JP2857105B2 - 免疫活性ポリペプチド及びその製法 - Google Patents
免疫活性ポリペプチド及びその製法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗百日咳ワクチン
の調製に使用される毒性のない又は毒性が低減された免
疫活性ポリペプチドに係る。
の調製に使用される毒性のない又は毒性が低減された免
疫活性ポリペプチドに係る。
【０００２】さらに、本発明は、該ポリペプチドの製法
及び該ポリペプチドの少なくとも１を治療上の有効量で
含有してなる抗百日咳ワクチンにも係る。
及び該ポリペプチドの少なくとも１を治療上の有効量で
含有してなる抗百日咳ワクチンにも係る。
【０００３】
【従来の技術】百日咳は、桿菌である百日咳菌(Bordete
lla pertusis)によって起る呼吸器系の病気であり、カ
タル期又は発作の間に、呼吸器系を介して、患者から罹
患し易い健康者に伝染する。
lla pertusis)によって起る呼吸器系の病気であり、カ
タル期又は発作の間に、呼吸器系を介して、患者から罹
患し易い健康者に伝染する。
【０００４】百日咳は痙攣、大脳障害を生ずることがあ
り、時には、特に幼児及び母性の抗百日咳抗体が欠けた
新生児では死亡する場合があるため、このような病気に
対して有効なワクチンが望まれている。
り、時には、特に幼児及び母性の抗百日咳抗体が欠けた
新生児では死亡する場合があるため、このような病気に
対して有効なワクチンが望まれている。
【０００５】現在では、マーシオレートで殺菌し、56℃
で処理した病原菌を含有する抗百日咳ワクチンが使用さ
れているが、この場合、たとえ永久免疫を与えることが
できるとしても、望ましくない副作用があること又はそ
の調製及び精製に由来する問題があること等のため、完
全には満足できるものではない。
で処理した病原菌を含有する抗百日咳ワクチンが使用さ
れているが、この場合、たとえ永久免疫を与えることが
できるとしても、望ましくない副作用があること又はそ
の調製及び精製に由来する問題があること等のため、完
全には満足できるものではない。
【０００６】かかる理由から、欠点のない抗百日咳ワク
チンの調製が熱望されている。
チンの調製が熱望されている。
【０００７】百日咳菌は、それ自体、毒性を有しておら
ず、その毒性は、第Ｉ期(毒性期)の間における各種物
質、すなわち溶血素(Hls)、アデニルサイクラーゼ(Ad
c)、皮膚壊死毒素(Dnc)、線維性血球凝集素(Fha)及び百
日咳毒素(PT)の合成に相関することが知られている。特
にPTは、百日咳菌によって生ずる主な毒性ファクターで
ある［Weiss A.ら「Infect,Immun.」42, 331-41 (198
3)；Weiss A.ら「J. Inf. Dis.」150, 219-222 (198
4)］だけでなく、該細菌によって生ずる感染に対する主
な保護抗原の１つでもある。
ず、その毒性は、第Ｉ期(毒性期)の間における各種物
質、すなわち溶血素(Hls)、アデニルサイクラーゼ(Ad
c)、皮膚壊死毒素(Dnc)、線維性血球凝集素(Fha)及び百
日咳毒素(PT)の合成に相関することが知られている。特
にPTは、百日咳菌によって生ずる主な毒性ファクターで
ある［Weiss A.ら「Infect,Immun.」42, 331-41 (198
3)；Weiss A.ら「J. Inf. Dis.」150, 219-222 (198
4)］だけでなく、該細菌によって生ずる感染に対する主
な保護抗原の１つでもある。
【０００８】事実、菌体ワクチンによって免疫された者
では抗PT抗体が見出され［AshworthL.A.Eら「Lancet」1
0月号，878-881 (1983)］、ホルムアルデヒドにより無
毒化したPTを使用し、エーロゾルを介して又は小脳を経
由して感染させたマウスでは保護免疫が獲得されている
［Sato Y.ら「Inf. and Imm.」41, 313 (1983)］。百日
咳毒素が新たな抗百日咳ワクチンの調製における必須の
成分ではあっても、その使用は、毒性に関連する多くの
欠点によって制限される。
では抗PT抗体が見出され［AshworthL.A.Eら「Lancet」1
0月号，878-881 (1983)］、ホルムアルデヒドにより無
毒化したPTを使用し、エーロゾルを介して又は小脳を経
由して感染させたマウスでは保護免疫が獲得されている
［Sato Y.ら「Inf. and Imm.」41, 313 (1983)］。百日
咳毒素が新たな抗百日咳ワクチンの調製における必須の
成分ではあっても、その使用は、毒性に関連する多くの
欠点によって制限される。
【０００９】実際問題として、PTは、リンパ球増加、ヒ
スタミン感受性、低血糖、エピネフリンの血糖上昇効果
に対する不応性及びランゲルハンス島の活性化の如き望
ましくない病態生埋学上の効果を誘発する。
スタミン感受性、低血糖、エピネフリンの血糖上昇効果
に対する不応性及びランゲルハンス島の活性化の如き望
ましくない病態生埋学上の効果を誘発する。
【００１０】さらに、現在使用されているワクチンにお
けるPTの存在は、発熱、水疱、神経系の変調及び死亡等
の副作用の主原因であり、このため、最近ではワクチン
の使用が激減し、新たな百日咳の流行を招いている。
けるPTの存在は、発熱、水疱、神経系の変調及び死亡等
の副作用の主原因であり、このため、最近ではワクチン
の使用が激減し、新たな百日咳の流行を招いている。
【００１１】ホルムアルデヒドによるPTの無毒化処理で
は、毒性のない免疫原性タンパク質が得られる(Satoら
の上記文献参照)が、該タンパク質は純粋、再現性かつ
安定な形では得られないことによるいくつかの欠点があ
る。
は、毒性のない免疫原性タンパク質が得られる(Satoら
の上記文献参照)が、該タンパク質は純粋、再現性かつ
安定な形では得られないことによるいくつかの欠点があ
る。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】発明者らは、従来法の
欠点を解消できると共に、簡単かつ経済的に実施可能な
方法によって純粋なものとして得られるポリペプチドを
見出し、本発明に従った。従って、本発明の目的は、抗
百日咳ワクチンの調製に使用される毒性のない又は毒性
が低減された免疫活性ポリペプチドにある。
欠点を解消できると共に、簡単かつ経済的に実施可能な
方法によって純粋なものとして得られるポリペプチドを
見出し、本発明に従った。従って、本発明の目的は、抗
百日咳ワクチンの調製に使用される毒性のない又は毒性
が低減された免疫活性ポリペプチドにある。
【００１３】本発明の他の目的は、該ポリペプチドの製
法にある。
法にある。
【００１４】本発明のさらに他の目的は、該ポリペプチ
ドの少なくとも１を治療上の有効量で含有してなるワク
チンにある。
ドの少なくとも１を治療上の有効量で含有してなるワク
チンにある。
【００１５】本発明の他の目的は、以下の記載及び実施
例から明らかになるであろう。
例から明らかになるであろう。
【００１６】
【課題を解決するための手段】百日咳毒素は５つの異な
るサブユニットを含有するタンパク質であり、その毒性
は、真核生物の細胞膜を介してのメッセージの伝達に関
与するGTPと結合するタンパク質のADP−リボリシレーシ
ョン(ribosilation)による。該PTは異なる官能性を有す
る２つのフラクションを含有する。その１つ(A)はサブ
ユニットS1を含有し、他方(B)は相互にサブユニットS5
によって結合された２つのダイマーD1(S2＋S4)及びD2(S
3＋S4)内に位置するサブユニットS2、S3、S4及びS5を含
有する。
るサブユニットを含有するタンパク質であり、その毒性
は、真核生物の細胞膜を介してのメッセージの伝達に関
与するGTPと結合するタンパク質のADP−リボリシレーシ
ョン(ribosilation)による。該PTは異なる官能性を有す
る２つのフラクションを含有する。その１つ(A)はサブ
ユニットS1を含有し、他方(B)は相互にサブユニットS5
によって結合された２つのダイマーD1(S2＋S4)及びD2(S
3＋S4)内に位置するサブユニットS2、S3、S4及びS5を含
有する。
【００１７】フラクションＡは酵素的に活性な部分、す
なわちPTの有毒性部分を代表するものであり、一方、フ
ラクションＢは真核生物細胞膜リセプターに結合され、
その中にサブユニットS1を導入し得る。
なわちPTの有毒性部分を代表するものであり、一方、フ
ラクションＢは真核生物細胞膜リセプターに結合され、
その中にサブユニットS1を導入し得る。
【００１８】特開昭62-228286号には、該サブユニット
をコードづけする遺伝子のクローニング、シーケンス及
び発現が開示されており、この遺伝子が主オペロンに分
類されることが記載されている。
をコードづけする遺伝子のクローニング、シーケンス及
び発現が開示されており、この遺伝子が主オペロンに分
類されることが記載されている。
【００１９】さらに、サブユニットS1のADP−リボシレ
ーション活性は、ハイブリッドプラスミドPTE225によっ
て形質転換された微生物を培養することによって測定さ
れており、このサブユニットがPTに匹敵する酵素活性を
有することが知られている。
ーション活性は、ハイブリッドプラスミドPTE225によっ
て形質転換された微生物を培養することによって測定さ
れており、このサブユニットがPTに匹敵する酵素活性を
有することが知られている。
【００２０】従って、百日咳毒素の免疫特性及び保護特
性を有するが、無毒性又は毒性が低減されているタンパ
ク質を得るために、該タンパク質の酵素活性に関する位
置及び基礎となるアミノ酸を確認した。特に、下記の位
置及びアミノ酸であることが判明した：８位チロシン、
９位アルギニン、50位フェニルアラニン、53位トレオニ
ン、129位グルタミン酸、121位グリシン、124位アラニ
ン、109位アスパラギン酸、99位グリシン、135位アルギ
ニン、159位トレオニン及び111位チロシン。
性を有するが、無毒性又は毒性が低減されているタンパ
ク質を得るために、該タンパク質の酵素活性に関する位
置及び基礎となるアミノ酸を確認した。特に、下記の位
置及びアミノ酸であることが判明した：８位チロシン、
９位アルギニン、50位フェニルアラニン、53位トレオニ
ン、129位グルタミン酸、121位グリシン、124位アラニ
ン、109位アスパラギン酸、99位グリシン、135位アルギ
ニン、159位トレオニン及び111位チロシン。
【００２１】これらアミノ酸の１又はそれ以上を異種の
各種アミノ酸で置換することにより、異った毒性のタン
パク質が得られることを見出し、本発明に至った。
各種アミノ酸で置換することにより、異った毒性のタン
パク質が得られることを見出し、本発明に至った。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明によれば、アミノ酸１から
180までのS1領域における１又はそれ以上の部位で、ア
ミノ酸を、免疫特性を変質させることなくその酵素活性
を破壊又は低減させ得る他のアミノ酸で直接変異誘発置
換することによって変性せしめた百日咳毒素のサブユニ
ットS1を含有するポリペプチドが合成される。
180までのS1領域における１又はそれ以上の部位で、ア
ミノ酸を、免疫特性を変質させることなくその酵素活性
を破壊又は低減させ得る他のアミノ酸で直接変異誘発置
換することによって変性せしめた百日咳毒素のサブユニ
ットS1を含有するポリペプチドが合成される。
【００２３】特に、かかる合成ポリペプチドとしては、
下記の如き置換することによって変性せしめた百日咳毒
素のサブユニットS1を含有するものである。
下記の如き置換することによって変性せしめた百日咳毒
素のサブユニットS1を含有するものである。
【００２４】８位チロシン及び９位アルギニンが、それ
ぞれアスパラギン酸及びグリシンによって置換されたも
の 50位フェニルアラニン及び53位トレオニンが、それぞれ
グルタミン酸及びイソロイシンで置換されたもの 129位グルタミン酸がグリシンで置換されたもの 121位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの 124位アラニンがアスパラギン酸で置換されたもの 109位アスパラギン酸及び124位アラニンが、それぞれグ
リシン及びアスパラギン酸で置換されたもの 99位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの 109位アスパラギン酸がグリシンで置換されたもの 135位アルギニンがグルタミン酸で置換されたもの 159位トレオニンがリシンで置換されたもの 111位チロシンがグリシンで置換され、かつ113位にアミ
ノ酸Asp Thr Gly Glyが挿入されたもの。
ぞれアスパラギン酸及びグリシンによって置換されたも
の 50位フェニルアラニン及び53位トレオニンが、それぞれ
グルタミン酸及びイソロイシンで置換されたもの 129位グルタミン酸がグリシンで置換されたもの 121位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの 124位アラニンがアスパラギン酸で置換されたもの 109位アスパラギン酸及び124位アラニンが、それぞれグ
リシン及びアスパラギン酸で置換されたもの 99位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの 109位アスパラギン酸がグリシンで置換されたもの 135位アルギニンがグルタミン酸で置換されたもの 159位トレオニンがリシンで置換されたもの 111位チロシンがグリシンで置換され、かつ113位にアミ
ノ酸Asp Thr Gly Glyが挿入されたもの。
【００２５】特に、本発明によるポリペプチドは、 ａ）DNA分子の１又はそれ以上の位置において、所定の
アミノ酸をコードづけする塩基配列を所望のアミノ酸を
コードづけする塩基配列で置換することによって抗百日
咳毒素のサブユニットS1をコードづけする遺伝子を直接
変異誘発により変性させ、 ｂ）該変性サブユニットS1をコードづけする遺伝子を含
有するDNAフラグメントをクローニングベクターに結合
させてハイブリッドプラスミドを構成し、 ｃ）前記工程ｂ）で得られたハイブリッドプラスミドに
よって宿主微生物を形質転換させ、 ｄ）炭素源、窒素源及び無機塩の存在下、適切な培地中
で形質転換微生物を培養し、 ｅ）培地又は菌体から、変性サブユニットS1を含有する
ポリペプチドを採取することからなる方法によって調製
される。
アミノ酸をコードづけする塩基配列を所望のアミノ酸を
コードづけする塩基配列で置換することによって抗百日
咳毒素のサブユニットS1をコードづけする遺伝子を直接
変異誘発により変性させ、 ｂ）該変性サブユニットS1をコードづけする遺伝子を含
有するDNAフラグメントをクローニングベクターに結合
させてハイブリッドプラスミドを構成し、 ｃ）前記工程ｂ）で得られたハイブリッドプラスミドに
よって宿主微生物を形質転換させ、 ｄ）炭素源、窒素源及び無機塩の存在下、適切な培地中
で形質転換微生物を培養し、 ｅ）培地又は菌体から、変性サブユニットS1を含有する
ポリペプチドを採取することからなる方法によって調製
される。
【００２６】本発明に従い、タンパク質の酵素活性に関
連するS1のアミノ酸領域を確認するため、S1をコードづ
けする遺伝子を制限酵素(異なる部位で切断する)で処理
した。得られたDNAフラグメント(異なる長さの3'及び／
5'末端配列が欠けている)を、公知の一般的方法に従っ
て操作して、発現プラスミド内でクローン化させた。つ
いで、削除された配列のDNAフラグメントを含有するベ
クターを使用して、大腸菌(Escherichia coli)の形質転
換を行った。
連するS1のアミノ酸領域を確認するため、S1をコードづ
けする遺伝子を制限酵素(異なる部位で切断する)で処理
した。得られたDNAフラグメント(異なる長さの3'及び／
5'末端配列が欠けている)を、公知の一般的方法に従っ
て操作して、発現プラスミド内でクローン化させた。つ
いで、削除された配列のDNAフラグメントを含有するベ
クターを使用して、大腸菌(Escherichia coli)の形質転
換を行った。
【００２７】選択培地で菌体をスクリーニングすること
によって得られた陽性の形質転換体を、適切な培地中、
温度30℃ないし40℃で20分間ないし５時間培養した。
によって得られた陽性の形質転換体を、適切な培地中、
温度30℃ないし40℃で20分間ないし５時間培養した。
【００２８】この時間の経過後、培地から菌体を回収
し、リゾチーム処理及び音波処理によって溶菌せしめ
た。
し、リゾチーム処理及び音波処理によって溶菌せしめ
た。
【００２９】このようにして抽出したタンパク質につい
て酵素活性を測定するため分析に供した。
て酵素活性を測定するため分析に供した。
【００３０】このタンパク質のADP−リボシレーション
活性を、Manningらによる方法［「ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)」259, 7
49-756(1984)］に従って操作してテストした。
活性を、Manningらによる方法［「ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)」259, 7
49-756(1984)］に従って操作してテストした。
【００３１】得られた結果(後述の実施例２の第１表に
示す)は、179位のアミノ酸に続くS1配列は、初めのアミ
ノ酸10個とは異なり、ADP−リボシレーションには必要
でないことを示した。
示す)は、179位のアミノ酸に続くS1配列は、初めのアミ
ノ酸10個とは異なり、ADP−リボシレーションには必要
でないことを示した。
【００３２】従って、サブユニットS1の酵素的に活性な
領域はアミノ酸１から180までで構成される。
領域はアミノ酸１から180までで構成される。
【００３３】本発明によれば、この領域に存在する活性
部位の同定を行ったところ、これら部位の少なくとも１
つが変換されていた。
部位の同定を行ったところ、これら部位の少なくとも１
つが変換されていた。
【００３４】実際問題として、S1をコードづけする遺伝
子はプラスミドPTE255から単離されており、その構造は
制限酵素EcoRI及びHindIIIでの消化によって明らかにさ
れ、特開昭62-228286号に報告されている。
子はプラスミドPTE255から単離されており、その構造は
制限酵素EcoRI及びHindIIIでの消化によって明らかにさ
れ、特開昭62-228286号に報告されている。
【００３５】S1をコードづけする遺伝子を含有する600
塩基対(bp)のDNAフラグメントをゲル電気泳動によって
消化混合物から分離し、電気溶出した後、直接変異誘発
によって変性して、インビトロにおいて、DNA分子の所
定部位で変異を生じさせ、該変異の効果をインビトロ又
はインビボでテストした。
塩基対(bp)のDNAフラグメントをゲル電気泳動によって
消化混合物から分離し、電気溶出した後、直接変異誘発
によって変性して、インビトロにおいて、DNA分子の所
定部位で変異を生じさせ、該変異の効果をインビトロ又
はインビボでテストした。
【００３６】この方法による所望塩基の置換は、下記の
手法の１つに従って実施される。 DNAにおける所定部位で塩基類似体を取込ませること 誤った方式でヌクレオチドを取込ませること 限定された配列を有するオリゴヌクレオチドのインビト
ロでの合成の間に変異を生じさせること DNAの塩基と反応する化学的変異誘発物質(たとえば亜硫
酸水素ナトリウム)を使用すること。
手法の１つに従って実施される。 DNAにおける所定部位で塩基類似体を取込ませること 誤った方式でヌクレオチドを取込ませること 限定された配列を有するオリゴヌクレオチドのインビト
ロでの合成の間に変異を生じさせること DNAの塩基と反応する化学的変異誘発物質(たとえば亜硫
酸水素ナトリウム)を使用すること。
【００３７】本発明では、S1をコードづけする遺伝子
を、Zoller M.J.らの方法［「DNA」3,479-488(1984)］
に従って操作して、限定された配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを使用して変性させた。
を、Zoller M.J.らの方法［「DNA」3,479-488(1984)］
に従って操作して、限定された配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを使用して変性させた。
【００３８】実施にあたり、600bpのDNAフラグメントを
ベクターでクローン化し、該DNAのシングルら線クロー
ンフラグメントを単離した。この目的に適するベクター
は、Bluescript SK (Stratagene)、pEMBL［Denteら「ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Resea
rch)」11, 1645-1655 (1983)］又はM13ファージ［Viera
及びMessing「ジーン(Gene)」19, 263 (1982)］から選
ばれる。本発明では、市販のBluescript SKべクターを
使用した。
ベクターでクローン化し、該DNAのシングルら線クロー
ンフラグメントを単離した。この目的に適するベクター
は、Bluescript SK (Stratagene)、pEMBL［Denteら「ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Resea
rch)」11, 1645-1655 (1983)］又はM13ファージ［Viera
及びMessing「ジーン(Gene)」19, 263 (1982)］から選
ばれる。本発明では、市販のBluescript SKべクターを
使用した。
【００３９】該ベクターを好適な制限酵素で処理し、つ
いで、T4 DNAリガーゼの存在下、リガーゼ混合物中の60
0bp DNAフラグメントに結合させた。
いで、T4 DNAリガーゼの存在下、リガーゼ混合物中の60
0bp DNAフラグメントに結合させた。
【００４０】得られた混合物を使用して大腸菌の形質転
換を行い、アンピシリンを含有する培地上で形質転換体
を選別した。
換を行い、アンピシリンを含有する培地上で形質転換体
を選別した。
【００４１】ベクター及び600bp DNAフラグメントを包
含するハイブリッドプラスミドを含有する陽性のクロー
ンを、ファージが存在する液状媒体に懸濁化させ、温度
30ないし40℃に２ないし10時間維持した。
含するハイブリッドプラスミドを含有する陽性のクロー
ンを、ファージが存在する液状媒体に懸濁化させ、温度
30ないし40℃に２ないし10時間維持した。
【００４２】この時間の経過後、ファージを沈殿させ、
遠沈によって溶液から分離し、pH7.5の緩衝液中に再度
懸濁化させ、水−エチルエーテル飽和フェノールで抽出
し、ついでエタノール及び酢酸アンモニウムで抽出して
シングルら線DNAを沈殿させた。
遠沈によって溶液から分離し、pH7.5の緩衝液中に再度
懸濁化させ、水−エチルエーテル飽和フェノールで抽出
し、ついでエタノール及び酢酸アンモニウムで抽出して
シングルら線DNAを沈殿させた。
【００４３】ついで、このDNAの一定量を使用し、直接
変異誘発によってS1を変性させた。この目的のため、1-
180 S1領域の所定部位に存在する１又はそれ以上のアミ
ノ酸をコードづけする塩基を、異なるアミノ酸をコード
づけする他の塩基で置換するヌクレオチド約20でなるオ
リゴヌクレオチドを合成させた。特に、S1をコードづけ
する遺伝子の下記変異体を調製し得るオリゴヌクレオチ
ドを合成した。
変異誘発によってS1を変性させた。この目的のため、1-
180 S1領域の所定部位に存在する１又はそれ以上のアミ
ノ酸をコードづけする塩基を、異なるアミノ酸をコード
づけする他の塩基で置換するヌクレオチド約20でなるオ
リゴヌクレオチドを合成させた。特に、S1をコードづけ
する遺伝子の下記変異体を調製し得るオリゴヌクレオチ
ドを合成した。
【００４４】41：プライマーGTCATAGCCGTCTACGGTを使用
して、チロシン(8)及びアルギニン(9)をそれぞれアスパ
ラギン酸及びグリシンに置換させた。相当する遺伝子
は、このような変性により、その配列が620-CGCCACCGTA
TACCGCTATGACTCCCGCCCG-650から620-CGCCACCGTAGACGGCT
ATGACTCCCGCCCG-650に変化した。
して、チロシン(8)及びアルギニン(9)をそれぞれアスパ
ラギン酸及びグリシンに置換させた。相当する遺伝子
は、このような変性により、その配列が620-CGCCACCGTA
TACCGCTATGACTCCCGCCCG-650から620-CGCCACCGTAGACGGCT
ATGACTCCCGCCCG-650に変化した。
【００４５】22：プライマーTGGAGACGTCAGCGCTGTを使用
して、フェニルアラニン(50)及びトレオニン(53)をそれ
ぞれグルタミン酸及びイソロイシンに置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が750-
AGCGCTTTCGTCTCCACCAGC-770から750-AGCGCTGACGTCTCCAT
CAGC-770に変化した。
して、フェニルアラニン(50)及びトレオニン(53)をそれ
ぞれグルタミン酸及びイソロイシンに置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が750-
AGCGCTTTCGTCTCCACCAGC-770から750-AGCGCTGACGTCTCCAT
CAGC-770に変化した。
【００４６】25：プライマーCTGGCGGCTTCGTAGAAAを使用
して、グリシン(99)をグルタミン酸に置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が910-
TACGGCGCCGC-920から910-TACGAAGCCGC-920に変化した。
して、グリシン(99)をグルタミン酸に置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が910-
TACGGCGCCGC-920から910-TACGAAGCCGC-920に変化した。
【００４７】17：プライマーCTGGTAGGTGTCCAGCGCGCCを
使用して、アスパラギン酸(109)をグリシンに置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTA-940から930-GTCGGCACTTA-940に変
化した。
使用して、アスパラギン酸(109)をグリシンに置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTA-940から930-GTCGGCACTTA-940に変
化した。
【００４８】27：プライマーGCCAGCGCTTCGGCGAGGを使用
して、グリシン(121)をグルタミン酸に置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が95
6-GCCGGCGCGCT-966から956-GCCGAAGCGCT-966に変化し
た。
して、グリシン(121)をグルタミン酸に置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が95
6-GCCGGCGCGCT-966から956-GCCGAAGCGCT-966に変化し
た。
【００４９】16：プライマーGCCATAAGTGCCGACGTATTCを
使用して、アラニン(124)をアスパラギン酸に置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が976-TGGCCACCTAC-984から976-TGGACACCTAC-986に変
化した。
使用して、アラニン(124)をアスパラギン酸に置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が976-TGGCCACCTAC-984から976-TGGACACCTAC-986に変
化した。
【００５０】1716：16及び17の変異を併せて包含する。
【００５１】28：プライマーGCCAGATACCCGCTCTGGを使用
して、グルタミン酸(129)をグリシンに置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が99
0-AGCGAATATCT-1000から990-AGCGGGTATCT-1000に変化し
た。
して、グルタミン酸(129)をグリシンに置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が99
0-AGCGAATATCT-1000から990-AGCGGGTATCT-1000に変化し
た。
【００５２】29：プライマーGCGGAATGTCCCGGTGTGを使用
して、アルギニン(135)をグルタミン酸に置換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
1010-GCGCATTCCGC-1020から1010-GGACATTCCGC-1020に変
化した。
して、アルギニン(135)をグルタミン酸に置換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
1010-GCGCATTCCGC-1020から1010-GGACATTCCGC-1020に変
化した。
【００５３】31：プライマーTACTCCGTTTTCGTGGTCを使用
して、トレオニン(159)をリシンに置換させた。相当す
る遺伝子は、このような変性により、その配列が1070-G
CATCACCGGCGAGACCACGACCACGGAGTA-1090から1070-GCATCA
CCGGCGAGACCACGAAAACGGAGTA-1090に変化した。
して、トレオニン(159)をリシンに置換させた。相当す
る遺伝子は、このような変性により、その配列が1070-G
CATCACCGGCGAGACCACGACCACGGAGTA-1090から1070-GCATCA
CCGGCGAGACCACGAAAACGGAGTA-1090に変化した。
【００５４】26：プライマーCGCCACCAGTGTCGACGTATTCGA
を使用して、チロシン(111)をグリシンに置換させた。
さらに、プライマーフラグメントの部分複製によって、
113位においてアミノ酸Asp Thr Gly Glyの挿入が生じ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTATGGCGACAAT-950から930-GTCGACACT
GGTGGCGACACTGGTGGCGACAAT-950に変化した。
を使用して、チロシン(111)をグリシンに置換させた。
さらに、プライマーフラグメントの部分複製によって、
113位においてアミノ酸Asp Thr Gly Glyの挿入が生じ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTATGGCGACAAT-950から930-GTCGACACT
GGTGGCGACACTGGTGGCGACAAT-950に変化した。
【００５５】上記オリゴヌクレオチドを、プライマー中
に存在する変異部取込みベクターのすべてのヌクレオチ
ド配列を複製するDNAポリメラーゼ用プライマ一として
使用した。
に存在する変異部取込みベクターのすべてのヌクレオチ
ド配列を複製するDNAポリメラーゼ用プライマ一として
使用した。
【００５６】プローブとしてプライマー自体を使用する
パイブリダイゼーション法によって、所望の変性を受け
たS1遺伝子を包含するベクターを単離した。
パイブリダイゼーション法によって、所望の変性を受け
たS1遺伝子を包含するベクターを単離した。
【００５７】ついで、Sanger F.らの方法［「P.N.A.
S.」74, 5463 (1977)］によって、変性遺伝子の正確な
ヌクレオチド配列を確認した。
S.」74, 5463 (1977)］によって、変性遺伝子の正確な
ヌクレオチド配列を確認した。
【００５８】変性遺伝子を含有するベクターを、制限酵
素EcoRI及びHindIIIで消化して、変性S1をコードづけす
る遺伝子を含有するDNAフラグメントを公知のものの中
から選ばれる発現プラスミドでクローン化した。
素EcoRI及びHindIIIで消化して、変性S1をコードづけす
る遺伝子を含有するDNAフラグメントを公知のものの中
から選ばれる発現プラスミドでクローン化した。
【００５９】このハイブリッドプラスミドを使用して、
大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)及び酵母の中から
選ばれる宿主微生物を形質転換させた。
大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)及び酵母の中から
選ばれる宿主微生物を形質転換させた。
【００６０】特に、本発明では、プラスミドPEx 34 (Ce
nter for Molecular Biology、ハイデルベルグ、西独)
及びE.coli K12-△H1-△trp［Remant E.ら「Gene」15,
81-93(1981)］を使用した。
nter for Molecular Biology、ハイデルベルグ、西独)
及びE.coli K12-△H1-△trp［Remant E.ら「Gene」15,
81-93(1981)］を使用した。
【００６１】ついで、形質転換せしめた微生物を、液状
培地中、炭素、窒素及び無機塩の存在下、温度30ないし
45℃で20分ないし５時間培養した。
培地中、炭素、窒素及び無機塩の存在下、温度30ないし
45℃で20分ないし５時間培養した。
【００６２】この時間の経過後、遠沈によって菌体を培
地から採取し、常法によって溶菌化した。
地から採取し、常法によって溶菌化した。
【００６３】タンパク質を含有する溶菌生成物を分析し
て、その酵素活性を測定した。
て、その酵素活性を測定した。
【００６４】得られた結果(後述の実施例３に報告する)
は、S1の配列において109位(17)及び124位(16)(これら
のいずれか一方又は両方)及び121位(27)のアミノ酸を置
換することによって、ADP−リボシレーション活性の良
好な低減(5−80%)、従って毒性の良好な低減が達成され
たことを示した。さらに、８位及び９位(41)、50位及び
53位(22)及び129位(28)のアミノ酸を置換させることに
よってサブユニットS1の酵素活性が完全に消失した。
は、S1の配列において109位(17)及び124位(16)(これら
のいずれか一方又は両方)及び121位(27)のアミノ酸を置
換することによって、ADP−リボシレーション活性の良
好な低減(5−80%)、従って毒性の良好な低減が達成され
たことを示した。さらに、８位及び９位(41)、50位及び
53位(22)及び129位(28)のアミノ酸を置換させることに
よってサブユニットS1の酵素活性が完全に消失した。
【００６５】このサブユニットは、インビボにおいて特
異的な抗体を生じさせ、このサブユニットは抗PT保護モ
ノクロナール抗体と反応し得る(サブユニット28)。
異的な抗体を生じさせ、このサブユニットは抗PT保護モ
ノクロナール抗体と反応し得る(サブユニット28)。
【００６６】従って、このような変性サブユニットを含
有するポリペプチドは抗百日咳ワクチンの調製に適して
いる。
有するポリペプチドは抗百日咳ワクチンの調製に適して
いる。
【００６７】変性サブユニットS1に加えてPTサブユニッ
トS2、S3、S4及びS5の少なくとも１つを含有するポリペ
プチドが好適である。
トS2、S3、S4及びS5の少なくとも１つを含有するポリペ
プチドが好適である。
【００６８】特に、抗百日咳毒素によって示されるもの
と同じ配列及び配置を有するサブユニットS2、S3、S4及
びS5を有するポリペプチドが好適である。
と同じ配列及び配置を有するサブユニットS2、S3、S4及
びS5を有するポリペプチドが好適である。
【００６９】このような好適なポリペプチドは、PTオペ
ロン内に含有されるS1をコードづけする遺伝子を変性さ
せ、変性サブユニットS1及びサブユニットS2、S3、S4及
びS5の１又はそれ以上を含有するポリペプチドをコード
づけするプラスミド(変性S1遺伝子はその領域を含有す
る)を構成せしめることによって調製される。
ロン内に含有されるS1をコードづけする遺伝子を変性さ
せ、変性サブユニットS1及びサブユニットS2、S3、S4及
びS5の１又はそれ以上を含有するポリペプチドをコード
づけするプラスミド(変性S1遺伝子はその領域を含有す
る)を構成せしめることによって調製される。
【００７０】本発明によれば、それぞれS1変性サブユニ
ット22、28及び41をコードづけする遺伝子を含有するプ
ラスミドPTE 255-22、PTE255-28及びPTE255-41は、E.co
li(PTE255-22)、E.coli(PTE255-28)及びE.coli(PTE255-
41)として、アメリカン・タイプ・カルチャー・センタ
ーに寄託されている(各寄託番号；ATCC 67542、ATCC675
43及びATCC 67544)。
ット22、28及び41をコードづけする遺伝子を含有するプ
ラスミドPTE 255-22、PTE255-28及びPTE255-41は、E.co
li(PTE255-22)、E.coli(PTE255-28)及びE.coli(PTE255-
41)として、アメリカン・タイプ・カルチャー・センタ
ーに寄託されている(各寄託番号；ATCC 67542、ATCC675
43及びATCC 67544)。
【００７１】
【実施例】以下の実施例は本発明を説明するためのもの
であり、限定するものではない。
であり、限定するものではない。
【００７２】（実施例１）ADP−リボシレーション活性
に相関するS1サブユニット領域の同定 Ａ．3'末端部を削除することによる変性S1コードづけ遺
伝子含有ハイブリッドプラスミドの構成 プラスミドPTE255 10μgを緩衝溶液(50mM Tris−HCl (p
H7.4)、10mM MgCl2、100mM NaCl) 100μlに懸濁化さ
せ、制限酵素XbaI(BRL) 30単位(U)により37℃で２時間
消化し、消化混合物のそれぞれ10μlを酵素NcoI、Bal
I、NruI、SalI及びSphIの１つ(各3U)により37℃で２時
間以上処理した。
に相関するS1サブユニット領域の同定 Ａ．3'末端部を削除することによる変性S1コードづけ遺
伝子含有ハイブリッドプラスミドの構成 プラスミドPTE255 10μgを緩衝溶液(50mM Tris−HCl (p
H7.4)、10mM MgCl2、100mM NaCl) 100μlに懸濁化さ
せ、制限酵素XbaI(BRL) 30単位(U)により37℃で２時間
消化し、消化混合物のそれぞれ10μlを酵素NcoI、Bal
I、NruI、SalI及びSphIの１つ(各3U)により37℃で２時
間以上処理した。
【００７３】このようにして消化したDNA混合物(それぞ
れ75bp XbaI−NcoI、377bp XbaI−BalI、165bp XbaI−N
ruI、355bp XbaI−SAlI及び503bp XbaI−SphIフラグメ
ントを含有する)に、Klenewポリメラーゼラージフラグ
メント3U及びデゾキシヌクレオチドdATP、dTTP、dCTP及
びdGTPの各50mMを含有する溶液2μlを添加して分子末端
を修繕した。
れ75bp XbaI−NcoI、377bp XbaI−BalI、165bp XbaI−N
ruI、355bp XbaI−SAlI及び503bp XbaI−SphIフラグメ
ントを含有する)に、Klenewポリメラーゼラージフラグ
メント3U及びデゾキシヌクレオチドdATP、dTTP、dCTP及
びdGTPの各50mMを含有する溶液2μlを添加して分子末端
を修繕した。
【００７４】混合物を室温(20−25℃)に15分間及び65℃
にさらに30分間維持し、酵素ポリメラーゼを不活性化し
た。この時間の経過後、混合物をリガーゼ緩衝液(66mM
Tris−HCl (pH7.6)、１mM ATP、10mM MgCl2、10mM ジチ
オトレイトール)で200μlに希釈し、T4 DNAリガーゼ１U
の存在下、15℃に１夜維持して、上記フラグメントを失
ったDNA分子を再度相互に結合させた。ついで、リガー
ゼ混合物を使用して、50mM CaCl2での処理［Mandel M.
及びHiga「I.Mol.Biol」53, 154 (1970)］によって調製
したK12−HLtrp大腸菌を形質転換させた。アンピシリン
30μg/mlを含有するLBアーガー［10g/l Bacto Tryptone
(DIFCO)、5g/l Bacto Yeast extract(DIFCO)、5g/l Na
Cl］上に菌体を置き、30℃で18時間インキュベートする
ことによって形質転換を選別した。正確なヌクレオチド
配列を特定するため、組換えプラスミドを分析に供し
た。
にさらに30分間維持し、酵素ポリメラーゼを不活性化し
た。この時間の経過後、混合物をリガーゼ緩衝液(66mM
Tris−HCl (pH7.6)、１mM ATP、10mM MgCl2、10mM ジチ
オトレイトール)で200μlに希釈し、T4 DNAリガーゼ１U
の存在下、15℃に１夜維持して、上記フラグメントを失
ったDNA分子を再度相互に結合させた。ついで、リガー
ゼ混合物を使用して、50mM CaCl2での処理［Mandel M.
及びHiga「I.Mol.Biol」53, 154 (1970)］によって調製
したK12−HLtrp大腸菌を形質転換させた。アンピシリン
30μg/mlを含有するLBアーガー［10g/l Bacto Tryptone
(DIFCO)、5g/l Bacto Yeast extract(DIFCO)、5g/l Na
Cl］上に菌体を置き、30℃で18時間インキュベートする
ことによって形質転換を選別した。正確なヌクレオチド
配列を特定するため、組換えプラスミドを分析に供し
た。
【００７５】これにより、以下のハイブリッドプラスミ
ドが同定された。
ドが同定された。
【００７６】PTE NCO S1遺伝子は、アミノ酸255から211まででなるサブユニッ
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
【００７７】PTE NRU S1遺伝子は、アミノ酸255から180まででなるサブユニッ
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
【００７８】PTE BAL S1遺伝子は、アミノ酸255から124まででなるサブユニッ
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
【００７９】PTE SAL S1遺伝子は、アミノ酸255から110まででなるサブユニッ
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
【００８０】PTE SPH S1遺伝子は、アミノ酸255から68まででなるサブユニッ
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
トS1のカルボキシ末端配列をコードづけする部分を失っ
ている。
【００８１】Ｂ．5'末端部を削除することによる変性S1
コードづけ遺伝子含有ハイブリッドプラスミドの構成 プラスミドPTE 255 3プローブ(各10μg)を、緩衝溶液(5
0mM Tris−HCl (pH7.4)、10mM MgCl2、50mM NaCl) 100
μl中、37℃、３時間で、それぞれ制限酵素SphI、SalI
及びBalI(各30U)で消化した。
コードづけ遺伝子含有ハイブリッドプラスミドの構成 プラスミドPTE 255 3プローブ(各10μg)を、緩衝溶液(5
0mM Tris−HCl (pH7.4)、10mM MgCl2、50mM NaCl) 100
μl中、37℃、３時間で、それぞれ制限酵素SphI、SalI
及びBalI(各30U)で消化した。
【００８２】各溶液に、デゾキシヌクレオチドdATP、dT
TP、dCTP及びdGTPの各50mMを含有する溶液2μlと供に、
Klenowラージフラグメントポリメラーゼ3Uを添加し、20
−25℃に15分間維持した後、65℃に30分間維持して酵素
を不活性化させた。
TP、dCTP及びdGTPの各50mMを含有する溶液2μlと供に、
Klenowラージフラグメントポリメラーゼ3Uを添加し、20
−25℃に15分間維持した後、65℃に30分間維持して酵素
を不活性化させた。
【００８３】ついで、各溶液に、制限酵素HindIII 30U
を添加し、得られた混合物を37℃に３時間し、ついで1.
5％アガロースゲル上に負荷し、70Vで3.5時間泳動させ
た。
を添加し、得られた混合物を37℃に３時間し、ついで1.
5％アガロースゲル上に負荷し、70Vで3.5時間泳動させ
た。
【００８４】このようにして、各混合物について２つの
バンドが分離され、１つはS1の削除部分を含有し、他は
PEx 34プラスミド及びS1の部分を含有していた。
バンドが分離され、１つはS1の削除部分を含有し、他は
PEx 34プラスミド及びS1の部分を含有していた。
【００８５】その後、Maniatisの方法［「モレキュラ
ー．クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Mol
ecular Cloning：a laboratory manual)」Cold Spring
Harbor, 1982］によって、520bp SphI−HindIII、372bp
SalI−HindIII及び394bp BalI−HindIIIフラグメント
を電気溶出した。これらフラグメントの各100ngを、リ
ガーゼ混合物30μl中、T4リガーゼ１Uの存在下で、予め
制限酵素BamHIで消化し、ポリメラーゼ及びデゾキシヌ
クレオチド溶液で処理しがつ制限酵素HindIIIで消化し
たプラスミドPEx 34と結合させた。リガーゼ混合物を使
用して、大腸菌K12−△HL−△trpを形質転換させ、前記
Ａ．で述べた如く、アンピシリンを含有するLBアーガー
上で形質転換体を選別した。
ー．クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Mol
ecular Cloning：a laboratory manual)」Cold Spring
Harbor, 1982］によって、520bp SphI−HindIII、372bp
SalI−HindIII及び394bp BalI−HindIIIフラグメント
を電気溶出した。これらフラグメントの各100ngを、リ
ガーゼ混合物30μl中、T4リガーゼ１Uの存在下で、予め
制限酵素BamHIで消化し、ポリメラーゼ及びデゾキシヌ
クレオチド溶液で処理しがつ制限酵素HindIIIで消化し
たプラスミドPEx 34と結合させた。リガーゼ混合物を使
用して、大腸菌K12−△HL−△trpを形質転換させ、前記
Ａ．で述べた如く、アンピシリンを含有するLBアーガー
上で形質転換体を選別した。
【００８６】陽性クローンから抽出したプラスミドの中
で、適当なフレームにクローン化フラグメントを含有す
るものについて、抗百日咳毒素抗体を使用するウエスタ
ンブロット法によって同定を行った。
で、適当なフレームにクローン化フラグメントを含有す
るものについて、抗百日咳毒素抗体を使用するウエスタ
ンブロット法によって同定を行った。
【００８７】これらのプラスミド(PTE SPH/HIND、PTE 2
55/SAL及びPTE255/BALと略称する)は、それぞれアミノ
酸1−67、1−109及び1−123でなるサブユニットのアミ
ノ末端部をコードづけするS1遺伝子配列を失っていた。
55/SAL及びPTE255/BALと略称する)は、それぞれアミノ
酸1−67、1−109及び1−123でなるサブユニットのアミ
ノ末端部をコードづけするS1遺伝子配列を失っていた。
【００８８】Ｃ．3'及び5'末端部を削除することによる
変性S1コードづけ遺伝子含有ハイブリッドプラスミドの
構成 上記Ａ．の如くして得られたプラスミドPTE NCOのサン
プル２つ(10μg)を、緩衝溶液(50mM Tris−HCl (pH7.
4)、10mM MgCl2、50mM NaCl) 100μl中、それぞれBstN1
(BRL) 30U及びBalI(BRL) 30Uにより37℃、３時間で消化
した。
変性S1コードづけ遺伝子含有ハイブリッドプラスミドの
構成 上記Ａ．の如くして得られたプラスミドPTE NCOのサン
プル２つ(10μg)を、緩衝溶液(50mM Tris−HCl (pH7.
4)、10mM MgCl2、50mM NaCl) 100μl中、それぞれBstN1
(BRL) 30U及びBalI(BRL) 30Uにより37℃、３時間で消化
した。
【００８９】ついで、消化混合物を、dATP、dGTP及びdT
TP 2mMの存在下、Klenewポリメラーゼ3Uにより20−25℃
で15分間処理して末端部を補完し、65℃で30分間インキ
ュベートした後、DNAを再度制限酵素HindIII 30Uにより
37℃、３時間で切断した。
TP 2mMの存在下、Klenewポリメラーゼ3Uにより20−25℃
で15分間処理して末端部を補完し、65℃で30分間インキ
ュベートした後、DNAを再度制限酵素HindIII 30Uにより
37℃、３時間で切断した。
【００９０】消化混合物を1.5％アガロースゲル上に負
荷し、70Vで3.5時間泳動し、上述の如くして、527bp Bs
tN1−HindIII及び279bp BalI−HindIIIフラグメントを
電気溶出した。
荷し、70Vで3.5時間泳動し、上述の如くして、527bp Bs
tN1−HindIII及び279bp BalI−HindIIIフラグメントを
電気溶出した。
【００９１】これらフラグメント100ngを、リガーゼ混
合物中、T4 DNAリガーゼ7Uの存在下、15℃、18時間で、
前記Ｂ．で述べた如く予め処理したプラスミドPEx 34に
結合させた。ついで、上述の如くして、大腸菌の形質転
換及び形質転換体の選別を行った。陽性のクローンから
抽出した組換えプラスミドの中で、正しいフレームに挿
入されたフラグメントを同定した。
合物中、T4 DNAリガーゼ7Uの存在下、15℃、18時間で、
前記Ｂ．で述べた如く予め処理したプラスミドPEx 34に
結合させた。ついで、上述の如くして、大腸菌の形質転
換及び形質転換体の選別を行った。陽性のクローンから
抽出した組換えプラスミドの中で、正しいフレームに挿
入されたフラグメントを同定した。
【００９２】該プラスミド(PTE 34A及びPTE NCO/BAL)
は、それぞれアミノ酸1−52及び255−211でなるサブユ
ニットS1の一部分をコードづけする遺伝子及びアミノ酸
１−124及び255−211でなる部分をコードづけする遺伝
子を失ったS1遺伝子を含有していた。
は、それぞれアミノ酸1−52及び255−211でなるサブユ
ニットS1の一部分をコードづけする遺伝子及びアミノ酸
１−124及び255−211でなる部分をコードづけする遺伝
子を失ったS1遺伝子を含有していた。
【００９３】Ｄ．PTE 16-A及び18-Bプラスミドの構成 プラスミドPTE 255 10μgを、緩衝溶液(100mM Tris−HC
l、50mM NaCl、10mM MgSO4) 100μl中、EcoRI 30Uで、
ついで緩衝溶液(10mM CaCl2、10mM MgCl2、0.2MNaCl、2
0mM Tris−HCl (pH8)、１mM EDTA)中、Bal 31(BRL)１U
で37℃において消化した。混合物の一定量を１、３、５
及び10分後に取出し、ついで5'末端部の削除フラグメン
トをHindIIIで切断し、ゲル電気泳動によって精製し、
溶出後、上述の如くしてプラスミドPEx 34に結合させ
た。得られたリガーゼ混合物を使用して大腸菌を形質転
換させ、上述の如く操作して、形質転換体を選別した。
l、50mM NaCl、10mM MgSO4) 100μl中、EcoRI 30Uで、
ついで緩衝溶液(10mM CaCl2、10mM MgCl2、0.2MNaCl、2
0mM Tris−HCl (pH8)、１mM EDTA)中、Bal 31(BRL)１U
で37℃において消化した。混合物の一定量を１、３、５
及び10分後に取出し、ついで5'末端部の削除フラグメン
トをHindIIIで切断し、ゲル電気泳動によって精製し、
溶出後、上述の如くしてプラスミドPEx 34に結合させ
た。得られたリガーゼ混合物を使用して大腸菌を形質転
換させ、上述の如く操作して、形質転換体を選別した。
【００９４】陽性のクローンから抽出したプラスミドか
ら、正しいフレームに挿入されたS1遺伝子フラグメント
を含有するプラスミド(そのヌクレオチド配列を分析に
よって確認)を単離した。
ら、正しいフレームに挿入されたS1遺伝子フラグメント
を含有するプラスミド(そのヌクレオチド配列を分析に
よって確認)を単離した。
【００９５】このようにして得られたプラスミドから、
S1アミノ末端部をコードづけする配列を持たないS1遺伝
子を含有するプラスミドを選別した。
S1アミノ末端部をコードづけする配列を持たないS1遺伝
子を含有するプラスミドを選別した。
【００９６】特に、プラスミドPTE 16-Aは最初のアミノ
酸10個をコードづけするヌクレオチドが欠けており、従
って、アミノ酸11-235を含有するタンパク質をコードづ
けするものであり、一方、プラスミドPTE 18-Aはアミノ
酸149−235を含有するタンパク質をコードづけするもの
である。
酸10個をコードづけするヌクレオチドが欠けており、従
って、アミノ酸11-235を含有するタンパク質をコードづ
けするものであり、一方、プラスミドPTE 18-Aはアミノ
酸149−235を含有するタンパク質をコードづけするもの
である。
【００９７】（実施例２）変性サブユニットS1の発現及
びそのADP−リボシレーション活性の測定 Ａ．前記実施例１の如くして調製したプラスミドで形質
転換させた大腸菌K12−△HL−△trpを、液状LB培地20ml
中、滑らかに撹拌しながら30℃で１夜培養した。
びそのADP−リボシレーション活性の測定 Ａ．前記実施例１の如くして調製したプラスミドで形質
転換させた大腸菌K12−△HL−△trpを、液状LB培地20ml
中、滑らかに撹拌しながら30℃で１夜培養した。
【００９８】各培地10mlをLB培地400mlに接取し、30℃
で２時間、42℃で2.5時間培養した。その後、培養物を
４℃において10000回転の速度で15分間遠心分離し、上
澄み液を排出し、菌体を回収し、溶液(2.5％ショ糖、10
mM Tris−HCl (pH8.0)、1mMEDTA) 3.2ml中に再度懸濁さ
せた。
で２時間、42℃で2.5時間培養した。その後、培養物を
４℃において10000回転の速度で15分間遠心分離し、上
澄み液を排出し、菌体を回収し、溶液(2.5％ショ糖、10
mM Tris−HCl (pH8.0)、1mMEDTA) 3.2ml中に再度懸濁さ
せた。
【００９９】この溶液にリゾチーム溶液(40mg/ml) 0.1m
l及び0.5M EDTA 0.8mlを添加し、ついで37℃で30分間反
応させた。
l及び0.5M EDTA 0.8mlを添加し、ついで37℃で30分間反
応させた。
【０１００】各溶液に細胞溶解緩衝液(１％、Triton−X
100、50mM Tris−HCl (pH6.0)、63mM EDTA) 8mlを加
え、０℃に15分間、37℃に30分間維持した。
100、50mM Tris−HCl (pH6.0)、63mM EDTA) 8mlを加
え、０℃に15分間、37℃に30分間維持した。
【０１０１】音波処理を１分間行った後、溶融した菌体
及び含まれていた部分を含有する混合物を10000回転の
速度で10分間遠心分離し、上澄み液を排出し、沈殿物を
ｌM尿素5ml中に再度懸濁化させ、37℃に30分間維持し
た。
及び含まれていた部分を含有する混合物を10000回転の
速度で10分間遠心分離し、上澄み液を排出し、沈殿物を
ｌM尿素5ml中に再度懸濁化させ、37℃に30分間維持し
た。
【０１０２】混合物を再度遠心分離し、沈殿物及び含ま
れていた部分を回収し、リン酸塩緩衝液(PBS) 5ml中に
溶解し、-20℃で保存した。
れていた部分を回収し、リン酸塩緩衝液(PBS) 5ml中に
溶解し、-20℃で保存した。
【０１０３】Ｂ．ADP−リボシレーション活性の分析 ADP−リボシレーションテストを実施する前に、含まれ
ていた部分を含有する溶液を遠心分離し、沈殿物を8M尿
素100μl中に再度懸濁化させた。
ていた部分を含有する溶液を遠心分離し、沈殿物を8M尿
素100μl中に再度懸濁化させた。
【０１０４】Manningらによる方法［「J.Biol.Chem.」2
59, 749-756 (1984)］に従ってADP−リボシレーション
テストを行った。
59, 749-756 (1984)］に従ってADP−リボシレーション
テストを行った。
【０１０５】実施にあたり、各溶液10μlを100mMジチオ
トレイトール溶液20μlと共に20−25℃で30分間プレイ
ンキュベートし、ついで牛の網膜のホモゲネート(ROS)
10μl、水80μl、Tris−HCl(pH7.5) 5μl、100mM ATP溶
液１μl、10mM GTP溶液１μl、チミジン10ml及び32PNAD
１μl(１nCi)を添加した。
トレイトール溶液20μlと共に20−25℃で30分間プレイ
ンキュベートし、ついで牛の網膜のホモゲネート(ROS)
10μl、水80μl、Tris−HCl(pH7.5) 5μl、100mM ATP溶
液１μl、10mM GTP溶液１μl、チミジン10ml及び32PNAD
１μl(１nCi)を添加した。
【０１０６】ついで、混合物を室温(20−25℃)で30分間
反応させ、遠心分離後、ROSを含有する残渣を回収し、
亜硫酸ドデシルナトリウム(SDS)緩衝液30μl中に溶解さ
せ、12.5％ポリアクリルアミトゲル上に負荷した。25mA
で４時間電気泳動させた後、ゲルを温度80℃において減
圧乾燥させ、オートラジオグラフィーに供した。放射線
活性のバンドをゲルから分離し、シンチレーション(Eco
nofluor、NEN)によって液5mlに懸濁化させ、べーターカ
ウンターで計数した。
反応させ、遠心分離後、ROSを含有する残渣を回収し、
亜硫酸ドデシルナトリウム(SDS)緩衝液30μl中に溶解さ
せ、12.5％ポリアクリルアミトゲル上に負荷した。25mA
で４時間電気泳動させた後、ゲルを温度80℃において減
圧乾燥させ、オートラジオグラフィーに供した。放射線
活性のバンドをゲルから分離し、シンチレーション(Eco
nofluor、NEN)によって液5mlに懸濁化させ、べーターカ
ウンターで計数した。
【０１０７】このようにして、変性タンパク質のADP−
リボシレーションを定量した。
リボシレーションを定量した。
【０１０８】得られた結果を表１に示す。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】この表から明らかなように、サブユニット
S1のADP−リボシレーション活性に関しては、5'末端配
列とは逆に、Nru部位(179位)に続く配列は必ずしも必要
ではない。
S1のADP−リボシレーション活性に関しては、5'末端配
列とは逆に、Nru部位(179位)に続く配列は必ずしも必要
ではない。
【０１１１】（実施例３）サブユニットS1の１−180領
域の活性部位の同定及び変異誘発 プラスミドPTE255 10μgを緩衝液［10mM Tris−HCl (pH
7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2］100μl中に懸濁化さ
せ、制限酵素EcoRI及びHindIIIの各30Uにより37℃、３
時間で消化した。
域の活性部位の同定及び変異誘発 プラスミドPTE255 10μgを緩衝液［10mM Tris−HCl (pH
7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2］100μl中に懸濁化さ
せ、制限酵素EcoRI及びHindIIIの各30Uにより37℃、３
時間で消化した。
【０１１２】ついで、消化混合物を1.3％アガロースに
負荷し、80mA、３時間で溶出した。
負荷し、80mA、３時間で溶出した。
【０１１３】このようにして操作することにより、２つ
のバンドが分離された。１つはベクターを含有する3500
bpであり、他方はサブユニットS1をコードづけする遺伝
子を含有する600bpである。
のバンドが分離された。１つはベクターを含有する3500
bpであり、他方はサブユニットS1をコードづけする遺伝
子を含有する600bpである。
【０１１４】600bpのバンドを電気溶出し、このフラグ
メント0.2μg及び予め制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化
したプラスミドBluescript SK(Stratagene、サンディエ
ゴ、カリフォルニア) 0.3ngを、緩衝溶液(66mM Tris−H
Cl (pH7.5)、1mM ATP、10mMMgCl2、10mMジチオトレイト
ール) 20μl中に懸濁化させ、T4 DNAリガーゼ１Uの存在
下、15℃、18時間で相互に結合させた。
メント0.2μg及び予め制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化
したプラスミドBluescript SK(Stratagene、サンディエ
ゴ、カリフォルニア) 0.3ngを、緩衝溶液(66mM Tris−H
Cl (pH7.5)、1mM ATP、10mMMgCl2、10mMジチオトレイト
ール) 20μl中に懸濁化させ、T4 DNAリガーゼ１Uの存在
下、15℃、18時間で相互に結合させた。
【０１１５】ついで、リガーゼ混合物を使用して大腸菌
JM101(安定させたもの)を形質転換させ、アンピシリン1
00μg/ml、IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラ
ノシド) 20μg/ml及びX−Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-イ
ンドリル-D-ガラクトピラノシド) 20μg/mlを含有するL
Bアーガー上で形質転換体を選別した。
JM101(安定させたもの)を形質転換させ、アンピシリン1
00μg/ml、IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラ
ノシド) 20μg/ml及びX−Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-イ
ンドリル-D-ガラクトピラノシド) 20μg/mlを含有するL
Bアーガー上で形質転換体を選別した。
【０１１６】恒温室において37℃で18時間培地をインキ
ュベートした。Bluescript SKベクター及び600bp DNAフ
ラグメントを包含するハイブリッドプラスミドを含有す
る白色の菌体を使用し、下記の如く操作してクローン化
フラグメントのシングルら線DNAを単離した。
ュベートした。Bluescript SKベクター及び600bp DNAフ
ラグメントを包含するハイブリッドプラスミドを含有す
る白色の菌体を使用し、下記の如く操作してクローン化
フラグメントのシングルら線DNAを単離した。
【０１１７】すなわち、白色の菌体を、LB液体培地1.5m
l中で、590mmにおける光学密度(OD)が約0.15に達するま
で培養した。
l中で、590mmにおける光学密度(OD)が約0.15に達するま
で培養した。
【０１１８】つづいて、この培養物に、F1ファージ(Str
atagen)のLB懸濁液(5×1012ファージ/ml) 10μlを添加
し、得られた溶液を37℃に６−８時間維持した。
atagen)のLB懸濁液(5×1012ファージ/ml) 10μlを添加
し、得られた溶液を37℃に６−８時間維持した。
【０１１９】その後、遠沈によって菌体を培地から分離
し、上澄み液を回収した。この上澄み液１mlに20％ポリ
エチレングリコール(PEG)及び2.5mM NaClを添加してフ
ァージを沈殿させた。
し、上澄み液を回収した。この上澄み液１mlに20％ポリ
エチレングリコール(PEG)及び2.5mM NaClを添加してフ
ァージを沈殿させた。
【０１２０】室温(20−25℃)に15分間維持した後、Eppe
ndorf遠心分離機において20℃、12000gで５分間遠心分
離し、このようにして得られたファージをTE緩衝液(10m
M Tris−HCl (pH7.5)、１mM EDTA) 100μl中に懸濁化さ
せた。
ndorf遠心分離機において20℃、12000gで５分間遠心分
離し、このようにして得られたファージをTE緩衝液(10m
M Tris−HCl (pH7.5)、１mM EDTA) 100μl中に懸濁化さ
せた。
【０１２１】ついで、この溶液を、１容の水−飽和フェ
ノールで１回、エチルエーテルで２回抽出処理し、ファ
ージ水溶液にエタノール250μl及び３M酢酸アンモニウ
ム10μlを添加してシングルら線DNAを沈殿させた。遠沈
によってDNAを混合物から分離し、TE緩衝液20μlに再度
懸濁させ、直接変異誘発［Zollerら「DNA」3, 479-488
(1984)］に使用した。
ノールで１回、エチルエーテルで２回抽出処理し、ファ
ージ水溶液にエタノール250μl及び３M酢酸アンモニウ
ム10μlを添加してシングルら線DNAを沈殿させた。遠沈
によってDNAを混合物から分離し、TE緩衝液20μlに再度
懸濁させ、直接変異誘発［Zollerら「DNA」3, 479-488
(1984)］に使用した。
【０１２２】この目的のため、所望のアミノ酸の少なく
とも１つをコードづけする塩基を他のアミノ酸をコード
づけするように変化させたオリゴヌクレオチドを、自動
装置１Plus DNA Synthesizer System (Beckman)によっ
て合成した。
とも１つをコードづけする塩基を他のアミノ酸をコード
づけするように変化させたオリゴヌクレオチドを、自動
装置１Plus DNA Synthesizer System (Beckman)によっ
て合成した。
【０１２３】該オリゴヌクレオチド(プラスミドBluescr
ipt SK内でクローン化されたシングルら線DNA内に存在
する配列に対して相補的である)は、プライマー内に存
在する変異部分を取込む全Bluescriptヌクレオチド配列
を転写するDNAポリメラーゼ用のプライマーとして使用
される。
ipt SK内でクローン化されたシングルら線DNA内に存在
する配列に対して相補的である)は、プライマー内に存
在する変異部分を取込む全Bluescriptヌクレオチド配列
を転写するDNAポリメラーゼ用のプライマーとして使用
される。
【０１２４】実際には、合成オリゴヌクレオチド3mM
に、10mM ATP 2μl、Kinase 10X (550mM Tris−HCl (pH
8.0)、100mM MgCl2) 緩衝液2μl、100mMジチオトレイト
ール(DTT)１μl及びKinaseポリヌクレオチド(Bochringe
r) 5Uを添加し、最終容量を20μlとした。
に、10mM ATP 2μl、Kinase 10X (550mM Tris−HCl (pH
8.0)、100mM MgCl2) 緩衝液2μl、100mMジチオトレイト
ール(DTT)１μl及びKinaseポリヌクレオチド(Bochringe
r) 5Uを添加し、最終容量を20μlとした。
【０１２５】混合物を37℃で30分間インキュベートし、
70℃に10分間維持して酵素を不活性化させた。
70℃に10分間維持して酵素を不活性化させた。
【０１２６】Kinase 10X １容中にシングルフィラメン
ト(マトリックスとして使用)１μg、１mM Tris−HCl (p
H8.0)−10mM MgCl2緩衝液１μlを含有する液をプライマ
ー2μlに添加した。
ト(マトリックスとして使用)１μg、１mM Tris−HCl (p
H8.0)−10mM MgCl2緩衝液１μlを含有する液をプライマ
ー2μlに添加した。
【０１２７】混合物を80℃に約３分間維持し、ついで室
温に約１時間維持した。
温に約１時間維持した。
【０１２８】１mM Tris−HCl (pH8.0)−10mM MgCl2緩衝
液10μl、0.05mM ATP、１mM DTT、４種類のデゾキシヌ
クレオチド0.5mM、T4 DNAリガーゼ１U及びDNAポリメラ
ーゼ(Fragment Klenow) 2.5Uを順次添加した。
液10μl、0.05mM ATP、１mM DTT、４種類のデゾキシヌ
クレオチド0.5mM、T4 DNAリガーゼ１U及びDNAポリメラ
ーゼ(Fragment Klenow) 2.5Uを順次添加した。
【０１２９】混合物を15℃で１夜インキュベートし、つ
いで上述の如き大腸菌JM 101の形質転換に使用した。
いで上述の如き大腸菌JM 101の形質転換に使用した。
【０１３０】変異誘発に使用したプライマーをプローブ
として使用するハイブリッドプラスミド法によって、変
異S1遺伝子を含有するプラスミドを確認した(32Pと符号
づけする)。実施にあたっては、形質転換された培養物
を含有するニトロセルロースフィルターを、6×SSC(１
×SSC＝0.015M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7)
10x Denhardt(１％BSA、１％Fioll、１％ポリビニルピ
ロリドン)及び0．2％硫酸ドデシルナトリウム(DSD)中、
20−25℃、18時間でバイブリダイズし、6×SSC中、下記
の温度で２時間洗浄した。
として使用するハイブリッドプラスミド法によって、変
異S1遺伝子を含有するプラスミドを確認した(32Pと符号
づけする)。実施にあたっては、形質転換された培養物
を含有するニトロセルロースフィルターを、6×SSC(１
×SSC＝0.015M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7)
10x Denhardt(１％BSA、１％Fioll、１％ポリビニルピ
ロリドン)及び0．2％硫酸ドデシルナトリウム(DSD)中、
20−25℃、18時間でバイブリダイズし、6×SSC中、下記
の温度で２時間洗浄した。
【０１３１】 25及び26位の変異体 45℃ 28、22及び29位の変異体 48℃ 27位の変異体 54℃ 31及び41位の変異体 46℃。
【０１３２】Sanger F.らの方法［「P.N.A.S.」74, 546
3 (1977)］に従って遺伝子のヌクレオチド配列の分析を
行うことによって、変異の誘発を確認した。
3 (1977)］に従って遺伝子のヌクレオチド配列の分析を
行うことによって、変異の誘発を確認した。
【０１３３】上述の如く操作することにより、変性S1を
コードづけする遺伝子を含有する下記のプラスミドを調
製した。
コードづけする遺伝子を含有する下記のプラスミドを調
製した。
【０１３４】41：プライマーGTCATAGCCGTCTACGGTを使用
して、チロシン(8)及びアルギニン(9)をそれぞれアスパ
ラギン酸及びグリシンに置換させた。相当する遺伝子
は、このような変性により、その配列が620-CGCCACCGTA
TACCGCTATGACTCCCGCCCG-650から620-CGCCACCGTAGACGGCT
ATGACTCCCGCCCG-650に変化した。
して、チロシン(8)及びアルギニン(9)をそれぞれアスパ
ラギン酸及びグリシンに置換させた。相当する遺伝子
は、このような変性により、その配列が620-CGCCACCGTA
TACCGCTATGACTCCCGCCCG-650から620-CGCCACCGTAGACGGCT
ATGACTCCCGCCCG-650に変化した。
【０１３５】22：プライマーTGGAGACGTCAGCGCTGTを使用
して、フェニルアラニン(50)及びトレオニン(53)をそれ
ぞれグルタミン酸及びイソロイシンに置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が750-
AGCGCTTTCGTCTCCACCAGC-770から750-AGCGCTGACGTCTCCAT
CAGC-770に変化した。
して、フェニルアラニン(50)及びトレオニン(53)をそれ
ぞれグルタミン酸及びイソロイシンに置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が750-
AGCGCTTTCGTCTCCACCAGC-770から750-AGCGCTGACGTCTCCAT
CAGC-770に変化した。
【０１３６】25：プライマーCTGGCGGCTTCGTAGAAAを使用
して、グリシン(99)をグルタミン酸に置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が910-
TACGGCGCCGC-920から910-TACGAAGCCGC-920に変化した。
して、グリシン(99)をグルタミン酸に置換させた。相当
する遺伝子は、このような変性により、その配列が910-
TACGGCGCCGC-920から910-TACGAAGCCGC-920に変化した。
【０１３７】17：プライマーCTGGTAGGTGTCCAGCGCGCCを
使用して、アスパラギン酸(109)をグリシンに置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTA-940から930-GTCCGCACTTA-940に変
化した。
使用して、アスパラギン酸(109)をグリシンに置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTA-940から930-GTCCGCACTTA-940に変
化した。
【０１３８】27：プライマーGCCAGCGCTTCGGCGAGGを使用
して、グリシン(121)をグルタミン酸に置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が95
6-GCCGGCGCGCT-966から956-GCCGAAGCGCT-966に変化し
た。
して、グリシン(121)をグルタミン酸に置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が95
6-GCCGGCGCGCT-966から956-GCCGAAGCGCT-966に変化し
た。
【０１３９】16：プライマーGCCATAAGTGCCGACGTATTCを
使用して、アラニン(124)をアスパラギン酸に置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が976-TGGCCACCTAC-984から976-TGGACACCTAC-986に変
化した。
使用して、アラニン(124)をアスパラギン酸に置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が976-TGGCCACCTAC-984から976-TGGACACCTAC-986に変
化した。
【０１４０】1716：16及び17の変異を併せて包含する。
【０１４１】28：プライマーGCCAGATACCCGCTCTGGを使用
して、グルタミン酸(129)をグリシンに置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が99
0-AGCGAATATCT-1000から990-AGCGGGTATCT-1000に変化し
た。
して、グルタミン酸(129)をグリシンに置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が99
0-AGCGAATATCT-1000から990-AGCGGGTATCT-1000に変化し
た。
【０１４２】29：プライマーGCGGAATGTCCCGGTGTGを使用
して、アルギニン(135)をグルタミン酸に置換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
1010-GCGCATTCCGC-1020から1010-GGACATTCCGC-1020に変
化した。
して、アルギニン(135)をグルタミン酸に置換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
1010-GCGCATTCCGC-1020から1010-GGACATTCCGC-1020に変
化した。
【０１４３】31：プライマーTACTCCGTTTTCGTGGTCを使用
して、トレオニン(159)をリシンに置換させた。相当す
る遺伝子は、このような変性により、その配列が1070-G
CATCACCGGCGAGACCACGACCACGGAGTA-1090から1070-GCATCA
CCGGCGAGACCACGAAAACGGAGTA-1090に変化した。
して、トレオニン(159)をリシンに置換させた。相当す
る遺伝子は、このような変性により、その配列が1070-G
CATCACCGGCGAGACCACGACCACGGAGTA-1090から1070-GCATCA
CCGGCGAGACCACGAAAACGGAGTA-1090に変化した。
【０１４４】26：プライマーCGCCACCAGTGTCGACGTATTCGA
を使用して、チロシン(111)をグリシンに置換させた。
さらに、プライマーフラグメントの部分複写によって、
113位においてアミノ酸Asp Thr Gly Glyの挿入が生じ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTATGGCGACAAT-950から930-GTCGACACT
GGTGGCGACACTGGTGGCGACAAT-950に変化した。
を使用して、チロシン(111)をグリシンに置換させた。
さらに、プライマーフラグメントの部分複写によって、
113位においてアミノ酸Asp Thr Gly Glyの挿入が生じ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が930-GTCGACACTTATGGCGACAAT-950から930-GTCGACACT
GGTGGCGACACTGGTGGCGACAAT-950に変化した。
【０１４５】S1遺伝子を含有するプラスミドを、制限酵
素EcoRI及びHindIIIで再度消化し、ゲル電気泳動によっ
て、消化混合物から上記変異部分を有するDNAフラグメ
ントを分離し、電気溶出し、上述の如く操作して、リガ
ーゼ混合物中、PEx 34Bベクター内でクローン化した。
素EcoRI及びHindIIIで再度消化し、ゲル電気泳動によっ
て、消化混合物から上記変異部分を有するDNAフラグメ
ントを分離し、電気溶出し、上述の如く操作して、リガ
ーゼ混合物中、PEx 34Bベクター内でクローン化した。
【０１４６】リガーゼ混合物を使用して、大腸菌K12−
△H1−△trpを形質転換させ、アンピシリン30μg/mlを
含有するLBアーガー培地上、30℃で形質転換体を単離し
た。
△H1−△trpを形質転換させ、アンピシリン30μg/mlを
含有するLBアーガー培地上、30℃で形質転換体を単離し
た。
【０１４７】ついで、変異プラスミドを含有する陽性の
クローンを、実施例２に記載の如くしてLB液体培地中で
培養し、溶菌処理後、得られたサブユニットS1のADP−
リボシレーション活性を測定した。
クローンを、実施例２に記載の如くしてLB液体培地中で
培養し、溶菌処理後、得られたサブユニットS1のADP−
リボシレーション活性を測定した。
【０１４８】結果を表２に示す。
【０１４９】
【表２】
【０１５０】上述の結果から、変異体28では、唯１つの
アミノ酸の置換によって酵素活性が完全に失なわれてお
り、特に興味深いものであることが理解される。
アミノ酸の置換によって酵素活性が完全に失なわれてお
り、特に興味深いものであることが理解される。
【０１５１】
【発明の効果】本発明の免疫活性ポリペプチドを用いる
ことにより、従来よりも毒性のないまたは毒性が低減さ
れた抗百日咳ワクチンを調製することができる。
ことにより、従来よりも毒性のないまたは毒性が低減さ
れた抗百日咳ワクチンを調製することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 596089539 Ｖｉａ・Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎａ １，ｓ ｉｅｎａ，ＩＴＡＬＹ (72)発明者 リーノ・ラップオーリ イタリー国ケルチェグロッサ市ビア・カ ラマンドレイ 35 (56)参考文献 特開 平１−165370（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／1976（ＷＯ，Ａ１) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．232，ｐ. 1258−1264（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/31 C07K 14/235 C12P 21/02
Claims (1)
- 【請求項１】 抗百日咳ワクチンの調製に使用される毒
性のない又は毒性が低減された免疫活性ポリペプチドで
あって、該免疫活性ポリペプチドは、アミノ酸１から18
0までのS1領域における１又はそれ以上の位置で、アミ
ノ酸を、免疫特性を変質させることなくS1の毒性を破壊
又は低減させ得る他のアミノ酸で直接変異誘発置換する
ことによって変性せしめた百日咳毒素のサブユニットS1
を含有し、ここで、該置換される位置及びアミノ酸が、
８位チロシン、９位アルギニン、50位フェニルアラニ
ン、53位トレオニン、121位グリシン、124位アラニン、
および109位アスパラギン酸の１又はそれ以上の位置で
置換され、８位チロシンが置換される場合はアスパラギ
ン酸に置換され、９位アルギニンが置換される場合はグ
リシンに置換される、免疫活性ポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT22481A/87 | 1987-11-02 | ||
| IT22481/87A IT1223334B (it) | 1987-11-02 | 1987-11-02 | Polipeptidi immunologicamente attivi con una tossicita' alterata utili per la preparazione di un vaccino antipertosse |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63276322A Division JP2728275B2 (ja) | 1987-11-02 | 1988-11-02 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09157293A JPH09157293A (ja) | 1997-06-17 |
| JP2857105B2 true JP2857105B2 (ja) | 1999-02-10 |
Family
ID=11196853
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63276322A Expired - Lifetime JP2728275B2 (ja) | 1987-11-02 | 1988-11-02 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
| JP8160348A Expired - Lifetime JP2857105B2 (ja) | 1987-11-02 | 1996-06-20 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63276322A Expired - Lifetime JP2728275B2 (ja) | 1987-11-02 | 1988-11-02 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0322533B1 (ja) |
| JP (2) | JP2728275B2 (ja) |
| AT (1) | ATE123062T1 (ja) |
| CA (1) | CA1341582C (ja) |
| DE (1) | DE3853876T2 (ja) |
| ES (1) | ES2072857T3 (ja) |
| HK (1) | HK192995A (ja) |
| IT (1) | IT1223334B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| KR0168039B1 (ko) * | 1987-09-04 | 1999-01-15 | 로버트 디. 웨스트 | 재조합 dna에서 유도한 보르데텔라 외독소 소단위체의 유사체 및 그를 포함하는 백신 |
| US5358868A (en) * | 1987-11-24 | 1994-10-25 | Connaught Laboratories Limited | Genetic detoxification of pertussis toxin |
| US5332583A (en) * | 1987-11-24 | 1994-07-26 | Connaught Laboratories Limited | Vaccine containing genetically-detoxified pertussis holotoxin |
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
| US5244657A (en) * | 1987-11-24 | 1993-09-14 | Connaught Laboratories Limited | Genetic detoxification of pertussis toxin |
| IT1223529B (it) * | 1987-12-18 | 1990-09-19 | Sclavo Spa | Epitopo immunodominante protettivo contenuto nella subunita' s1 della tossina della pertosse |
| AP8900132A0 (en) * | 1988-07-22 | 1991-01-14 | Smithkline Biolog | Bordetella pertussis vaccine |
| DK0396964T3 (da) * | 1989-04-28 | 1995-10-30 | Sclavo Spa | Pertussistoxin-mutanter, Bordetella-stammer, der er i stand til at producere sådanne mutanter, samt deres anvendelse til udvikling af antipertussis-vacciner |
| US5786189A (en) * | 1989-11-29 | 1998-07-28 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine |
| IT1248735B (it) * | 1990-06-21 | 1995-01-26 | Sclavo Spa | Vaccini acellulari contro la pertosse |
| US5856122A (en) | 1993-08-24 | 1999-01-05 | University Of Alberta | Modification of pertussis toxin |
| GB9908263D0 (en) * | 1999-04-13 | 1999-06-02 | Binding Site The Limited | Eliciting improved immune responses |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| GB0313242D0 (en) * | 2003-06-09 | 2003-07-16 | Imp College Innovations Ltd | Pulmonary immunopathology |
| GB0313916D0 (en) | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
| WO2008028957A2 (en) | 2006-09-07 | 2008-03-13 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine |
| EA201490303A1 (ru) | 2007-05-02 | 2014-05-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина |
| TW201103980A (en) | 2009-07-08 | 2011-02-01 | Abbott Biologicals Bv | Viral vaccine and use thereof |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
| JP2015525794A (ja) | 2012-08-06 | 2015-09-07 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 乳児においてｒｓｖ及び百日咳菌に対する免疫応答を惹起するための方法 |
| RU2015111987A (ru) * | 2012-10-12 | 2016-12-10 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс Са | Несшитые бесклеточные коклюшные антигены для применения в комбинированных вакцинах |
| US8916173B2 (en) | 2013-03-08 | 2014-12-23 | Crucell Holland B.V. | Acellular pertussis vaccine |
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|---|---|---|---|---|
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