DE3853876T2

DE3853876T2 - Bordetella pertussis-Toxin mit veränderter Toxizität.

Info

Publication number: DE3853876T2
Application number: DE3853876T
Authority: DE
Inventors: Antonella Bartoloni; Mariagrazia Pizza; Rino Rappuoli
Original assignee: Sclavo SpA
Current assignee: Sclavo SpA
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1988-10-25
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2008-10-26
Also published as: ATE123062T1; JPH09157293A; IT1223334B; JP2857105B2; JP2728275B2; JPH01165370A; ES2072857T3; DE3853876D1; HK192995A; IT8722481A0; CA1341582C; EP0322533A1; EP0322533B1; US7410646B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immunologisch aktive Polypeptide mit keiner oder verminderter Toxizität, die für die Herstellung eines Antipertussis-Impfstoffes verwendbar sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide und einen Antipertussis-Impfstoff, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der Polypeptide.
Pertussis ist eine Erkrankung des Atmungssystems, die durch Bordetella pertussis (B. pertussis) verursacht wird, einem Bacillus, dessen Übertragung während der Katarrh- und Krampfphase der Erkrankung von einer kranken Person auf ein gesundheitlich prädisponiertes Individuum über das Atmungssystem erfolgt.
Ein Impfstoff, der gegen diese Krankheit wirksam ist, ist besonders wünschenswert, da Pertussis Krämpfe, Gehirnschädigungen und manchmal den Tod verursachen kann, hauptsächlich bei kleinen Kindern und Neugeborenen, denen mütterliche Antipertussis-Antikörper fehlen.
Derzeit wird ein Antipertussis-Impfstoff verwendet, der virulente Bakterien umfaßt, die mit Merthiolat abgetötet und bei 56ºC behandelt wurden. Dieser ist, auch wenn er permanenten Schutz verleiht, nicht vollständig zufriedenstellend, entweder aufgrund des Vorhandenseins von unerwünschten Nebenwirkungen oder wegen zahlreicher Probleme, die sich aus seiner Herstellung und Reinigung ergeben.
Das führt zu einem Bedarf an Antipertussis-Impfstoff, der keinen der vorstehend erwähnten Nachteile aufweist.
Es ist bekannt, daß B. pertussis per se keine Virulenz aufweist und daß seine Toxizität während der virulenten Phase mit der Synthese solcher Substanzen wie: Hämolysin (Hls), Adenylcyclase (Adc), dermonekrotisches Toxin (Dnc), filamentöses Hämagglutinin (Fha) und Pertussis-Toxin (PT) korreliert. Das letztere repräsentiert insbesondere nicht nur den durch B. pertussis produzierten Hauptvirulenzfaktor (Weiss A. et al., Infect. Immun. 42 (1983), 333-341; Weiss A. et al., J. Inf. Dis. 150 (1984), 219-222), sondern auch eines der Hauptschutzantigene gegen Infektionen, die durch dieses Bakterium verursacht werden.
Anti-PT-Antikörper wurden in Individuen gefunden, die mit dem zellulären Impfstoff immunisiert worden waren (Ashworth L.A.E. et al., Lancet. Oct. (1983), 878-881), und in Mäusen, die über ein Aerosol oder intracerebral unter Verwendung von Formaldehyd-entgiftetem PT infiziert worden waren, wurde eine Schutzimmunität gezeigt (Sato Y. et al., Inf. and Imm. 41 (1983), 313). Auch wenn PT ein wesentlicher Bestandteil bei der Herstellung neuer Antipertussis-Impfstoffe ist, wird seine Anwendung durch zahlreiche Nachteile begrenzt, die sich aus seiner Toxizität ergeben.
PT induziert unerwünschte pathophysiologische Wirkungen, wie Lymphocytose, Histaminempfindlichkeit, Hypoglykämie, Unempfindlichkeit gegen die hyperglykämische Wirkung von Epinephrin und die Aktivierung der Langerhans-Inseln.
Ferner wurde festgestellt, daß PT in dem jetzt eingesetzten Impfstoff die Hauptursache solcher Nebenwirkungen ist, wie Fieber, Blasen, neurologische Veränderungen und Tod, die in den letzten Jahren zur drastischen Reduzierung der Anwendung des Impfstoffs führte, was neue Ausbrüche von Pertussis- Fällen zur Folge hatte.
Obwohl die PT-Entgiftungsbehandlung durch Formaldehyd ein immunogenes Protein ohne Toxizität bereitstellt (Sato et al., Literaturstelle vorstehend angegeben), weist sie einige Nachteile auf, die sich aus der Tatsache ergeben, daß das Protein nicht in einer reinen, reproduzierbaren und stabilen Form erhältlich ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden jetzt Polypeptide gefunden, die fähig sind, die Nachteile des Stands der Technik zu überwinden, und die durch ein einfaches und ökonomisch durchführbares Verfahren in reiner Form erhältlich sind. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung von immunologisch aktiven Polypeptiden mit keiner oder verminderter Toxizität, die für die Herstellung eines Antipertussis-Impfstoffes verwendbar sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide.
Eine andere erfindungsgemäße Aufgabe ist ein Impfstoff, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der Polypeptide.
Weitere erfindungsgemäße Aufgaben werden beim Lesen der folgenden Beschreibung und der Beispiele deutlich.
PT ist ein Protein, das fünf unterschiedliche Untereinheiten umfaßt; seine Toxizität ist auf die ADP-Ribosylierung von Proteinen zurückzuführen, die GTP binden, das bei der Übertragung von Nachrichten durch eukaryontische Zellmembranen beteiligt ist.
PT umfaßt zwei Domänen mit unterschiedlicher Funktionalität: die A-Domäne umfaßt die S1-Untereinheit und die B-Domäne umfaßt die S2-, S3-, S4- und S5-Untereinheiten, die in zwei Dimeren, D1 (S2 + S4) und D2 (S3 + S4), organisiert sind, die durch eine S5-Untereinheit miteinander verbunden sind.
Die A-Domäne stellt den enzymatisch aktiven und deshalb toxischen Teil von PT dar, während die B-Domäne an eukaryontische Zellmembranrezeptoren bindet und die Einführung der S1- Untereinheit darin erlaubt.
In der gleichzeitig anhängigen Europäischen Patentanmeldung EP-A-0232229 wurde das Clonieren, Sequenzieren und die Expression der Gene beschrieben und beansprucht, die die Untereinheiten codieren, und es wurde gezeigt, daß die Gene in einem einzigen Operon angeordnet sind.
Ferner wurde die ADP-Ribosylierungsaktivität der S1-Untereinheit durch Züchtung eines mit dem Plasmid PTE 225 transformierten Mikroorganismus nachgewiesen, und es wurde festgestellt, daß die Untereinheit eine mit PT vergleichbare enzymatische Aktivität besitzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Protein mit den Immun- und Schutzeigenschaften des PT-Toxins bereitgestellt, aber mit keiner oder verminderter Toxizität. Die Positionen und die Art der wesentlichen Aminosäuren für die enzymatische Aktivität des Proteins wurden identifiziert. Insbesondere wurden die folgenden Positionen und Aminosäuren gefunden:
Tyrosin (8), Arginin (9), Phenylalanin (50), Threonin (53), Glutaminsäure (129) Glycin (121), Alanin (124), Asparaginsäure (109), Glycin (99), Arginin (135), Threonin (159) und Tyrosin (111).
Die Substitution einer oder mehrerer dieser Aminosäuren durch eine unterschiedliche Aminosäure stellt ein Protein mit veränderter Toxizität bereit.
Erfindungsgemäß wurden Polypeptide synthetisiert, die die S1-Untereinheit von modifiziertem PT enthalten, das durch direkte Mutagenese modifiziert wurde, wobei eine Aminosäure an einer oder mehreren Positionen des S1-Bereichs zwischen den Aminosäuren 1 bis 180 durch eine andere ersetzt wurde, die fähig ist, seine enzymatische Aktivität zu zerstören oder zu reduzieren, ohne dessen immunologische Eigenschaften zu verändern.
Insbesondere wurden Polypeptide synthetisiert, die die S1-Untereinheit von PT enthalten, die durch die folgenden Substitutionen modifiziert wurde:
- Tyrosin in Position 8 und Arginin in Position 9 wurden durch Asparaginsäure bzw. Glycin ersetzt;
- Phenylalanin in Position 50 und Threonin in Position 53 wurden durch Glutaminsäure bzw. Isoleucin ersetzt;
- Glutaminsäure in Position 129 wurde durch Glycin ersetzt;
- Glycin in Position 121 wurde durch Glutaminsäure ersetzt;
- Alanin in Position 124 wurde durch Asparaginsäure ersetzt
- Asparaginsäure in Position 109 und Alanin in Position 124 wurden durch Glycin bzw. Asparaginsäure ersetzt;
- Glycin in Position 99 wurde durch Glutaminsäure ersetzt;
- Asparaginsäure in Position 109 wurde durch Glycin ersetzt;
- Arginin in Position 135 wurde durch Glutaminsäure ersetzt;
- Threonin in Position 159 wurde durch Lysin ersetzt; und
- Tyrosin in Position 111 wurde,durch Glycin ersetzt und die Aminosäuren Asp Thr Gly und Gly in Position 113 inseriert.
Insbesondere wurden die erfindungsgemäßen Polypeptide durch ein Verfahren hergestellt, umfassend:
a) Modifizierung des die S1-Untereinheit des Pertussis-Toxins codierenden Gens durch direkte Mutagenese durch Ersetzen der Basensequenz, die eine vorherbestimmte Aminosäure codiert, an einer oder mehreren Stellen des DNA-Moleküls durch eine Basensequenz, die die interessierende Aminosäure codiert;
b) Konstruktion eines Hybridplasmids durch Verknüpfung eines Clonierungsvektors mit dem DNA-Fragment, das die modifizierte S1-Untereinheit enthält;
c) Transformation eines Wirtsmikroorganismus mit einem gemäß (b) erhaltenen Hybridplasmid;
d) Züchtung eines transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium in Gegenwart einer Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralsalz-Quelle und, schließlich
e) Gewinnung des Polypeptids, das die modifizierte S1-Untereinheit enthält, aus dem Kulturmedium oder aus den Zellen.
Um den S1-Aminosäurebereich zu identifizieren, der mit der enzymatischen Aktivität des Proteins korreliert ist, wurde erfindungsgemäß das Gen, das S1 codiert, mit Restriktionsenzymen behandelt, die an unterschiedlichen Stellen spalten, und die so erhaltenen DNA-Fragmente, denen terminale 3'- oder 5'-Sequenzen von unterschiedlicher Länge fehlen, wurden gemäß allgemein bekannter Techniken in einem Expressionsplasmid cloniert. Die Vektoren, die die DNA-Fragmente mit den deletierten Sequenzen enthalten, wurden dann zur Transformation von Escherichia coli (E. coli)-Zellen verwendet.
Positive Transformanten, die durch Screening der Zellen auf einem Selektionsmedium erhalten wurden, wurden in einem geeigneten Kulturmedium bei Temperaturen zwischen 30ºC und 40ºC für einen Zeitraum von 20 Minuten bis 5 Stunden gezüchtet.
Am Ende dieses Zeitraums wurden die Zellen aus dem Kulturmedium gewonnen und durch eine Lysozymbehandlung und Beschallung lysiert.
Die so extrahierten Proteine wurden analysiert, um eine enzymatische Aktivität zu bestimmen.
Die ADP-Ribosylierungsaktivität der Proteine wurde gemäß dem von Manning et al. (J. Biol. Chem. 259 (1984), 749- 759) beschriebenen Verfahren getestet.
Die erhaltenen und in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß S1-Sequenzen, die sich der Aminosäure in Position 179 anschließen, im Gegensatz zu den ersten zehn Aminosäuren nicht für die ADP-Ribosylierungsaktivität notwendig sind.
Der enzymatisch aktive Bereich der S1-Untereinheit befindet sich deshalb zwischen den Aminosäuren 1 und 180. Die Identifizierung der in diesem Bereich vorliegenden aktiven Stellen wurde erfindungsgemäß ausgeführt und mindestens eine dieser Stellen wurde modifiziert.
Das S1-codierende Gen wurde aus dem PTE 255-Plasmid durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII isoliert, über dessen Konstruktion in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0232229 berichtet wird.
Ein 600 Basenpaar großes DNA-Fragment, welches das S1- codierende Gen umfaßt, wurde aus dem Spaltgemisch durch Gelelektrophorese abgetrennt und nach Elektroelution durch direkte Mutagenese modifiziert, die in vi< tro-Mutationen an bestimmten Stellen des DNA-Moleküls erzeugt. Dies erlaubt es, die Wirkung der Mutation in vitro oder in vivo zu testen.
Der Ersatz der gewünschten Base wird auf eine der folgenden Weisen erreicht:
- durch Einbau von Basenanalogen in DNA-Stellen;
- durch falschen Einbau von Nucleotiden;
- durch Einführung einer Mutation während der in vitro-Synthese von Oligonucleotiden mit definierten Sequenzen; oder
- durch Anwendung von spezifischen chemischen mutagenen Mitteln, wie Natriumbisulphit, die mit den DNA-Basen reagieren.
Erfindungsgemäß wurde das S1-codierende Gen unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden mit definierten Sequenzen gemäß dem von Zoller M.J. et al. (DNA 3 (1984), 479- 488) beschriebenen Verfahren modifiziert.
Das 600 bp große DNA-Fragment wurde in einen Vektor cloniert, der die Isolierung einzelsträngiger DNA erlaubt.
Danach können geeignete Vektoren ausgewählt werden aus Bluescript SK (Stratagene, San Diego, CA), pEMBL (Dente et al., Nucleic Acids Research 11 (1983), 1645-1655) oder M13- Phagen (Viera und Messing, Gene 19 (1982), 263).
Erfindungsgemäß wurde der im Handel erhältliche Bluescript SK-Vektor verwendet.
Der Vektor wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen behandelt und dann mit dem 600 bp großen DNA-Fragment in einem Ligasegemisch in Gegenwart des T4-DNA-Ligaseenzyms ligiert.
Das Gemisch wurde dann zur Transformation von E. coli- Zellen verwendet und die Transformanten wurden auf einem Kulturmedium, das Ampicillin einschließt, nacheinander selektiert.
Die positiven Clone, die Hybridplasmide enthalten, welche den Vektor und das 600 bp große DNA-Fragment umfassen, wurden in einem Flüssigmedium in Gegenwart von Phagen suspendiert und bei einer Temperatur von 30ºC bis 40ºC für einen Zeitraum von 2 bis 10 Stunden gehalten.
Am Ende dieses Zeitraums wurden die Phagen ausgefällt, aus der Lösung durch Zentrifugation abgetrennt, in einem Puffer mit pH 7,5 resuspendiert, mit Wasser-Ethylether-gesättigtem Phenol extrahiert und dann mit Ethanol und Ammoniumacetat extrahiert, um die einzelsträngige DNA zu präzipitieren.
Aliquots der DNA wurden zur Modifikation des S1-Gens durch direkte Mutagenese verwendet. Danach wurden Oligonucleotide von etwa 20 Nucleotiden synthetisiert, in denen die Basen, die eine oder mehrere Aminosäuren codieren, die an den bestimmten Stellen des 1-180-S1-Bereichs vorliegen, durch andere Basen ersetzt wurden, die eine andere Aminosäure codieren. Insbesondere wurden Oligonucleotide synthetisiert, die die Herstellung der folgenden Mutanten des S1-codierenden Gens erlauben:
41: Tyrosin 8 und Arginin 9 wurden unter Verwendung des Primers GTCATAGCCGTCTACGGT durch Asparaginsäure bzw. Glycin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
620-CGCCACCGTATACCGCTATGACTCCCGCCCG-650
620-CGCCACCGTAGACGGCTATGACTCCCGCCCG-650
22: Phenyalanin 50 und Threonin 53 wurden unter Verwendung des Primers TGGAGACGTCAGCGCTGT durch Glutaminsäure bzw. Isoleucin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 750-AGCGCTTTCGTCTCCACCAGC-770 wurde in 750-AGCGCTGACGTCTCCATCAGC-770 geändert.
25: Glycin 99 wurde unter Verwendung des Primers CTGGCGGCTTCGTAGAAA durch Glutaminsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 910-TACGGCGCCGC-920 wurde in 910-TACGAAGCCGC-920 geändert.
17: Asparaginsäure 109 wurde unter Verwendung des Primers CTGGTAGGTGTCCAGCGCGCC durch Glycin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 930-GTCGACACTTA-940 wurde in 930-GTCGGCACTTA-940 geändert.
27: Glycin 121 wurde unter Verwendung des Primers GCCAGCGCTTCGGCGAGG durch Glutaminsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 956-GCCGGCGCGCT-966 wurde in 956-GCCGAAGCGCT-966 geändert.
16: Alanin 124 wurde unter Verwendung des Primers GCCATAAGTGCCGACGTATTC durch Asparaginsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 976-TGGCCACCTAC-984 wurde in 976-TGGACACCTAC-986 geändert.
1716: enthält die kombinierten Mutationen 16 und 17.
28: Glutaminsäure 129 wurde unter Verwendung des Primers GCCAGATACCCGCTCTGG durch Glycin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 990-AGCGAATATCT-1000 wurde in 990-AGCGGGTATCT-1000 geändert.
29: Arginin 135 wurde unter Verwendung des Primers GCGGAATGTCCCGGTGTG durch Glutaminsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 1010-GCGCATTCCGC-1020 wurde in 1010-GGACATTCCGC-1020 geändert.
31: Threonin 159 wurde unter Verwendung des Primers TACTCCGTTTTCGTGGTC durch Lysin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
1070-GCATCACCGGCGAGACCACGACCACGGAGTA-1090 wurde in 1070-GCATCACCGGCGAGACCACGAAAACGGAGTA-1090 geändert.
26: Tyrosin 111 wurde durch Glycin ersetzt.
Ferner ereignete sich wegen einer partiellen DuPlikation eines Primerfragments die Insertion der Aminosäuren Asp Thr Gly und Gly in Position 113 unter Verwendung des Primers CGCCACCAGTGTCGACGTATTCGA. Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
930-GTCGACACTTATGGCGACAAT-950
930-GTCGACACTGGTGGCGACACTGGTGGCGACAAT-950.
Die Oligonucleotide wurden als Primer für die DNA-Polymerase verwendet, die alle Nucleotidsequenzen des Vektors transkribiert, die die im Primer vorliegenden Mutationen eingebaut haben.
Die Vektoren, die das S1-Gen mit den gewünschten Modifikationen enthalten, wurden unter Verwendung des Primers selbst als Sonde durch Hybridisierung isoliert.
Die genauen Nucleotidsequenzen der modifizierten Gene wurden dann mit der Technik von Sanger F. et al. bestätigt (P.N.A.S. 74 (1977), 5463).
Vektoren, die die modifizierten Gene enthalten, wurden dann mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten und die DNA-Fragmente, die das Gen enthalten, welches das modifizierte S1 codiert, wurden in einem Expressionsplasmid cloniert, das aus jenen ausgewählt wurde, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Die Hybridplasmide wurden zur Transformation eines Wirtsorganismus verwendet, ausgewählt aus E. coli, Bacillus subtilis und Hefen.
Insbesondere wurden erfindungsgemäß das Plasmid PEx34 (Center for Molecular Biology, Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland) und der Mikroorganismus E. coli K12-ΔHl-Δtrp (Remant E. et al., Gene in (1981), 81-93) verwendet.
Die transformierten Mikroorganismen wurden dann in einem Flüssigmedium in Gegenwart einer Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralsalz-Quelle bei einer Temperatur zwischen 30ºC und 45ºC für einen Zeitraum von 20 Minuten bis 5 Stunden gezüchtet.
Am Ende dieses Zeitraums wurden die Zellen durch Zentrifugieren aus dem Medium gewonnen und durch Anwendung von allgemein bekannten Techniken lysiert.
Die zellulären Lysate, die die Proteine enthalten, wurden dann analysiert, um die enzymatische Aktivität davon zu bestimmen. Die im folgenden Beispiel 3 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß durch den Ersatz von Aminosäuren in der S1-Sequenz an den Positionen 109 (17) und 124 (16), entweder getrennt oder in Kombination, und der Aminosäure in Position 121 (27) eine gute Verminderung (5-80%) der ADP-Ribosylierungsaktivität und deshalb der Toxizität erhalten wurde.
Ein völliger Verlust der enzymatischen Aktivität der S1-Untereinheit wurde durch den Ersatz der Aminosäuren an den Positionen 8 und 9 (41), 50 und 53 (22) sowie 129 (28) beobachtet.
Ferner sind die Untereinheiten imstande, spezifische Antikörper in vivo zu induzieren und mit monoclonalen Anti-PT- Schutz-Antikörpern zu reagieren (Untereinheit 28).
Polypeptide, die diese modifizierten Untereinheiten enthalten, sind deshalb für die Herstellung eines Antipertussis-Impfstoffes geeignet.
Bevorzugt werden Polypeptide, die zusätzlich zur modifizierten S1-Untereinheit mindestens eine der S2-, S3-, S4- und S5-PT-Untereinheiten enthalten.
Insbesondere bevorzugt werden Polypeptide, welche S2-, S3-, S4- und S5-Untereinheiten mit der gleichen Anordnung und Konfiguration aufweisen, die im Pertussis-Toxin vorliegen.
Die bevorzugten Polypeptide können durch die Modifikation des S1-codierenden Gens, das im PT-Operon enthalten ist, und durch die Konstruktion von Plasmiden hergestellt werden, die das gesamte Operon mit den modifizierten S1-Genen oder Bereichen davon umfassen, die im wesentlichen ein Polypeptid codieren, das die modifizierte S1-Untereinheit und eine oder mehrere der S2-, S3-, S4- und S5-Untereinheiten enthält.
Erfindungsgemäß wurden die Plasmide PTE 255-22, PTE 255-28 und PTE 255-41, die das Gen enthalten, das die S1-modifizierten Untereinheiten 22, 28 bzw. 41 codiert, beim American Type Culture Center als E. coli (PTE 255-22), E. coli (PTE 255-28) und E. coli (PTE 255-41) hinterlegt und erhielten die Bezeichnungen ATCC 67542, ATCC 67543 und ATCC 67544.
Die folgenden experimentellen Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen und nicht begrenzen.

Beispiel 1

Identifizierung des S1-Untereinheitsbereichs. der mit der ADP- Ribosvlierungsaktivität korreliert ist

A. Konstruktion der Hybridplasmide die das Gen enthalten, das die durch Deletion des 3'-terminalen Teils modifizierte S1-Untereinheit codiert

10 ug des PTE 255-Plasmids wurden in 100 ul Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl) suspendiert und bei 37ºC für zwei Stunden mit 30 Einheiten (U) des Restriktionsenzyms XbaI (BRL) gespalten. Dann wurden Aliquots des Spaltgemisches von 10 ul bei 37ºC für zwei weitere Stunden mit 3 U eines der folgenden Enzyme behandelt: NcoI, BalI, NruI, SalI und SphI.
Die so gespaltenen DNA-Gemische, die jeweils das 75 Basenpaar (bp) große XbaI-NcoI-Fragment, das 377 bp große XbaI- BalI-Fragment, das 165 bp große XbaI-NruI-Fragment, das 355 bp große XbaI-SalI-Fragment und das 503 bp große XbaI-SphI-Fragment enthielten, wurden mit 3 U der Klenow-Polymerase und mit 2 ul einer Lösung vereinigt, die je 50 mM der folgenden Desoxynucleotide enthielt: dATP, dTTP, dCTP und dGTP, um die Molekülenden zu reparieren.
Die Gemische wurden 15 Minuten bei Umgebungstemperatur (20-25ºC) und für weitere 30 Minuten bei 65ºC gehalten, um auf diese Weise das Polymeraseenzym zu inaktivieren.
Am Ende dieses Zeitraums werden die Gemische mit Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit) auf 200 ul verdünnt und über Nacht in Gegenwart einer Einheit der T4-DNA-Ligase bei 15ºC gehalten, so daß die DNA-Moleküle, die die vorstehend erwähnten Fragmente verloren haben, wieder miteinander verknüpft wurden. Die Ligasegemische wurden dann zur Transformation von K12-Hl-trp-E. coli-Zellen verwendet, die durch eine Behandlung mit 50 mM CaCl&sub2; präpariert worden waren (Mandel M. und Higa, I. Mol. Biol. 53 (1970), 154).
Die Transformanten wurden selektiert, indem die Zellen auf LB-Agar-Medium (10 g/l Bacto-Trypton (DIFCO), 5 g/l Bacto- Hefeextrakt (DIFCO) und 5 g/l NaCl), das 30 ug/ml Ampicillin enthielt, ausplattiert und die Platten bei 30ºC für 18 Stunden inkubiert wurden. Die rekombinanten Plasmide wurden analysiert, um die genaue Nucleotidsequenz zu überprüfen.
Die folgenden Hybridplasmide wurden identifiziert:
PTE NCO, worin dem S1-Gen ein Teil fehlt, der die Carboxy-terminale Sequenz der S1-Untereinheit zwischen den Aminosäuren 211 und 255 codiert.
PTE NRU, worin dem S1-Gen ein Teil fehlt, der die Carboxy-terminale Sequenz der S1-Untereinheit zwischen den Aminosäuren 180 und 255 codiert.
PTE BAL, worin dem S1-Gen ein Teil fehlt, der die Carboxy-terminale Sequenz der S1-Untereinheit zwischen den Aminosäuren 124 und 255 codiert.
PTE SAL, worin dem S1-Gen ein Teil fehlt, der die Carboxy-terminale Sequenz der S1-Untereinheit zwischen den Aminosäuren 110 und 255 codiert.
PTE SPH, worin dem S1-Gen ein Teil fehlt, der die Carboxy-terminale Sequenz der S1-Untereinheit zwischen den Aminosäuren 68 und 255 codiert.

B. Konstruktion der Hybridplasmide, die das Gen enthalten, welches das durch Deletion des 5'-terminalen Teils modifizierte S1 codiert

3 Proben (10 ug) des PTE 255-Plasmids wurden in 100 ul einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl) bei 37ºC für 3 Stunden mit je 30 U der folgenden Restriktionsenzyme gespalten: SphI, SalI und BalI.
3 U des Klenow-Polymeraseenzyms wurden dann jeder Lösung zusammen mit 2 ul einer Lösung zugegeben, die je 50 mM der folgenden Desoxynucleotide enthielt: dATP, dTTP, dCTP sowie dGTP, und nach 15 Minuten bei 20-25ºC wurde das Enzym bei 65ºC für 30 Minuten inaktiviert.
Jeder Lösung wurden dann 30 U des HindIII-Restriktionsenzyms zugegeben. Die erhaltenen Gemische wurden für 3 Stunden bei 37ºC gehalten und dann auf ein 1,5%iges Agarosegel geladen und einer Elektrophorese bei 70 Volt für 3,5 Stunden unterworfen.
Auf diese Weise wurden für jedes Gemisch zwei Banden getrennt, eine enthielt den Deletionsteil von S1 und die andere enthielt das PeX-34-Plasmid und einen Teil von S1.
Das 520 bp große SphI-HindIII-Fragment, das 372 bp große SalI-HindIII-Fragment und das 394 bp große BalI-HindIII- Fragment wurde dann mit dem Maniatis-Verfahren elektroeluiert (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). 100 ng jedes Fragments wurden dann in 30 ul des Ligasegemisches in Gegenwart von 1 U T4-DNA-Ligase mit dem Plasmid PeX-34 verknüpft, das vorher mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten worden war, mit Polymeraseenzym sowie einer Lösung der Desoxynucleotide behandelt und dann mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten.
Die Ligasegemische wurden nacheinander zur Transformation von E. coli-K12-ΔHl-Δtrp-Zellen verwendet und die Transformanten wurden, wie in Abschnitt A berichtet, auf LB-Agar- Medium, das Ampicillin enthielt, selektiert.
Unter den aus den positiven Clonen extrahierten Plasmiden wurden jene durch einen Western-Blot mit Pertussis-anti- Toxin-Antikörpern identifiziert, die die clonierten Fragmente in einem richtigen Leserahmen enthielten.
Den mit den Abkürzungen PTE SPH/HIND, PTE 255/SAL und PTE 255/BAL bezeichneten Plasmiden fehlen die S1-Gensequenzen, die die aminoterminalen Teile der Untereinheit zwischen den Aminosäuren 1-67, 1-109 bzw. 1-123 codieren.

C. Konstruktion der Hybridplasmide, die das Gen enthalten, welches die durch Deletion von 3'- und 5'-terminalen Teilen modifizierte S1-Untereinheit codiert

2 Proben (10 ug) des Plasmids PTE NCO, das wie in Abschnitt A veranschaulicht erhalten wurde, wurden in 100 ul einer Lösung aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl mit je 30 U BstN1 (BRL) und 30 U BalI (BRL) bei 37ºC für 3 Stunden gespalten.
Die Spaltgemische wurden dann bei 20-25ºC für 15 Minuten mit 3 U des Klenow-Polymeraseenzyms in Gegenwart von 2 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP behandelt, wobei die terminalen Teile vervollständigt wurden, und, nach der Inaktivierung des Enzyms bei 65ºC für 30 Minuten, wurde die DNA erneut mit 30 U des Restriktionsenzyms HindIII bei 37ºC für 3 Stunden gespalten.
Die Spaltgemische wurden auf eine 1,5%iges Agarosegel geladen, eluiert und einer Elektrophorese bei 70 Volt für 3,5 Stunden unterworfen, wobei das 527 bp große BstN1-HindIII- Fragment und das 279 bp große BalI-HindIII-Fragment, wie vorstehend berichtet, elektroeluiert wurden.
100 ng der Fragmente wurden anschließend mit dem Plasmid PeX-34, das wie vorher in Abschnitt B berichtet behandelt wurde, in einem Ligasegemisch in Gegenwart von 7 U T4-DNA- Ligase bei 15ºC für 18 Stunden ligiert. Die Transformation der E. coli-Zellen und die Selektion der Transformanten wurde dann wie vorstehend veranschaulicht durchgeführt. Die Fragmente, die in den richtigen Leserahmen inseriert wurden, wurden unter den aus den positiven Clonen extrahierten rekombinanten Plasmiden identifiziert.
Die mit den Abkürzungen PTE 34A und PTE NCO/BAL bezeichneten Plasmide enthalten jeweils das S1-Gen ohne die Sequenzen, die den Teil der S1-Untereinheit zwischen den Aminosäuren 1-52 und 211-255 sowie den Teil zwischen den Aminosäuren 1-124 und 211-255 codieren.

D. Konstruktion der PTE 16-A und -18-A-Plasmide

10 ug des PTE 255-Plasmids wurden in 100 ul eines Puffers aus 100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl und 10 mM MgSO&sub4; mit 30 U EcoRI gespalten und dann bei 37ºC mit 1 U Bal31 (BRL) in 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM MgCl&sub2;, 0,2 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA. Nach 1, 3, 5 und 10 Minuten wurden Aliquots des Gemisches entnommen und die Deletionsfragmente wurden dann am 5'-Ende mit HindIII gespalten, durch Gelelektrophorese gereinigt und nach einer Elution, wie vorstehend berichtet, mit dem PeX-34-Plasmid ligiert. Die Ligasegemische wurden dann zur Transformation der E. coli-Zellen verwendet und die Transformanten wurden, wie in den vorhergehenden Schritten berichtet, selektiert.
Plasmide, die die S1-Genfragmente enthalten, die in den richtigen Leserahmen inseriert wurden, und die durch die Analyse ihrer Nucleotidsequenz bestimmt wurden, wurden aus den Plasmiden isoliert, die aus den positiven Clonen extrahiert wurden.
Plasmide, die das S1-Gen ohne die Sequenz enthalten, die den S1-aminoterminalen Teil codiert, wurden aus den so erhaltenen Plasmiden selektiert.
Insbesondere fehlten dem Plasmid PTE 16-A die Nucleotide, die die ersten 10 Aminosäuren codieren, und die deshalb ein Protein codieren, das die Aminosäuren 11-235 enthält, während das Plasmid PTE 18-A ein Protein codiert, das die Aminosäuren 149 bis 235 enthält.

Beispiel 2

Expression der modifizierten S1-Untereinheiten und Bestimmung der ADP-Ribosylierungsaktivität davon

A.
K12-ΔHl-Δtrp-E. coli-Zellen, die mit den, wie in Beispiel 1 berichtet, hergestellten Plasmiden transformiert wurden, wurden für eine Nacht bei 30ºC in 20 ml Flüssig-LB-Medium unter gleichmäßigem Mischen gezüchtet.
10 ml jeder Kultur wurde zum Beimpfen von 400 ml LB- Medium verwendet und die Zellen wurden für zwei Stunden bei 30ºC und für 2,5 Stunden bei 42ºC gezüchtet.
Am Ende dieses Zeitraums wurden die Kulturen bei 10 000 Upm 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen, die Zellen wurden gewonnen und dann in 3,2 ml einer Lösung aus 2,5% Saccharose, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA resuspendiert.
0,1 ml einer Lysozymlösung (40 mg/ml) und 0,8 ml 0,5 M EDTA wurden den Lösungen zugegeben, die dann 30 Minuten bei 37ºC inkubiert wurden.
8 ml eines Lysepuffers (1% Triton-X 100, 50 mM Tris- HCl, pH 6,0, und 63 mM EDTA) wurden dann jeder Lösung zugegeben, die für 15 Minuten bei 0ºC und für 30 Minuten bei 37ºC gehalten wurde.
Nach einer Beschallung von einer Minute wurden die Gemische mit den lysierten Zellen und ihren Inhalten bei 10 000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Präzipitate wurden in 5 ml 1M Harnstoff resuspendiert und 30 Minuten bei 37ºC gehalten.
Die Gemische wurden dann erneut zentrifugiert und die Präzipitate oder Zellinhalte wurden gewonnen, in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst und bei -20ºC eingefroren.

B: Analyse der ADP-Ribosylierungsaktivität

Lösungen mit Zellinhalten wurden zentrifugiert und die Präzipitate wurden vor Durchführung des ADP-Ribosylierungstests in 100 ul 8 N Harnstoff resuspendiert.
Der ADP-Ribosylierungstest wurde gemäß der von Manning et al. (J. Biol. Chem. 259 (1984), 749-756) beschriebenen Technik durchgeführt.
10 ul jeder Lösung wurden mit 20 ul einer Lösung von 100 mM Dithiothreit bei 20-25ºC für 30 Minuten vorinkubiert, dann wurden 10 ul Ochsenretinahomogenat (ROS), 80 ul Wasser, 5 ul Tris-HCl (pH 7,5), 1 ul einer 100 mM ATP-Lösung, 1 ul einer 10 mM GTP-Lösung, 10 ml Thymidin und 1 ul (1 nCi) ³²PNAD hinzugefügt.
Man ließ die Gemische dann bei Umgebungstemperatur (20- 25ºC) 30 Minuten reagieren und nach dem Zentrifugieren wurden die ROS-enthaltenden Rückstände gewonnen, in 30 ul Natriumdodecylsulfat (SDS)-Puffer gelöst und auf ein 12,5%iges Polyacrylamidgel geladen. Nach einer Elektrophorese bei 25 mA für 4 Stunden wurden die Gele bei einer Temperatur von 80ºC unter vermindertem Druck getrocknet und dann einer Autoradiographie unterzogen. Die radioaktiven Banden wurden aus dem Gel abgetrennt, in 5 ml Scintillationsflüssigkeit (Econofluor, NEN) suspendiert und in einem Beta-Zähler gezählt.
Auf diese Weise wurde die ADP-Ribosylierung der modifizierten Proteine quantitativ bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt: Tabelle I Plasmide, die das modifizierte S1-Gen enthalten ADP-Ribosylierungsaktivität der modifizierten S1-Untereinheit (%)
Aus den in Tabelle I offenbarten Ergebnissen wird ganz deutlich, daß die Sequenzen, die der Nru-Stelle (Position 179) folgen, im Gegensatz zu den 5'-terminalen Sequenzen für die ADP-Ribosylierungsaktivität der S1-Untereinheit nicht notwendig sind.

Beispiel 3

Identifizierung und Mutation der aktiven Stellen des 1-180- Bereichs der S1-Untereinheit

10 ug des Plasmids PTE 255 wurden in 100 ul eines Puffers aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl und 10 mM MgCl&sub2; suspendiert und mit je 30 U der Enzyme EcoRI und HindIII 3 Stunden bei 37ºC gespalten.
Das spaltgemisch wurde dann auf ein 1,3%iges Agarosegel geladen und 3 Stunden bei 80 mA eluiert.
Auf diese Weise wurden zwei Banden getrennt: eine von 3500 bp enthielt den Vektor und die andere von 600 bp enthielt das für die S1-Untereinheit codierende Gen.
Die 600 bp Bande wurde dann elektroeluiert und 0,2 ug des Fragments sowie 0,3 ng des Bluescript SK-Plasmids (Stratagene, San Diego, CA), das vorher mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten worden war, wurden in 20 ul Pufferlösung (66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreit) suspendiert und in Gegenwart von 1 U T4-DNA-Ligase 18 Stunden bei 15ºC ligiert.
Das Ligasegemisch wurde dann zur Transformation kompetenter JM 101-E. coli-Zellen verwendet und die Transformanten wurden auf Platten von LB-Agar selektiert, das 100 ug/ml Ampicillin, 20 ug/ml IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid) und 20 ug/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactopyranosid) umfaßt.
Die Platten wurden 18 Stunden bei 37ºC in einer thermostatischen Kammer inkubiert. Die weißen Kolonien, die das Plasmid enthalten, das den Bluescript SK-Vektor und das 600 bp DNA-Fragment umfaßt, wurden wie folgt zur Isolierung der einzelsträngigen DNA des clonierten Fragments verwendet.
Die weißen Kolonien wurden in 1,5 ml LB-Flüssigmedium gezüchtet, um eine optische Dichte (OD) bei 590 mm von etwa 0,15 zu erreichen.
Den Kulturen wurden anschließend 10 ul einer F1-Phagen- Suspension (Stratagene, San Diego, CA) in LB (5 x 10¹² Phagen/ml) zugegeben und die erhaltenen Lösungen wurden 6 bis 8 Stunden bei 37ºC gehalten.
Am Ende dieses Zeitraums wurden die Zellen vom Kulturmedium durch Zentrifugieren abgetrennt und der Überstand gewonnen. 20% Polyethylenglykol (PEG) und 2,5 mM NaCl wurden zu 1 ml des Überstandes gegeben, wobei die Phagen präzipitiert wurden.
Nach 15 Minuten bei Umgebungstemperatur (20-25ºC) wurde das Gemisch bei 12 000 Upm 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 20ºC zentrifugiert und die so gewonnenen Phagen wurden in 100 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) resuspendiert.
Die Lösung wurde dann einmal mit einem Volumenteil wassergesättigtem Phenol extrahiert, zweimal mit Ethylether und schließlich wurde die einzelsträngige DNA durch die Zugabe der wäßrigen Phase von 250 ul Ethanol und 10 ul 3 M Ammoniumacetat ausgefällt.
Die DNA wurde durch Zentrifugieren vom Gemisch abgetrennt, in 20 ul TE-Puffer resuspendiert und zur stellengerichteten Mutagenese verwendet (Zoller et al., DNA 3 (1984), 479-488).
Danach wurden Oligonucleotide, in denen die Basen, die mindestens eine der gewünschten Aminosäuren codieren, modifiziert wurden, um für eine andere Aminosäure zu codieren, mit Hilfe eines 1 Plus-DNA-Synthetisierer-Automatiksystems (Beckman) synthetisiert.
Die Oligonucleotide, die zur Sequenz der einzelsträngigen DNA komplementär sind, die im Bluescript SK-Plasmid cloniert wurde, wurden als Primer für die DNA-Polymerase verwendet, die die gesamte Bluescript-Nucleotidsequenz, einschließlich der im Primer vorhandenen Mutationen, transkribiert.
2 ul 10 mM ATP, 2 ul 10x Kinase-Puffer (550 mM Tris- HCl, pH 8,0, 100 mM MgCl&sub2;), 1 ul 100 mM Dithiothreit (DTT) und 5 U Polynucleotid-Kinase (Boehringer) wurden zu 3 mM des synthetischen Oligonucleotids gegeben und das Endvolumen wurde auf 20 ul eingestellt.
Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und das Enzym wurde 10 Minuten bei 70ºC inaktiviert.
1 ug des als Matrize verwendeten Einzelstrangs, 1 ul 1 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 10 mM MgCl&sub2; in einem Volumenteil 10x Kinase-Puffer wurden zu 2 ul des Primers gegeben.
Das Gemisch wurde für etwa 3 Minuten bei 80ºC gehalten und dann für etwa eine Stunde bei Umgebungstemperatur.
Anschließend wurden 10 ul 1 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;-Puffer, 0,05 mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM der vier Desoxynucleotide, 1 U T4-DNA-Ligase und 2,5 U des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I zugegeben.
Das Gemisch wurde über Nacht bei 15ºC inkubiert und dann zur Transformation von JM 101-E. coli-Zellen verwendet, wie vorstehend veranschaulicht wurde.
Die Plasmide, die das mutierte S1-Gen enthalten, wurden dann durch Hybridisierung mit dem ³²P-markierten Primer, der zur Mutagenese verwendet wurde, als Sonde identifiziert. Die Nitrocellulosefilter mit den transformierten Kulturen wurden in 6x SSC (1x SSC = 0,015 M NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat, pH 7), 10x Denhardt (1% BSA, 1% Ficoll, 1% Polyvinylpyrrolidon) und 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 20 bis 25ºC für 18 Stunden hybridisiert und dann 2 Stunden in 6x SSC bei den folgenden Temperaturen gewaschen: (45ºC) 25- und 26- Mutanten; (48ºC) 28-, 22- und 29-Mutanten; (54ºC) 27-Mutante sowie (46ºC) 31- und 41-Mutanten.
Die Mutationen wurden durch die Analyse der Nucleotidsequenz des Gens gemäß dem Verfahren von Sanger F. et al. bestätigt (PNAS 74 (1977), 5463).
Wie vorstehend berichtet, wurden Plasmide, die das Gen enthalten, welches das modifizierte S1 codiert, wie folgt hergestellt:
41: Tyrosin 8 und Arginin 9 wurden unter Verwendung des Primers GTCATAGCCGTCTACGGT durch Asparaginsäure bzw. Glycin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
620-CGCCACCGTATACCGCTATGACTCCCGCCCG-650
620-CGCCACCGTAGACGGCTATGACTCCCGCCCG-650
22: Phenylalanin 50 und Threonin 53 wurden unter Verwendung des Primers TGGAGACGTCAGCGCTGT durch Glutaminsäure bzw. Isoleucin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 750-AGCGCTTTCGTCTCCACCAGC-770 wurde in 750-AGCGCTGACGTCTCCATCAGC-770 geändert.
25: Glycin 99 wurde unter Verwendung des Primers durch Glutaminsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 910-TACGGCGCCGC-920 wurde in 910-TACGAAGCCGC-920 geändert.
17: Asparaginsäure 109 wurde unter Verwendung des Primers CTGGTAGGTGTCCAGCGCGCC durch Glycin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 930-GTCGACACTTA-940 wurde in 930-GTCGGCACTTA-940 geändert.
27: Glycin 121 wurde unter Verwendung des Primers GCCAGCGCTTCGGCGAGG durch Glutaminsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 956-GCCGGCGCGCT-966 wurde in 956-GCCGAAGCGCT-966 geändert.
16: Alanin in Position 124 wurde unter Verwendung des Primers GCCATAAGTGCCGACGTATTC durch Asparaginsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 976-TGGCCACCTAC-984 wurde in 976-TGGACACCTAC-986 geändert.
1716: enthält die kombinierten Mutationen 16 und 17
28: Glutaminsäure 129 wurde unter Verwendung des Primers GCCAGATACCCGCTCTGG durch Glycin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 990-AGCGAATATCT-1000 wurde in 990-AGCGGGTATCT-1000 geändert.
29: Arginin 135 wurde unter Verwendung des Primers GCGGAATGTCCCGGTGTG durch Glutaminsäure ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 1010-GCGCATTCCGC-1020 wurde in 1010-GGACATTCCGC-1020 geändert.
31: Threonin 159 wurde unter Verwendung des Primers TACTCCGTTTTCGTGGTC durch Lysin ersetzt.
Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
die Sequenz 1070-GCATCACCGGCGAGACCACGACCACGGAGTA-1090 wurde in 1070-GCATCACCGGCGAGACCACGAAAACGGAGTA-1090 geändert.
26: Tyrosin 111 wurde durch Glycin ersetzt.
Ferner erfolgte unter Verwendung des Primers CGCCACCAGTGTCGACGTATTCGA wegen einer partiellen Duplikation eines Primerfragments die Insertion der Aminosäuren Asp Thr Gly und Gly in der Position 113. Das entsprechende Gen wurde wie folgt modifiziert:
930-GTCGACACTTATGGCGACAAT-950
930-GTCGACACTGGTGGCGACACTGGTGGCGACAAT-950.
Die das S1-Gen enthaltenden Plasmide wurden erneut mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten und das DNA-Fragment mit den vorstehend erwähnten Mutationen wurde aus dem Spaltgemisch durch Gelelektrophorese abgetrennt, elektroeluiert und in einem Ligasegemisch in den PeX-34B-Vektor cloniert, wie vorstehend berichtet.
Die Ligasegemische wurden zur Transformation geeigneter K12-ΔHl-Δtrp-E. coli-Zellen verwendet und die Transformanten wurden auf LB-Agarmedium mit 30 ug/ml Ampicillin bei 30ºC isoliert.
Die positiven Clone mit den mutierten Plasmiden wurden dann, wie in Beispiel 2 berichtet, in LB-Flüssigmedium gezüchtet. Nach der Zellyse wurde die ADP-Ribosylierungsaktivität der so erhaltenen S1-Untereinheiten bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt: Tabelle II Mutierte Untereinheiten ADP-Ribosylierungsaktivität der mutierten Untereinheiten (%)
BppB und BBp sind S1-Hybride, die jeweils das Gen von B. pertussis bis zur SalI-Stelle und den restlichen Abschnitt von P. bronchiseptica und umgekehrt enthalten.
Aus den vorstehenden Ergebnisse wird ersichtlich, daß die Mutante 28, bei der die Substitution von nur einer Aminosäure zu einem vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität führte, besonders interessant ist.

Claims

1. Immunologisch aktives Polypeptid mit keiner oder reduzierter Toxizität, verwendbar für die Herstellung eines Antipertussis-Impfstoffes, wobei das Polypeptid die S1- Untereinheit des Pertussis-Toxins enthält, modifiziert durch die Substitution einer Aminosäure durch eine andere, die fähig ist, die Toxizität von S1 zu zerstören oder zu reduzieren, ohne dessen immunologische Eigenschaften zu verändern, wobei mindestens Glutaminsäure (129) durch eine andere Aminosäure substituiert wird.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, zusätzlich enthaltend mindestens eine der Untereinheiten S2, S3, S4 und S5 des Pertussis-Toxins.

3. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die Untereinheiten S2, S3, S4 und S5 dieselbe Anordnung wie die im natürlichen Pertussis-Toxin vorliegende haben.

4. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der vorangegangenen Patentansprüche, umfassend:

(a) Modifizierung des für die S1-Untereinheit des Pertussis-Toxins codierenden Gens durch direkte Mutagenese durch Substitution der Basen-Sequenz für eine Aminosäure an einer oder mehreren Stellen des DNA-Moleküls durch eine Basensequenz, die eine andere Aminosäure codiert, wobei mindestens die Basensequenz, die für Glutaminsäure in Position 129 codiert, durch eine Basensequenz substituiert wird, die für eine andere Aminosäure codiert;

(b) Konstruktion eines Hybridplasmids durch Ligierung eines Clonierungsvektors mit dem DNA-Fragment, das das Gen für die modifizierte S1-Untereinheit enthält;

(c) Transformation eines Wirtsmikroorganismus mit einem gemäß (b) erhaltenen Hybridplasmid;

(d) Züchtung eines transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium in Gegenwart einer Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralsalz-Quelle und, schließlich

(e) Gewinnung des Polypeptids, enthaltend die modifizierte Untereinheit aus dem Kulturmedium oder aus den Zellen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei in Schritt (a) das für die S1-Untereinheit codierende Gen im Pertussis-Toxin- Operon enthalten ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei in Schritt (b) das DNA- Fragment zusätzlich mindestens ein Gen enthält, das für die Untereinheiten S2, S3, S4 oder S5 des Pertussis- Toxins codiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Gene in dem Operon angeordnet sind, das für das Pertussis-Toxin codiert.

8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei im Schritt (c) der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird, die Escherichia coli, Bacillus und Hefen umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli (E. coli) ist.

10. E. coli (PTE 255-28), ATCC 67543, transformierte Mikroorganismen.

11. Antipertussis-Impfstoff, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge mindestens eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

12. Gen, das ein immunologisch aktives Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert codiert.

13. Hybridplasmid, enthaltend das wie in Anspruch 12 definierte Gen.

14. Mikroorganismus, transformiert mit einem Hybridplasmid wie in Anspruch 13 definiert.