JPH03169825A - 新規な百日咳毒素変異株、このような変異株を生産し得るボルデテラ菌株及び抗百日咳菌ワクチンの開発に於けるそれらの使用 - Google Patents
新規な百日咳毒素変異株、このような変異株を生産し得るボルデテラ菌株及び抗百日咳菌ワクチンの開発に於けるそれらの使用Info
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- JPH03169825A JPH03169825A JP2111865A JP11186590A JPH03169825A JP H03169825 A JPH03169825 A JP H03169825A JP 2111865 A JP2111865 A JP 2111865A JP 11186590 A JP11186590 A JP 11186590A JP H03169825 A JPH03169825 A JP H03169825A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（発明の産業上の利用分’ＪＴ）
本発明は，百日咳毒素変異株を生産し分泌し得る、減少
された毒性を有するか、または毒性をもたない新規な免
疫学的に活性な百Ｂ＠導Ｍ菌株、それらの調製のための
手段及び方法、並びに有効な抗百日咳菌ワクチンを開発
するためのそれらの使用に関する． また、本発明は、活性成分として少なくとも一種の免疫
学的に活性な百日咳毒素変異株を含み、しかも減少され
た毒性を有するか、または毒性をもたない抗百日咳菌ワ
クチンとして好適な免疫原性製剤（これはホルムアルデ
ヒドにより処理されていてもよい）、または上記の変異
株を生産し分泌し得るボルデデラ菌株もしくは百日咳菌
ワクチンを生産し得ないｔｏｘボルデテラ菌株に関する
． （従来の技術） 百日咳，即ち痙９性せき及び重い呼吸シンソマトロジイ
ｆｓｉｎｔｈｏｍａｔｏｌｏｇｙｌの発作を特徴とする
バクテリア源の感染症は，全年令の個人を冒し、幼年期
の場合には、患者の０，５％で致命的である． 百日咳菌（これは百日咳の病因学的因子である）は，病
ｉ＋Ｉａ階（段階１》中番こ一連の毒性成分を生産し、
その中で百日咳毒素ｆＰＴ）がその疾患の主な病原性因
子に相当するだけでなく、重大な免疫原に相当する． ＰＴ （これは５つの異なるサブユニット（Ｓ１，Ｓ２
．Ｓ３．Ｓ４．及びＳ５）からなるアンヘキサマー（ａ
ｎｈｅｘａＩｌｅｒｌの構造を有する）は，実際に、百
日咳に対して保護を与えるのに充分な量の抗体を実験動
物に誘導し得る． 感染の発生率は、好適なワクチンによる個人の免疫化に
より制御し得る． 現在、細胞ワクチンが使用され、これはメルチ才レート
（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）により処理され５６℃で殺
された病原性百日咳菌の全細胞からなるワクチンである
． しかしながら，上記のワクチンは、保護免疫を与えるが
、単なる水泡、紅斑及び究熱からｔＭ撃及び脳損傷に至
る範囲の望ましくない副作用を生じることがある．これ
らの動機に関し、上記のワクチンの使用は最近数年間で
著しく減少されてきてＪ３９、その疾患の新しい大発生
をもたらした．それ故、無細胞ワクチンが、ホルムアル
デヒド（サトウ（Ｓａｔｏｌら著． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｎ．４１巻、３１３〜３２０頁（１９８３年））
、グルタルアルデヒド（クエンチンーミレット（Ｑｕｅ
ｎｔｉｎ−ｉＪｉｌｌｅｔｌら著，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｓｔａ
ｎｄ． １６巻、９９〜１０８頁（１９８８年））、テ
トラニトロメタン（シバー（Ｓｉｂｅｒｌ ら１９８８
年：ウィンドベリイ（Ｗｉｎｄｂｅｒｒｙｌ ら、１
９８８年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈ
ｏｐ ｏｆ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ ｅｒｔ．ｕｓｓｉｓ
．ハミルトン（Ｈａｎｉ １ ｔｏｎｌ、ＭＯ）、トリ
ニトロヘンセンスルホン酸（フィッシュ（Ｆｉｓｃｈｌ
ら著、Ｉｎｆｅｃｔ．ＴＩＩＩＩｕｎ．４４＠、Ｉ−
１６頁（１９８４年））、過酸化水素（セクラｆｓｅｋ
ｕｒａｌら著、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １１３
巻、１１０６〜８！３頁ｆ１９８：１年））の如き種々
の化学試薬により解毒された病原性百日咳閑により生産
され分泌された一種以上の抗原毒性タンパク質からなる
技術に於いて提案された． しかしながら、上記の解毒方法は、下記の欠点を呈する
。 −９ ：／ ／＜ ’） ｆｆ Ｎ 性の復帰．実際に
、ホルムアルデヒドで解島されたＰ丁またはＦＴ及び糸
状血ｔｅａｓ？（両方ともホルミアルデヒドにより処理
されている）のみからなる無細胞ワクチン（サトウＹ．
ら著 ［Ｌａｎｃｅｔ ｉ． １２２ 〜１２６頁、１
９８４年））は、子供の８０％をその疾患から保護し、
５０〜６０％を感染から保護する（Ａｄ ｈｏｅ Ｇｒ
ｏｕｐ ｆｏｒ ｔｈｅＳｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｅｒｔｕ
ｓｓＬｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ． Ｌａｎｃｅｔ ｌ
巻、９５９〜９６０頁． １９８８年）が、毒性の復帰
を示す（ソートサエタ−（Ｓｏｒｔｓａｅｔｅｒ） Ｊ
．ら著、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．
Ｊ． ， ７巻、６３７ 〜６４５頁． １９８８年）
：一解毒段階に必要とされる苛酷な条件によりひき起こ
される抗原タンパク質の減少された免疫原性； −解毒生産物の再現性の欠如： ■夫々の調製に関して復帰を評価する試験（これらの試
験は長時間を要する）の必要なこと，及び最後に， ■このような抗原タンパク質の調製に使用されろ人々に
関して、多量の毒性物質を取扱うことに於ける危険性． 知られているように、百日咳毒素の毒性は、そのＳｌサ
ブユニットのＡＤＰ−リボシルートランスフエラーゼ活
性により媒介される．上記欠点のない百日咳ワクチンの
調製に適した，野生型百日咳毒素＋ＰＴｌに関して変化
された毒性を有する分子を得る目的のため、ＳｌのＮ一
末端部分及び／またはＣ一末端部分の一連の欠失変異株
、並びにイタリア特許出願第２２４８１号Ａ（１９８７
年１月２１日出Ｉｆｆ）に開示されているような，一つ
以上のアミノａ置換を配列中に含む、Ｓｌに類似性の一
連のべブチドが、構成され、大腸菌で形質発現された． 実際に、百日咳ジオキシンのサブユニットＳｌを暗号化
するＩＩＮＡフラグメントは、部位特異性の突然変異誘
発により修飾されて、特異性部位中に、ＰＴ中に存在す
るアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を含むサブユニッ
トを暗号化した．上記の処理された大Ｉｌａｗ株の培養
により得られたべブチドは，百日咳毒素の一つに関して
変化された毒性を示した．しかしながら、上記のべブチ
ドは、＃ｋ３２バクテリオファージのポリメラーゼの９
８個のアミノ酸のアミノ末端配列に融合されたタンパク
質として形質発現された． 更に、生体内（マウス）中で試験された場合，上記のベ
ブヂドは、おそらく、それらがそのままでは、それらが
天然分子中で呈するのと同じ立体配座構造を示し得ない
という理由のため，保護抗百日咳抗体の生成を誘導し得
なかった．それ故，異種タンパク質（即ち，宿主微生物
菌株により自然に生産されないタンパク質）を得るため
に，ＤＮＡ組換え技術により処理された大ＩＩＩ菌の如
き宿主微生物を用いる方法は、所望の免疫原性を有する
生産物の調製に適さないようである．（発明が解決しよ
うとする課ＷＩ） 本発明の目的は、従来技術の欠点のない、抗百日咳ワク
チンの調製に適する免疫原を得ることである．これは，
本発明によれば，減少された毒性を有するか，または毒
性をもたない百口咳毒索変異株を形質発現し分泌し得る
新規なボルデテラ菌株を提供することにより得られる． それ故，本発明の別の目的は，サブユニットのＳ１アミ
ノ酸配列の特異性部位中に、一つ以上の欠失残基または
異なるアミノ酸残基により置換された残基な含むことを
特徴とする、減少された毒性を有するか、または毒性を
もたない免疫活性な変異株を得ることである． 本発明は． ０．０３５％〜０． ４２０％の重徽／容
量％のホルムアルデヒドによる処理により得られる、熱
安定性及び減少された，もしくは不在の、分裂促進性（
＊ｉｔｏｇｅ−ｎｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙｌ及
び血球凝集性を特徴とする、毒性のない、もしくは減少
された毒性を有する免疫活性な百日咳毒素変異株である
． 本発明の更に別のロ的は、減少された毒性を示すか、ま
たは毒性を示さない免疫活性な百日咳毒素変異株を生産
し分泌し得るボルデテラ菌株である． 本発明の別の目的は，このようなボルデテラ菌株を調製
する方法である． 本発明の更に別の目的は，好適な条件中でこのような突
然賓興ボルデテラｍａを墳狸することを含む、減少され
た毒性を有するか、または毒性をもたない免疫活性な百
日咳毒素変異株の調製方法である． 本発明の別の目的は、抗百日咳の有効な細胞ワクチンの
調製のために、減少された毒性を示すか、または毒性を
示さない百日咳毒素の免疫活性変異株を生産し分泌し得
るボルデテラ菌株、及び／または百日咳毒素を生産し得
ないΔｔｏｘボルデテラ菌株を使用することである． 本発明の別の目的は、有効な抗百日咳烈細胞ワクチンの
調製のために，必要によりホルムアルデヒドにより処理
された、減少された毒性を有するか、または毒性をもた
ない免疫活性な百日咳毒素変異株を使用することである
． 更に，本発明は，目的として、免疫有効量の上記のボル
デテラ菌株を含む、病原性百日咳菌から誘導する感染に
対して有効な保護応答を人に誘導し得る無細胞ワクチン
として適する免疫原住製剤を有する． 本￥’ｔ’ｒ０４の更に別の目的は，免ｒｌｊ有効飼の
、減少された毒性を有するか、または毒性をもたない免
疫活性な百日咳毒素変異株（上記の変異株は必要により
ホルムアルデヒドで処理される）を含む、病原性百日咳
菌から誘導する感染に対して有効な保護応答を人に生じ
得る無細胞ワクチンとして好適な免疫原性製剤である． 本発明の別の目的は、以下の説明及び実施例を読むこと
により明らかにされる． （課題を解決するための手段） 特に、本発明の減少された毒性を有するか，または毒性
をもたない免疫活性な百日咳毒素変異株は、サブユニッ
トの１アミノ酸配列のアミノ酸残Ｍ （ｉ ！ｌ ｕ
ｔ２９．Ａｓｐ Ｉ１、Ｔｒｐ ２６．Ａｒｇ ９．Ｐ
ｈｅ ５０，＾ｓｐｌ ，Ａｒｇ １３．Ｔｙｒ １３
０、Ｇｌｙ ８６． Ｈｌｌ ｅ ８８．Ｔｙｒ ８９
．Ｔｙｒ ８．Ｇ １２ ｙ ４４．Ｔｈｒ５３及びＧ
ｊ２ｙ８０の少なくとも一つが欠失されるか、または天
然アミノ酸の群から選ばれた異なるアミノ酸により置換
されるという事実を特徴とする． 本発明の好ましい百日咳毒素変異株は，アミノａＳ基（
ｉＪｕｌ２９とアミノ酸残４Ａｒｇ ５．Ａ！Ｉｌｌ
１１．Ａｓｐ １３及びＴｒｐ ２６の少なくとも一つ
とが、欠失されるか、または天然アミノ酸の群から選ば
れた異なるアミノ酸残基により置換されるという事実を
特徴とする、百日咳毒素変異株である．本発明の実施態
様によれば，百日咳毒素変異株は、表■、欄１に示され
たアミノ酸置換を含む．この表中、第一行には突然変異
タンパク質の名称が示され、第二行には，行なわれた突
然変異の型が示され、第三行には、突然変異に１１１用
されたヌクレ才チド配列が示される． これらの中で、下記の百日咳毒素変異株が、持に好まし
い． ＰＴ ２１１Ｇ（ＰＴ−１２９Ｇ１、Ｌ９／２８
Ｇ（ＰＴ−９Ｋ／１２９６１． １１３／２８ＧｆＰＴ
−）：ｔＬ／１２９Ｇ＋， １２６／２８６ｆＦ’Ｔ−
２１１！／１２９Ｇ１、 Ｌ１３＃２６／２１１Ｇ（
Ｐ丁−１３Ｌ／２６１／１２９Ｇ１、 ＰＴ−８８Ｅ
／８９Ｓ及びＥ３８／Ｓ８９／２１１Ｇ（ＰＴ−８８Ｅ
／８９Ｓ／１２９Ｇ＋ ．上記の特徴を有するＦＴ変異
株は、本発明によれば、部位特穴性の突然変異誘発によ
り突然変異された百日咳菌から単離されたＰＴを暗号化
する染色体遺伝子を含むボルデテラ菌株の培養により．
＆るいはＳｌサブユニットを暗号化するヌクレ才チド配
列の一つ以上の特異性部位中のヌクレ才チド塩基の欠失
により、得られる． 本発明によれば、上記のボルデテラ菌株は、ａ）少なく
とも一種の抗生物質に耐性な野生型ボルデテラ菌株を選
択し， ｂｌ （ａｔで得られた菌株中の相同組換えにより、百
日咳毒素を暗号化する染色体遺伝子を異なるタンパク質
を暗号化する遺伝子で置換し、 ｃｌ （ｂｌ で得られたＰＴ（Δｔｏｘ ）遺伝子
を含まないボルデテラ菌株を選択し、 ｄ）百日咳菌から単離された百日咳毒素遺伝子を突然変
異誘発し， ｅ）ボルデテラを複製し得ない適当に変性されたプラス
ミド中で上記の突然変異遺伝子を導人し、 ｆｌ ｉｃｌ で選択されたボルデテラ菌株（Δｔｏ
ｘ ）中の上記のプラスミドを導入し、ついで！後に Ｃ）突然変異百日咳毒素遺伝子による相同組換えが行な
われたボルデテラ菌株を単離することを含む方法により
得られる． 本発明のボルデテラ野生型菌株は，種百日咳菌、パラ百
日咳菌及び気管支敗血症菌の中から選ばれる．最後の二
つは，百日咳毒素オベロンを有しているが、その内部に
官能プロモーターの不在のため、通常それを生産しない
． 本発明の方法の段階ａ）に於いて，ボルデテラ菌株は，
突然変異株の選択を容易にするために、一８以上の抗生
物質に対して耐性にされる．本発明の実施態様によれば
，上記のボルデテラ菌株は，ナリジクス酸（ｎａｉｌ及
びストレプトマイシン（ｓｔｒ）に対して耐性にされる
．本発明の方法の段階ｂ）に於いて，置換は． ＰＴと
異なるタンパク質を暗号化する遺伝子、例えばカナマイ
シン（Ｎａｎｌによる、ａ）で得られた菌株中に含まれ
るＰＴを暗号化する染色体遺伝子の相同組換えにより、
行なわれる．その組換えは、一般に知られる技術を用い
て，ボルデテラ中でｍｏｂ得ないプラスミドを用いて行
なわれてもよい．プラスミドｐｎＴｐｔが使用されるこ
とが好ましく、その構成はスティビッツ（Ｓｔｉｂｉｔ
ｚｌＳら（ＧＥＮＥ、５０巻，１３３〜１４０頁、１９
８６年）により記載された．上記のプラスミドは，大腸
菌株を用いて二成分で，あるいは云わゆるヘルパープラ
スミドを含む大腸菌株を用いて三成分で接合によりボル
デテラ細胞中に導入されてもよい．本発明によれば、ｐ
ＲＴｐｉプラスミドはＥｃｏＲＩ制限酵素により消化さ
れ、ついでＰＴと異なるタンパク質を暗号化する遺伝子
を含み，且つヌクレ才チドの中に、ＰＴＩＯＩＡＴＣＣ
６７８５４プラスミド中に含まれる百日咳菌ＰＴの遺伝
子の領域ｌ〜４２０及び３６２５〜４６９６に相当する
配列を含釘ＤＮＡ ＥｃｏＲ？フラグメントとつながれ
る．ついで，大腸菌細胞は、得られたプラスミドにより
形質転換され、形質転換体が通常の技術を用いて選択さ
れる． ついで，このようにしてｉ１！択された陽性のクローン
が、ボルデットーゲンゴウ（Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇａ＊ｇｅ
＋ａ） （ＩＧと称する）培地′Ｌｓ３ ７℃で約４８
時間予め１ｌｊ！！された、ａ｝で得られたボルデテラ
閑株と接合される．その接合は、通常の技術に従っＴ：
． １ ０ｍＭｆ） ＭｇＣｊｌ！ ｘが添加された
ＢＧ培地テ３７℃で３〜６時間行なわれる． 本発明の方法の段階Ｃ）に於いて、染色体レベルで相同
組換えが行なわれたボルデテラ菌株は，好適な抗生物質
の添加により選択的にされたＧＨ培地で選択される．
ｎａＩ２及びｓｔｒに耐性のボルデテラ菌株が使用され
． ＰＴと異なる遺伝子がカナマイシンの一種である場
合，培地に添加される抗生物質はｎａｆｆ ，ｓｔｒ及
びＫａｎである．この培地で増殖する閑株（三つの抗生
物質に対して耐性である）は、カナマイシン遺伝子によ
るＰＴ遺伝子の完全な置換が行なわれ、且つストレプト
マイシンに対する感受性を付与するｐＲＴＰｌプラスミ
ドを失なった菌株である． このような置換を確かめる目的で、以下にΔｔｏｘとし
て示される上記の菌株が、サザンプロット（Ｅ．サザン
（Ｅ． Ｓｏｕｔｈｅｒｌ著． Ｊ．Ｍｏｌ２ ；Ｂｉ
ｏｆｆ：９８巻、５０３〜５１７頁． ＋１９７５年）
）、ＥＬＩＳＡ分析１ウォン（１１ｅｉｇ），Ｌｔｔ．
及びスケルトン（Ｓｋａｌｔｏｎ）Ｓ．Ｘ．Ｊ．著、Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ− ２６巻．１３
１６〜１３２０頁、１９８８年）及びＣＩＩＯ細胞に関
する毒性試験（ヒュウレット（Ｈｅｗｌｅｔｔｌ ．
Ｅ． Ｌ．ら著． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｓｕｎ．４０巻
．． １１９８ 〜１２３０頁（１９８３年））により
、特性決定された． これらの結果は，以下のことを示した．ａ） ＰＴ遺
伝子の分子社よりも低い分子量を有するヌクレ才チドフ
ラグメントのΔｔｏｘ菌株染色体のＤＮＡ中の存在、こ
れは上記の遺伝子及びその置換体（カナマイシン遺伝子
》の両方と雑種をっくる： ｂ） Δｔｏｘ菌株のいずれもが、ＥＬＴＳＡ分析によ
り検出可能な賃で百日咳７Ｂ素を生産，分泌し得・ない
： ｃｌ １／１０に希釈されたボルデテラΔｔｏｘの上澄
液を用いて測定されたＣＨＯ細胞に関する毒性は、それ
らの増殖を変更し得ない．上澄液をそのまま用いて，わ
ずかに非特異的な毒性が観察される．上記のΔｔｏｘ
ｉ株が病原性百日咳菌に対して保謹を与える能力を確か
める目的のため、“２１７ＰＡＮ７Ｇ２０．４ ＣＯ
ＤＥ ＯＦ ＦＥυＥＲＡＩ− ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ
Ｓ，Ｐｏｔｅｎｃｙｔｅｓｔ ｏｆ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ ｖａｃｃｉｎｅ （百日咳ワクチンノ効能試験）
”に記載されているように“大脳内抗原投与“分析が、
行なわれる．実施例ｌに示された得られた結果は上記の
菌株がＰＴを暗号化する通伝子を最早有していないが，
病原性百日咳閑による大脳内感染に対して優れた保譲を
依然として誘起し得ることを示す． 本発明の方法の段階ｄ）に於いて，突然変異ＰＴ遺伝子
の構成はＰＴＩＯＩ ＡＴＣＣ ６７８５４プラスミド
中に含まれる百日咳閑ＰＴを暗号化する遺伝子のＳｌサ
ブユニットを暗号化するヌクレ才チド配列の決定された
部分の１種以上のヌクレ才チドをｆＩ４位特異的な突然
変異誘発作用によって欠失または置換することにより行
なわれる． 本発明の一つの実施態様によれば． ｐ’ｒ遺伝子は−
Ａｌｌ中に示された突然変異を含み、第一欄の３行に示
されたヌクレ才チド配列を用いて、横成される． 本発明の方法の段階Ｃ）に於いて、ｔ（階ｄ）で得られ
た突然変異遺伝子がボルデテラ中で複製し得ないプラス
ミド中でクローン化される．その目的のために、プラス
ミドｐＲＴＰｌが利用され，ゲンタマイシン（市販され
ている）に対する抵抗性を暗号化する遺伝子またはテト
ラサイクリン（市販されている）に対する抵抗性を暗号
化する遺伝子をその制限部位ＢａｍＩＩＩ中に神入する
ことにより、それを変性する．このような遺伝子のクロ
ーン化は遺伝子工学に一般に使用される既知の技術の一
つに従って行なわれる．かくして、夫々ｐＨＴＰＧｌ及
びｐＲＴＰＴｌとして示される新規なベクターが使用さ
れて，突然変異ＰＴ遺伝子をボルデテラ八ｔａｘ菌株染
色体中に掃人する． 特に、突然変異遺伝子はプラスミドｐＲＴＰＧ１及びｐ
ＲＴＰＴＩ中でクローン化され、得られる組換えプラス
ミドが大腸菌細胞中に形質転換により導入される．形質
転換・体は上記のような操作により、ΔＬｏｌ１ボルデ
テラ菌株と接合される．本発明の目的に適した大ｌｌ１
菌細胞はサイモンｌｓｘｉｓ＊鰐） ｎ、ら習、Ｄｉｏ
ｔｅｃｈ ｌ巻、７８４ 〜７９３ Ｍ．１９８３年に
記載された大腸菌ＳＳＭＩＯである．最後に，本発明の
方法の段階ｇ）に於いて、ボルデテラ菌株の選択が行な
われ、それらの染色体中に突然変異ＰＴ遺伝子を含む． 特に、最初に、染色体中に組込まれた組換えプラスミド
を含むボルデテラ菌株の選択がｎａｌ及びゲンタマイシ
ンまたはｎａｌ及びテトラサイクリンを添加したＢＧ培
地による培養によって行なわれ、ついで上記のプラスミ
ドを失った菌株の選択がｓｔｒを含むＢＧ培地による培
養により行なわれる．最後に、この培地で増殖し得るコ
ロニーが単離され、ｎａｌ ， ｓｔｒ及びκａｎまた
はｎａｌ及びｓｔｒを含むＢＧ培地で培養される。この
最後の培地により，この様に操作して、Ｋａｎ遺伝子の
突然変異ＰＴｉ伝子によるＩＩＩのために，カナマイシ
ン抵抗性フエノタイブを失ったボルデテラコロニーが選
択される． 上記のボルデテラ菌株が突然変異染色体遺伝子により暗
号化されたＦＴ変″１４株の形質を発現し，分泌する能
力を確かめるために、これらの菌株の幾？かが好適な培
地、例えば実廁例ｌに示された組成を有する培地中で培
養される．生産データは下記のことを示す． ■百日咳菌株は同じ野生型菌株を培養することにより得
られる量に匹敵する量でＰＴ変異株を生産する． 一→Ｔ毒素を通常生産しない気管支敗血症菌株及びパラ
百日咳菌株は驚くべきことに培地中でＰＴ毒素生産、分
泌し得る． ■パラ百日咳菌株は百日咳菌株より６多徹にＰＴｆ８素
を生産する． 上記の結果は例えば、百日咳菌ＰＴの一つの如き有効な
プロモーターによる、上記の野生型ボルデテラ中に存在
する不活性なプロモーターの置換が上記の菌株にＰＴま
たはＩ’Ｔの変異株の形質を発現することを可能にする
ことを示す． 本発明によれ１１、上記のようにして得られたＰＴ変異
株が例えばセクラｌｓｅｋｕｒａｌ Ｒ． Ｄ．ら著，
Ｊ．１１ｉｏ１、ｃｊ＋ｅ＋ｗ．２５８巻．１４６４７
〜１４６５１頁１１９８：］年》に記載された精製技
術の如き．当業者に知られた禎製技術の中から選ばれた
精製技術により、照細胞培地から純粋な形で取出される
． 本発明によれば，或種のＰＴ変異株の物理化学的性質，
生物学的性質及び免疫学的性質が試験管内及び生体内で
測定された． 物理化学的性質に関する限り、ポリアクリルアミドゲル
によるＳＯＳ中の電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥＩによる
分析は混在タンパク質の不在及びＰＴの一つと同じパタ
ーンを示し，一方、アミノ酸分析は既知のアミノ酸配列
に基づいて予想される値と一致するアミノ酸組成を示す
． 更に、ジメチル（２．６−０−１０−シクロデキストリ
ンの不在がベレイ（Ｒｅｌａｙ） Ｊ． Ｇ ｆ１９８
５年）により記載された方法（ ＋Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎｂｉｏｃｈｅａ＋ｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ
（生化学及び分子生物学に於ける実験室技術）”，バ
ードン１１１ｕｒｄθＲ）ル．ｎ．及びバン・クニッペ
ンベルグｌＶａｎＫｎｉｐｐｅｎｎｂｅｒｇｌ Ｐ．Ｈ
． （編集） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １６巻）を用いて確
認され，また．Ｎ綱胞抗百日咳ワクチンの可能な混在物
質である、フェチュイン，タンバク質６９κＤ及び糸状
血球凝集素の何れもの不在がこのようなタンパク質に特
異的な抗体を利用するウエスタンブロッティング分析
された毒性を有するか、または毒性をもたない新規な免
疫学的に活性な百Ｂ＠導Ｍ菌株、それらの調製のための
手段及び方法、並びに有効な抗百日咳菌ワクチンを開発
するためのそれらの使用に関する． また、本発明は、活性成分として少なくとも一種の免疫
学的に活性な百日咳毒素変異株を含み、しかも減少され
た毒性を有するか、または毒性をもたない抗百日咳菌ワ
クチンとして好適な免疫原性製剤（これはホルムアルデ
ヒドにより処理されていてもよい）、または上記の変異
株を生産し分泌し得るボルデデラ菌株もしくは百日咳菌
ワクチンを生産し得ないｔｏｘボルデテラ菌株に関する
． （従来の技術） 百日咳，即ち痙９性せき及び重い呼吸シンソマトロジイ
ｆｓｉｎｔｈｏｍａｔｏｌｏｇｙｌの発作を特徴とする
バクテリア源の感染症は，全年令の個人を冒し、幼年期
の場合には、患者の０，５％で致命的である． 百日咳菌（これは百日咳の病因学的因子である）は，病
ｉ＋Ｉａ階（段階１》中番こ一連の毒性成分を生産し、
その中で百日咳毒素ｆＰＴ）がその疾患の主な病原性因
子に相当するだけでなく、重大な免疫原に相当する． ＰＴ （これは５つの異なるサブユニット（Ｓ１，Ｓ２
．Ｓ３．Ｓ４．及びＳ５）からなるアンヘキサマー（ａ
ｎｈｅｘａＩｌｅｒｌの構造を有する）は，実際に、百
日咳に対して保護を与えるのに充分な量の抗体を実験動
物に誘導し得る． 感染の発生率は、好適なワクチンによる個人の免疫化に
より制御し得る． 現在、細胞ワクチンが使用され、これはメルチ才レート
（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）により処理され５６℃で殺
された病原性百日咳菌の全細胞からなるワクチンである
． しかしながら，上記のワクチンは、保護免疫を与えるが
、単なる水泡、紅斑及び究熱からｔＭ撃及び脳損傷に至
る範囲の望ましくない副作用を生じることがある．これ
らの動機に関し、上記のワクチンの使用は最近数年間で
著しく減少されてきてＪ３９、その疾患の新しい大発生
をもたらした．それ故、無細胞ワクチンが、ホルムアル
デヒド（サトウ（Ｓａｔｏｌら著． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｎ．４１巻、３１３〜３２０頁（１９８３年））
、グルタルアルデヒド（クエンチンーミレット（Ｑｕｅ
ｎｔｉｎ−ｉＪｉｌｌｅｔｌら著，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｓｔａ
ｎｄ． １６巻、９９〜１０８頁（１９８８年））、テ
トラニトロメタン（シバー（Ｓｉｂｅｒｌ ら１９８８
年：ウィンドベリイ（Ｗｉｎｄｂｅｒｒｙｌ ら、１
９８８年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈ
ｏｐ ｏｆ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ ｅｒｔ．ｕｓｓｉｓ
．ハミルトン（Ｈａｎｉ １ ｔｏｎｌ、ＭＯ）、トリ
ニトロヘンセンスルホン酸（フィッシュ（Ｆｉｓｃｈｌ
ら著、Ｉｎｆｅｃｔ．ＴＩＩＩＩｕｎ．４４＠、Ｉ−
１６頁（１９８４年））、過酸化水素（セクラｆｓｅｋ
ｕｒａｌら著、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １１３
巻、１１０６〜８！３頁ｆ１９８：１年））の如き種々
の化学試薬により解毒された病原性百日咳閑により生産
され分泌された一種以上の抗原毒性タンパク質からなる
技術に於いて提案された． しかしながら、上記の解毒方法は、下記の欠点を呈する
。 −９ ：／ ／＜ ’） ｆｆ Ｎ 性の復帰．実際に
、ホルムアルデヒドで解島されたＰ丁またはＦＴ及び糸
状血ｔｅａｓ？（両方ともホルミアルデヒドにより処理
されている）のみからなる無細胞ワクチン（サトウＹ．
ら著 ［Ｌａｎｃｅｔ ｉ． １２２ 〜１２６頁、１
９８４年））は、子供の８０％をその疾患から保護し、
５０〜６０％を感染から保護する（Ａｄ ｈｏｅ Ｇｒ
ｏｕｐ ｆｏｒ ｔｈｅＳｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｅｒｔｕ
ｓｓＬｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ． Ｌａｎｃｅｔ ｌ
巻、９５９〜９６０頁． １９８８年）が、毒性の復帰
を示す（ソートサエタ−（Ｓｏｒｔｓａｅｔｅｒ） Ｊ
．ら著、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．
Ｊ． ， ７巻、６３７ 〜６４５頁． １９８８年）
：一解毒段階に必要とされる苛酷な条件によりひき起こ
される抗原タンパク質の減少された免疫原性； −解毒生産物の再現性の欠如： ■夫々の調製に関して復帰を評価する試験（これらの試
験は長時間を要する）の必要なこと，及び最後に， ■このような抗原タンパク質の調製に使用されろ人々に
関して、多量の毒性物質を取扱うことに於ける危険性． 知られているように、百日咳毒素の毒性は、そのＳｌサ
ブユニットのＡＤＰ−リボシルートランスフエラーゼ活
性により媒介される．上記欠点のない百日咳ワクチンの
調製に適した，野生型百日咳毒素＋ＰＴｌに関して変化
された毒性を有する分子を得る目的のため、ＳｌのＮ一
末端部分及び／またはＣ一末端部分の一連の欠失変異株
、並びにイタリア特許出願第２２４８１号Ａ（１９８７
年１月２１日出Ｉｆｆ）に開示されているような，一つ
以上のアミノａ置換を配列中に含む、Ｓｌに類似性の一
連のべブチドが、構成され、大腸菌で形質発現された． 実際に、百日咳ジオキシンのサブユニットＳｌを暗号化
するＩＩＮＡフラグメントは、部位特異性の突然変異誘
発により修飾されて、特異性部位中に、ＰＴ中に存在す
るアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を含むサブユニッ
トを暗号化した．上記の処理された大Ｉｌａｗ株の培養
により得られたべブチドは，百日咳毒素の一つに関して
変化された毒性を示した．しかしながら、上記のべブチ
ドは、＃ｋ３２バクテリオファージのポリメラーゼの９
８個のアミノ酸のアミノ末端配列に融合されたタンパク
質として形質発現された． 更に、生体内（マウス）中で試験された場合，上記のベ
ブヂドは、おそらく、それらがそのままでは、それらが
天然分子中で呈するのと同じ立体配座構造を示し得ない
という理由のため，保護抗百日咳抗体の生成を誘導し得
なかった．それ故，異種タンパク質（即ち，宿主微生物
菌株により自然に生産されないタンパク質）を得るため
に，ＤＮＡ組換え技術により処理された大ＩＩＩ菌の如
き宿主微生物を用いる方法は、所望の免疫原性を有する
生産物の調製に適さないようである．（発明が解決しよ
うとする課ＷＩ） 本発明の目的は、従来技術の欠点のない、抗百日咳ワク
チンの調製に適する免疫原を得ることである．これは，
本発明によれば，減少された毒性を有するか，または毒
性をもたない百口咳毒索変異株を形質発現し分泌し得る
新規なボルデテラ菌株を提供することにより得られる． それ故，本発明の別の目的は，サブユニットのＳ１アミ
ノ酸配列の特異性部位中に、一つ以上の欠失残基または
異なるアミノ酸残基により置換された残基な含むことを
特徴とする、減少された毒性を有するか、または毒性を
もたない免疫活性な変異株を得ることである． 本発明は． ０．０３５％〜０． ４２０％の重徽／容
量％のホルムアルデヒドによる処理により得られる、熱
安定性及び減少された，もしくは不在の、分裂促進性（
＊ｉｔｏｇｅ−ｎｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙｌ及
び血球凝集性を特徴とする、毒性のない、もしくは減少
された毒性を有する免疫活性な百日咳毒素変異株である
． 本発明の更に別のロ的は、減少された毒性を示すか、ま
たは毒性を示さない免疫活性な百日咳毒素変異株を生産
し分泌し得るボルデテラ菌株である． 本発明の別の目的は，このようなボルデテラ菌株を調製
する方法である． 本発明の更に別の目的は，好適な条件中でこのような突
然賓興ボルデテラｍａを墳狸することを含む、減少され
た毒性を有するか、または毒性をもたない免疫活性な百
日咳毒素変異株の調製方法である． 本発明の別の目的は、抗百日咳の有効な細胞ワクチンの
調製のために、減少された毒性を示すか、または毒性を
示さない百日咳毒素の免疫活性変異株を生産し分泌し得
るボルデテラ菌株、及び／または百日咳毒素を生産し得
ないΔｔｏｘボルデテラ菌株を使用することである． 本発明の別の目的は、有効な抗百日咳烈細胞ワクチンの
調製のために，必要によりホルムアルデヒドにより処理
された、減少された毒性を有するか、または毒性をもた
ない免疫活性な百日咳毒素変異株を使用することである
． 更に，本発明は，目的として、免疫有効量の上記のボル
デテラ菌株を含む、病原性百日咳菌から誘導する感染に
対して有効な保護応答を人に誘導し得る無細胞ワクチン
として適する免疫原住製剤を有する． 本￥’ｔ’ｒ０４の更に別の目的は，免ｒｌｊ有効飼の
、減少された毒性を有するか、または毒性をもたない免
疫活性な百日咳毒素変異株（上記の変異株は必要により
ホルムアルデヒドで処理される）を含む、病原性百日咳
菌から誘導する感染に対して有効な保護応答を人に生じ
得る無細胞ワクチンとして好適な免疫原性製剤である． 本発明の別の目的は、以下の説明及び実施例を読むこと
により明らかにされる． （課題を解決するための手段） 特に、本発明の減少された毒性を有するか，または毒性
をもたない免疫活性な百日咳毒素変異株は、サブユニッ
トの１アミノ酸配列のアミノ酸残Ｍ （ｉ ！ｌ ｕ
ｔ２９．Ａｓｐ Ｉ１、Ｔｒｐ ２６．Ａｒｇ ９．Ｐ
ｈｅ ５０，＾ｓｐｌ ，Ａｒｇ １３．Ｔｙｒ １３
０、Ｇｌｙ ８６． Ｈｌｌ ｅ ８８．Ｔｙｒ ８９
．Ｔｙｒ ８．Ｇ １２ ｙ ４４．Ｔｈｒ５３及びＧ
ｊ２ｙ８０の少なくとも一つが欠失されるか、または天
然アミノ酸の群から選ばれた異なるアミノ酸により置換
されるという事実を特徴とする． 本発明の好ましい百日咳毒素変異株は，アミノａＳ基（
ｉＪｕｌ２９とアミノ酸残４Ａｒｇ ５．Ａ！Ｉｌｌ
１１．Ａｓｐ １３及びＴｒｐ ２６の少なくとも一つ
とが、欠失されるか、または天然アミノ酸の群から選ば
れた異なるアミノ酸残基により置換されるという事実を
特徴とする、百日咳毒素変異株である．本発明の実施態
様によれば，百日咳毒素変異株は、表■、欄１に示され
たアミノ酸置換を含む．この表中、第一行には突然変異
タンパク質の名称が示され、第二行には，行なわれた突
然変異の型が示され、第三行には、突然変異に１１１用
されたヌクレ才チド配列が示される． これらの中で、下記の百日咳毒素変異株が、持に好まし
い． ＰＴ ２１１Ｇ（ＰＴ−１２９Ｇ１、Ｌ９／２８
Ｇ（ＰＴ−９Ｋ／１２９６１． １１３／２８ＧｆＰＴ
−）：ｔＬ／１２９Ｇ＋， １２６／２８６ｆＦ’Ｔ−
２１１！／１２９Ｇ１、 Ｌ１３＃２６／２１１Ｇ（
Ｐ丁−１３Ｌ／２６１／１２９Ｇ１、 ＰＴ−８８Ｅ
／８９Ｓ及びＥ３８／Ｓ８９／２１１Ｇ（ＰＴ−８８Ｅ
／８９Ｓ／１２９Ｇ＋ ．上記の特徴を有するＦＴ変異
株は、本発明によれば、部位特穴性の突然変異誘発によ
り突然変異された百日咳菌から単離されたＰＴを暗号化
する染色体遺伝子を含むボルデテラ菌株の培養により．
＆るいはＳｌサブユニットを暗号化するヌクレ才チド配
列の一つ以上の特異性部位中のヌクレ才チド塩基の欠失
により、得られる． 本発明によれば、上記のボルデテラ菌株は、ａ）少なく
とも一種の抗生物質に耐性な野生型ボルデテラ菌株を選
択し， ｂｌ （ａｔで得られた菌株中の相同組換えにより、百
日咳毒素を暗号化する染色体遺伝子を異なるタンパク質
を暗号化する遺伝子で置換し、 ｃｌ （ｂｌ で得られたＰＴ（Δｔｏｘ ）遺伝子
を含まないボルデテラ菌株を選択し、 ｄ）百日咳菌から単離された百日咳毒素遺伝子を突然変
異誘発し， ｅ）ボルデテラを複製し得ない適当に変性されたプラス
ミド中で上記の突然変異遺伝子を導人し、 ｆｌ ｉｃｌ で選択されたボルデテラ菌株（Δｔｏ
ｘ ）中の上記のプラスミドを導入し、ついで！後に Ｃ）突然変異百日咳毒素遺伝子による相同組換えが行な
われたボルデテラ菌株を単離することを含む方法により
得られる． 本発明のボルデテラ野生型菌株は，種百日咳菌、パラ百
日咳菌及び気管支敗血症菌の中から選ばれる．最後の二
つは，百日咳毒素オベロンを有しているが、その内部に
官能プロモーターの不在のため、通常それを生産しない
． 本発明の方法の段階ａ）に於いて，ボルデテラ菌株は，
突然変異株の選択を容易にするために、一８以上の抗生
物質に対して耐性にされる．本発明の実施態様によれば
，上記のボルデテラ菌株は，ナリジクス酸（ｎａｉｌ及
びストレプトマイシン（ｓｔｒ）に対して耐性にされる
．本発明の方法の段階ｂ）に於いて，置換は． ＰＴと
異なるタンパク質を暗号化する遺伝子、例えばカナマイ
シン（Ｎａｎｌによる、ａ）で得られた菌株中に含まれ
るＰＴを暗号化する染色体遺伝子の相同組換えにより、
行なわれる．その組換えは、一般に知られる技術を用い
て，ボルデテラ中でｍｏｂ得ないプラスミドを用いて行
なわれてもよい．プラスミドｐｎＴｐｔが使用されるこ
とが好ましく、その構成はスティビッツ（Ｓｔｉｂｉｔ
ｚｌＳら（ＧＥＮＥ、５０巻，１３３〜１４０頁、１９
８６年）により記載された．上記のプラスミドは，大腸
菌株を用いて二成分で，あるいは云わゆるヘルパープラ
スミドを含む大腸菌株を用いて三成分で接合によりボル
デテラ細胞中に導入されてもよい．本発明によれば、ｐ
ＲＴｐｉプラスミドはＥｃｏＲＩ制限酵素により消化さ
れ、ついでＰＴと異なるタンパク質を暗号化する遺伝子
を含み，且つヌクレ才チドの中に、ＰＴＩＯＩＡＴＣＣ
６７８５４プラスミド中に含まれる百日咳菌ＰＴの遺伝
子の領域ｌ〜４２０及び３６２５〜４６９６に相当する
配列を含釘ＤＮＡ ＥｃｏＲ？フラグメントとつながれ
る．ついで，大腸菌細胞は、得られたプラスミドにより
形質転換され、形質転換体が通常の技術を用いて選択さ
れる． ついで，このようにしてｉ１！択された陽性のクローン
が、ボルデットーゲンゴウ（Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇａ＊ｇｅ
＋ａ） （ＩＧと称する）培地′Ｌｓ３ ７℃で約４８
時間予め１ｌｊ！！された、ａ｝で得られたボルデテラ
閑株と接合される．その接合は、通常の技術に従っＴ：
． １ ０ｍＭｆ） ＭｇＣｊｌ！ ｘが添加された
ＢＧ培地テ３７℃で３〜６時間行なわれる． 本発明の方法の段階Ｃ）に於いて、染色体レベルで相同
組換えが行なわれたボルデテラ菌株は，好適な抗生物質
の添加により選択的にされたＧＨ培地で選択される．
ｎａＩ２及びｓｔｒに耐性のボルデテラ菌株が使用され
． ＰＴと異なる遺伝子がカナマイシンの一種である場
合，培地に添加される抗生物質はｎａｆｆ ，ｓｔｒ及
びＫａｎである．この培地で増殖する閑株（三つの抗生
物質に対して耐性である）は、カナマイシン遺伝子によ
るＰＴ遺伝子の完全な置換が行なわれ、且つストレプト
マイシンに対する感受性を付与するｐＲＴＰｌプラスミ
ドを失なった菌株である． このような置換を確かめる目的で、以下にΔｔｏｘとし
て示される上記の菌株が、サザンプロット（Ｅ．サザン
（Ｅ． Ｓｏｕｔｈｅｒｌ著． Ｊ．Ｍｏｌ２ ；Ｂｉ
ｏｆｆ：９８巻、５０３〜５１７頁． ＋１９７５年）
）、ＥＬＩＳＡ分析１ウォン（１１ｅｉｇ），Ｌｔｔ．
及びスケルトン（Ｓｋａｌｔｏｎ）Ｓ．Ｘ．Ｊ．著、Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ− ２６巻．１３
１６〜１３２０頁、１９８８年）及びＣＩＩＯ細胞に関
する毒性試験（ヒュウレット（Ｈｅｗｌｅｔｔｌ ．
Ｅ． Ｌ．ら著． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｓｕｎ．４０巻
．． １１９８ 〜１２３０頁（１９８３年））により
、特性決定された． これらの結果は，以下のことを示した．ａ） ＰＴ遺
伝子の分子社よりも低い分子量を有するヌクレ才チドフ
ラグメントのΔｔｏｘ菌株染色体のＤＮＡ中の存在、こ
れは上記の遺伝子及びその置換体（カナマイシン遺伝子
》の両方と雑種をっくる： ｂ） Δｔｏｘ菌株のいずれもが、ＥＬＴＳＡ分析によ
り検出可能な賃で百日咳７Ｂ素を生産，分泌し得・ない
： ｃｌ １／１０に希釈されたボルデテラΔｔｏｘの上澄
液を用いて測定されたＣＨＯ細胞に関する毒性は、それ
らの増殖を変更し得ない．上澄液をそのまま用いて，わ
ずかに非特異的な毒性が観察される．上記のΔｔｏｘ
ｉ株が病原性百日咳菌に対して保謹を与える能力を確か
める目的のため、“２１７ＰＡＮ７Ｇ２０．４ ＣＯ
ＤＥ ＯＦ ＦＥυＥＲＡＩ− ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ
Ｓ，Ｐｏｔｅｎｃｙｔｅｓｔ ｏｆ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ ｖａｃｃｉｎｅ （百日咳ワクチンノ効能試験）
”に記載されているように“大脳内抗原投与“分析が、
行なわれる．実施例ｌに示された得られた結果は上記の
菌株がＰＴを暗号化する通伝子を最早有していないが，
病原性百日咳閑による大脳内感染に対して優れた保譲を
依然として誘起し得ることを示す． 本発明の方法の段階ｄ）に於いて，突然変異ＰＴ遺伝子
の構成はＰＴＩＯＩ ＡＴＣＣ ６７８５４プラスミド
中に含まれる百日咳閑ＰＴを暗号化する遺伝子のＳｌサ
ブユニットを暗号化するヌクレ才チド配列の決定された
部分の１種以上のヌクレ才チドをｆＩ４位特異的な突然
変異誘発作用によって欠失または置換することにより行
なわれる． 本発明の一つの実施態様によれば． ｐ’ｒ遺伝子は−
Ａｌｌ中に示された突然変異を含み、第一欄の３行に示
されたヌクレ才チド配列を用いて、横成される． 本発明の方法の段階Ｃ）に於いて、ｔ（階ｄ）で得られ
た突然変異遺伝子がボルデテラ中で複製し得ないプラス
ミド中でクローン化される．その目的のために、プラス
ミドｐＲＴＰｌが利用され，ゲンタマイシン（市販され
ている）に対する抵抗性を暗号化する遺伝子またはテト
ラサイクリン（市販されている）に対する抵抗性を暗号
化する遺伝子をその制限部位ＢａｍＩＩＩ中に神入する
ことにより、それを変性する．このような遺伝子のクロ
ーン化は遺伝子工学に一般に使用される既知の技術の一
つに従って行なわれる．かくして、夫々ｐＨＴＰＧｌ及
びｐＲＴＰＴｌとして示される新規なベクターが使用さ
れて，突然変異ＰＴ遺伝子をボルデテラ八ｔａｘ菌株染
色体中に掃人する． 特に、突然変異遺伝子はプラスミドｐＲＴＰＧ１及びｐ
ＲＴＰＴＩ中でクローン化され、得られる組換えプラス
ミドが大腸菌細胞中に形質転換により導入される．形質
転換・体は上記のような操作により、ΔＬｏｌ１ボルデ
テラ菌株と接合される．本発明の目的に適した大ｌｌ１
菌細胞はサイモンｌｓｘｉｓ＊鰐） ｎ、ら習、Ｄｉｏ
ｔｅｃｈ ｌ巻、７８４ 〜７９３ Ｍ．１９８３年に
記載された大腸菌ＳＳＭＩＯである．最後に，本発明の
方法の段階ｇ）に於いて、ボルデテラ菌株の選択が行な
われ、それらの染色体中に突然変異ＰＴ遺伝子を含む． 特に、最初に、染色体中に組込まれた組換えプラスミド
を含むボルデテラ菌株の選択がｎａｌ及びゲンタマイシ
ンまたはｎａｌ及びテトラサイクリンを添加したＢＧ培
地による培養によって行なわれ、ついで上記のプラスミ
ドを失った菌株の選択がｓｔｒを含むＢＧ培地による培
養により行なわれる．最後に、この培地で増殖し得るコ
ロニーが単離され、ｎａｌ ， ｓｔｒ及びκａｎまた
はｎａｌ及びｓｔｒを含むＢＧ培地で培養される。この
最後の培地により，この様に操作して、Ｋａｎ遺伝子の
突然変異ＰＴｉ伝子によるＩＩＩのために，カナマイシ
ン抵抗性フエノタイブを失ったボルデテラコロニーが選
択される． 上記のボルデテラ菌株が突然変異染色体遺伝子により暗
号化されたＦＴ変″１４株の形質を発現し，分泌する能
力を確かめるために、これらの菌株の幾？かが好適な培
地、例えば実廁例ｌに示された組成を有する培地中で培
養される．生産データは下記のことを示す． ■百日咳菌株は同じ野生型菌株を培養することにより得
られる量に匹敵する量でＰＴ変異株を生産する． 一→Ｔ毒素を通常生産しない気管支敗血症菌株及びパラ
百日咳菌株は驚くべきことに培地中でＰＴ毒素生産、分
泌し得る． ■パラ百日咳菌株は百日咳菌株より６多徹にＰＴｆ８素
を生産する． 上記の結果は例えば、百日咳菌ＰＴの一つの如き有効な
プロモーターによる、上記の野生型ボルデテラ中に存在
する不活性なプロモーターの置換が上記の菌株にＰＴま
たはＩ’Ｔの変異株の形質を発現することを可能にする
ことを示す． 本発明によれ１１、上記のようにして得られたＰＴ変異
株が例えばセクラｌｓｅｋｕｒａｌ Ｒ． Ｄ．ら著，
Ｊ．１１ｉｏ１、ｃｊ＋ｅ＋ｗ．２５８巻．１４６４７
〜１４６５１頁１１９８：］年》に記載された精製技
術の如き．当業者に知られた禎製技術の中から選ばれた
精製技術により、照細胞培地から純粋な形で取出される
． 本発明によれば，或種のＰＴ変異株の物理化学的性質，
生物学的性質及び免疫学的性質が試験管内及び生体内で
測定された． 物理化学的性質に関する限り、ポリアクリルアミドゲル
によるＳＯＳ中の電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥＩによる
分析は混在タンパク質の不在及びＰＴの一つと同じパタ
ーンを示し，一方、アミノ酸分析は既知のアミノ酸配列
に基づいて予想される値と一致するアミノ酸組成を示す
． 更に、ジメチル（２．６−０−１０−シクロデキストリ
ンの不在がベレイ（Ｒｅｌａｙ） Ｊ． Ｇ ｆ１９８
５年）により記載された方法（ ＋Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎｂｉｏｃｈｅａ＋ｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ
（生化学及び分子生物学に於ける実験室技術）”，バ
ードン１１１ｕｒｄθＲ）ル．ｎ．及びバン・クニッペ
ンベルグｌＶａｎＫｎｉｐｐｅｎｎｂｅｒｇｌ Ｐ．Ｈ
． （編集） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １６巻）を用いて確
認され，また．Ｎ綱胞抗百日咳ワクチンの可能な混在物
質である、フェチュイン，タンバク質６９κＤ及び糸状
血球凝集素の何れもの不在がこのようなタンパク質に特
異的な抗体を利用するウエスタンブロッティング分析
【
トウビン（ＴｏｗｂｉｎｌＨ．Ｔ．ラ著（１９７６年．
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．．ＵＳＡ． ７３巻、３６！〜３６５
頁］により確認される．Ｒ後に，皮ｆＩ壊死性毒素の不
在がキム（Ｋｉｍｅｌ Ｋ．Ｔ．ら著（ １９８６年）
（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｓｕｎ， ５２巻、３７０ 〜
３７７頁）に記載されるようなモルモットに関して行な
われる分析により確認され、一方、培地に一般に用いら
れる成分であるシクロデキストリンの不在が薄層クロマ
トグラフィーにより示される． 本発明によるＰＴ変異株毒性の不在または減少は試験管
内及び生体内の種々の実験系で−ＩＩ定される． ＣＨＯ （チャイニーズハムスター卵巣細胞）細胞分
析で得られた結果は生来のＰＴｉ性に関してｌＯ倍〜１
、［Ｉ＠ｅ．開Ｏ倍の毒性の消失までの減少を示す．特
に、ＰＴ−１２９６． ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ． ＰＴ
−１：ＩＬ７１２９Ｇ．ＦＴ−２６１／１２９Ｇ． Ｐ
Ｔ−１３１／２ｆｉｌ／１２９Ｇ． ＰＴ−ａ８Ｅ／８
９Ｓ及びＰ７−ＨＥ／［９５／１２９Ｇ の変異株ＩＦ
ｔｋ’ｉ”． 最ｒｉｉノ結果が得られる． 更に、その他の分析のいずれに於いても、生産物の毒性
はここで用いた最高の投与量でも賎察されなかった． このような結果は毒性のＰＴ活性がそのＳｌサブユニッ
トのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性によるも
のであることを裏付ける． Ｓｌサプユニットの遺伝子操作によっては変更されない
唯一のＰＴ変異株活性は細胞に対する分裂促進性（ｍｉ
ｔ．ｏｇｅｎｅｔｉｃｉｔｙｌ及び血球凝集能力であり
，これらは，知られているように、Ｂオリゴマーの存在
により分子に付与される．実際に，分裂促進活性の存在
に間して試験管内で分析される上記のオリゴマ−（表１
■中Ｂで示される）のみを分泌する本発明のボルデテラ
菌株は上記した既知の技術の教示を裏付．ける． 上記の生体内の活性の役割は未だ明らかでないが、試験
管内で確かめられる分裂促進効果をもつためには、高淵
度（０． ３ 〜）．ｆ｝ ｕ ｇ／ ｒａｇ ）が必
要であることから，それは最小または存在しなくなるべ
きであることが，予知し得る．このような濃度はワクチ
ン接種の部位にのみ存在する．しかしながら，本発明に
よれば，本発明を限定しないが、ＰＴ−９Ｋ７１．２９
Ｇ変異株の免疫原性が以下の実施例に示されるように生
体内で試験される．その結果は上記の変異株が高い抗体
力価を有する抗ＰＴ抗体の生成を誘起し得ること及び上
記の抗体がＣＨＯ細胞に関するＰＴＩ性作用を中和し得
ることを示す． それ故、突然変異ＰＴ遺伝子の構成に関して行なわれた
遺伝子操作が百日咳毒素の典型的な免疫原住を変更しな
いこと及び既知の技術に報告されたことと異なって、上
記の性質がＰＴＳＩサブユニットの酵素活性とは無関係
であることを結論し得る． よって、本発明により得られたボルデテラ菌株及び静素
的者こ不活性なｌ’Ｔ変′Ａ殊｛減少された毒性を有す
るか、または毒性をもたない）は有効な百日咳ワクチン
の開発のための爛れた候補である．本発明に従って、抗
百日咳ワクチンとして適する免疫原性処方は上記の菌株
またはそれらにより生産された変異株を、患者に於いて
免疫原性物質のためのビヒクルとして一般に使用される
担体の中から選ばれた製薬的に許容し得る担体に添加す
ることにより調製し得る．このような担体の例は食塩水
である．抗原生産物は溶液または懸濁液の形で担体中に
存在してもよい．また，上記の処方は免疫応答を’ｊｉ
ｌ＋激し、それ故、ワクチン有効性を改良するために、
補助薬（アジュヴアント）を含んでもよい．本発明の目
的のため、好適な補助薬は剰えば、リン酸アルミニウム
、水酸化アルミニウム、１〜インターロイキンらしくは
２−インターロイキンまたはそれらのべプチドフラグメ
ントを含む． 抗百日咳ワクチンとして好適な免疫原性処方は一般に、
百日咳に対して有効な免疫を与えるために選ばれた最終
濃度の麟株及びそれらにより生産された突然変異体を含
む．処方後に、ワクチンは無菌容器中に導入され、種々
の瀾度、例えば４℃、２０℃，もしくは３７℃で保たれ
てもよく，または凍結乾燥されてちよい。百日咳に対し
て有効な免疫を誘起するため、都合よく処方されたワク
チンを１以上の投薬量で投与してもよい。 本発明のワクチンは通常の方法により投与し得る．その
処置は一つの投薬量またはそれより多い投薬量を継続的
に投与することからなってもよい．本発明のワクチンは
例えば．ｌｉｌ｛ｕｆｆｌ｝キソイドもしくはジフテリ
アトキソイドまたはその他のボルデテラ抗原の如き、一
種以上の抗原成分を含んでもよい． 最後の処方が抗百日咳ワクチン中に含まれることを確か
めるために、０． ０３５％〜０．４２０％の重量／容
鑓で表わされる量（即ち，σ．３ロひ〜Ｏ』２５のＰＴ
変異株／ホルムアルデヒド重量比に相当する）のホルム
アルデヒドで安定化し得る．このような濃度で使用され
るホルムアルデヒドは変異株安定化を可能にすることの
他に，免疫学的性質を変えないで、使用される濃度に応
じて、分製促道性及び血Ｉ１ｌ′ａ集活性の減少及び／
また１１消失を誘起する． ジフテリア毒素の（：ＲＭ１９７に関する文献に記載さ
れたこと（その分子のホルムアルデヒド処理が保謹免疫
を得るのに必要であった）と異なって、本発明者らはホ
ルムアルデヒドで安定化されたＰＴ変異株及びホルムア
ルデヒドで安定化されなかった１１Ｔへ変異株の両方が
同じ免疫学的活１・１（抗体中和の誘起及び病原性百日
咳囚による大脳感染に対ずる保護）を示すことを蒙くべ
きことに見い出した． 両方の処方（安定化変異株を含み、または含まない）は
２０℃または４℃で保たれる場合、同じ安定性を示すが
，一方、３７℃では，ホルムアルデヒドで処理された変
異株に関して、一層高い安定性が観察される． 本発明の抗百日咳ワクチンは活性成分として，化学試薬
により解毒されたＰＴを含む既知の技術のワクチンに対
してかなりの１り点を示−ケ．本発明の遺伝子操作によ
り得られたＰＴ変異株は実際に、不ＯＴ逆性の毒性変更
及び未変化の免疫悼性を示す．本発明のＦＴ変異株の安
定性は人体に予想される投薬量の１０００倍である１５
００＋Ｌｇ／体重１ｋｇによる生体内試験が局所もしく
は全身の毒性反応をもたらさないという証拠により更に
確かめられる．要するに、本発明により突然変異された
ボルデテラ菌株及び好ましくは、それらにより生産され
る突然変異ＰＴ毒素は高い免疫原性及び毒性を有しない
ために、所望の特性を有する合成の細胞及び無細胞の抗
百日咳ワクチンの開発に特に適する抗原である． 本発明に従ッテ、百日咳菌（Ｗ２８１ ＰＴＬ９／２８
Ｇ （ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇｌ 、パラ百日咳菌ＰＴ２
８Ｇ（ＰＴ−１２９Ｇ＋及びパラ６日咳菌ＰＴＩ２６／
２８６ ｆＰＴ−２６１／１２９ＧｌがＡＴＣＣ ５３
δ９４，ＡＴＣＣ ５３＆９２及ヒＡＴＣＣ ５３８９
３トＬ，Ｔ、１９８９年４１５日に、ザ・アメリカン・
タイプ・カルチャー・センター１ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒｌに寄
託された． 以下の実施例は例示であり、本′ｙｅ明のμＨ定ではな
い． 実施例ｌ 百日咳菌株ＢＰ １６５． ＯＰ Ｔｏｈａ＋ｓａ及び
ＢＰＷ ２８ｉｓ（：ＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ．ｌ ．パ
ラ百日咳菌の株ＯＰ １４（ＳＣＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ
．）及び気管支敗血症菌ＢＰ ？＋＋６５Ｉｓ（：ＬＡ
ＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ．ｌ をストレプトマイシン（ｓｔｒ
）及びナリジクス酸 （ｎａｉｌに耐性にする．実際に
、夫々の菌株の約＋ＱＩＯ個の細菌を８００ｕｇ／ｍｌ
２のｓｔｒまたは２００ｕ ｇ ／ｍＰのｎａｌを含み
．１５％のフィブリンが除去した無菌血液を補充したボ
ルデットーゲンゴウ（ＢＧ）寒天（ジフコ（ａｒｒｃｏ
）］ 上ニｔａ布シ、３７℃で約１０（ｉｆ！’ＩＩＪ
ｔｔｆｆＪ１する． 上記のプレート上で増殖した自然変異株を単離し、それ
らの染色体中に含まれる百日咳ｆ８素を鴎号化するｉ！
ｌ伝子を第１図に示さＩ１た方式に従って操作して、カ
ナマ・イシン構造遺伝子で置換する． この目的のためにプラスミドｐＲＴＰ１ （スチビッッ
（ Ｓｔｉｂｉｚ）ら著． Ｇｅｎｅ． ５０巻、１３
３ 〜１４０頁，１９８６年）を使用した．これはボル
デテラ中で複製しないが，接合によりそれの中に導入し
得る．実際に、プラスミドｐＲＴＲｌ（１ ０μｇ》を
，供給業者により示唆された方法に従っ゛Ｃ、５０ユニ
ットの制限酵素ＥｃｏＲＩ （ＢＲＬ）で切断する．つ
いでプラスミドＯＮ＾を１ユニットＴ４ ＤＮＡリガー
ゼの存在下でリガーゼの混合物［６６ｍＭのトリス（Ｔ
ｒｉｓｌ −１１ＣＩ２ｐＨ７．６， ｌ ｍＷのＡ
ＴＰ、ｌＯｍＭの ｌＪｇｃ４２ ｚ． １ ５ ｍＭ
のジチ、オスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌｌ］ １ ０μ、β中で，カナマイシン （Ｋａｎ
ｌ ［ファーマシアｌＰｈａｒｍａｃｉａ） ，ウプサ
ラ （Ｕｐｐｓａｌａｌ ］に対する抵抗性を暗号化す
る構造遺伝子を含み，側面に位置する領域！〜４２０及
び３６２６〜４６９２に相当するヌクレ才チド配列の中
に構造百日咳毒素遺伝子を含むＤＮＡ Ｅｅｏ旧フラグ
メント０．２μｇとｌ４℃で一夜にわたって接合する．
上記のフラグメントはまずプラスミド［ｌＮＡ ＰＴＩ
ＯＩ ＡＴＣＣ６７ａ５４を制限酵素ＩｓｔＥｆｌ ｛
これは位置４２１及び３６２５という制限部位のみで切
断する｝で切断し、配列４２１〜３６２５をＪＪｊ除し
，ついでクレノー酵素により、末端部位の切断力を失わ
せたＢｓｔＥＩ Ｉをつくることにより得られる．最後
に、Ｋａｎ遺伝子を含むフラグメントＨｉｎｃＩＩをＴ
４ＤＮＡリガーゼの存在下のりガーゼ混合物中で，上記
の文献に記載された線状化プラスミドＤＮＡと接合する
．１４℃で約１８時間後に，リガーゼ混合物を使用して
受容大腸菌細胞を形質転換し，該形質転換体を５０μｇ
／＋４のアンピシリン及び５０μｇ ／ｍβのカナマ
イシンを添加したＬＢ寒天培地上で３５℃で一夜にわた
って選別する．最後に，陽性クローンのｌから，期待さ
れる特性を有するプラスミドを単離し，続いて、Ｅｃｏ
Ｆ｝Ｉ制限酵素で切断する．カナマイシン遺伝子を含む
ＤＮＡフラグメントな、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）らｉ （１９１１３年）“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ （酵素学に於ける方法）”に記載さ
れるようにアガ日二スゲル上で単ｍする．ついで，上記
のＥｃｏＲＩフラグメントを、Ｅｃｏ旧で先に切断され
た−ＴＰ！プラスミドと接合し，ｍられるリガーゼ混合
物を使用して，″鱈ｅｌＪｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｓ＋ｏ
１ｏｇｙ″１０１巻．２０〜７８頁． １９８３年に於
いてメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇｌにより記載されるよう
にして、サイモンｌｓｉｍｏｎ） Ｒ．ら著［ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏ１、１巻，７８４〜７９１頁（ １９８３
年）］により記載された大腸菌ＳＭＩＯ細胞を受容性に
形質転換する．形質転換体を５０μＢ／ｌＩ（２のアン
ビシリン及び５０μｇ／ｍｌ２のカナマイシンを含むＬ
Ｄ寒天プレート（ジフコ、Ｌａｂ．ｊ上で３７℃で２４
時間選別する． 陽性クローンの一つから、期待される特性を有する，
ｐＲＴＰｌ−ΔＰＴ− ＫＡＮと称されるプラスミドを
抽出する．続いて、上記のプラスミドで形質転換されＬ
ｆｉ寒天上で３７℃で約１８時間培養された大鑵菌ＳＭ
Ｉロ細胞をボルデットーゲンゴウ培地で４８時間にわた
り，予め培養されたボルデテラのｓＬｒまたはｎａｌに
耐性の菌株と接合する．その接合は１０ｓ＋帥のれＣ忍
ｉを添加した開培地で３７℃で３〜６時間行なわれる．
ついで、得られるコロニーを回収し、３０μｇ ／＋ａ
εのナリジクス酸及び５０ｕｇ／ｍｊ？のカナマイシン
を含む開培地に塗布する．このような抗生物質に耐性の
菌株を選別する目的で、それらのプレートを３７℃に保
つ．３日後（気管支敗血症菌の場合）及び５〜６日後（
百日咳閏及びパラ百日咳菌の場合）に，ｎａｌ及びＫＡ
Ｎに耐性の多数の単一の溶血性コロニーが観察され、こ
れらはそれらの染色体中に、百日咳毒素遺伝子の側面領
域の１つとの相同組換えにより組込まれたｐＲＴＰ１〜
ΔＰＴ−ＫＡＮを含む．また、同様に第二領域の組換え
を容易にし、それ故にカナマイシンの遺伝子によるＰＴ
染色体遺伝子の置換を容易にするために，コロニーを４
００μｇ／ｏｌのストレプトマイシンを含むＢＧ培地上
に再度塗布する．上記の文献に記載されたように操作し
て、染色体ボルデテラ抵抗性に優性形質として有し、ス
トレプトマイシンに対する感受性を与えるｐＲＴＰ＋プ
ラスミドを失なった菌株を選択する． こうして、二つの型のフ０二一、即ち次のちのが得られ
る． ｌ） 完全にプラスミドを欠き，及び組換えち行なわれ
ておらず．ｓｔ．ｒ及びｎａｌに耐性で、かつＫａｎに
感受性のコロニー及び ２）二重組換え（Δｔｏｘｌにより、カナマイシン遺伝
子のＰＴ遺伝子への置換が行なわれた． ｓｔｒ．ｎａ
ｌ及びＫａｎに耐性のコロニ このような染色体の置換を確かめる目的で、閑株Δｔｏ
ｘ １１２，Δｔｏｘ Ｔｏｈａａ＋ａ．Δｔｏｘ １
６５．ΔｔｏｘＰ１４及びΔｔｏｘ ７８６５の特性を
サザンプロット，ＥＬＩＳＡ分析及びＣＩＩＯ細胞に関
する毒性により、既知の技術に従って検定する．実際に
、マームル（Ｍａｒｎ＋ｕｒ１、 Ｊ．の方法［Ｊ．Ｍ
ａ１、［ｌｉｏ１． ３巻、２０８〜２１６頁（１９６
１年）ｊにより上記のボルデテラ菌株から単離された染
色体ＤＮＡを好適な制限酵素で切断し，ｔ気泳動にかけ
、ニトロセルロース膜上に移し，ついでブローブとして
４６９６を用い、ＩＩＲＬニックー翻訳キットを用いて
ＰＴＪｆｌ伝子を含むｂｐＥｃｏＲＩフラグメントと放
射性同位元素でラベル付けしたＦＩＡＮ ｉｉｉｉ伝子
を含むｌ）ｒｆＡフラグメントとを交配（ｈｙｂｒｉｄ
）する． その交配反応１ｊＥ．サザンの方法（Ｊ．−１．Ｉ）（
ａ）．．９８巻、５１）３〜５１７頁（１９７５年）に
従って操作して行なわれる． その結果は両ブローブと交配するＰＴ遺伝子の分量より
も低い分子量をもつＤＮＡフラグメントのボルデテラΔ
ｔｏｘ菌株染色体ＤＮＡ中の存在を示す． ボルデテラ△ｔａｘ閑株をＳＳ変性培地中で３７℃で７
２時間培謄する．その培地の組成（ｇ／βで示す）は以
下のとおりである． Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ＩＯ．７．Ｌ−ブロリン
ロ．２４ ； Ｎａ（：ｇ ２．５：κＨｄ’０
４０．５ ； ＫＣＡＯ．２ ； Ｍｇ（；９１６！
ｂ０ ０．１： （：ａＣｆｆｚ Ｏ．Ｑ２： ｔ・
リス６．１；Ｌ−システィン０．０４” ； ＦｅＳＯ
−４１［ｘ００．００１” ：ナイアシン０．００４’
；グルタチ才ン０．１０” ：アスコルビン酸０
．０２９：レスミン酸（ｒｅｓｕｍｉｎ ａｃｉｄｓ）
１０．０ ； ２．６−０−ジメチルーβ−シクロデ
キストリン１．０，ｐＨ ７．６，この培地を２０分間
滅菌し、一方、＊が符された成分を濾過により別々に滅
菌する。規【１１１的な間隔で、培地試柑を採取し、１
２１１０（ｌｒ． ｐ． ｍ． ｔ．． ｐ． ｅ．で
４℃で４分間遠心分離する．続いて，無瑠胞１澄液の分
取液を百日咳毒素が存在するか否か，及びその毒性を確
かめるために、ＥＬｉＳＡ試験及び（：ｌＩＯ細胞に関
する毒性により分析する．ウォング（ Ｗｏｎｇｌ ．
ｋ．Ｉ１．及びスケルトン（Ｓｋｅｌｔｏｎｌ ．Ｓ．
Ｋ．著［Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏ１、．２６巻． １３１６〜１３２０頁（１９８８年
）］に記載されたようにして行なわれたＥＬＩＳＡ分折
はΔｔｏｘ ｍ株のいずれもが検出可能な量のＰＴを生
産し得ないことを示す． 更に． １／１０に希釈された上澄液はＣＨＯ細胞〔ヒ
ュウレット（Ｈｅｗｌｅｔｔ→， ｆＥ．Ｌ．ら著、Ｉ
ｎｆｅｃｌＩｍｍｕｎ ， ４（ｌ巻、１１９８ 〜１
２３ロ頁ｆ１９８３年）］を変性しない．未希釈上澄液
を用いれば、非特異的なａ性が観察される． 上記の菌株がＰＴを生産しないにせよ、病原性百日咳菌
に対する保護を依然として与え得るか否かを確かめる目
的で，ＣＯ叶１）Ｆ Ｆ［叶＾１．肝ＧυＬＡＴＩ（｝
Ｎ、ｐｏｔｅｎｃｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ （百日咳ワクチンの効能試験
） ． ２１／ｐａｒ ７１ｔ２１に記載された技術に
従って，大脳内抗原投与試験が行なわれる．実際に、Δ
ｔｏｘ １２８菌株及びＴｏｈａｍａ菌株並びに抗百日
咳ワクヂンの調製に一般に使用される同じ野生型菌株を
５９０ｎｍで測定した光学密度０．７まで， ３００ｍ
ｇの変性ＳＳ培地中で３７℃で培養する．ついで、培養
菌をｌ００００ｔ．ｐ−ｍ．でｌＯ分間遠心分離し［Ｊ
ＩＯローターを備えたべツクマン（Ｂｅｃｋ＋ｍａｎｌ
Ｊ２１遠心分離器１、ついで上澄液から分離された細胞
をＳＯ＋ｎｊｌｔの食塩水中に再度懸濁し，５６℃に３
０分間保つ．続いて、得られる懸濁液をＧＯ［ｌＥ Ｏ
Ｆ ＦＥＤＥＲＡＬ ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮＧ．：記載
されたようにして適当に希釈して、異なる投薬量用の通
常のワクチンとして使用する．その結果を、下記の表Ｉ
に示す． 表１ ｍＪ２／？ウＸ” Ｔｏｈａａ＋ａ Ｔ
ｏｈａｍａ△Ｌｏｘ １１２１１ Ｗ
２Ｊｌ △ｔａｘ０．０４ １５ハ６ ０．００８ １：ｌ／１６ Ｇ．（ｌａｌｌ＋ ９／ｌ＠ ６．ｆｌｆｌｆ｝３２ ２／ＩＩ １４／１６ １＠／１６ Ｉｔ／１６ １６／１６ ６／１６ １１７ＱＩ ２ハＩ ４／３６ １＠／ｌ６ １３７１Ｇ ８／ｌ６ ２ノ１ａ 表から観察し得るように，Δｔｏｘ菌株に関してわずか
な・保護の減少が観察されるが、それらは依然として極
めて良好な保護を与え，それ故、抗百日咳ワクチンとし
て特に適するようである．＊は細胞悲濁液の容量を示す
． 実施例２ 実施例ｌに示されたようにして得られた八Ｌｏｘ菌株の
染色体中に突然変異形態の百日咳毒素遺伝子を導入する
目的で、部位ＢａｍＨＩ中に、ゲンタマイシン（フ７−
マシア、ウプサラ）に対する抵抗性を暗号化する遺伝子
及びテトラサイクリン（ファーマシア，ウプサラ）に対
する抵抗性を暗号化する遺伝子を導入して． ｐＲＴＰ
１プラスミドを変性する．上記の遺伝子のクローン化は
マニアチスらにより記ａされたｍ換λ開Ａｏ）ｆｌ！ｉ
短の技術を用いて行なわれる．ついで，ボルデテラ染色
体中に百日＠嚢素の突然麦ｗＡ株を導入するために，夫
々ｐｎ■Ｐｃｉ及びｐＲ’ｒｌＴｌと称されるこれらの
新規ベクターを使用する．特に、上記の遺伝子は異なる
アミノ酸を暗号化するその他の遺伝子による，ヌクレ才
チド配列のＰＴＩＯＩ ＡＴＣＣ ６７８５４プラスミ
ド中に含まれるＰＴを暗号化する遺伝子に於ける，欠失
または置換により、部位特異的な突然変異誘発技術によ
り得られる．更に詳細には，下記の表■【の第一欄に示
される突然変異をＳｌヌクレ才チド配列中に含むＰＴ遺
伝子が構成される． ｐＲＴＰＧｌプラスミド及びｐｎＴｐＴｔプラスミド中
に上記の突然変異を含むＥｅｏＲｌフラグメントをクロ
ーン化した後に、ｓｕｔｏ大腸菌細胞を形質転換するた
めに，これらを使用し、こうして得られた形質転換体を
八ｔａｘボルデテラ菌株と接合する．ついで、染色体中
にこのようなプラスミドの組込みを示すコロニーを，夫
々、３０μｓ ／ｍβのｎａｌ及び２０μｇ／ｍβのゲ
ンタマイシンまたは３０μｇ７ｍｇのｆ１ａｌ及びｌ”
Ｊ．ｓμ８八４のテトラサイクリンを含むＨＧ培地プレ
ートで選別する．こうして選別されたコロニーは全て，
それらｆｌｆ＊の染色体中に組込まれたプラスミドを示
す．紡いて、プラスミドを失ったコロニーを選別する目
的で，報告されているようにして得られたコロニーを４
００ｕｇ／鵡βのストレプトマイシンを含むＢＧ培地に
塗布する．ついで、上記の培地上に増殖し得るコロニを
，夫々次のものを含有するＢＧプレート上で同時に培養
する． ａｔ ｎａｌ ３ ０ ｕｇ ／ｔａｌ２ ， ｓｔ
ｒ ４００ ｕｇ ／ｍ（２及び５０μｇ／ｙａｌ２の
カナマイシン ｂｌ ｎａｌ ３０ｕｇ ／１１４２． ｓｔｒ ４
００ ｕｇ／＋＋Ｉ１２ａ》中に得られたコロニーはプ
ラスミドを失ったユロニーであり、それ故、カナマイシ
ンに耐性である元のΔｔｏｘコロニーと同じである．一
方、培地ｂ）で増殖されたコロニーはカナマイシンに対
する抵抗性を失ったものであり、その遺伝子は突然変異
を生じた遺伝子により，Ｍ換された． ｂ）で１９られたコロニーがＰＴ変異株を生産，分泌す
る能力の例として，百日咳菌１２８／ＰＴ−１２９Ｇ、
パラ百日咳閑Ｐ１４／ＰＴ−１２９Ｇ及び気管支敗血症
菌７Ｊｌ＠Ｓ／ＰＴ−１２９Ｇの菌株をまずＢ６プレー
ト上に塗？し、ついで１５ｆｆｌＩ２の変性ＳＳ培地中
で３７℃で７２時間培養する． ＥＬＩＳＡ分析による
監視により評価されたＰＴ変異株生産のデータが第２図
に示され、以下のことを示す． ■試験した全てのボルデテラ菌株がＰＴ変異株を生産し
、パラ百日咳菌がその他のボルデテラ閑の２倍の債のＰ
Ｔ変異株を生産する． 表Ｉ【の第一欄に示された突然変異の主因となるＰ丁遺
伝子を含有する百日咳菌Ｗ２８株及びＩｌＦ’ １６５
株並びにバラ百日咳菌Ｐｌ４ 味を上記の文献に示され
たように培養することにより得られた｛】゛ｒ変異株の
生産に関するデータが同表の第三欄に示され、以下のこ
とを示す． 一試験した全ての菌株はＰＴ変異株の形質を発現し５’
｝泌し得る． ■上記のＰＴ変異株の拠つかが野生型Ｐ’ｒ（＋＋＋＋
ｌに関して得られた社に匹敵する量で生産され、且つ■
バラ百日咳菌Ｐ目は百日咳菌の２倍の量のＦＴ変異株を
生産する． 上記の菌株の幾つか（Ｄで示される）は百日咳毒素のオ
リゴマーＢ（サブユニットＳ２，Ｓ３．Ｓ４及びＳ５に
より構成される）のみを分泌する． 更に、大脳内抗原投与試験後に得られた結果は上記のボ
ルデテラ菌株が抗百日咳細胞ワクチンの開発に適するこ
とを示す． 実施例３ ＰＴ・・田・のＩ産び ゜ ハラ百日咳菌Ｐ１４／ＰＴ−１２９Ｇ株、百日咳ＩＭ１
２８９ｋ７１２９Ｇ株，百日咳菌Ｗ２８ １３Ｌ／１２
９Ｇ株及び百日咳菌１２８ ２６１／１２９Ｇ株ヲ２０
４２のＳＳ変性培地（ｐＨ ７．４１を含む３０Ｉ２の
容量のケマップ（Ｃｈｅｍａｐ）発酵容器中で， ０．
１Ｖ／Ｖ／ｆｆｉの空気流量で培養する．毎分の回転数
を最小の２００から最大の７００まで変えて，溶解酸素
量を２０％に保つ．温度を３５℃に調節し、ｐｌ（を１
、 ５Ｎのグルタミン酸、１．５Ｎの塩酸． ０．１５
Ｎのブロリンを含む溶液を使用することにより中性の値
に保つ．約３６〜４８時間後、即ち培養菌が５９０開で
測定した光学密度１４〜１８に達した時に、細胞を発酵
培地の遠心分ｉ１ｉ！ ［ベツクマンｌＢｅｅｋ＋ｍａ
ｎｌ ＪＣＦ−７遠心分離器、６０ｈｆｆ ／分の流量
で，１９００Ｇｐｍ− ４℃、３分間１により除去し、
突然変異ク・ンバク質を無細胞上澄液から精製し％無菌
条件
トウビン（ＴｏｗｂｉｎｌＨ．Ｔ．ラ著（１９７６年．
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．．ＵＳＡ． ７３巻、３６！〜３６５
頁］により確認される．Ｒ後に，皮ｆＩ壊死性毒素の不
在がキム（Ｋｉｍｅｌ Ｋ．Ｔ．ら著（ １９８６年）
（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｓｕｎ， ５２巻、３７０ 〜
３７７頁）に記載されるようなモルモットに関して行な
われる分析により確認され、一方、培地に一般に用いら
れる成分であるシクロデキストリンの不在が薄層クロマ
トグラフィーにより示される． 本発明によるＰＴ変異株毒性の不在または減少は試験管
内及び生体内の種々の実験系で−ＩＩ定される． ＣＨＯ （チャイニーズハムスター卵巣細胞）細胞分
析で得られた結果は生来のＰＴｉ性に関してｌＯ倍〜１
、［Ｉ＠ｅ．開Ｏ倍の毒性の消失までの減少を示す．特
に、ＰＴ−１２９６． ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ． ＰＴ
−１：ＩＬ７１２９Ｇ．ＦＴ−２６１／１２９Ｇ． Ｐ
Ｔ−１３１／２ｆｉｌ／１２９Ｇ． ＰＴ−ａ８Ｅ／８
９Ｓ及びＰ７−ＨＥ／［９５／１２９Ｇ の変異株ＩＦ
ｔｋ’ｉ”． 最ｒｉｉノ結果が得られる． 更に、その他の分析のいずれに於いても、生産物の毒性
はここで用いた最高の投与量でも賎察されなかった． このような結果は毒性のＰＴ活性がそのＳｌサブユニッ
トのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性によるも
のであることを裏付ける． Ｓｌサプユニットの遺伝子操作によっては変更されない
唯一のＰＴ変異株活性は細胞に対する分裂促進性（ｍｉ
ｔ．ｏｇｅｎｅｔｉｃｉｔｙｌ及び血球凝集能力であり
，これらは，知られているように、Ｂオリゴマーの存在
により分子に付与される．実際に，分裂促進活性の存在
に間して試験管内で分析される上記のオリゴマ−（表１
■中Ｂで示される）のみを分泌する本発明のボルデテラ
菌株は上記した既知の技術の教示を裏付．ける． 上記の生体内の活性の役割は未だ明らかでないが、試験
管内で確かめられる分裂促進効果をもつためには、高淵
度（０． ３ 〜）．ｆ｝ ｕ ｇ／ ｒａｇ ）が必
要であることから，それは最小または存在しなくなるべ
きであることが，予知し得る．このような濃度はワクチ
ン接種の部位にのみ存在する．しかしながら，本発明に
よれば，本発明を限定しないが、ＰＴ−９Ｋ７１．２９
Ｇ変異株の免疫原性が以下の実施例に示されるように生
体内で試験される．その結果は上記の変異株が高い抗体
力価を有する抗ＰＴ抗体の生成を誘起し得ること及び上
記の抗体がＣＨＯ細胞に関するＰＴＩ性作用を中和し得
ることを示す． それ故、突然変異ＰＴ遺伝子の構成に関して行なわれた
遺伝子操作が百日咳毒素の典型的な免疫原住を変更しな
いこと及び既知の技術に報告されたことと異なって、上
記の性質がＰＴＳＩサブユニットの酵素活性とは無関係
であることを結論し得る． よって、本発明により得られたボルデテラ菌株及び静素
的者こ不活性なｌ’Ｔ変′Ａ殊｛減少された毒性を有す
るか、または毒性をもたない）は有効な百日咳ワクチン
の開発のための爛れた候補である．本発明に従って、抗
百日咳ワクチンとして適する免疫原性処方は上記の菌株
またはそれらにより生産された変異株を、患者に於いて
免疫原性物質のためのビヒクルとして一般に使用される
担体の中から選ばれた製薬的に許容し得る担体に添加す
ることにより調製し得る．このような担体の例は食塩水
である．抗原生産物は溶液または懸濁液の形で担体中に
存在してもよい．また，上記の処方は免疫応答を’ｊｉ
ｌ＋激し、それ故、ワクチン有効性を改良するために、
補助薬（アジュヴアント）を含んでもよい．本発明の目
的のため、好適な補助薬は剰えば、リン酸アルミニウム
、水酸化アルミニウム、１〜インターロイキンらしくは
２−インターロイキンまたはそれらのべプチドフラグメ
ントを含む． 抗百日咳ワクチンとして好適な免疫原性処方は一般に、
百日咳に対して有効な免疫を与えるために選ばれた最終
濃度の麟株及びそれらにより生産された突然変異体を含
む．処方後に、ワクチンは無菌容器中に導入され、種々
の瀾度、例えば４℃、２０℃，もしくは３７℃で保たれ
てもよく，または凍結乾燥されてちよい。百日咳に対し
て有効な免疫を誘起するため、都合よく処方されたワク
チンを１以上の投薬量で投与してもよい。 本発明のワクチンは通常の方法により投与し得る．その
処置は一つの投薬量またはそれより多い投薬量を継続的
に投与することからなってもよい．本発明のワクチンは
例えば．ｌｉｌ｛ｕｆｆｌ｝キソイドもしくはジフテリ
アトキソイドまたはその他のボルデテラ抗原の如き、一
種以上の抗原成分を含んでもよい． 最後の処方が抗百日咳ワクチン中に含まれることを確か
めるために、０． ０３５％〜０．４２０％の重量／容
鑓で表わされる量（即ち，σ．３ロひ〜Ｏ』２５のＰＴ
変異株／ホルムアルデヒド重量比に相当する）のホルム
アルデヒドで安定化し得る．このような濃度で使用され
るホルムアルデヒドは変異株安定化を可能にすることの
他に，免疫学的性質を変えないで、使用される濃度に応
じて、分製促道性及び血Ｉ１ｌ′ａ集活性の減少及び／
また１１消失を誘起する． ジフテリア毒素の（：ＲＭ１９７に関する文献に記載さ
れたこと（その分子のホルムアルデヒド処理が保謹免疫
を得るのに必要であった）と異なって、本発明者らはホ
ルムアルデヒドで安定化されたＰＴ変異株及びホルムア
ルデヒドで安定化されなかった１１Ｔへ変異株の両方が
同じ免疫学的活１・１（抗体中和の誘起及び病原性百日
咳囚による大脳感染に対ずる保護）を示すことを蒙くべ
きことに見い出した． 両方の処方（安定化変異株を含み、または含まない）は
２０℃または４℃で保たれる場合、同じ安定性を示すが
，一方、３７℃では，ホルムアルデヒドで処理された変
異株に関して、一層高い安定性が観察される． 本発明の抗百日咳ワクチンは活性成分として，化学試薬
により解毒されたＰＴを含む既知の技術のワクチンに対
してかなりの１り点を示−ケ．本発明の遺伝子操作によ
り得られたＰＴ変異株は実際に、不ＯＴ逆性の毒性変更
及び未変化の免疫悼性を示す．本発明のＦＴ変異株の安
定性は人体に予想される投薬量の１０００倍である１５
００＋Ｌｇ／体重１ｋｇによる生体内試験が局所もしく
は全身の毒性反応をもたらさないという証拠により更に
確かめられる．要するに、本発明により突然変異された
ボルデテラ菌株及び好ましくは、それらにより生産され
る突然変異ＰＴ毒素は高い免疫原性及び毒性を有しない
ために、所望の特性を有する合成の細胞及び無細胞の抗
百日咳ワクチンの開発に特に適する抗原である． 本発明に従ッテ、百日咳菌（Ｗ２８１ ＰＴＬ９／２８
Ｇ （ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇｌ 、パラ百日咳菌ＰＴ２
８Ｇ（ＰＴ−１２９Ｇ＋及びパラ６日咳菌ＰＴＩ２６／
２８６ ｆＰＴ−２６１／１２９ＧｌがＡＴＣＣ ５３
δ９４，ＡＴＣＣ ５３＆９２及ヒＡＴＣＣ ５３８９
３トＬ，Ｔ、１９８９年４１５日に、ザ・アメリカン・
タイプ・カルチャー・センター１ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒｌに寄
託された． 以下の実施例は例示であり、本′ｙｅ明のμＨ定ではな
い． 実施例ｌ 百日咳菌株ＢＰ １６５． ＯＰ Ｔｏｈａ＋ｓａ及び
ＢＰＷ ２８ｉｓ（：ＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ．ｌ ．パ
ラ百日咳菌の株ＯＰ １４（ＳＣＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ
．）及び気管支敗血症菌ＢＰ ？＋＋６５Ｉｓ（：ＬＡ
ＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ．ｌ をストレプトマイシン（ｓｔｒ
）及びナリジクス酸 （ｎａｉｌに耐性にする．実際に
、夫々の菌株の約＋ＱＩＯ個の細菌を８００ｕｇ／ｍｌ
２のｓｔｒまたは２００ｕ ｇ ／ｍＰのｎａｌを含み
．１５％のフィブリンが除去した無菌血液を補充したボ
ルデットーゲンゴウ（ＢＧ）寒天（ジフコ（ａｒｒｃｏ
）］ 上ニｔａ布シ、３７℃で約１０（ｉｆ！’ＩＩＪ
ｔｔｆｆＪ１する． 上記のプレート上で増殖した自然変異株を単離し、それ
らの染色体中に含まれる百日咳ｆ８素を鴎号化するｉ！
ｌ伝子を第１図に示さＩ１た方式に従って操作して、カ
ナマ・イシン構造遺伝子で置換する． この目的のためにプラスミドｐＲＴＰ１ （スチビッッ
（ Ｓｔｉｂｉｚ）ら著． Ｇｅｎｅ． ５０巻、１３
３ 〜１４０頁，１９８６年）を使用した．これはボル
デテラ中で複製しないが，接合によりそれの中に導入し
得る．実際に、プラスミドｐＲＴＲｌ（１ ０μｇ》を
，供給業者により示唆された方法に従っ゛Ｃ、５０ユニ
ットの制限酵素ＥｃｏＲＩ （ＢＲＬ）で切断する．つ
いでプラスミドＯＮ＾を１ユニットＴ４ ＤＮＡリガー
ゼの存在下でリガーゼの混合物［６６ｍＭのトリス（Ｔ
ｒｉｓｌ −１１ＣＩ２ｐＨ７．６， ｌ ｍＷのＡ
ＴＰ、ｌＯｍＭの ｌＪｇｃ４２ ｚ． １ ５ ｍＭ
のジチ、オスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌｌ］ １ ０μ、β中で，カナマイシン （Ｋａｎ
ｌ ［ファーマシアｌＰｈａｒｍａｃｉａ） ，ウプサ
ラ （Ｕｐｐｓａｌａｌ ］に対する抵抗性を暗号化す
る構造遺伝子を含み，側面に位置する領域！〜４２０及
び３６２６〜４６９２に相当するヌクレ才チド配列の中
に構造百日咳毒素遺伝子を含むＤＮＡ Ｅｅｏ旧フラグ
メント０．２μｇとｌ４℃で一夜にわたって接合する．
上記のフラグメントはまずプラスミド［ｌＮＡ ＰＴＩ
ＯＩ ＡＴＣＣ６７ａ５４を制限酵素ＩｓｔＥｆｌ ｛
これは位置４２１及び３６２５という制限部位のみで切
断する｝で切断し、配列４２１〜３６２５をＪＪｊ除し
，ついでクレノー酵素により、末端部位の切断力を失わ
せたＢｓｔＥＩ Ｉをつくることにより得られる．最後
に、Ｋａｎ遺伝子を含むフラグメントＨｉｎｃＩＩをＴ
４ＤＮＡリガーゼの存在下のりガーゼ混合物中で，上記
の文献に記載された線状化プラスミドＤＮＡと接合する
．１４℃で約１８時間後に，リガーゼ混合物を使用して
受容大腸菌細胞を形質転換し，該形質転換体を５０μｇ
／＋４のアンピシリン及び５０μｇ ／ｍβのカナマ
イシンを添加したＬＢ寒天培地上で３５℃で一夜にわた
って選別する．最後に，陽性クローンのｌから，期待さ
れる特性を有するプラスミドを単離し，続いて、Ｅｃｏ
Ｆ｝Ｉ制限酵素で切断する．カナマイシン遺伝子を含む
ＤＮＡフラグメントな、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）らｉ （１９１１３年）“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ （酵素学に於ける方法）”に記載さ
れるようにアガ日二スゲル上で単ｍする．ついで，上記
のＥｃｏＲＩフラグメントを、Ｅｃｏ旧で先に切断され
た−ＴＰ！プラスミドと接合し，ｍられるリガーゼ混合
物を使用して，″鱈ｅｌＪｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｓ＋ｏ
１ｏｇｙ″１０１巻．２０〜７８頁． １９８３年に於
いてメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇｌにより記載されるよう
にして、サイモンｌｓｉｍｏｎ） Ｒ．ら著［ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏ１、１巻，７８４〜７９１頁（ １９８３
年）］により記載された大腸菌ＳＭＩＯ細胞を受容性に
形質転換する．形質転換体を５０μＢ／ｌＩ（２のアン
ビシリン及び５０μｇ／ｍｌ２のカナマイシンを含むＬ
Ｄ寒天プレート（ジフコ、Ｌａｂ．ｊ上で３７℃で２４
時間選別する． 陽性クローンの一つから、期待される特性を有する，
ｐＲＴＰｌ−ΔＰＴ− ＫＡＮと称されるプラスミドを
抽出する．続いて、上記のプラスミドで形質転換されＬ
ｆｉ寒天上で３７℃で約１８時間培養された大鑵菌ＳＭ
Ｉロ細胞をボルデットーゲンゴウ培地で４８時間にわた
り，予め培養されたボルデテラのｓＬｒまたはｎａｌに
耐性の菌株と接合する．その接合は１０ｓ＋帥のれＣ忍
ｉを添加した開培地で３７℃で３〜６時間行なわれる．
ついで、得られるコロニーを回収し、３０μｇ ／＋ａ
εのナリジクス酸及び５０ｕｇ／ｍｊ？のカナマイシン
を含む開培地に塗布する．このような抗生物質に耐性の
菌株を選別する目的で、それらのプレートを３７℃に保
つ．３日後（気管支敗血症菌の場合）及び５〜６日後（
百日咳閏及びパラ百日咳菌の場合）に，ｎａｌ及びＫＡ
Ｎに耐性の多数の単一の溶血性コロニーが観察され、こ
れらはそれらの染色体中に、百日咳毒素遺伝子の側面領
域の１つとの相同組換えにより組込まれたｐＲＴＰ１〜
ΔＰＴ−ＫＡＮを含む．また、同様に第二領域の組換え
を容易にし、それ故にカナマイシンの遺伝子によるＰＴ
染色体遺伝子の置換を容易にするために，コロニーを４
００μｇ／ｏｌのストレプトマイシンを含むＢＧ培地上
に再度塗布する．上記の文献に記載されたように操作し
て、染色体ボルデテラ抵抗性に優性形質として有し、ス
トレプトマイシンに対する感受性を与えるｐＲＴＰ＋プ
ラスミドを失なった菌株を選択する． こうして、二つの型のフ０二一、即ち次のちのが得られ
る． ｌ） 完全にプラスミドを欠き，及び組換えち行なわれ
ておらず．ｓｔ．ｒ及びｎａｌに耐性で、かつＫａｎに
感受性のコロニー及び ２）二重組換え（Δｔｏｘｌにより、カナマイシン遺伝
子のＰＴ遺伝子への置換が行なわれた． ｓｔｒ．ｎａ
ｌ及びＫａｎに耐性のコロニ このような染色体の置換を確かめる目的で、閑株Δｔｏ
ｘ １１２，Δｔｏｘ Ｔｏｈａａ＋ａ．Δｔｏｘ １
６５．ΔｔｏｘＰ１４及びΔｔｏｘ ７８６５の特性を
サザンプロット，ＥＬＩＳＡ分析及びＣＩＩＯ細胞に関
する毒性により、既知の技術に従って検定する．実際に
、マームル（Ｍａｒｎ＋ｕｒ１、 Ｊ．の方法［Ｊ．Ｍ
ａ１、［ｌｉｏ１． ３巻、２０８〜２１６頁（１９６
１年）ｊにより上記のボルデテラ菌株から単離された染
色体ＤＮＡを好適な制限酵素で切断し，ｔ気泳動にかけ
、ニトロセルロース膜上に移し，ついでブローブとして
４６９６を用い、ＩＩＲＬニックー翻訳キットを用いて
ＰＴＪｆｌ伝子を含むｂｐＥｃｏＲＩフラグメントと放
射性同位元素でラベル付けしたＦＩＡＮ ｉｉｉｉ伝子
を含むｌ）ｒｆＡフラグメントとを交配（ｈｙｂｒｉｄ
）する． その交配反応１ｊＥ．サザンの方法（Ｊ．−１．Ｉ）（
ａ）．．９８巻、５１）３〜５１７頁（１９７５年）に
従って操作して行なわれる． その結果は両ブローブと交配するＰＴ遺伝子の分量より
も低い分子量をもつＤＮＡフラグメントのボルデテラΔ
ｔｏｘ菌株染色体ＤＮＡ中の存在を示す． ボルデテラ△ｔａｘ閑株をＳＳ変性培地中で３７℃で７
２時間培謄する．その培地の組成（ｇ／βで示す）は以
下のとおりである． Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ＩＯ．７．Ｌ−ブロリン
ロ．２４ ； Ｎａ（：ｇ ２．５：κＨｄ’０
４０．５ ； ＫＣＡＯ．２ ； Ｍｇ（；９１６！
ｂ０ ０．１： （：ａＣｆｆｚ Ｏ．Ｑ２： ｔ・
リス６．１；Ｌ−システィン０．０４” ； ＦｅＳＯ
−４１［ｘ００．００１” ：ナイアシン０．００４’
；グルタチ才ン０．１０” ：アスコルビン酸０
．０２９：レスミン酸（ｒｅｓｕｍｉｎ ａｃｉｄｓ）
１０．０ ； ２．６−０−ジメチルーβ−シクロデ
キストリン１．０，ｐＨ ７．６，この培地を２０分間
滅菌し、一方、＊が符された成分を濾過により別々に滅
菌する。規【１１１的な間隔で、培地試柑を採取し、１
２１１０（ｌｒ． ｐ． ｍ． ｔ．． ｐ． ｅ．で
４℃で４分間遠心分離する．続いて，無瑠胞１澄液の分
取液を百日咳毒素が存在するか否か，及びその毒性を確
かめるために、ＥＬｉＳＡ試験及び（：ｌＩＯ細胞に関
する毒性により分析する．ウォング（ Ｗｏｎｇｌ ．
ｋ．Ｉ１．及びスケルトン（Ｓｋｅｌｔｏｎｌ ．Ｓ．
Ｋ．著［Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏ１、．２６巻． １３１６〜１３２０頁（１９８８年
）］に記載されたようにして行なわれたＥＬＩＳＡ分折
はΔｔｏｘ ｍ株のいずれもが検出可能な量のＰＴを生
産し得ないことを示す． 更に． １／１０に希釈された上澄液はＣＨＯ細胞〔ヒ
ュウレット（Ｈｅｗｌｅｔｔ→， ｆＥ．Ｌ．ら著、Ｉ
ｎｆｅｃｌＩｍｍｕｎ ， ４（ｌ巻、１１９８ 〜１
２３ロ頁ｆ１９８３年）］を変性しない．未希釈上澄液
を用いれば、非特異的なａ性が観察される． 上記の菌株がＰＴを生産しないにせよ、病原性百日咳菌
に対する保護を依然として与え得るか否かを確かめる目
的で，ＣＯ叶１）Ｆ Ｆ［叶＾１．肝ＧυＬＡＴＩ（｝
Ｎ、ｐｏｔｅｎｃｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ （百日咳ワクチンの効能試験
） ． ２１／ｐａｒ ７１ｔ２１に記載された技術に
従って，大脳内抗原投与試験が行なわれる．実際に、Δ
ｔｏｘ １２８菌株及びＴｏｈａｍａ菌株並びに抗百日
咳ワクヂンの調製に一般に使用される同じ野生型菌株を
５９０ｎｍで測定した光学密度０．７まで， ３００ｍ
ｇの変性ＳＳ培地中で３７℃で培養する．ついで、培養
菌をｌ００００ｔ．ｐ−ｍ．でｌＯ分間遠心分離し［Ｊ
ＩＯローターを備えたべツクマン（Ｂｅｃｋ＋ｍａｎｌ
Ｊ２１遠心分離器１、ついで上澄液から分離された細胞
をＳＯ＋ｎｊｌｔの食塩水中に再度懸濁し，５６℃に３
０分間保つ．続いて、得られる懸濁液をＧＯ［ｌＥ Ｏ
Ｆ ＦＥＤＥＲＡＬ ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮＧ．：記載
されたようにして適当に希釈して、異なる投薬量用の通
常のワクチンとして使用する．その結果を、下記の表Ｉ
に示す． 表１ ｍＪ２／？ウＸ” Ｔｏｈａａ＋ａ Ｔ
ｏｈａｍａ△Ｌｏｘ １１２１１ Ｗ
２Ｊｌ △ｔａｘ０．０４ １５ハ６ ０．００８ １：ｌ／１６ Ｇ．（ｌａｌｌ＋ ９／ｌ＠ ６．ｆｌｆｌｆ｝３２ ２／ＩＩ １４／１６ １＠／１６ Ｉｔ／１６ １６／１６ ６／１６ １１７ＱＩ ２ハＩ ４／３６ １＠／ｌ６ １３７１Ｇ ８／ｌ６ ２ノ１ａ 表から観察し得るように，Δｔｏｘ菌株に関してわずか
な・保護の減少が観察されるが、それらは依然として極
めて良好な保護を与え，それ故、抗百日咳ワクチンとし
て特に適するようである．＊は細胞悲濁液の容量を示す
． 実施例２ 実施例ｌに示されたようにして得られた八Ｌｏｘ菌株の
染色体中に突然変異形態の百日咳毒素遺伝子を導入する
目的で、部位ＢａｍＨＩ中に、ゲンタマイシン（フ７−
マシア、ウプサラ）に対する抵抗性を暗号化する遺伝子
及びテトラサイクリン（ファーマシア，ウプサラ）に対
する抵抗性を暗号化する遺伝子を導入して． ｐＲＴＰ
１プラスミドを変性する．上記の遺伝子のクローン化は
マニアチスらにより記ａされたｍ換λ開Ａｏ）ｆｌ！ｉ
短の技術を用いて行なわれる．ついで，ボルデテラ染色
体中に百日＠嚢素の突然麦ｗＡ株を導入するために，夫
々ｐｎ■Ｐｃｉ及びｐＲ’ｒｌＴｌと称されるこれらの
新規ベクターを使用する．特に、上記の遺伝子は異なる
アミノ酸を暗号化するその他の遺伝子による，ヌクレ才
チド配列のＰＴＩＯＩ ＡＴＣＣ ６７８５４プラスミ
ド中に含まれるＰＴを暗号化する遺伝子に於ける，欠失
または置換により、部位特異的な突然変異誘発技術によ
り得られる．更に詳細には，下記の表■【の第一欄に示
される突然変異をＳｌヌクレ才チド配列中に含むＰＴ遺
伝子が構成される． ｐＲＴＰＧｌプラスミド及びｐｎＴｐＴｔプラスミド中
に上記の突然変異を含むＥｅｏＲｌフラグメントをクロ
ーン化した後に、ｓｕｔｏ大腸菌細胞を形質転換するた
めに，これらを使用し、こうして得られた形質転換体を
八ｔａｘボルデテラ菌株と接合する．ついで、染色体中
にこのようなプラスミドの組込みを示すコロニーを，夫
々、３０μｓ ／ｍβのｎａｌ及び２０μｇ／ｍβのゲ
ンタマイシンまたは３０μｇ７ｍｇのｆ１ａｌ及びｌ”
Ｊ．ｓμ８八４のテトラサイクリンを含むＨＧ培地プレ
ートで選別する．こうして選別されたコロニーは全て，
それらｆｌｆ＊の染色体中に組込まれたプラスミドを示
す．紡いて、プラスミドを失ったコロニーを選別する目
的で，報告されているようにして得られたコロニーを４
００ｕｇ／鵡βのストレプトマイシンを含むＢＧ培地に
塗布する．ついで、上記の培地上に増殖し得るコロニを
，夫々次のものを含有するＢＧプレート上で同時に培養
する． ａｔ ｎａｌ ３ ０ ｕｇ ／ｔａｌ２ ， ｓｔ
ｒ ４００ ｕｇ ／ｍ（２及び５０μｇ／ｙａｌ２の
カナマイシン ｂｌ ｎａｌ ３０ｕｇ ／１１４２． ｓｔｒ ４
００ ｕｇ／＋＋Ｉ１２ａ》中に得られたコロニーはプ
ラスミドを失ったユロニーであり、それ故、カナマイシ
ンに耐性である元のΔｔｏｘコロニーと同じである．一
方、培地ｂ）で増殖されたコロニーはカナマイシンに対
する抵抗性を失ったものであり、その遺伝子は突然変異
を生じた遺伝子により，Ｍ換された． ｂ）で１９られたコロニーがＰＴ変異株を生産，分泌す
る能力の例として，百日咳菌１２８／ＰＴ−１２９Ｇ、
パラ百日咳閑Ｐ１４／ＰＴ−１２９Ｇ及び気管支敗血症
菌７Ｊｌ＠Ｓ／ＰＴ−１２９Ｇの菌株をまずＢ６プレー
ト上に塗？し、ついで１５ｆｆｌＩ２の変性ＳＳ培地中
で３７℃で７２時間培養する． ＥＬＩＳＡ分析による
監視により評価されたＰＴ変異株生産のデータが第２図
に示され、以下のことを示す． ■試験した全てのボルデテラ菌株がＰＴ変異株を生産し
、パラ百日咳菌がその他のボルデテラ閑の２倍の債のＰ
Ｔ変異株を生産する． 表Ｉ【の第一欄に示された突然変異の主因となるＰ丁遺
伝子を含有する百日咳菌Ｗ２８株及びＩｌＦ’ １６５
株並びにバラ百日咳菌Ｐｌ４ 味を上記の文献に示され
たように培養することにより得られた｛】゛ｒ変異株の
生産に関するデータが同表の第三欄に示され、以下のこ
とを示す． 一試験した全ての菌株はＰＴ変異株の形質を発現し５’
｝泌し得る． ■上記のＰＴ変異株の拠つかが野生型Ｐ’ｒ（＋＋＋＋
ｌに関して得られた社に匹敵する量で生産され、且つ■
バラ百日咳菌Ｐ目は百日咳菌の２倍の量のＦＴ変異株を
生産する． 上記の菌株の幾つか（Ｄで示される）は百日咳毒素のオ
リゴマーＢ（サブユニットＳ２，Ｓ３．Ｓ４及びＳ５に
より構成される）のみを分泌する． 更に、大脳内抗原投与試験後に得られた結果は上記のボ
ルデテラ菌株が抗百日咳細胞ワクチンの開発に適するこ
とを示す． 実施例３ ＰＴ・・田・のＩ産び ゜ ハラ百日咳菌Ｐ１４／ＰＴ−１２９Ｇ株、百日咳ＩＭ１
２８９ｋ７１２９Ｇ株，百日咳菌Ｗ２８ １３Ｌ／１２
９Ｇ株及び百日咳菌１２８ ２６１／１２９Ｇ株ヲ２０
４２のＳＳ変性培地（ｐＨ ７．４１を含む３０Ｉ２の
容量のケマップ（Ｃｈｅｍａｐ）発酵容器中で， ０．
１Ｖ／Ｖ／ｆｆｉの空気流量で培養する．毎分の回転数
を最小の２００から最大の７００まで変えて，溶解酸素
量を２０％に保つ．温度を３５℃に調節し、ｐｌ（を１
、 ５Ｎのグルタミン酸、１．５Ｎの塩酸． ０．１５
Ｎのブロリンを含む溶液を使用することにより中性の値
に保つ．約３６〜４８時間後、即ち培養菌が５９０開で
測定した光学密度１４〜１８に達した時に、細胞を発酵
培地の遠心分ｉ１ｉ！ ［ベツクマンｌＢｅｅｋ＋ｍａ
ｎｌ ＪＣＦ−７遠心分離器、６０ｈｆｆ ／分の流量
で，１９００Ｇｐｍ− ４℃、３分間１により除去し、
突然変異ク・ンバク質を無細胞上澄液から精製し％無菌
条件
【デュラボア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ、商！）カートリ
ッジ（ミリボア （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｌ） ｏｄｏ．
２ ２ｌｌ１μによるＪ中アフィーゲル・ブルー（＾
ｆｆｉ−ＧｅｌＢｌｕｅｌによる吸着及びセクラ （Ｓ
ｅｋｕｒａｌ Ｒ．Ｄ、ら著Ｊ．［ｌｉｏ１、Ｃｂｅｍ
．．２５８＠， １４６４７ 〜１４５６１頁（ １９
８３年）により記載されたセファローズーフェツイン（
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｆｅｔｕｉｎ．商標）による逐
次アフィニテ４ （ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ａｆｆｊｎ
ｉｔｙｌ クロマトグラフイーにより濾過する． Ｂ）ＰＴ” の 理化“的 の 上記の文献に示されたようにして精製された幾つかのＰ
Ｔ変異株の物理化学的性質をリームリ（Ｌｅａａ＋ｍｌ
ｉｌ Ｎ．Ｋ．著Ｎａｔｕｒｅ， ２２７巻． ６８０
〜６８５頁（１９７ロ年）により記載されたように操
作して、コマシー（Ｃｏｏｎ＋ａｓｓｉｅｌ ブルーで
着色されたポリアクリルアミド・ナトリウムドデシルサ
ルフエートＩＳＤＳＩでゲル電気泳動により測定する．
第３図に示された結果は混在タンパク質の不在及び野生
型ＰＴのパターンと同じパターンを示す．その他の混在
物質，特に変異株の調製のための発酵方法に使用された
物質が存在しているか否かを確かめるための別の対照実
験によれば以一トのことが確かめられた． ？ビーレイ（ロｅｅｌｅｙｌ ．Ｊ．Ｇ．著， “ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒｂｉｏｌｏｇｙ （生化学及び分子生物学に於ける
実験技術）”バードン（Ｂｕｒｄｏｎ） ． Ｒ． Ｈ
．及びパン ニッペンベルグ（Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎ
ｎｂｅｒｇ） ， Ｐ．Ｉ１、 （編集），Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ １６巻（ １９８５年）に記載された方法に従
って測定された．ジメチル（２．６−０１ β−シク
ロデキストリンの不在： 一一→９ＫＯタンパク質に対して特異的な抗体を利用す
るウェスタンブロッティング分析（１・ウビンｆＴｏｗ
ｂｉｎｌ ． １１． Ｔ． ら著， Ｐ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．．ＩＪＳＡ， ７３巻、３６１〜３６５頁、１９７
６年）により測定された、６９ＫＤタンパク質のフェチ
ュイン及び糸状血球凝集素（これらは無細胞抗百日咳ワ
クヂンの潜在的な混在物質である）の不在； ■クメ （Ｋｕｍｅ）， Ｌ丁．ら著、 Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉａｍｕ．５２巻．：１７０〜３７７頁、ト９８Ｇ
年に記載されたようにして、モルモットに対して行なわ
れた試験により測定された，熱壊死生毒素の不在： −Ｅ一層クロマトグラフィ一番こよりｍｊ４Ａ？された
，シク口デキストリン（これは培地の主成分である）の
不在． ＰＴ変異株゜（収率８ｏ％）は純度９９％を示
す． 実施例４ Ａ）Ｃｌ｛Ｏ細胞に関する毒生 この試験は、ＯＭＥＮ培地［ Ｆｌｏｗ ｊａｂ．．マ
クレーン （Ｍｃｌｅａｎｌ ．Ｖａ］中１７１０に希
釈された，表Ｉ＋の第一欄に示された突然変先を含む幾
つかのボルデテラ菌株の培養の机上澄液及び精製上澄液
を使用して行なわれる． 先の表ＩＩに示された結果は町生型ＰＴに関して百日咳
毒素変異株の毒性の減少を示す．最良の結果が変異株Ｐ
Ｔ−２６１／１２９Ｇ．ＰＴ−９Ｎ／１２９Ｇ及びｆ’
Ｔ−１３１／１２９Ｇに関して得られ，これらについて
毒性の不てＥが観察される．更に，解毒されなかったＰ
丁−１２９Ｇ変異株は訃生型百日咳毒素に関して、１．
５〜１０％の残留毒素を示し、一方，ムノッ（ｕｕｎｕ
ｚｌ ．Ｊ．Ｊ．ら著ｒｎｆｅｃＬ Ｉ＊ａｕｎ．．３
２巻． ２４３ 〜２５（ｌ頁（１９８１年）により記
載されたようにグルタルアルデヒドで解毒された同じ変
′ｇ４株はＣ！１０細胞に関して認められる程の毒性を
示さない． Ｂ）ＲＩＡ試 （こよる の この試験により、ポリクローメル抗体（抗ＰＴヤギγ−
グロプリン． ＳＣＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ．ｌ及ヒモノ
クローナル抗ＳＬ抗体［Ｈ．サトウ（Ｓａｔｏ）ら著，
Ｉｎｆｅｃｔ． Ｌ＋＋ｍｕ．．４６＠、４２２ 〜４
２８頁（１９８４年）に記載された１１１７ ］に関す
る幾つかのＰＴ変異株の親和性定数が測定される． ９６個のウエルのボリスチレンの平底マイクロプレート
［ダイナテク・ラボラトリイズ・インコーボレーテッド
ｆＤｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｅ．１、アレキサンドリア（Ａｌｅｘａｎｄｒｊａ）．
Ｖａ ］の夫々のウエル中に、ｌ Ｏ ｓｔｇ ／ｒａ
ｉｌの抗体を含む２００μ４のグリシン緩衝液５ ｍＭ
．ｐＨ９．２を導入する．４℃で一夜後、プレートを食
塩水・リン酸塩緩衝液（ＰＢＳｌｐｌ１ １１．０中の
２−５ ％（重ｉｔ／容ｆ！）のウシ７ルブミ〉血清（
ＢＳＡ）で飽和し、０． １２５ｍ氾／βのトウイーン
（Ｔｗｅｅｎ） 一２ ０を含むｔｏｏｕ ｇのＰｌｕ
ｓで洗浄する．ついで，プレートを異なる濃度（ｏ．ｏ
ｉ−ｒ）．０２５−０．０５−０．１〜０．２５４ｊ．
５−１．０ａｇ ／ｔｔｉ ） ノＰＴ及びＰＴ変異株
の存在下で、１２５Ｉ （ヨードｌ２５）でラベル付け
された百日咳毒素の夫々のウェル中で１ ０ ’ｃｐｍ
（カウント／分）で、保温する．室温（２０〜２５℃
）で３時間後，プレートをｐｐｓで徹底的に洗浄し、含
まれる放射能をγ一カウンター（パッカート’ （Ｐａ
ｃｋａｒｄ） ｒｎｓｔ． ＵＳＡＩでｍｒｒ定する，
各試料を２回分析する．百日咳毒素を供給業者の指示に
従って操作して，通常のクロラミン′ｒ法（ＢＤＨ Ｃ
Ｉｌ（１１１１．．英国）により放射性ヨウ素でラベル
付けする． 下記の表ＩＴＩに示された結果は全てのＰＴ変異株がモ
ノクローナルＩＢ７抗体の認識されたエビトーブを維持
し，それらが百日咳抗毒素ヤギγ−グロプリンから高い
親和性を有する６のとして認識され，それ故ＰＴ毒素を
中和し得ることを示す．実施例５ ＰＴ−ｙ の一体 ・ ｉ″ 幾つかのＰＴ変異株の生物学的性質及び抗百日咳ワクチ
ンに於けるそれらの使用の可能性を下記の方法により試
験した． ａ）友皺Δ五途且１ この試験は通常の細胞ワクチン（対照）並びに． ＰＴ
−１２９ｒ．変異株そのちの及びグルタルアルデヒドで
解毒されたＰＴ− １２９Ｇ変異株（ＰＴ−１２９Ｇ
Ｄｅｔｌ及びＩ’Ｔ−２●１ハ２ｇＧを用いて行なわれ
る，紬！Ｉが表■に示される． 表ＩＶ ＰＴ−１２９Ｇを用いて得られた低い生存率（ネ）はＰ
Ｔ毒素の毒性の約１〜２％である変異株残留毒性による
． ｂ） 血 ＬＥＵＣＯＣＹＴＯＳＩＳ体重約
２０１の年令７〜８Ｂの４匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウス
の群をＯ日目に、０．２＋ｓｊ２の生理（食塩水）無菌
アビローゲン（ａｐｙｒａｇｅｎｌ溶滴そのもの（対照
）または（０． ００４−０． （１２−０． ０４−
０． １〜 ０． ５ 及び１．０１ｚｇ／マウス）
のＰＴ； （０．１〜０．５−２．５−μｇ／マウス）
のＰＴ−１３Ｌ： （０．１〜０．５−２．５−１２．
５−２５．０及びｓｏ．ｏｕｇ／マウス）のＰＴ−９Ｋ
， ＰＴ−１２９Ｇ、解毒されたＰＴ−１２９Ｇ， Ｐ
Ｔ−２６Ｉ／１２９Ｇ．ＰＴ−１３１／１２９Ｇ及びＰ
Ｔ−９κ／１２９Ｇを含む０．２ｍｌ２の生理（食塩水
）無菌アビローゲン溶液で、静脈内注射により処置する
．３日後に，マウスから探血し、合計の単核細胞数（Ｐ
ＢＭＣＩ ／ｍ Ｉ２一末梢血をチュルク液（０．０１
％ゲンチアアナバイオレット及び３％酢酸）中で個個に
数える．ついで，赤血球の溶液ライサント（ｌｉｓａｎ
ｔ）で予め処理された、夫々のマウスの末梢血の一部を
ＦＡＣＳ （螢光励起細胞分離捕集装圓）で使用して、
対照に対して、各種の毒素で処置されたマウス中のリン
パ球の増加率及び多形核細胞の増加率を測定する． 第４図に示された結果は一般にＰＴに対してＩ’Ｔ変胃
株毒性の減少を示し、これは変異株ＰＴ−２６１／１２
９Ｇ． Ｐ丁−９Ｋ７１２９Ｇ及びＰＴ−１３Ｌ／’１
２９Ｇに関して０．０１％よりも低い値に達する． 同じ試験が０．５ｍＩ２の生理無菌溶液そのものまたは
上記と同じ濃度のＩ’ＴまたはＰ丁−９Ｋ／１２９Ｇ変
異株を含む０．５ｍｌの生理無菌溶液の０８目の腹腔内
注射により， Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群に対して行なわ
れる． 投与の３日後に、血液試料を動物の眼窩神経叢から採取
し，上記のように試験する．個々に試験された５匹の動
物からの白血球のカウントの平均＋／一標準偏差として
表わされた結果が夫々ＰＴ及びＩ）Ｔ−９Ｋ７１２９Ｇ
に関して、第４図及び表Ｖに示される． １．０００ ５５．１９ ＋／一 ６、６２ ５０．０１１０ ４．７ｌ ＋／− ０．３５ Ｎ．Ｄ．＝測定されず Ｃ）二羞２ｊ≦ヨ４父豆 体重約２０ｇの年令７〜８週の５匹の雌の［＋ａｌ ｂ
／（：マウスの群に，０日目に、０．５僧βの生理食塩
水無菌アビローゲン溶液そのもの（対照）または各種の
投薬量のＰＴ． ＰＴ−１２９Ｇそのもの，またはグル
タルアルデヒドで解ｉエされたＰＴ−１２９ＧｆＰＴ−
１２９Ｇ Ｄｅｔ．１、 ＰＴ−９Ｋ及びＩＩＴ−９Ｋ
７１２９Ｇを含む０． ５ｍεの生理食塩水無菌アビロ
ーゲン？８液で腹腔内接種する．投与６日後に，マウス
を４ ｍｇ／マウスのヒスタミン・二虐酸塩（シグマ・
ケミカル・カンバニイ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏｍｐａｎｙ＋．セントルイス、ＭＯ）を含む０
．５ｍｇの生理無菌アビローゲン溶液で腹腔内接種する
。ヒスタミン投与の２４時間後に，死亡を記録する．結
果を、下記の表■及び表ｖｎに示す． 表■ ０日目 投薬量／７ウス ０．５ｍｊ２ ／ｉ．ｐ． 食塩水 Ｐ丁 ０．０５０ＸＩＯ ／／ ０．５００ＸｌＯ ｕ ５．０００ｘｌＯ ｎ ５０．０００ｘ １０ １／ １００．ロ００ＸＩＯ ／／ ５００．０００Ｘ １０ ｔｔ １、 ０００． ０００ ｘ １０ＰＴ−１２９
Ｇ Ｏ．０００５μｇ 〃 ロ．ｏｏｓｏμｇ ／／ ０．０５０’Ｏｕｇ ／／ ０．５（１ｅ６ｕｌ １１ ５．００００μｇ １１ ５０．００００μｇ ＰＴ−１２９６ ｎｅｔ １１．ｏｏ０５ｕｇ ／／ ０．（｝０５１）μｇＩ／
Ｏ．０５００μｇ ＩＩ ｌ）．５０００μ８ ｔｔ ５．００００ｕｇ ６日目 投薬量／７ウス ０．５ｎｌ ／ｉ．ｐ． ヒスタミン （４ｍｇｌ 死亡／合計 ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ３／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ５／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ Ｄ／５ ０／５ 表■ ０８目 投薬量／７ウス ０． ５１１１β／ｉ． ｐ． ｏ．ｏｉｏ ｏ．ｏｓｏ Ｏ．１００ ０．５００ ｉ．ｏｏｏ ５．０００ ０．１００ ０．５００ ｉ．ｏｏｏ ５．０００ ５０．０００ ＰＴ ９Ｋ７１２９Ｇ Ｏ．１００ ０．５００ １．００ｅ ２．５００ ５．００α ７．５０１） １２．５００ ２５．０００ ５０．０００ ６日目 投薬量／７ウス ０．５ｍβ／ｉ．ｐ． ヒスタミン （４＋ｎｇ） 死亡／合計 ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ １／５ ４／５ ５／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ５／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ Ｄ／５ ０／５ ０／５ ０／５ ｄ）アナフ ラキシー アナフィラキシー感受性の強化をステインマン（Ｓｔｅ
ｉｎｍａｎ）Ｌらに記載された方法［ Ｐ． Ｎ． Ａ
． Ｓ． ＵＳＡ８２巻、８７３３〜８７３６頁（１９
８５年）］に従って測定する。 体重約２０ｇの年令７〜８週の５匹の雌のＢａｌ ｂ／
Ｃマウス（Ｈ−２’）の群を−１日目、＋１日目、＋６
日目に、０．２ｎｌの生理食塩水無菌アビローゲン溶液
そのもの（対照）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
（シグマ・ケミカル・カンバニイ、セントルイス、Ｍ
Ｏ）を含む０．２ｍｌの上記の溶液を腹腔内接種する。 ついで、同じ群の複数のマウスをＯ日目、＋２日目に、
０．４ｎ＋ｊ２のアビローゲン無菌食塩水そのもの、ま
たは４０， １００及び５００ｎｇ／マウスのＰＴ％１
００，５００及び２５００ｎｇ／マウスのＰＴ−１２９
Ｇそのものもしくはグルタルアルデヒドで解毒されたＰ
Ｔ−１２９Ｇ（ＰＴ−１２９Ｇ Ｄｅｔ）または５００
． ２５００及び７５０Ｄｎｇ／マウスのＰＴ−９１’
ｌ／１２９ＧＩ含む０．４ｖａＡの上記の食塩水で静脈
内接種する．最後のＢＳＡ投与の２時間後に死亡を記録
する．結果を表■に示す表 ■ ｅ） ＩＡＰ（膵島活性化タンパク質）ＰＴまたはＰ
Ｔ−９Ｋ／１２９Ｇによる膵島の活性化を、クレーフテ
ンベルグ（Ｋｒｅｅｆｔｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｇら（Ｊ
．Ｂｉｏ１．Ｓｔａｎｄ．， １２巻、１５１〜１５７
頁、１９８４年）にヨリ記載されたように測定する。 体重約２０ｇの年令５〜７週の５匹の雌のＢａｌｂ／Ｃ
マウスの群を０．２ｍｊ２のアビローゲン無菌食塩水そ
のもの（対照）または２５μｇ ／ｍ℃のＰＴ−９Ｋ／
１ ２９Ｇもしくは１μｇ／ＩＩＩ１２のＰＴを含む０
．２ ｍｆｌの上記の食塩水を腹腔内接種する。４日
後に、マウス血清中のインシュリンのｍ（ｍυ／βで表
わされる〉を測定する． 結果は予想されるように、ＰＴにより誘発されるインシ
ュリン分泌の著しい増加（１９． ６ｍＵ／−９ ）を
示し、一方、ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株により誘起さ
れる分泌物の値（５ｎ＋Ｕ／ｎ）は対照により得られた
Ｍ （８膳Ｕ／ｌに匹敵する． 実施例６ ＰＴ−９Ｋ １２９Ｇ のホルムアルデヒドａ
） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇの 、血
実施例３に記載されたようにして精製された変異株を０
． ０２５％のリジン（味の素、日本）及び０．Ｏｌ％
のメルチオレート［エランコ（ＥＬＡＮＣＯ）、米国】
を含むＰＢＳ，ｐＨ ７．４に対して４℃で２４時間透
析し、ついでＰＢＳ中に再度懸濁する。タンパク質含量
の測定［ロウリイ（Ｌ．ｏｖｔｒｙ）．０．Ｈ．ら著、
Ｊ．Ｂｉｏ ｊ２．ｃｈｅｍ．，１９３巻、２６５ 〜
２７５頁（１９５１年）を参照のこと］の後に、混合物
の分取物に各種の濃度［０．０３５ ％ 〜０．４２０
％ （Ｗ／Ｖ）） のホルＡ７ルデヒド（ ＰＢＳ
中の４％溶液、ｐＨ ７．４）を添加して、変異株対ホ
ルムアルデヒドの最終比（重量／重量） ０．３００〜
０． ０２５を得る．得られた混合物を０． ０２５Ｍ
のリジンの不在下及び存在下で３７℃で４８時間保温し
、ついでＰＢＳに対して繰返し透析する．ついで、混合
物を試験して、それらの′ｉｌＩ隨のホルムアルデヒド
含量を測定し、これが０．Ｏｌ％（重！／容量）よりも
低いことが判明する．更に、ＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析さ
れた混合物はＰ丁と同じ電気泳動パターン及び幾つかの
特別の帯域［そのうちの１つはサブユニットＳ２及びＳ
３と共に移行し、それよりも高い分子量をもつその他の
ものはサブユニットＳ１と共に移行する（第５図、レー
ン３を参照のこと）】の存在を示す． ついで、異なる濃度のホルムアルデヒドで処理されたＰ
Ｔ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株（ ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ
と称される）の分裂促進活性を正常の成人から単離され
たヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖応答として
測定し、ＰＴ並びに同じ変異株そのものの分裂促進活性
と比較する（第６図を参照のこと）。実際に、ＰＢＭＣ
＠胞を２ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸
、ＩＯＸＩＯ−’Ｍの２−メルカブトエタノール及び１
０％のヒトアルブミン血清で補充された０．２島記のＲ
ＰＭＩ １６４０［ジブコ・ラボラトリイズ（Ｇｉｂｃ
ｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），バイスレイ （Ｐａ
ｉｓｌｅｙ） ］中の１０’個／ウエルのａｙｉで、９
６個の平底ウエルマイクロプレート
ッジ（ミリボア （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｌ） ｏｄｏ．
２ ２ｌｌ１μによるＪ中アフィーゲル・ブルー（＾
ｆｆｉ−ＧｅｌＢｌｕｅｌによる吸着及びセクラ （Ｓ
ｅｋｕｒａｌ Ｒ．Ｄ、ら著Ｊ．［ｌｉｏ１、Ｃｂｅｍ
．．２５８＠， １４６４７ 〜１４５６１頁（ １９
８３年）により記載されたセファローズーフェツイン（
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｆｅｔｕｉｎ．商標）による逐
次アフィニテ４ （ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ａｆｆｊｎ
ｉｔｙｌ クロマトグラフイーにより濾過する． Ｂ）ＰＴ” の 理化“的 の 上記の文献に示されたようにして精製された幾つかのＰ
Ｔ変異株の物理化学的性質をリームリ（Ｌｅａａ＋ｍｌ
ｉｌ Ｎ．Ｋ．著Ｎａｔｕｒｅ， ２２７巻． ６８０
〜６８５頁（１９７ロ年）により記載されたように操
作して、コマシー（Ｃｏｏｎ＋ａｓｓｉｅｌ ブルーで
着色されたポリアクリルアミド・ナトリウムドデシルサ
ルフエートＩＳＤＳＩでゲル電気泳動により測定する．
第３図に示された結果は混在タンパク質の不在及び野生
型ＰＴのパターンと同じパターンを示す．その他の混在
物質，特に変異株の調製のための発酵方法に使用された
物質が存在しているか否かを確かめるための別の対照実
験によれば以一トのことが確かめられた． ？ビーレイ（ロｅｅｌｅｙｌ ．Ｊ．Ｇ．著， “ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒｂｉｏｌｏｇｙ （生化学及び分子生物学に於ける
実験技術）”バードン（Ｂｕｒｄｏｎ） ． Ｒ． Ｈ
．及びパン ニッペンベルグ（Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎ
ｎｂｅｒｇ） ， Ｐ．Ｉ１、 （編集），Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ １６巻（ １９８５年）に記載された方法に従
って測定された．ジメチル（２．６−０１ β−シク
ロデキストリンの不在： 一一→９ＫＯタンパク質に対して特異的な抗体を利用す
るウェスタンブロッティング分析（１・ウビンｆＴｏｗ
ｂｉｎｌ ． １１． Ｔ． ら著， Ｐ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．．ＩＪＳＡ， ７３巻、３６１〜３６５頁、１９７
６年）により測定された、６９ＫＤタンパク質のフェチ
ュイン及び糸状血球凝集素（これらは無細胞抗百日咳ワ
クヂンの潜在的な混在物質である）の不在； ■クメ （Ｋｕｍｅ）， Ｌ丁．ら著、 Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉａｍｕ．５２巻．：１７０〜３７７頁、ト９８Ｇ
年に記載されたようにして、モルモットに対して行なわ
れた試験により測定された，熱壊死生毒素の不在： −Ｅ一層クロマトグラフィ一番こよりｍｊ４Ａ？された
，シク口デキストリン（これは培地の主成分である）の
不在． ＰＴ変異株゜（収率８ｏ％）は純度９９％を示
す． 実施例４ Ａ）Ｃｌ｛Ｏ細胞に関する毒生 この試験は、ＯＭＥＮ培地［ Ｆｌｏｗ ｊａｂ．．マ
クレーン （Ｍｃｌｅａｎｌ ．Ｖａ］中１７１０に希
釈された，表Ｉ＋の第一欄に示された突然変先を含む幾
つかのボルデテラ菌株の培養の机上澄液及び精製上澄液
を使用して行なわれる． 先の表ＩＩに示された結果は町生型ＰＴに関して百日咳
毒素変異株の毒性の減少を示す．最良の結果が変異株Ｐ
Ｔ−２６１／１２９Ｇ．ＰＴ−９Ｎ／１２９Ｇ及びｆ’
Ｔ−１３１／１２９Ｇに関して得られ，これらについて
毒性の不てＥが観察される．更に，解毒されなかったＰ
丁−１２９Ｇ変異株は訃生型百日咳毒素に関して、１．
５〜１０％の残留毒素を示し、一方，ムノッ（ｕｕｎｕ
ｚｌ ．Ｊ．Ｊ．ら著ｒｎｆｅｃＬ Ｉ＊ａｕｎ．．３
２巻． ２４３ 〜２５（ｌ頁（１９８１年）により記
載されたようにグルタルアルデヒドで解毒された同じ変
′ｇ４株はＣ！１０細胞に関して認められる程の毒性を
示さない． Ｂ）ＲＩＡ試 （こよる の この試験により、ポリクローメル抗体（抗ＰＴヤギγ−
グロプリン． ＳＣＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ．ｌ及ヒモノ
クローナル抗ＳＬ抗体［Ｈ．サトウ（Ｓａｔｏ）ら著，
Ｉｎｆｅｃｔ． Ｌ＋＋ｍｕ．．４６＠、４２２ 〜４
２８頁（１９８４年）に記載された１１１７ ］に関す
る幾つかのＰＴ変異株の親和性定数が測定される． ９６個のウエルのボリスチレンの平底マイクロプレート
［ダイナテク・ラボラトリイズ・インコーボレーテッド
ｆＤｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｅ．１、アレキサンドリア（Ａｌｅｘａｎｄｒｊａ）．
Ｖａ ］の夫々のウエル中に、ｌ Ｏ ｓｔｇ ／ｒａ
ｉｌの抗体を含む２００μ４のグリシン緩衝液５ ｍＭ
．ｐＨ９．２を導入する．４℃で一夜後、プレートを食
塩水・リン酸塩緩衝液（ＰＢＳｌｐｌ１ １１．０中の
２−５ ％（重ｉｔ／容ｆ！）のウシ７ルブミ〉血清（
ＢＳＡ）で飽和し、０． １２５ｍ氾／βのトウイーン
（Ｔｗｅｅｎ） 一２ ０を含むｔｏｏｕ ｇのＰｌｕ
ｓで洗浄する．ついで，プレートを異なる濃度（ｏ．ｏ
ｉ−ｒ）．０２５−０．０５−０．１〜０．２５４ｊ．
５−１．０ａｇ ／ｔｔｉ ） ノＰＴ及びＰＴ変異株
の存在下で、１２５Ｉ （ヨードｌ２５）でラベル付け
された百日咳毒素の夫々のウェル中で１ ０ ’ｃｐｍ
（カウント／分）で、保温する．室温（２０〜２５℃
）で３時間後，プレートをｐｐｓで徹底的に洗浄し、含
まれる放射能をγ一カウンター（パッカート’ （Ｐａ
ｃｋａｒｄ） ｒｎｓｔ． ＵＳＡＩでｍｒｒ定する，
各試料を２回分析する．百日咳毒素を供給業者の指示に
従って操作して，通常のクロラミン′ｒ法（ＢＤＨ Ｃ
Ｉｌ（１１１１．．英国）により放射性ヨウ素でラベル
付けする． 下記の表ＩＴＩに示された結果は全てのＰＴ変異株がモ
ノクローナルＩＢ７抗体の認識されたエビトーブを維持
し，それらが百日咳抗毒素ヤギγ−グロプリンから高い
親和性を有する６のとして認識され，それ故ＰＴ毒素を
中和し得ることを示す．実施例５ ＰＴ−ｙ の一体 ・ ｉ″ 幾つかのＰＴ変異株の生物学的性質及び抗百日咳ワクチ
ンに於けるそれらの使用の可能性を下記の方法により試
験した． ａ）友皺Δ五途且１ この試験は通常の細胞ワクチン（対照）並びに． ＰＴ
−１２９ｒ．変異株そのちの及びグルタルアルデヒドで
解毒されたＰＴ− １２９Ｇ変異株（ＰＴ−１２９Ｇ
Ｄｅｔｌ及びＩ’Ｔ−２●１ハ２ｇＧを用いて行なわれ
る，紬！Ｉが表■に示される． 表ＩＶ ＰＴ−１２９Ｇを用いて得られた低い生存率（ネ）はＰ
Ｔ毒素の毒性の約１〜２％である変異株残留毒性による
． ｂ） 血 ＬＥＵＣＯＣＹＴＯＳＩＳ体重約
２０１の年令７〜８Ｂの４匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウス
の群をＯ日目に、０．２＋ｓｊ２の生理（食塩水）無菌
アビローゲン（ａｐｙｒａｇｅｎｌ溶滴そのもの（対照
）または（０． ００４−０． （１２−０． ０４−
０． １〜 ０． ５ 及び１．０１ｚｇ／マウス）
のＰＴ； （０．１〜０．５−２．５−μｇ／マウス）
のＰＴ−１３Ｌ： （０．１〜０．５−２．５−１２．
５−２５．０及びｓｏ．ｏｕｇ／マウス）のＰＴ−９Ｋ
， ＰＴ−１２９Ｇ、解毒されたＰＴ−１２９Ｇ， Ｐ
Ｔ−２６Ｉ／１２９Ｇ．ＰＴ−１３１／１２９Ｇ及びＰ
Ｔ−９κ／１２９Ｇを含む０．２ｍｌ２の生理（食塩水
）無菌アビローゲン溶液で、静脈内注射により処置する
．３日後に，マウスから探血し、合計の単核細胞数（Ｐ
ＢＭＣＩ ／ｍ Ｉ２一末梢血をチュルク液（０．０１
％ゲンチアアナバイオレット及び３％酢酸）中で個個に
数える．ついで，赤血球の溶液ライサント（ｌｉｓａｎ
ｔ）で予め処理された、夫々のマウスの末梢血の一部を
ＦＡＣＳ （螢光励起細胞分離捕集装圓）で使用して、
対照に対して、各種の毒素で処置されたマウス中のリン
パ球の増加率及び多形核細胞の増加率を測定する． 第４図に示された結果は一般にＰＴに対してＩ’Ｔ変胃
株毒性の減少を示し、これは変異株ＰＴ−２６１／１２
９Ｇ． Ｐ丁−９Ｋ７１２９Ｇ及びＰＴ−１３Ｌ／’１
２９Ｇに関して０．０１％よりも低い値に達する． 同じ試験が０．５ｍＩ２の生理無菌溶液そのものまたは
上記と同じ濃度のＩ’ＴまたはＰ丁−９Ｋ／１２９Ｇ変
異株を含む０．５ｍｌの生理無菌溶液の０８目の腹腔内
注射により， Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群に対して行なわ
れる． 投与の３日後に、血液試料を動物の眼窩神経叢から採取
し，上記のように試験する．個々に試験された５匹の動
物からの白血球のカウントの平均＋／一標準偏差として
表わされた結果が夫々ＰＴ及びＩ）Ｔ−９Ｋ７１２９Ｇ
に関して、第４図及び表Ｖに示される． １．０００ ５５．１９ ＋／一 ６、６２ ５０．０１１０ ４．７ｌ ＋／− ０．３５ Ｎ．Ｄ．＝測定されず Ｃ）二羞２ｊ≦ヨ４父豆 体重約２０ｇの年令７〜８週の５匹の雌の［＋ａｌ ｂ
／（：マウスの群に，０日目に、０．５僧βの生理食塩
水無菌アビローゲン溶液そのもの（対照）または各種の
投薬量のＰＴ． ＰＴ−１２９Ｇそのもの，またはグル
タルアルデヒドで解ｉエされたＰＴ−１２９ＧｆＰＴ−
１２９Ｇ Ｄｅｔ．１、 ＰＴ−９Ｋ及びＩＩＴ−９Ｋ
７１２９Ｇを含む０． ５ｍεの生理食塩水無菌アビロ
ーゲン？８液で腹腔内接種する．投与６日後に，マウス
を４ ｍｇ／マウスのヒスタミン・二虐酸塩（シグマ・
ケミカル・カンバニイ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏｍｐａｎｙ＋．セントルイス、ＭＯ）を含む０
．５ｍｇの生理無菌アビローゲン溶液で腹腔内接種する
。ヒスタミン投与の２４時間後に，死亡を記録する．結
果を、下記の表■及び表ｖｎに示す． 表■ ０日目 投薬量／７ウス ０．５ｍｊ２ ／ｉ．ｐ． 食塩水 Ｐ丁 ０．０５０ＸＩＯ ／／ ０．５００ＸｌＯ ｕ ５．０００ｘｌＯ ｎ ５０．０００ｘ １０ １／ １００．ロ００ＸＩＯ ／／ ５００．０００Ｘ １０ ｔｔ １、 ０００． ０００ ｘ １０ＰＴ−１２９
Ｇ Ｏ．０００５μｇ 〃 ロ．ｏｏｓｏμｇ ／／ ０．０５０’Ｏｕｇ ／／ ０．５（１ｅ６ｕｌ １１ ５．００００μｇ １１ ５０．００００μｇ ＰＴ−１２９６ ｎｅｔ １１．ｏｏ０５ｕｇ ／／ ０．（｝０５１）μｇＩ／
Ｏ．０５００μｇ ＩＩ ｌ）．５０００μ８ ｔｔ ５．００００ｕｇ ６日目 投薬量／７ウス ０．５ｎｌ ／ｉ．ｐ． ヒスタミン （４ｍｇｌ 死亡／合計 ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ３／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ５／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ Ｄ／５ ０／５ 表■ ０８目 投薬量／７ウス ０． ５１１１β／ｉ． ｐ． ｏ．ｏｉｏ ｏ．ｏｓｏ Ｏ．１００ ０．５００ ｉ．ｏｏｏ ５．０００ ０．１００ ０．５００ ｉ．ｏｏｏ ５．０００ ５０．０００ ＰＴ ９Ｋ７１２９Ｇ Ｏ．１００ ０．５００ １．００ｅ ２．５００ ５．００α ７．５０１） １２．５００ ２５．０００ ５０．０００ ６日目 投薬量／７ウス ０．５ｍβ／ｉ．ｐ． ヒスタミン （４＋ｎｇ） 死亡／合計 ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ １／５ ４／５ ５／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ５／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ Ｄ／５ ０／５ ０／５ ０／５ ｄ）アナフ ラキシー アナフィラキシー感受性の強化をステインマン（Ｓｔｅ
ｉｎｍａｎ）Ｌらに記載された方法［ Ｐ． Ｎ． Ａ
． Ｓ． ＵＳＡ８２巻、８７３３〜８７３６頁（１９
８５年）］に従って測定する。 体重約２０ｇの年令７〜８週の５匹の雌のＢａｌ ｂ／
Ｃマウス（Ｈ−２’）の群を−１日目、＋１日目、＋６
日目に、０．２ｎｌの生理食塩水無菌アビローゲン溶液
そのもの（対照）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
（シグマ・ケミカル・カンバニイ、セントルイス、Ｍ
Ｏ）を含む０．２ｍｌの上記の溶液を腹腔内接種する。 ついで、同じ群の複数のマウスをＯ日目、＋２日目に、
０．４ｎ＋ｊ２のアビローゲン無菌食塩水そのもの、ま
たは４０， １００及び５００ｎｇ／マウスのＰＴ％１
００，５００及び２５００ｎｇ／マウスのＰＴ−１２９
Ｇそのものもしくはグルタルアルデヒドで解毒されたＰ
Ｔ−１２９Ｇ（ＰＴ−１２９Ｇ Ｄｅｔ）または５００
． ２５００及び７５０Ｄｎｇ／マウスのＰＴ−９１’
ｌ／１２９ＧＩ含む０．４ｖａＡの上記の食塩水で静脈
内接種する．最後のＢＳＡ投与の２時間後に死亡を記録
する．結果を表■に示す表 ■ ｅ） ＩＡＰ（膵島活性化タンパク質）ＰＴまたはＰ
Ｔ−９Ｋ／１２９Ｇによる膵島の活性化を、クレーフテ
ンベルグ（Ｋｒｅｅｆｔｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｇら（Ｊ
．Ｂｉｏ１．Ｓｔａｎｄ．， １２巻、１５１〜１５７
頁、１９８４年）にヨリ記載されたように測定する。 体重約２０ｇの年令５〜７週の５匹の雌のＢａｌｂ／Ｃ
マウスの群を０．２ｍｊ２のアビローゲン無菌食塩水そ
のもの（対照）または２５μｇ ／ｍ℃のＰＴ−９Ｋ／
１ ２９Ｇもしくは１μｇ／ＩＩＩ１２のＰＴを含む０
．２ ｍｆｌの上記の食塩水を腹腔内接種する。４日
後に、マウス血清中のインシュリンのｍ（ｍυ／βで表
わされる〉を測定する． 結果は予想されるように、ＰＴにより誘発されるインシ
ュリン分泌の著しい増加（１９． ６ｍＵ／−９ ）を
示し、一方、ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株により誘起さ
れる分泌物の値（５ｎ＋Ｕ／ｎ）は対照により得られた
Ｍ （８膳Ｕ／ｌに匹敵する． 実施例６ ＰＴ−９Ｋ １２９Ｇ のホルムアルデヒドａ
） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇの 、血
実施例３に記載されたようにして精製された変異株を０
． ０２５％のリジン（味の素、日本）及び０．Ｏｌ％
のメルチオレート［エランコ（ＥＬＡＮＣＯ）、米国】
を含むＰＢＳ，ｐＨ ７．４に対して４℃で２４時間透
析し、ついでＰＢＳ中に再度懸濁する。タンパク質含量
の測定［ロウリイ（Ｌ．ｏｖｔｒｙ）．０．Ｈ．ら著、
Ｊ．Ｂｉｏ ｊ２．ｃｈｅｍ．，１９３巻、２６５ 〜
２７５頁（１９５１年）を参照のこと］の後に、混合物
の分取物に各種の濃度［０．０３５ ％ 〜０．４２０
％ （Ｗ／Ｖ）） のホルＡ７ルデヒド（ ＰＢＳ
中の４％溶液、ｐＨ ７．４）を添加して、変異株対ホ
ルムアルデヒドの最終比（重量／重量） ０．３００〜
０． ０２５を得る．得られた混合物を０． ０２５Ｍ
のリジンの不在下及び存在下で３７℃で４８時間保温し
、ついでＰＢＳに対して繰返し透析する．ついで、混合
物を試験して、それらの′ｉｌＩ隨のホルムアルデヒド
含量を測定し、これが０．Ｏｌ％（重！／容量）よりも
低いことが判明する．更に、ＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析さ
れた混合物はＰ丁と同じ電気泳動パターン及び幾つかの
特別の帯域［そのうちの１つはサブユニットＳ２及びＳ
３と共に移行し、それよりも高い分子量をもつその他の
ものはサブユニットＳ１と共に移行する（第５図、レー
ン３を参照のこと）】の存在を示す． ついで、異なる濃度のホルムアルデヒドで処理されたＰ
Ｔ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株（ ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ
と称される）の分裂促進活性を正常の成人から単離され
たヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖応答として
測定し、ＰＴ並びに同じ変異株そのものの分裂促進活性
と比較する（第６図を参照のこと）。実際に、ＰＢＭＣ
＠胞を２ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸
、ＩＯＸＩＯ−’Ｍの２−メルカブトエタノール及び１
０％のヒトアルブミン血清で補充された０．２島記のＲ
ＰＭＩ １６４０［ジブコ・ラボラトリイズ（Ｇｉｂｃ
ｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），バイスレイ （Ｐａ
ｉｓｌｅｙ） ］中の１０’個／ウエルのａｙｉで、９
６個の平底ウエルマイクロプレート
【コスター（Ｃｏｓ
ｔａｒ）、ケンブリッジ、鯵轟Ｊのウエノレに入れる．
？いで、ＰＴ及びＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株並びに
Ｐ丁−９Ｋ ７１２９Ｇ変異株を０．１， ０．３，
１．０及び３．０並びに６．０μｇ／ｆｆＩ１２の濃度
で各ウェル中に添加する。３７℃で９６時間保温した後
、各ウェル中にＩＩＬｃｉの（３Ｈ）チミジン（ｓｐ．
ａｃｔ．１８５ ＧＢｑ／ミリモル；アメーシャム・イ
ンターナショナル（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ）、アメーシャム英国）を導入する。室温で
１６時間後に、細胞を細胞コレクター（スカトロン（Ｓ
ｋａｔｒｏｎ） ．リアー（Ｌｉｅｒ）、ノルウェー）
でガラスウールフィルター上に集め、含まれる放射能を
液体シンチレーションにより測定する。第６図（ＰＴ．
ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ）及び表ＩＸ （ＰＴ−９Ｋ／
１２９Ｇ及びＰＴＦ−９Ｋ／１ ２９Ｇ）に示された結
果は以下のことを示す． −ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株はＰＴタンパク質のＴヒ
トリンパ球に対する分裂促進活性に匹敵するＴヒトリバ
球に対する分裂促進活性を維持する．これは上記の分裂
促進活性がＢ才リゴマーの存在によるという観察と一致
する． ■ホルムアルデヒド濃度を増加すると、分裂促進活性を
消失まで減少する。 変異株ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇの血球凝集活性をサトウ
（Ｓａｔｏ）ら著、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ４１
巻、３１３頁〜３２０頁， １９８３年に記載されたよ
うにして、標的細胞として、グルタルアルデヒドで固定
されたニワトリの赤血球を用いて測定する。表■中に示
された結果は増加するホルムアルデヒドによる処理か変
異株の血球凝集活性を次第に減少することを示す。 親和性定数を先の実施例４に記載されたようにして測定
する。結果を表■に示す。 表 ＩＸ 表■中、 ａ）結果は２回試験された夫々の培養菌に関して平均の
カウント／分（ｃｐｍ Ｘ １０−”）として表わされ
る。 ｂ）結果はグルタルアルデヒドで固定されたニワトリの
赤血球の完全な凝集を生じるタンパク質投与量として表
わされる。 Ｃ）親水性定数はＲＩＡ試験により測定される。 ｄ）試料中のホルムアルデヒドの％（重量／容量）が記
載される。 ｅ）は試料中の変異株／ホルムアルデヒド比（重量／重
量）を示す． ＰＴ，変異株ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇそのもの及び０．
０３５％（Ｗ／Ｖ）のホルムアルデヒドで処理された同
変異株（ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ）を４℃、２０℃及び
３７℃に保つ。 ついで、タンパク質を１２０日後（４℃及び２０℃の場
合）及び３０日後（３７℃の場合）に処理して、電気泳
動プロフィール並びにポリクローナル（抗ＰＴγ−グロ
プリン）（Ａ）抗体及びモノクローナル（ＩＢ？） （
Ｂ）抗体に対する親和性定数を測定する。 結果（表Ｘ及び第５図）は４℃及び２０℃で１２０日の
期間にわたって保たれた分子がそれらの電気泳動パター
ンまたはそれらの親和定数の変化を受けないことを示す
． ３７℃で３０日間保たれた同分子はその代わりに、ＰＴ
及びＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株に関して、ＳＬサブユ
ニットに相当する帯の強度の次第の減少を示し（第５図
、レーン４及び５）、これはＰＴＫ−９Ｋ／１２９Ｇ変
異株に関して観察されない（第５図、レーン６）． 表Ｘ ＰＴ（Ａ） ＰＴ（Ｂ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ （Ｂ） ＰＴ（Ａ） ＰＴ（Ｂ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ （Ｂ） ＰＴ（Ａ） ＰＴ （Ｂ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） ＰＴＦ−ＩＫ／１２９Ｇ （Ａ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） 表中、 日数 変換温度 親和性 ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２．ＯＸ １０”” ２．４ＸｌＯ” ９．８Ｘ １０” ６．ＩＸ１０” １．７Ｘ １０” ３．２ＸｌＯ” Ｎ． Ｄ． ” Ｎ．Ｄ． ９．５Ｘ１０” ５、７Ｘ ｔｏ＠ １．４Ｘ １０” ６。２Ｘ１０” Ｎ．Ｄ． Ｎ．Ｄ． ３．ＩＸ１０” ２．９ＸｌＯ” １．５Ｘ １０１０ ２．ＩＸ１０” ａ） 非綿形回帰分析により評価されたデータがＫａ（Ｌ／モ
ル） として表わされ、 ３回試験された試 料に関して得られた値の幾何平均を表わす．標 準偏差値は１５％より高くない． ｂ》 Ｎ．Ｄ．＝測定されず Ｃ）アミノ７且 の 変異株ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇのアミノ酸残基の分析は０
． ０３５％のホルムアルデヒドの処理の前及び後に、
スパックマン（Ｓｐａｃｋｍａｎ）Ｄ． Ｈら著、Ａｎ
ａ１、Ｃｈｅｍ， ３０巻、１１９０ 〜１２０６頁に
記載されたようにして、行なわれる。ＰＴ変異株の酸加
水分解は減圧下でシールされたパイアル中１１０℃で２
４時間６ＮのＨＣｌ中で行なわれる。その後、アミノ酸
分析は、アミノ酸分析装置（コントロン（Ｋｏｎｔｒｏ
ｎ）、チューリッヒ、スイス）を用いて行なわれる。 酸加水分解中、トリブトファンアミノ酸残基が分解され
、それ故、それを測定することができなかった。更に、
酸加水分解中の脱アミド化のため、アスパラギン及びグ
ルタミンがアスパラギン酸及びグルタミン酸中で夫々変
換される．アスパラギン＋アスパラギン酸の合計（＾Ｓ
Ｘ）及びグルタミン＋グルタミン酸の合計（Ｇｌｘ）に
相当する値が表Ｍに示される。 結果を表用に示す． 表Ｍ アミノ酸 ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ ＰＦＴ−９Ｋ／１２９Ｇ ＡＳｘ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｘ Ｐｒｏ Ｇ１ｙ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｉ１ｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ 表Ｍ中、 ６１、２ ７０．５ ７０．１ ６０．１ Ｎ． Ｄ． ” ８１、３ ７９．８ Ｎ．Ｄ． ７２．９ ２８．８ ４０．０ ７５．８ ６３．５ ３０．５ ３９．３ ｌ６．７ ６３．５ Ｎ．Ｄ． ６７．０ ６５．６ ６１、４ ９３．５ Ｎ．Ｄ． ８５．５ ９０．Ｏ Ｎ．Ｄ． ６７．９ ２６．７ ３８．０ ７７．３ ６１．２ ３１、０ １６４．９′ １４，６ ６５．Ｏ Ｎ．Ｄ． 一次タンパク質構造から推定される理論値がアミノ酸／
タンパク質の比として表わされる．Ｎ．Ｄ．＝測定され
ず 下線が符された値は０． ０２５ Ｍのリシン６ｅの存 在下のホルムアルデヒド処理後のシリン増加量を示す。 実施例７ ＣＨＯ細 に るＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ の
ＩＸＩＯ’個のＣＨＯ細胞を異なるＰＴＦ−９Ｋ／１２
９Ｇ投与量（０．０１ 〜５ｕｇ／ ｍｊ２）及びＰＴ
投与ｆｆｉ （０． ３ｐｇ〜９０ｎｇ／ｍβ）と共に
４８時間保温する。細胞の形態変化を生じ得る最小投与
量を測定する。結果は、ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株
が最大の試験投与量（５μｇ／ｍＩ２）で毒性がなく、
ＰＴ （ ５ｐｇ／ ｍＡ ）よりも少なくとも１０’
倍毒性でないことを示す。 実施例８ アナフィラキシー感受性の導入がステインマン，Ｌらに
より記載された方法ＣＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８２巻
、８７３３〜８７３６頁， １９２１５年）に従って測
定される． 体重約２０１の５〜７選の５匹の雌のＩｌａｌｂ／Ｃマ
ウスの群を０．２０１Ｊ２の生理無菌アビローゲン食塩
水そのちの、またはｌ ｍｇ／マウスのＢＳＡ （シ
グマ・ケミカル・カンバニイ、セントルイス、ＭＯ）を
含むその０．２ｍβの食塩水で、一ｌ日目、＋ｌ日目及
び＋６日目に腹腔内接種した。ついで、マウスの同じ群
を０．２ｍｊ２のアビローゲン無菌食塩水そのもの、ま
たは０．０４，０．１及び０．５μｇ／マウスのＰＴま
たは２．５及び７．５μｇ／マウスのＰＴＦ／９Ｋ／１
２９Ｇを含む０．２ｍｊ２のその食塩水でＯ日目及び＋
２日目に静脈内処置した．最後のＢＳＡ投与の２時間後
に、死亡を記録した。 結果を表刈に示す。 Ｂ）亘工ｌ主之巡叉立 体重約２０ｇの５〜７週の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスの群
を０．５ｍ尼の食塩水アビローゲン無菌生理液そのもの
、または０．００４，０．０２，０．０４，０．１，０
．５及び１．０μｇのＰＴもしくは２． ５， １２．
５， ２５． ０， ５０． ０μｇのＰＴＦ−！ｌ
／１２９Ｇを含む０．５ｏ＋１のその生理液でＯ日目に
腹腔内接種する。 ＋６日目に、マウスを、ヒスタミン＝塩酸３ｎ４ｍｇを
含む０．５ｍｆｉのアビローゲン無菌食塩水で腹腔内接
種した。 ヒスタミン投与の２４時間後に、死亡を記録した。 結果を表刈に示す。 Ｃ）狂鉦思量迦 体重約２０ｇの５〜７週の５匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウ
スの群を０．５ｎ＋４２のアビローゲン無菌溶液そのも
の、または０． ００４， Ｏ。０２， ０． ０４，
０． １，０． ５及び１．０μｇ ＰＴもしくは２
． ５， １２． ５， ２５．０及び５０．０μｇの
ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇを含む０．５ｆｆｌ忍のその溶
液でＯ日目に腹腔内接種した。 投与の３日後に、動物の唄窩集網から血液試料を採取し
、試験して白血球増加を測定した．個々に試験された５
匹の動物からの白血球カウントの平均＋／一標準偏差と
して表わされる結果な表朋に示す． 表刈 食塩水 − ５．２３＋／−０．５１ ０／５
０／ＳＰＴ Ｏ．００４ ５．
９４＋／−０．４１ ０／５ Ｎ．Ｄ．０．０
２０ １０．３３＋／−０．８２ ０／５
Ｎ．Ｄ．０．０４０ １４．３４＋／−０．８３
０／５ ４／５０．１００ １７．７３＋／−
１．１２ １／５ ４／５０．５００ ４５
．７３＋／−３．７６ ５／５ ５／５１．０
００ ５５．１９＋／−６．６２ ５／５
Ｎ．Ｄ．ＰＴＦ−９Ｋ／ ２．５００ ４．
４５＋／−０．４１ ０／５ ０／５１２９Ｇ
７．５００ Ｎ．Ｄ．
Ｎ．Ｄ． Ｏ／５１２．５００ ４。３９＋／
−０．３２ ０／５ Ｎ．Ｄ．２５．０００
４．７９＋／−０．４４ ０／５ Ｎ．Ｄ
．５０．０００ ４．７１＋／−０．３５ ０／
５ Ｎ．Ｄ．＊Ｎ． Ｄ． ＝測定されず （ｂ）＝５匹のマウス／群の合計に対する死亡数表から
わかるように、腹腔内接種されたマウスは３日後に投与
量に依存する白血球増加を示す。 末梢血単核細胞（ＢＰＭ（：）の増加は０． ０２０μ
ｇの精製ＰＴ毒素でもって統計上有意であり、一方、Ｐ
ＴＦ一９Ｋ／１２９Ｇは５０μｇ／マウスの投与量で白
血球増加を全く促進し得ない． 上記と同じ投与量で腹腔内接種された上記の変異株はヒ
スタミン投与後にマウスに致死効果を誘起しない。一方
、０．５μｇ／マウスの投与量で接種されたＰＴは１０
０％の死亡率を生じる。 百日咳毒素がＢＳＡアナフィラキシーを強化する能力、
即ち細胞抗百日咳ワクチンによりひき起こされる脳障害
と関連した現象はＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株に関す
る限り、存在しない。 ０．０４μｇのＰＴで接種されたマウスに８０％の死亡
率を生じるアナフィラキシー強化は７．５μｇのＰＴＦ
−９Ｋ７１２９Ｇで処置されたマウスに観察されない． Ｄ）急ＩＬ牲 毒性の腹腔内もしくは皮下研究がＯＭＳの指示（ＷＨＯ
Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．６３８ ＠，６０ 〜８
０頁（１９７９年）】に従って行なわれる． ５匹のマウス及び５匹のラットの群を、ＰＴ−！ｌ／１
２９Ｇ変異株及びＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株（体重
１ｋｇ当り１５００μｇ）で膓腔内１１ｔｉＬ、皮下接
種した．ついで、動物を制御下に１４時＆”ｌｉったが
、その間に局所反応または全身反応を示すような体重変
化またはその他の徴候が記録されなかった。 実施例９ ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株の免疫原住を調べる目的
のため、体重３５０ｇの４週の年令の６匹のモルモット
を０． ００１ｍｇのナトリウムエチル水銀チオサリチ
レート及びＡｊ２ （ＯＨ）ｓ（ｌＩＩＩｇ／ ｍｌ
）に吸着された３，１０．２５及び５０μｇのＰＴＦ−
９Ｋ／１２９Ｇ並びに０．７５ ｍβ（ヒトの投薬量の
１．５倍に相当する）の古典的な三ＩＩＩＤＰＴワクチ
ン（抗ジフテリア、抗百日咳及び抗破傷風） （ＳＣＬ
ＡＶＯ，Ｓ．ｐ．Ａ．） （百日咳成分は死滅百日咳
菌からなる）を含む０．５ｍｌの生理アビローゲン無菌
食塩水で皮下接種する．最初の接種から４週間後に、血
液試料を採取し、動物を同じ投薬量のＰＴＦ−９Ｎ／１
２９Ｇ及びＤＰＴワクチンで再度皮下接種する．第二の
接種から２週間後に、別の血液゛試料をｔｏｔｔする．
ついで、試料から得られた血清なＥＬＩＳＡ分析で処理
して抗体及び抗ＰＴ力価を測定し、ＣＨＯ試験で処理し
てＰＴを中和する抗体能力を測定する。ＥＬＩＳＡ分析
〔これはエングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）及びベールマン
（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）により記載されたＥＬＩＳＡ分析
： Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ１、 ， １０９巻、１２９〜
１３５頁（１９７２年）の改良法である〕は以下のよう
にして行なわれる。 ボリスチレンの平底マイクロプレート（ダイナテク・ラ
ボラトリイズＩｎｃ．，アレキサンドリア、ＶＡ）の各
ウエル中に、１μｇの精製ＰＴ （抗原）を含む２００
μＱ ＰＢＳ （ｐＨ７． ４）を導入する。固相上の
抗原吸着は３７℃で３時間、ついで４℃で一夜、保湿室
中で行なわれる．プラスチック材料上の血清タンパク質
の非特異的吸着をＰＢＳ中の１％のＢＳＡでもって最小
にした後、モルモットから得られ、０．０５％のトウイ
ーン−２０を添加したＰＢＳで１：９ｌ２０に連続希釈
された血清試料を各マイクロプレートウエルに導入し、
３７℃で２時間保温する．終了時に、０．０５％トウイ
ーン−２０を含むＰＢＳ中１：３０００に希釈されたア
ルカリホスファターゼＣマイルス（Ｍｉｌｅｓ） ％イ
エダ（Ｙｅｄａ）、イスラエル）で接合されたＩｇＧヤ
ギ抗体抗モルモットを各ウエルに導入し、プレートを３
７℃で２時間保温する。全ての工程で、保温間にプレー
トを洗浄するため、１００μ忍容量を使用する。洗浄は
０．０５％のトウイーン−２０及び０．０２％のＮａＮ
ｓを含むＰＢＳを用いて３回行なわれる．特異的基質（
ｐ−ニトロフエニルホスフェート、１ ｍｇ／ｍβ）を
添加した３０分後に室温で生じる比色反応をタイターテ
ク・マルチスカン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉａｋ
ａｎ） （フロー・ラボラトリイズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ，マクリーン（ＭｃＬｅａｎ）
、ＶＡ）中で４０５ｎｍで読み取る。 各プレートに関する対照は抗原を含まない血清試料及び
その逆のものを含むウエルな含む。抗体力価を評価し，
グラフ中に、重複して試験された血清の希釈（横軸）対
夫々の吸光度の平均（縦軸）を示す。変曲点と吸光度軸
との交差が未希釈血清吸光度（ＡＢＳ−ＭＡＸ）の値を
示す．ＰＰＴ及び異なる投薬量のＰＴＦ−９Ｋ／１２９
Ｇで免疫化された各群の動物に関して得られたＡＢ３−
ＭＡＸ ＠が夫々のサンプリング後に、夫々の免疫前の
血清と比較される｛第７図）。ＡＢＳ−ＭＡＸ増加はそ
れがワクチン投与前の血清に関して得られた値よりも少
なくとも４倍高い場合に、統計上有意と考えられる。 第７図から観察し得るように、最初の接種の４週間後に
採取された未希釈血清は４０５ｎｍで吸光度値（ＡＢＳ
−ＭＡＸ． １回投与）を示し、この値は免疫化前に
測定された値よりも３２〜４０倍高い。第二の接種から
２週間後に採取された血清に関して、更に５０％の増加
が観察される（ＡＢＳ−ＭＡＸ、２回投与）． ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ免疫化後に観察される抗体力価
の増加はＣＨＯ試験で測定される中和活性と相関関係が
ある。事実、３，１０．２５及び５０μｇのＰＴＦ−９
Ｋ／１２９Ｇの１回の注射後に得られた血清は１２０！
）ｇＰＴにより誘起されるＣ）１０細胞に対する凝集効
果を中和でき、夫々１／２０． １／２０， ｌ／２０
及びｌ／８０の希釈である。毒素を中和する能力は第二
の免疫化後に、かなり増大する．事実、３μｇのＰＴＦ
−９Ｋ／１２９Ｇにより免疫化された動物．から得られ
た抗体は１／１，２８０の希釈で毒素活性を中和できる
（ｍ７図を参照のこと）。 体重約１６ｇの３〜４週の１６ｃＤｌ （チャールズ
・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ） 、カル：Ｉ
（Ｃａｌｃｏ）．イタリア）雄のマウスの群をＯＭＳ
規準に従って、０． ２４， １、 ２０， １．９２
， ４． ８０， １２． ００及び３０． ００μｇ
の液体（非吸着） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ並びにＡＪ２
（ＯＨ） ｓ （ｌｍｇ／ｍｊ２）に吸着された０．
０３５％のホルムアルデヒドで安定化された０． ２
４， １． ２０， ６． ００及び３０． ００μｇ
の同変異体（ ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ ）を含む０．
５＋＋Ｉ！２の無菌食塩水で腹腔内接種する．陽性の対
照として、マウスの群を０． ０００３２， ０． ０
０１， ０． ００８及び０．０４ ｍｊ２の通常の抗
百日咳細胞ワクチン【ナショナル・インスティテユート
・オブ・ヘルス（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ ｌ｛ｅａｌｔｈｌ、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ）、ＭＤ）で腹腔内接種する．投与１４日後、マウス
を平均致死量の３００倍を含む病原性百日咳菌（菌株ｌ
●３２３；ＳＣＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ． ）の懸濁液で
大脳内（ＩＣ）感染させる．ついで、マウスを制御下に
１４日間保った。 結果を表■に示す。 表■ ０．００４ ｏ．ｏｏｇ Ｏ．００１０ ０．０００３２ １６／１６ ３０ １４／１６
１６／１６１３７１８ １２ Ｎ
．Ｄ．ｅ １６／１６９／１６ ６
１４／１６ Ｎ．０．１／１６
４．８０ Ｎ．Ｄ． １２／１６１．
９２ Ｎ．０． １０／１６１．２０
８／１６ ７／１６０．２４
２／１６ ３／１６ｐＤｓ。（ｄ） １．
２ １．１ａ） ワクチンは８つの保護国際単
位／ｏｌ２．を含むｂ）値は試験゛された合計１６匹の
マウスに対する生存マウスの数として表わされる． ｃ） Ｎ．Ｄ．：測定されず． ｄ）病原性百日咳菌１８３２３による大脳内感染から５
０％のマウスを保護するｔ９薬量． 表から観察されるように、ＡＩＯＨ）．に吸着されたＰ
ＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇは１．２μｇ／マウス（ＰＤ．。 ）の投薬量で５０％のマウスに麻痺または死亡からの保
護を誘起する。 ホルムアルデヒドで処理されない液体ＰＴ−９Ｋ／１２
９Ｇにより、一層良好な結果が得られる。 事実、毎回ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇを免疫原として使用し
て、ＩＣ抗原投与直後に１００％の保護に達する。しか
しながら、ＰＤＩ。（１．１μｇ／マウス）は有意に変
化しない． 実施例１１ この研究の目的はボランティア集団に於いて、活性成分
としてＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇを含む無細胞抗百日咳ワ
クチンの寛容性及び免疫原性（特異的な中和抗体を誘導
する能力）を評価することである．この目的のため、２
０ＥＬＩＳＡ単位（Ｅｌ） ／ｙａ Ａより低い抗ＰＴ
抗体力′価を有する２９人の成人、即ち男女の健康な個
人を選んだ。患者をそれらの病歴（百日咳に関して未知
／陰性、疾患に関して陽性、ワクチン化に関して陽性）
に応じて、分ける。 各群の中で随時選択した後、患者を以下のように連続に
処置する。 １） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株を含む抗百日咳
無細胞ワクチン（１８人のボランティア）。 夫々の０．５ｍｊ２の投薬量は１５μｇのＰＴＦ−９Ｋ
／１２９Ｇ （活性成分） 、０．００１ｍｇのナトリ
ウムエチル水銀チオサリチレート及び０．５ｍｇの水酸
化アルミニウム（賦形剤）を含む。 あるいは、 ２） ワクチンに関して未分化（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｔｅｄ）の特性の水酸化ナトリウムからなる偽薬
（１１人のボランティア）．随時選択に基づいて、各患
者は２回の投与の間に６週間の間隔で、左三角筋の部位
で、２回投与の抗百日咳ワクチンまたは２回投与の偽薬
を筋肉内投与される．患者を試験の開始後３ケ月間、制
御下に保ち、局所及び／＊たけ全身の副作用の全てを調
べる．全血漿及び／またはγヒトグロプリンの投与が実
験の開始前３ケ月以降及びその全期間中に避けられる。 同じ期間中に、またコルチゾン化合物及び／または抗高
血圧症薬の投与が避けられる。 患者をワクチン投与後３０分間、厳しい観察下に置く。 毎日、ワクチン投与に続く５日間にわたって、アセラー
（ａｓｃｅｌｌａｒ）測定による体温の値を調べ、投与
部位及びサテライト・スーパーフィシャル・リンパグラ
ンジュラー・ステーション（Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｕ
ｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｌｙｍｐｈｏｇｌａｎｄｕｌａｒ
ｓｔａｔｉｏｎ）の検査及び触診を行なう．抗百日咳ワ
クチン投与の４日後に、血液学的試験、血液化学試験、
免疫学的試験（ＣＤ３， ＣＤ４， ＣＩｌ１９，ＣＤ
２５， ＣＤ２３，ＣＤ１４及びＣＤ５７としてリンパ
系細胞の活性化マーカー； ＰＴ，ＦＴ−９Ｋ／１２９
Ｇ及び破傷風トキソイド抗原に関する試験管内増殖｝を
行なう目的で静脈末梢血の試料を採取する． ワクチン投与の３０日後に、抗体滴定の他に、細胞蝿介
免疫評価及びＩｌｌ滴定がまた行なわれる． ２回目のワクチンまたは偽薬の投与後に、上記の方法に
従って、同じ分析が行なわれる．１回目及び２回目のワ
クチン投与の後に副作用が現われないことはＰＴＦ−９
Ｋ／１２９Ｇ変異体に対して完全に耐性であることを示
す。 各ボランティアに関して、抗百日咳抗体力価（ＥＬＩＳ
Ａ分折）及び中和力価（Ｃ｝１０細胞）が測定される。 結果を表頽に示す。 表 Ｘ■ 抗体抗ＰＴ力価は 標準参照血清［ＵＳ Ｒｅｆｅｒ−
ｅｎｃｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ａｎｔｉ
ｓｅｒｕｍ．ロット番号３．ＦＤＡ、ベセスダ、米国、
Ｊ．メンクラーク（ＭｅｎｃｌａｒｋＪ博士から供給さ
れた］の幾何平均として表わされ、一方、中和力価はＣ
ＭＯ細胞に対する天然毒素の凝集効果を抑制し得る最大
血清希釈として表わされる。（ ）内の値はスチューデ
ント”ｔ”検定で測定された９５％の信頼限界を表わす
．先の表に、ワクチン及び偽薬の投与の前及び後に測定
された抗体力価及び中和力価の増加率（後／前）が示さ
れる。
ｔａｒ）、ケンブリッジ、鯵轟Ｊのウエノレに入れる．
？いで、ＰＴ及びＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株並びに
Ｐ丁−９Ｋ ７１２９Ｇ変異株を０．１， ０．３，
１．０及び３．０並びに６．０μｇ／ｆｆＩ１２の濃度
で各ウェル中に添加する。３７℃で９６時間保温した後
、各ウェル中にＩＩＬｃｉの（３Ｈ）チミジン（ｓｐ．
ａｃｔ．１８５ ＧＢｑ／ミリモル；アメーシャム・イ
ンターナショナル（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ）、アメーシャム英国）を導入する。室温で
１６時間後に、細胞を細胞コレクター（スカトロン（Ｓ
ｋａｔｒｏｎ） ．リアー（Ｌｉｅｒ）、ノルウェー）
でガラスウールフィルター上に集め、含まれる放射能を
液体シンチレーションにより測定する。第６図（ＰＴ．
ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ）及び表ＩＸ （ＰＴ−９Ｋ／
１２９Ｇ及びＰＴＦ−９Ｋ／１ ２９Ｇ）に示された結
果は以下のことを示す． −ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株はＰＴタンパク質のＴヒ
トリンパ球に対する分裂促進活性に匹敵するＴヒトリバ
球に対する分裂促進活性を維持する．これは上記の分裂
促進活性がＢ才リゴマーの存在によるという観察と一致
する． ■ホルムアルデヒド濃度を増加すると、分裂促進活性を
消失まで減少する。 変異株ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇの血球凝集活性をサトウ
（Ｓａｔｏ）ら著、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ４１
巻、３１３頁〜３２０頁， １９８３年に記載されたよ
うにして、標的細胞として、グルタルアルデヒドで固定
されたニワトリの赤血球を用いて測定する。表■中に示
された結果は増加するホルムアルデヒドによる処理か変
異株の血球凝集活性を次第に減少することを示す。 親和性定数を先の実施例４に記載されたようにして測定
する。結果を表■に示す。 表 ＩＸ 表■中、 ａ）結果は２回試験された夫々の培養菌に関して平均の
カウント／分（ｃｐｍ Ｘ １０−”）として表わされ
る。 ｂ）結果はグルタルアルデヒドで固定されたニワトリの
赤血球の完全な凝集を生じるタンパク質投与量として表
わされる。 Ｃ）親水性定数はＲＩＡ試験により測定される。 ｄ）試料中のホルムアルデヒドの％（重量／容量）が記
載される。 ｅ）は試料中の変異株／ホルムアルデヒド比（重量／重
量）を示す． ＰＴ，変異株ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇそのもの及び０．
０３５％（Ｗ／Ｖ）のホルムアルデヒドで処理された同
変異株（ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ）を４℃、２０℃及び
３７℃に保つ。 ついで、タンパク質を１２０日後（４℃及び２０℃の場
合）及び３０日後（３７℃の場合）に処理して、電気泳
動プロフィール並びにポリクローナル（抗ＰＴγ−グロ
プリン）（Ａ）抗体及びモノクローナル（ＩＢ？） （
Ｂ）抗体に対する親和性定数を測定する。 結果（表Ｘ及び第５図）は４℃及び２０℃で１２０日の
期間にわたって保たれた分子がそれらの電気泳動パター
ンまたはそれらの親和定数の変化を受けないことを示す
． ３７℃で３０日間保たれた同分子はその代わりに、ＰＴ
及びＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株に関して、ＳＬサブユ
ニットに相当する帯の強度の次第の減少を示し（第５図
、レーン４及び５）、これはＰＴＫ−９Ｋ／１２９Ｇ変
異株に関して観察されない（第５図、レーン６）． 表Ｘ ＰＴ（Ａ） ＰＴ（Ｂ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ （Ｂ） ＰＴ（Ａ） ＰＴ（Ｂ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ （Ｂ） ＰＴ（Ａ） ＰＴ （Ｂ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ａ） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） ＰＴＦ−ＩＫ／１２９Ｇ （Ａ） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｂ） 表中、 日数 変換温度 親和性 ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ４ ℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２０℃ ２．ＯＸ １０”” ２．４ＸｌＯ” ９．８Ｘ １０” ６．ＩＸ１０” １．７Ｘ １０” ３．２ＸｌＯ” Ｎ． Ｄ． ” Ｎ．Ｄ． ９．５Ｘ１０” ５、７Ｘ ｔｏ＠ １．４Ｘ １０” ６。２Ｘ１０” Ｎ．Ｄ． Ｎ．Ｄ． ３．ＩＸ１０” ２．９ＸｌＯ” １．５Ｘ １０１０ ２．ＩＸ１０” ａ） 非綿形回帰分析により評価されたデータがＫａ（Ｌ／モ
ル） として表わされ、 ３回試験された試 料に関して得られた値の幾何平均を表わす．標 準偏差値は１５％より高くない． ｂ》 Ｎ．Ｄ．＝測定されず Ｃ）アミノ７且 の 変異株ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇのアミノ酸残基の分析は０
． ０３５％のホルムアルデヒドの処理の前及び後に、
スパックマン（Ｓｐａｃｋｍａｎ）Ｄ． Ｈら著、Ａｎ
ａ１、Ｃｈｅｍ， ３０巻、１１９０ 〜１２０６頁に
記載されたようにして、行なわれる。ＰＴ変異株の酸加
水分解は減圧下でシールされたパイアル中１１０℃で２
４時間６ＮのＨＣｌ中で行なわれる。その後、アミノ酸
分析は、アミノ酸分析装置（コントロン（Ｋｏｎｔｒｏ
ｎ）、チューリッヒ、スイス）を用いて行なわれる。 酸加水分解中、トリブトファンアミノ酸残基が分解され
、それ故、それを測定することができなかった。更に、
酸加水分解中の脱アミド化のため、アスパラギン及びグ
ルタミンがアスパラギン酸及びグルタミン酸中で夫々変
換される．アスパラギン＋アスパラギン酸の合計（＾Ｓ
Ｘ）及びグルタミン＋グルタミン酸の合計（Ｇｌｘ）に
相当する値が表Ｍに示される。 結果を表用に示す． 表Ｍ アミノ酸 ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ ＰＦＴ−９Ｋ／１２９Ｇ ＡＳｘ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｘ Ｐｒｏ Ｇ１ｙ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｉ１ｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ 表Ｍ中、 ６１、２ ７０．５ ７０．１ ６０．１ Ｎ． Ｄ． ” ８１、３ ７９．８ Ｎ．Ｄ． ７２．９ ２８．８ ４０．０ ７５．８ ６３．５ ３０．５ ３９．３ ｌ６．７ ６３．５ Ｎ．Ｄ． ６７．０ ６５．６ ６１、４ ９３．５ Ｎ．Ｄ． ８５．５ ９０．Ｏ Ｎ．Ｄ． ６７．９ ２６．７ ３８．０ ７７．３ ６１．２ ３１、０ １６４．９′ １４，６ ６５．Ｏ Ｎ．Ｄ． 一次タンパク質構造から推定される理論値がアミノ酸／
タンパク質の比として表わされる．Ｎ．Ｄ．＝測定され
ず 下線が符された値は０． ０２５ Ｍのリシン６ｅの存 在下のホルムアルデヒド処理後のシリン増加量を示す。 実施例７ ＣＨＯ細 に るＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ の
ＩＸＩＯ’個のＣＨＯ細胞を異なるＰＴＦ−９Ｋ／１２
９Ｇ投与量（０．０１ 〜５ｕｇ／ ｍｊ２）及びＰＴ
投与ｆｆｉ （０． ３ｐｇ〜９０ｎｇ／ｍβ）と共に
４８時間保温する。細胞の形態変化を生じ得る最小投与
量を測定する。結果は、ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株
が最大の試験投与量（５μｇ／ｍＩ２）で毒性がなく、
ＰＴ （ ５ｐｇ／ ｍＡ ）よりも少なくとも１０’
倍毒性でないことを示す。 実施例８ アナフィラキシー感受性の導入がステインマン，Ｌらに
より記載された方法ＣＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８２巻
、８７３３〜８７３６頁， １９２１５年）に従って測
定される． 体重約２０１の５〜７選の５匹の雌のＩｌａｌｂ／Ｃマ
ウスの群を０．２０１Ｊ２の生理無菌アビローゲン食塩
水そのちの、またはｌ ｍｇ／マウスのＢＳＡ （シ
グマ・ケミカル・カンバニイ、セントルイス、ＭＯ）を
含むその０．２ｍβの食塩水で、一ｌ日目、＋ｌ日目及
び＋６日目に腹腔内接種した。ついで、マウスの同じ群
を０．２ｍｊ２のアビローゲン無菌食塩水そのもの、ま
たは０．０４，０．１及び０．５μｇ／マウスのＰＴま
たは２．５及び７．５μｇ／マウスのＰＴＦ／９Ｋ／１
２９Ｇを含む０．２ｍｊ２のその食塩水でＯ日目及び＋
２日目に静脈内処置した．最後のＢＳＡ投与の２時間後
に、死亡を記録した。 結果を表刈に示す。 Ｂ）亘工ｌ主之巡叉立 体重約２０ｇの５〜７週の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスの群
を０．５ｍ尼の食塩水アビローゲン無菌生理液そのもの
、または０．００４，０．０２，０．０４，０．１，０
．５及び１．０μｇのＰＴもしくは２． ５， １２．
５， ２５． ０， ５０． ０μｇのＰＴＦ−！ｌ
／１２９Ｇを含む０．５ｏ＋１のその生理液でＯ日目に
腹腔内接種する。 ＋６日目に、マウスを、ヒスタミン＝塩酸３ｎ４ｍｇを
含む０．５ｍｆｉのアビローゲン無菌食塩水で腹腔内接
種した。 ヒスタミン投与の２４時間後に、死亡を記録した。 結果を表刈に示す。 Ｃ）狂鉦思量迦 体重約２０ｇの５〜７週の５匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウ
スの群を０．５ｎ＋４２のアビローゲン無菌溶液そのも
の、または０． ００４， Ｏ。０２， ０． ０４，
０． １，０． ５及び１．０μｇ ＰＴもしくは２
． ５， １２． ５， ２５．０及び５０．０μｇの
ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇを含む０．５ｆｆｌ忍のその溶
液でＯ日目に腹腔内接種した。 投与の３日後に、動物の唄窩集網から血液試料を採取し
、試験して白血球増加を測定した．個々に試験された５
匹の動物からの白血球カウントの平均＋／一標準偏差と
して表わされる結果な表朋に示す． 表刈 食塩水 − ５．２３＋／−０．５１ ０／５
０／ＳＰＴ Ｏ．００４ ５．
９４＋／−０．４１ ０／５ Ｎ．Ｄ．０．０
２０ １０．３３＋／−０．８２ ０／５
Ｎ．Ｄ．０．０４０ １４．３４＋／−０．８３
０／５ ４／５０．１００ １７．７３＋／−
１．１２ １／５ ４／５０．５００ ４５
．７３＋／−３．７６ ５／５ ５／５１．０
００ ５５．１９＋／−６．６２ ５／５
Ｎ．Ｄ．ＰＴＦ−９Ｋ／ ２．５００ ４．
４５＋／−０．４１ ０／５ ０／５１２９Ｇ
７．５００ Ｎ．Ｄ．
Ｎ．Ｄ． Ｏ／５１２．５００ ４。３９＋／
−０．３２ ０／５ Ｎ．Ｄ．２５．０００
４．７９＋／−０．４４ ０／５ Ｎ．Ｄ
．５０．０００ ４．７１＋／−０．３５ ０／
５ Ｎ．Ｄ．＊Ｎ． Ｄ． ＝測定されず （ｂ）＝５匹のマウス／群の合計に対する死亡数表から
わかるように、腹腔内接種されたマウスは３日後に投与
量に依存する白血球増加を示す。 末梢血単核細胞（ＢＰＭ（：）の増加は０． ０２０μ
ｇの精製ＰＴ毒素でもって統計上有意であり、一方、Ｐ
ＴＦ一９Ｋ／１２９Ｇは５０μｇ／マウスの投与量で白
血球増加を全く促進し得ない． 上記と同じ投与量で腹腔内接種された上記の変異株はヒ
スタミン投与後にマウスに致死効果を誘起しない。一方
、０．５μｇ／マウスの投与量で接種されたＰＴは１０
０％の死亡率を生じる。 百日咳毒素がＢＳＡアナフィラキシーを強化する能力、
即ち細胞抗百日咳ワクチンによりひき起こされる脳障害
と関連した現象はＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株に関す
る限り、存在しない。 ０．０４μｇのＰＴで接種されたマウスに８０％の死亡
率を生じるアナフィラキシー強化は７．５μｇのＰＴＦ
−９Ｋ７１２９Ｇで処置されたマウスに観察されない． Ｄ）急ＩＬ牲 毒性の腹腔内もしくは皮下研究がＯＭＳの指示（ＷＨＯ
Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．６３８ ＠，６０ 〜８
０頁（１９７９年）】に従って行なわれる． ５匹のマウス及び５匹のラットの群を、ＰＴ−！ｌ／１
２９Ｇ変異株及びＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株（体重
１ｋｇ当り１５００μｇ）で膓腔内１１ｔｉＬ、皮下接
種した．ついで、動物を制御下に１４時＆”ｌｉったが
、その間に局所反応または全身反応を示すような体重変
化またはその他の徴候が記録されなかった。 実施例９ ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株の免疫原住を調べる目的
のため、体重３５０ｇの４週の年令の６匹のモルモット
を０． ００１ｍｇのナトリウムエチル水銀チオサリチ
レート及びＡｊ２ （ＯＨ）ｓ（ｌＩＩＩｇ／ ｍｌ
）に吸着された３，１０．２５及び５０μｇのＰＴＦ−
９Ｋ／１２９Ｇ並びに０．７５ ｍβ（ヒトの投薬量の
１．５倍に相当する）の古典的な三ＩＩＩＤＰＴワクチ
ン（抗ジフテリア、抗百日咳及び抗破傷風） （ＳＣＬ
ＡＶＯ，Ｓ．ｐ．Ａ．） （百日咳成分は死滅百日咳
菌からなる）を含む０．５ｍｌの生理アビローゲン無菌
食塩水で皮下接種する．最初の接種から４週間後に、血
液試料を採取し、動物を同じ投薬量のＰＴＦ−９Ｎ／１
２９Ｇ及びＤＰＴワクチンで再度皮下接種する．第二の
接種から２週間後に、別の血液゛試料をｔｏｔｔする．
ついで、試料から得られた血清なＥＬＩＳＡ分析で処理
して抗体及び抗ＰＴ力価を測定し、ＣＨＯ試験で処理し
てＰＴを中和する抗体能力を測定する。ＥＬＩＳＡ分析
〔これはエングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）及びベールマン
（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）により記載されたＥＬＩＳＡ分析
： Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ１、 ， １０９巻、１２９〜
１３５頁（１９７２年）の改良法である〕は以下のよう
にして行なわれる。 ボリスチレンの平底マイクロプレート（ダイナテク・ラ
ボラトリイズＩｎｃ．，アレキサンドリア、ＶＡ）の各
ウエル中に、１μｇの精製ＰＴ （抗原）を含む２００
μＱ ＰＢＳ （ｐＨ７． ４）を導入する。固相上の
抗原吸着は３７℃で３時間、ついで４℃で一夜、保湿室
中で行なわれる．プラスチック材料上の血清タンパク質
の非特異的吸着をＰＢＳ中の１％のＢＳＡでもって最小
にした後、モルモットから得られ、０．０５％のトウイ
ーン−２０を添加したＰＢＳで１：９ｌ２０に連続希釈
された血清試料を各マイクロプレートウエルに導入し、
３７℃で２時間保温する．終了時に、０．０５％トウイ
ーン−２０を含むＰＢＳ中１：３０００に希釈されたア
ルカリホスファターゼＣマイルス（Ｍｉｌｅｓ） ％イ
エダ（Ｙｅｄａ）、イスラエル）で接合されたＩｇＧヤ
ギ抗体抗モルモットを各ウエルに導入し、プレートを３
７℃で２時間保温する。全ての工程で、保温間にプレー
トを洗浄するため、１００μ忍容量を使用する。洗浄は
０．０５％のトウイーン−２０及び０．０２％のＮａＮ
ｓを含むＰＢＳを用いて３回行なわれる．特異的基質（
ｐ−ニトロフエニルホスフェート、１ ｍｇ／ｍβ）を
添加した３０分後に室温で生じる比色反応をタイターテ
ク・マルチスカン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉａｋ
ａｎ） （フロー・ラボラトリイズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ，マクリーン（ＭｃＬｅａｎ）
、ＶＡ）中で４０５ｎｍで読み取る。 各プレートに関する対照は抗原を含まない血清試料及び
その逆のものを含むウエルな含む。抗体力価を評価し，
グラフ中に、重複して試験された血清の希釈（横軸）対
夫々の吸光度の平均（縦軸）を示す。変曲点と吸光度軸
との交差が未希釈血清吸光度（ＡＢＳ−ＭＡＸ）の値を
示す．ＰＰＴ及び異なる投薬量のＰＴＦ−９Ｋ／１２９
Ｇで免疫化された各群の動物に関して得られたＡＢ３−
ＭＡＸ ＠が夫々のサンプリング後に、夫々の免疫前の
血清と比較される｛第７図）。ＡＢＳ−ＭＡＸ増加はそ
れがワクチン投与前の血清に関して得られた値よりも少
なくとも４倍高い場合に、統計上有意と考えられる。 第７図から観察し得るように、最初の接種の４週間後に
採取された未希釈血清は４０５ｎｍで吸光度値（ＡＢＳ
−ＭＡＸ． １回投与）を示し、この値は免疫化前に
測定された値よりも３２〜４０倍高い。第二の接種から
２週間後に採取された血清に関して、更に５０％の増加
が観察される（ＡＢＳ−ＭＡＸ、２回投与）． ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ免疫化後に観察される抗体力価
の増加はＣＨＯ試験で測定される中和活性と相関関係が
ある。事実、３，１０．２５及び５０μｇのＰＴＦ−９
Ｋ／１２９Ｇの１回の注射後に得られた血清は１２０！
）ｇＰＴにより誘起されるＣ）１０細胞に対する凝集効
果を中和でき、夫々１／２０． １／２０， ｌ／２０
及びｌ／８０の希釈である。毒素を中和する能力は第二
の免疫化後に、かなり増大する．事実、３μｇのＰＴＦ
−９Ｋ／１２９Ｇにより免疫化された動物．から得られ
た抗体は１／１，２８０の希釈で毒素活性を中和できる
（ｍ７図を参照のこと）。 体重約１６ｇの３〜４週の１６ｃＤｌ （チャールズ
・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ） 、カル：Ｉ
（Ｃａｌｃｏ）．イタリア）雄のマウスの群をＯＭＳ
規準に従って、０． ２４， １、 ２０， １．９２
， ４． ８０， １２． ００及び３０． ００μｇ
の液体（非吸着） ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ並びにＡＪ２
（ＯＨ） ｓ （ｌｍｇ／ｍｊ２）に吸着された０．
０３５％のホルムアルデヒドで安定化された０． ２
４， １． ２０， ６． ００及び３０． ００μｇ
の同変異体（ ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ ）を含む０．
５＋＋Ｉ！２の無菌食塩水で腹腔内接種する．陽性の対
照として、マウスの群を０． ０００３２， ０． ０
０１， ０． ００８及び０．０４ ｍｊ２の通常の抗
百日咳細胞ワクチン【ナショナル・インスティテユート
・オブ・ヘルス（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ ｌ｛ｅａｌｔｈｌ、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ）、ＭＤ）で腹腔内接種する．投与１４日後、マウス
を平均致死量の３００倍を含む病原性百日咳菌（菌株ｌ
●３２３；ＳＣＬＡＶＯ Ｓ．ｐ．Ａ． ）の懸濁液で
大脳内（ＩＣ）感染させる．ついで、マウスを制御下に
１４日間保った。 結果を表■に示す。 表■ ０．００４ ｏ．ｏｏｇ Ｏ．００１０ ０．０００３２ １６／１６ ３０ １４／１６
１６／１６１３７１８ １２ Ｎ
．Ｄ．ｅ １６／１６９／１６ ６
１４／１６ Ｎ．０．１／１６
４．８０ Ｎ．Ｄ． １２／１６１．
９２ Ｎ．０． １０／１６１．２０
８／１６ ７／１６０．２４
２／１６ ３／１６ｐＤｓ。（ｄ） １．
２ １．１ａ） ワクチンは８つの保護国際単
位／ｏｌ２．を含むｂ）値は試験゛された合計１６匹の
マウスに対する生存マウスの数として表わされる． ｃ） Ｎ．Ｄ．：測定されず． ｄ）病原性百日咳菌１８３２３による大脳内感染から５
０％のマウスを保護するｔ９薬量． 表から観察されるように、ＡＩＯＨ）．に吸着されたＰ
ＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇは１．２μｇ／マウス（ＰＤ．。 ）の投薬量で５０％のマウスに麻痺または死亡からの保
護を誘起する。 ホルムアルデヒドで処理されない液体ＰＴ−９Ｋ／１２
９Ｇにより、一層良好な結果が得られる。 事実、毎回ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇを免疫原として使用し
て、ＩＣ抗原投与直後に１００％の保護に達する。しか
しながら、ＰＤＩ。（１．１μｇ／マウス）は有意に変
化しない． 実施例１１ この研究の目的はボランティア集団に於いて、活性成分
としてＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇを含む無細胞抗百日咳ワ
クチンの寛容性及び免疫原性（特異的な中和抗体を誘導
する能力）を評価することである．この目的のため、２
０ＥＬＩＳＡ単位（Ｅｌ） ／ｙａ Ａより低い抗ＰＴ
抗体力′価を有する２９人の成人、即ち男女の健康な個
人を選んだ。患者をそれらの病歴（百日咳に関して未知
／陰性、疾患に関して陽性、ワクチン化に関して陽性）
に応じて、分ける。 各群の中で随時選択した後、患者を以下のように連続に
処置する。 １） ＰＴＦ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株を含む抗百日咳
無細胞ワクチン（１８人のボランティア）。 夫々の０．５ｍｊ２の投薬量は１５μｇのＰＴＦ−９Ｋ
／１２９Ｇ （活性成分） 、０．００１ｍｇのナトリ
ウムエチル水銀チオサリチレート及び０．５ｍｇの水酸
化アルミニウム（賦形剤）を含む。 あるいは、 ２） ワクチンに関して未分化（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｔｅｄ）の特性の水酸化ナトリウムからなる偽薬
（１１人のボランティア）．随時選択に基づいて、各患
者は２回の投与の間に６週間の間隔で、左三角筋の部位
で、２回投与の抗百日咳ワクチンまたは２回投与の偽薬
を筋肉内投与される．患者を試験の開始後３ケ月間、制
御下に保ち、局所及び／＊たけ全身の副作用の全てを調
べる．全血漿及び／またはγヒトグロプリンの投与が実
験の開始前３ケ月以降及びその全期間中に避けられる。 同じ期間中に、またコルチゾン化合物及び／または抗高
血圧症薬の投与が避けられる。 患者をワクチン投与後３０分間、厳しい観察下に置く。 毎日、ワクチン投与に続く５日間にわたって、アセラー
（ａｓｃｅｌｌａｒ）測定による体温の値を調べ、投与
部位及びサテライト・スーパーフィシャル・リンパグラ
ンジュラー・ステーション（Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｕ
ｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｌｙｍｐｈｏｇｌａｎｄｕｌａｒ
ｓｔａｔｉｏｎ）の検査及び触診を行なう．抗百日咳ワ
クチン投与の４日後に、血液学的試験、血液化学試験、
免疫学的試験（ＣＤ３， ＣＤ４， ＣＩｌ１９，ＣＤ
２５， ＣＤ２３，ＣＤ１４及びＣＤ５７としてリンパ
系細胞の活性化マーカー； ＰＴ，ＦＴ−９Ｋ／１２９
Ｇ及び破傷風トキソイド抗原に関する試験管内増殖｝を
行なう目的で静脈末梢血の試料を採取する． ワクチン投与の３０日後に、抗体滴定の他に、細胞蝿介
免疫評価及びＩｌｌ滴定がまた行なわれる． ２回目のワクチンまたは偽薬の投与後に、上記の方法に
従って、同じ分析が行なわれる．１回目及び２回目のワ
クチン投与の後に副作用が現われないことはＰＴＦ−９
Ｋ／１２９Ｇ変異体に対して完全に耐性であることを示
す。 各ボランティアに関して、抗百日咳抗体力価（ＥＬＩＳ
Ａ分折）及び中和力価（Ｃ｝１０細胞）が測定される。 結果を表頽に示す。 表 Ｘ■ 抗体抗ＰＴ力価は 標準参照血清［ＵＳ Ｒｅｆｅｒ−
ｅｎｃｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ａｎｔｉ
ｓｅｒｕｍ．ロット番号３．ＦＤＡ、ベセスダ、米国、
Ｊ．メンクラーク（ＭｅｎｃｌａｒｋＪ博士から供給さ
れた］の幾何平均として表わされ、一方、中和力価はＣ
ＭＯ細胞に対する天然毒素の凝集効果を抑制し得る最大
血清希釈として表わされる。（ ）内の値はスチューデ
ント”ｔ”検定で測定された９５％の信頼限界を表わす
．先の表に、ワクチン及び偽薬の投与の前及び後に測定
された抗体力価及び中和力価の増加率（後／前）が示さ
れる。
第１図はボルデテラ菌株染色体から百日咳毒素遺伝子を
除去し、突然変異毒素を暗号化する遺伝子またはカナマ
イシンで置換するために使用される方法の略図である． 第２図は縦軸に、百日咳菌Ｗ２１１／ＰＴｌ２９Ｇ（Ｘ
） ．気管支敗血症菌７３６５／Ｐ丁−１２９Ｇ（ ）
及びバラ百日咳藺Ｐ１４／Ｐ丁−１２９Ｇ（１））の菌
株の培養により得られ６ ＰＴ−１２９Ｇの光学密度（
０． Ｄ． ）及び生産を示し、横軸に時間を示す。 第３図はＰＴ野生型（＾）毒素及びに精製変異株ＰＴ−
９Ｋ（Ｂ），ＰＴ−１２９Ｇ（Ｃ），ＰＴ−２６Ｉ／１
２９Ｇ（Ｄ），ＰＴ−１３Ｌ／１２９Ｇ（Ｅ） ，ＰＴ
−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｆ）のポリアクリルアミド１５％ゲ
ルを示す。 第４図は横軸にＰＴ及びＰＴ変異株の投薬量（μｍ／マ
ウスで表わされる）を示し、縦軸に白血球の数（ＸｌＯ
’ｍｊ２）を示す。 第５図は野生型ＰＴ． （レーン１．４ ） ． ＰＴ
−９Ｋ／１２９Ｇ非安定化変異株（レーン２．５）、ホ
ルムアルデヒドで同定化された同変異株（ＰＴＦ−９Ｋ
／１２９Ｇ） Ｃレーン３及び６）のＯ日目（レーン
ｌ，２．３）及び３７℃で１ケ月後（レーン４，５．６
）の電気泳動バクーンを示す． 第６図は野生型ＰＴ及びＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株に
対するＰＢＩＪＣ分裂促進応答を示す．この試験に使用
されたＰＢＭＣは、熱失活ＰＴに対して著しい抗原特異
的応？！Ｉを示さない．ｍ＊ａ！Ｉは１５％未満であっ
た． 第７図はＰＴまたは異なる投薬量のＡＩＯＨ）．に吸着
されたＰＴＦ−９Ｋ／ｌＺ９Ｇの１回もしくは２回の皮
下注射後にモルモット中に得られる抗体の抗体力価（Ｅ
ＬＩＳＡ分析）及び中和能力を示す。抗体の抗毒素レベ
ルは、未希釈血清の最大吸光度（ＡＢＳ一ＭＡＸ）の値
として表わされる。中和力価（ＮＴ）は、３回分析され
た、１２０ｐｇ ＰＴにより誘導されたＣＯＨ細胞に関
する凝集効果の１００％の抑制を誘導し得る最高血清希
釈の回帰として表わされる。 第８図は異なる濃度（％）のホルムアルデヒド（０．０
３５， ０．０４２， ０．０５２， ０．０７０，
０．１０５， ０．１４０，０． ２１０及び０． ４
２０％）で処理されたＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ試験体のポ
リアクリルアミドＳＤＳゲルによる電気泳動を示す．
除去し、突然変異毒素を暗号化する遺伝子またはカナマ
イシンで置換するために使用される方法の略図である． 第２図は縦軸に、百日咳菌Ｗ２１１／ＰＴｌ２９Ｇ（Ｘ
） ．気管支敗血症菌７３６５／Ｐ丁−１２９Ｇ（ ）
及びバラ百日咳藺Ｐ１４／Ｐ丁−１２９Ｇ（１））の菌
株の培養により得られ６ ＰＴ−１２９Ｇの光学密度（
０． Ｄ． ）及び生産を示し、横軸に時間を示す。 第３図はＰＴ野生型（＾）毒素及びに精製変異株ＰＴ−
９Ｋ（Ｂ），ＰＴ−１２９Ｇ（Ｃ），ＰＴ−２６Ｉ／１
２９Ｇ（Ｄ），ＰＴ−１３Ｌ／１２９Ｇ（Ｅ） ，ＰＴ
−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｆ）のポリアクリルアミド１５％ゲ
ルを示す。 第４図は横軸にＰＴ及びＰＴ変異株の投薬量（μｍ／マ
ウスで表わされる）を示し、縦軸に白血球の数（ＸｌＯ
’ｍｊ２）を示す。 第５図は野生型ＰＴ． （レーン１．４ ） ． ＰＴ
−９Ｋ／１２９Ｇ非安定化変異株（レーン２．５）、ホ
ルムアルデヒドで同定化された同変異株（ＰＴＦ−９Ｋ
／１２９Ｇ） Ｃレーン３及び６）のＯ日目（レーン
ｌ，２．３）及び３７℃で１ケ月後（レーン４，５．６
）の電気泳動バクーンを示す． 第６図は野生型ＰＴ及びＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ変異株に
対するＰＢＩＪＣ分裂促進応答を示す．この試験に使用
されたＰＢＭＣは、熱失活ＰＴに対して著しい抗原特異
的応？！Ｉを示さない．ｍ＊ａ！Ｉは１５％未満であっ
た． 第７図はＰＴまたは異なる投薬量のＡＩＯＨ）．に吸着
されたＰＴＦ−９Ｋ／ｌＺ９Ｇの１回もしくは２回の皮
下注射後にモルモット中に得られる抗体の抗体力価（Ｅ
ＬＩＳＡ分析）及び中和能力を示す。抗体の抗毒素レベ
ルは、未希釈血清の最大吸光度（ＡＢＳ一ＭＡＸ）の値
として表わされる。中和力価（ＮＴ）は、３回分析され
た、１２０ｐｇ ＰＴにより誘導されたＣＯＨ細胞に関
する凝集効果の１００％の抑制を誘導し得る最高血清希
釈の回帰として表わされる。 第８図は異なる濃度（％）のホルムアルデヒド（０．０
３５， ０．０４２， ０．０５２， ０．０７０，
０．１０５， ０．１４０，０． ２１０及び０． ４
２０％）で処理されたＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ試験体のポ
リアクリルアミドＳＤＳゲルによる電気泳動を示す．
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、サブユニットの１アミノ酸配列のアミノ酸残基Ｇｌ
ｕ１２９、Ａｓｐ１１、Ｔｒｐ２６、Ａｒｇ９、Ｐｈｅ
５０、Ａｓｐ１、Ａｒｇ１３、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｙ８
６、Ｉｌｅ８８、Ｔｙｒ８９、Ｔｙｒ８、Ｇｌｙ４４、
Ｔｈｒ５３及びＧｌｙ８０の少なくとも一つが天然アミ
ノ酸の群から選ばれた異なるアミノ酸により欠失及び置
換されることを特徴とする、減少された毒性を有するか
、または毒性をもたない免疫活性百日咳毒素変異株。 ２、アミノ酸残基Ｇｌｕ１２９とアミノ酸残基Ａｒｇ９
、Ａｓｐ１１、Ａｓｐ１３及びＴｒｐ２６の少なくとも
一つとが、天然アミノ酸の群から選ばれた異なるアミノ
酸残基により欠失及び置換されることを特徴とする、請
求項１記載の百日咳毒素変異株。 ３、サブユニットの１アミノ酸配列のアミノ酸残基Ｇｌ
ｕ１２９、Ａｓｐ１１、Ｔｒｐ２６、Ａｒｇ９、Ｐｈｅ
５０、Ａｓｐ１、Ａｒｇ１３、Ｔｙｒ１３０、Ｇｌｙ８
６、Ｉｌｅ８８、Ｔｙｒ８９、Ｔｙｒ８、Ｇｅｙ４４、
Ｔｈｒ５３及びＧｌｙ８０の少なくとも一つが、表IIに
示されたアミノ酸残基により置換されることを特徴とす
る、請求項１記載の百日咳毒素変異株。 ４、アミノ酸残基Ｇｌｕ１２９及びＡｒｇ９がアミノ酸
残基Ｇｌｙ及びＬｙｓにより夫々置換されることを特徴
とする、請求項１記載のＰＴ−９Ｋ百日咳毒素変異株。 ５、アミノ酸残基Ｇｌｕ１２９及びＴｒｐ２６がアミノ
酸残基Ｇｌｙ及びＩｌｅにより夫々置換されることを特
徴とする、請求項１記載のＰＴ−２６Ｉ／１２９Ｇ百日
咳毒素変異株。 ６、アミノ酸残基Ｇｌｕ１２９、Ａｒｇ１３及びＴｒｐ
２６がアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｌｅｕ及びＩｌｅにより夫
々置換されることを特徴とする、請求項１記載のＰＴ−
１３Ｌ／２６Ｉ／１２９Ｇ百日咳毒素変異株。 ７、アミノ酸残基Ｇｌｕ１２９及びＡｒｇ１３がアミノ
酸残基Ｇｌｙ及びＩ１ｅにより夫々置換されることを特
徴とする、請求項１記載のＰＴ−１３Ｌ／１２９Ｇ百日
咳毒素変異株。 ８、アミノ酸残基Ｉｌｅ８８及びＴｙｒ８９がアミノ酸
残基Ｇｌｕ及びＳｅｒにより夫々置換されることを特徴
とする、請求項１記載のＰＴ−８８Ｅ／８９Ｓ百日咳毒
素変異株。９、アミノ酸残基Ｉｌｅ８８、Ｔｙｒ８９及
びＧｌｕ１２９がアミノ酸残基Ｇｌｕ、Ｓｅｒ及びＧｌ
ｙにより夫々置換されることを特徴とする、請求項１記
載のＰＴ−８８Ｅ／８９Ｇ／１２９Ｇ百日咳毒素変異株
。 １０、０．０３５％〜０．４２０％の重量／容量％の量
のホルムアルデヒドによる処理により得られる、減少さ
れた分裂促進性もしくは血球凝集活性を有するか、また
はそれらの活性をもたないことを特徴とする、請求項１
〜９の夫々に記載の百日咳毒素変異株。 １１、０．０３５％〜０．４２０％の重量／容量％の量
のホルムアルデヒドによる処理により得られる、３７℃
に等しいか、またはほぼ等しい温度に於ける安定性を特
徴とする、請求項１〜９の夫々に記載の百日咳毒素変異
株。 １２、ホルムアルデヒドの量が０．０３５％である、請
求項１１記載の百日咳毒素変異株。 １３、ボルデテラ菌株であって、 それらがそれらの染色体中に野生型百日咳毒素及びその
形質発現を暗号化する遺伝子及び分泌調節配列を含み、
上記遺伝子のＳ１サブユニットのヌクレオチドが請求項
１〜９の夫々に記載の減少された毒性を有するか、また
は毒性をもたない百日咳毒素変異株を暗号化するように
突然変異誘発されることを特徴とする、ボルデテラ菌株
。 １４、百日咳毒素染色体遺伝子が突然変異９Ｋ／１２９
Ｇ、１３Ｌ／１２９Ｇ、２６Ｉ／１２９Ｇ、１３Ｌ／２
６Ｉ／１２９Ｇまたは８８Ｅ／８９Ｓ／１２９Ｇの少な
くとも一つを含む、請求項１３記載のボルデテラ菌株。 １５、ボルデテラが百日咳菌、パラ百日咳菌または気管
支敗血症菌である、請求項１３記載のボルデテラ菌株。 １６、百日咳菌（Ｗ２８）ＰＴ−９Ｋ／１２９ＧＡＴＣ
Ｃ５３８９４。 １７、パラ百日咳菌ＰＴ−１２９ＧＡＴＣＣ５３８９２
。 １８、パラ百日咳菌ＰＴ−２６Ｉ／１２９ＧＡＴＣＣ５
３８９３。 １９、百日咳毒素を暗号化する染色体遺伝子が欠失され
ることを特徴とする、ボルデテラ菌株。 ２０、ａ）少なくとも一種の抗生物質に耐性な野生型ボ
ルデテラ菌株を選択し、 ｂ）（ａ）で得られた菌株中の相同組換えにより、百日
咳毒素を暗号化する染色体遺伝子を異なるタンパク質を
暗号化する遺伝子で置換し、 ｃ）（ｂ）で得られたＰＴ（Δｔｏｘ）遺伝子を含まな
いボルデテラ菌株を選択し、 ｄ）百日咳菌から単離された百日咳毒素遺伝子を突然変
異誘発し、 ｅ）ボルデテラを複製し得ない適当に変性されたプラス
ミド中で上記の突然変異遺伝子を挿入し ｆ）（ｃ）で選択されたボルデテラ菌株 （Δｔｏｘ）中で上記のプラスミドを挿入し、ついで最
後に ｇ）突然変異百口咳毒素遺伝子による相同組換えが行な
われたボルデテラ菌株を単離することを含む方法により
得られる、請求項１３〜１９記載のボルデテラ菌株。 ２１、段階ｄ）に於いて、百日咳毒素遺伝子がプラスミ
ドＰＴ−１０１ＡＴＣＣ６７８５４から単離される、請
求項２０記載のボルデテラ菌株。 ２２、種百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支敗血症菌
の中から選択される、請求項２０記載のボルデテラ菌株
。 ２３、炭素源、窒素源及び無機塩の存在化で液体培地中
で、請求項１３〜１８記載のボルデテラ菌株を培養し、
こうして得られた百日咳毒素変異株の培地から単離し、
精製することを含む方法により得られる、請求項１〜９
の夫々に記載の百日咳毒素変異株。 ２４、病原性の百日咳菌によりひき起こされる感染に対
して有効な保護免疫を人に与え得る抗百日咳菌無細胞ワ
クチンの調整のための活性成分として、請求項１〜１２
記載の百日咳菌変異株の使用。 ２５、病原性の百日咳菌によりひき起こされる感染に対
して有効な保護免疫を人に与え得る細胞抗百日咳菌ワク
チンの調整のための活性成分として、請求項１３〜１９
の夫々に記載のボルデテラ菌株の使用。 ２６、免疫学的に有効量の請求項１〜１２の夫々に記載
の百日咳毒素変異株を含む、病原性の百日咳菌によりひ
き起こされる感染に対して保護免疫を人に誘導し得る無
細胞抗百日咳菌ワクチンとして好適な免疫原性製剤。 ２７、免疫学的に有効量の請求項１３〜１９記載のボル
デテラ菌株を含む、百日咳菌によりひき起こされる感染
に対して保護免疫を人に誘導し得る、細胞抗百日咳菌ワ
クチンとして好適な免疫原性製剤。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT8920341A IT1230139B (it) | 1989-04-28 | 1989-04-28 | Ceppi di bordetella utili come vaccini antipertosse |
| IT19286A/90 | 1990-02-07 | ||
| IT01928690A IT1238007B (it) | 1990-02-07 | 1990-02-07 | Mutanti della tossina della pertosse, ceppi di bordetella capaci di produrre detti mutanti e loro impiego per lo sviluppo di vaccini antipertosse |
| IT20341A/89 | 1990-02-07 |
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