧ。

上の記述から明らかなように、ポリベプチビリガンドをコードする遺伝的塩基配 列の領域は、対応するアミノ酸配列が、・・イブリッド蛋白質の選択された細胞 種への結合を引き起こさせるのに十分でなければならない。遺伝子は、リガンド の結合領域の遺伝的塩基配列を全部あるいは大部分含んでいることが望ましい。

一般的には、上述の例のように、クローニングベクター、例えば、７アージやプ ラスミドを用いて操作法を行なう。ポリはプチドリガンピの結合領域をコードす る遺伝的材料は、クローン化されたＤＮＡ．　あるいは、合成オリゴヌクレオチ ド配列のいずれでも可能である。一般的には、融合遺伝子は、培養された微生物 あるいは酵母菌（　ｙｅａｓｔ　）　６るいは哺乳動物宿主細胞を形質転換する のに用いられる、クローニングベクター、例えば、プラスミドあるいは７アージ に存在させる。ノ・イブリッド蛋白質は、次に、慣習的方法を用いて、細胞の培 地から回収する。

本発明のハイブリッド蛋白質の精製は、用いられたポリペプチビリガンビに関係 なく、ジフテリア毒素フラグメンｌ−　Ｂに対するモノクローナル抗体を用いて 、アフイニテイクロマトグラフイによって行なわれる。

上述のように、標識された・・イブリッド蛋白質を用いた、主要な診断的用法は 、慣習的な細胞染色および標識技術を使用した、ｉｎ　ｖｉｖａおよびｉｎ　Ｖ ｉｔｒＯでの転移部位の検出である。上記のような検出は、例えば、転移性黒色 腫細胞を除去する際に、どの程度の量の組織を切開するかを知る際に必要とされ る情報を外科医に与えることで、外科に於いて重要な価値がちる。

他の実施例は、以下の請求の範囲に含まれている。

待人昭６１−５０２３０４　（６） ＦＩＧ　４　ＦＩＧ　６ ＦＩＧ　７　ＦＩＧ　８ ＦＩＧ　９　ＦＩＧ　１０ 国際調査報告 ｌｎ＋−ａｌ１６ＭＩ　ＡｏＩＩｕｗ＋ｍｎ　”Ｐｃ’ｒ／ｕｓ　ａ　５　／　 ０１０８１

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．ハイブリツド蛋白質をコードする融合遺伝子であつて、上記ハイブリツド蛋 白質が細胞の細胞質膜を透過可能で且つ上記細胞を殺す能力を持つことが無いよ うにするためのジフテリア毒素分子のフラグメントをコードする第一の塩基配列 と、 前記第一の塩基配列と融合し、上記ハイブリツド蛋白質が上記細胞と選択的に結 合可能となるようにするのに有効なポリペプチドリガンドの一部をコードする、 第二の塩基配列を含む、上記融合遺伝子。
2. ２．上記第一の塩基配列が上記ジフテリア毒素分子のフラグメントＡの全体より 少ない部分をコードする、請求の範囲第１項記載の融合遺伝子。
3. ３．上記第一の塩基配列がフラグメントＡを全くコードしない請求の範囲第２項 記載の融合遺伝子。
4. ４．上記第一の塩基配列が、上記ハイブリツド蛋白質を上記細胞の細胞質膜を透 過可能とするのに十分な、ジフテリア毒素のフラグメントＢの部分をコードし、 フラグメントＢの一般的な結合領域をコードしていない、請求の範囲第１項記載 の融合遺伝子。
5. ５．上記第一の塩基配列が、ｔｏｘ２２８遺伝子のＳａｕ３Ａ１−Ｎｒｕ１の塩 基配列を含む、請求の範囲第４項記載の融合遺伝子。
6. ６．上記第一の塩基配列が、ｔｏｘ遺伝子のＳａｕ３Ａ１−Ｓｐｈ１塩基配列を 含む、請求の範囲第４項記載の融合遺伝子。
7. ７．上記第一の塩基配列が、上記ジフテリア毒素分子の両親媒性領域および疎水 性領域をコードする塩基配列を含む、請求の範囲第４項記載の融合遺伝子。
8. ８．上記第一の塩基配列が、ジスルフイドループｌ２をコードする塩基配列を、 さらに含んでいる請求の範囲第７項記載の融合遺伝子。
9. ９．上記第一の塩基配列が、ジフテリア毒素フラグメントＢの両親媒性領域全体 および疎水性領域の少なくとも一部をコードし、上記第一の塩基配列が、少なく ともフラグメントＢをコードする領域の、ｌ１をコードする領域中のＳａｕ３Ａ １部位から、ｔｏｘ２２８対立遺伝子上のＮｒｕ１部位に対応する位置から１８ ０塩基対上流を越えない位置までの部分を含む、請求の範囲第１項記載の融合遺 伝子。
10. １０．請求の範囲第１項記載の融合遺伝子によつてコードされるハイブリツド蛋 白質。
11. １１．請求の範囲第２項乃至第９項記載のいずれか１項の融合遺伝子によつてコ ードされるハイブリツド蛋白質。
12. １２．検出可能な標識をさらに含む、請求の範囲第１０項記載のハイブリツド蛋 白質。
13. １３．上記ハイブリツド蛋白質が上記細胞に、エンドサイトーシスによつて取り 込まれ得る、請求の範囲第１０項記載のハイブリツド蛋白質。
14. １４．上記標識が蛍光染色剤である、請求の範囲第１２項記載のハイブリツド蛋 白質。
15. １５．上記染色剤が、上記ハイブリツド蛋白質とともに、上記細胞の細胞質膜中 に挿入され得る、請求の範囲第１４項記載のハイブリツド蛋白質。
16. １６．上記ポリペプチドリガンドがホルモンである、請求の範囲第１０項記載の ハイブリツド蛋白質。
17. １７．上記ホルモンがα−あるいはβ−メラニン細胞刺激ホルモンである、請求 の範囲第１６項記載のハイブリツド蛋白質。
18. １８．上記ポリペプチドホルモンがインターロイキンＩである、請求の範囲第１ ６項記載のハイブリツド蛋白質。
19. １９．上記ポリペプチドホルモンがインターロイキンＩＩである、請求の範囲第 １６項記載のハイブリツド蛋白質。
20. ２０．上記ポリペプチドホルモンがインターロイキンＩＩＩである、請求の範囲 第１６項記載のハイブリツド蛋白質。
21. ２１．上記ポリペプチドホルモンがアルフアあるいはベータｈＣＧである、請求 の範囲第１６項記載のハイブリツド蛋白質。
22. ２２．上記細胞を請求の範囲第１２項記載の標識されたハイブリツド蛋白質と接 触させることを含む、特定細胞種の標識法。