CN114276431A - 一种骆驼奶特征肽段组合及鉴定方法 - Google Patents

一种骆驼奶特征肽段组合及鉴定方法 Download PDF

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CN114276431A CN202111612793.9A CN202111612793A CN114276431A CN 114276431 A CN114276431 A CN 114276431A CN 202111612793 A CN202111612793 A CN 202111612793A CN 114276431 A CN114276431 A CN 114276431A
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Abstract

本发明涉及一种骆驼奶特征肽段组合及鉴定方法，通过高效液相色谱‑串联质谱联用技术检测，找到专属性的特征多肽标志物组合，特征肽段组合包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示鉴定骆驼奶粉真实性的特征肽段，SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.8可鉴别单双峰骆驼奶。本发明通过大量实验筛选，从具有物种专属性特征肽段中筛选出性质稳定、响应高、重复性好的肽段，排除酶解性质、蛋白修饰及基质效应对检测的影响，建立的方法灵敏度高，准确度好，可操作性强。此外，本发明选择蛋白中的特征肽段作为检测对象，其不受蛋白稳定性和深加工的影响，可满足样品中的非变性与变性蛋白检测，方法的适用性强。为骆驼乳制品掺伪监测和商品标签真实性监管提供有效的技术手段。

Description

一种骆驼奶特征肽段组合及鉴定方法
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域。涉及一种骆驼奶特征肽段组合及其筛选方法和鉴定方法。具体涉及骆驼奶特征肽段组合以及基于骆驼奶特征肽段组合的骆驼奶的真伪、掺假样品检测、掺假比例检测和单双峰骆驼奶的鉴别。
背景技术
骆驼属(Camelus)是偶蹄目、骆驼科下的一个属，分为单峰驼(Camelusdromedarius，也称阿拉伯驼)和双峰驼(Camelus bactrianus，也称亚洲驼)两个种。单峰驼主要分布于西亚、中东和北非地区，占骆驼总数的90％；双峰驼主要分布在中亚国家和蒙古，我国的新疆、内蒙古、甘肃是世界上双峰驼的主要分布区域之一。
对驼乳营养价值、生理功能等的深入研究发现，骆驼乳中除了含有常规乳中的营养成分以外，还含有许多具有生理功能的活性蛋白质和/或肽，如溶菌酶、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、血管紧张素转化酶抑制肽、类激素胰岛素等。拟议的促健康益处包括抗菌和抗氧化特性、助血压调节、以及抗糖尿病作用。此外，骆驼乳与人乳一样不含β-乳球蛋白(一种高免疫原性乳蛋白)，因此对婴儿和老年人可能是比牛奶更可取的低致敏性替代乳。
驼乳丰富的营养价值和潜在的药用价值，使市场需求不断增加。但其产量稀少，仅占全球乳产量的0.3％(牛乳和羊乳约占90％)，而其中我国双峰驼的日产乳量仅为进口单峰驼乳的1/5，是名副其实的稀缺乳、“沙漠黄金”，因此经济价值远高于牛乳、羊乳。已有一些不法商人，在驼乳中稀释或掺入牛乳、羊乳等其他低价动物乳以谋取暴利，使市场商品真实性受到严重挑战。这些掺假乳劣币驱逐良币，扰乱乳业健康发展。不仅使消费者承受经济损失，还可能对牛乳过敏人群构成严重的健康危害。
现阶段可鉴别驼乳真伪的方法较少，主要有酶联免疫法(ELISA)——“一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒及其应用(CN201910223481)”、聚合酶链式反应法(PCR)——“肉乳中骆驼和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒(CN201910709532)”和基于光谱的指纹图谱法——“奶牛奶、马奶、骆驼奶、山羊奶和水牛奶的光谱指纹识别方法(CN202011411882)”。由于不同物种乳蛋白质种类性质接近，ELISA法受制于抗体制备困难；对结构类似蛋白质易存在交叉反应；加工过程蛋白质变性、基质复杂，易导致假阴性或假阳性。PCR法容易受到加工过程的破坏、DNA降解、复杂基质的干扰和样品提取与扩增方法的影响，且乳中的DNA主要来自白细胞与脱落的乳腺细胞，受到泌乳个体品种、健康情况及生理周期影响含量不稳定，不易建立标准化的检测方法。光谱指纹识别方法灵敏度较低，依赖于大样品量模型的建立，数据存在一定的误差，无法稳定准确地定性掺假，同样对深加工产品的鉴别较困难。
目前骆驼蛋白很少被完整表征，国内外尚无利用质谱技术对骆驼属不同种乳制品进行准确区分的方法。我国骆驼乳产业正在迅速发展，并且有很好的发展前景，但目前国内对于驼乳，尤其我国特色的双峰驼乳制品缺乏可靠的掺假检测方法和标准，难以保证产品质量，因此开发骆驼乳质品中掺假物鉴定和掺假比例的检测方法是迫切需要解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明通过大量实验筛选，提供了一种利用特征标识肽段组合区分骆驼奶与其他常见掺假奶及细分其亚种来源的方法。该方法基于质谱法检测特征肽段生物标志物，不受蛋白质稳定性和深加工技术的影响，具有较高的特异性、灵敏度和准确性，可同时实现定性与定量分析，并能够同时监测多种掺假物种奶。此外，该方法可用于单峰骆驼奶与双峰骆驼奶的区分及质量控制，为乳制品质量安全监管提供有力的技术支持。
本发明的第一个目的是提供一种用于骆驼奶检测的特征多肽组合，所述特征多肽组合包括骆驼奶特征多肽；所述骆驼奶特征多肽的氨基酸序列如下：
特征多肽序列号 特征多肽氨基酸序列 来源蛋白 来源物种
SEQ ID No.1 GLHPVPQPLVPVIA β-酪蛋白 骆驼
SEQ ID No.2 LLQLEAIR α-s1-酪蛋白 骆驼
SEQ ID No.3 INEDNHPQLGEPVK α-s1-酪蛋白 骆驼
SEQ ID No.4 YFPIQFVQSR κ-酪蛋白 骆驼
SEQ ID No.5 NICDISCDK α-乳白蛋白 骆驼
SEQ ID No.6 ILDLAVVSPIQFR α-s1-酪蛋白 骆驼
SEQ ID No.7 AMPVQAVLPFQEPVPDPVR β-酪蛋白 骆驼
SEQ ID No.8 AIPVQAVLPFQEPVPDPVR β-酪蛋白 骆驼
本发明的第二个目的是提供一种基于前述特征多肽组合检测骆驼奶掺假情况的方法，所述特征多肽组合还包括其他动物乳的特征多肽；所述检测方法包括如下步骤：
S1：制备待测样品肽段；
S2：用液相色谱-三重四极杆串联质谱MRM模式对待测样品肽段进行检测，并与特征多肽组合的检测结果进行比较，获得待测样品液相色谱-串联质谱结果；
所述检测方法能够获得的待测样品信息包括(1)至(3)的其中至少一个：
(1)检测待测样品是否为骆驼奶：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果仅出现与其他动物乳的特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本为非来源于骆驼的其他动物源性的奶类；
(2)检测待测样品中是否为纯骆驼奶：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果仅出现与SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本为纯骆驼奶；
(3)定性和/或定量检测待测样品中是否掺假其他动物源性的奶类：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图、且出现与其他动物乳的特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本为含有其他动物源性的奶类的掺假骆驼奶；进而定量计算待测样品中骆驼奶和/或其他动物源性的奶类的含量；
进一步的，所述其他动物乳的特征多肽为牛乳的特征多肽和/或羊乳的特征多肽；
进一步的，所述其他动物乳的特征多肽为SEQ ID NO.9所示牛乳的特征多肽和/或SEQ ID NO.10所示羊乳的特征多肽。
即，所述特征多肽组合中，SEQ ID No.1～8为骆驼属(Camelus)独有的特征肽段。对比奶牛(Bos taurus，种)奶、牦牛(Bos mutus，种)奶、水牛(Bubalus bubalis，种)奶、山羊(Capra hircus，种)奶、绵羊(Ovis aries，种)奶时，所述肽段是骆驼奶独有的。
为了与其他常见掺假奶相互区分并做掺假比例的判断，本发明还提供了SEQ IDNO.9所示奶牛(Bos taurus，种)奶、牦牛(Bos mutus，种)奶、水牛(Bubalus bubalis，种)奶和SEQ ID NO.10所示山羊(Capra hircus，种)奶、绵羊(Ovis aries，种)奶的典型高灵敏度特征肽段供实施使用：
特征多肽序列号 特征多肽氨基酸序列 来源蛋白 来源物种
SEQ ID No.9 AVPYPQR β-酪蛋白 奶牛、牦牛、水牛
SEQ ID No.10 YPVEPFTESQSLTLTDVEK β-酪蛋白 山羊、绵羊
在某些特定的实施例中，
当液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图、且出现与SEQ ID No.9相同的谱图时，则判断待测样品有奶牛(Bos taurus，种)奶和/或牦牛(Bos mutus，种)奶和/或水牛(Bubalusbubalis，种)奶，或含有来自奶牛(Bos taurus，种)奶和/或牦牛(Bos mutus，种)奶和/或水牛(Bubalus bubalis，种)奶的蛋白掺伪；
当液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图、且出现与SEQ ID No.10相同的谱图时候，则判断待测样品有山羊(Capra hircus，种)奶和/或绵羊(Ovis aries，种)奶，或含有来自山羊(Capra hircus，种)奶和/或绵羊(Ovis aries，种)奶的蛋白掺伪。
当液相色谱-串联质谱结果仅出现与SEQ ID No.9相同的谱图时候，则判断待测样品为奶牛(Bos taurus，种)奶和/或牦牛(Bos mutus，种)奶和/或水牛(Bubalus bubalis，种)奶；
当液相色谱-串联质谱结果仅出现与SEQ ID No.10相同的谱图时候，则判断待测样品为山羊(Capra hircus，种)奶和/或绵羊(Ovis aries，种)奶。
进一步的，所述待测样品为包括骆驼奶和/或其他动物源性的奶类的液态奶或奶粉；
进一步的，所述其他动物源性的奶类为牛奶、羊奶中的一种或多种；所述牛奶来源于奶牛和/或牦牛和/或水牛；所述羊奶来源于山羊和/或绵羊。
进一步的，S1所述制备待测样品肽段的具体操作为：对待测样品进行总蛋白质含量测定，将待测样品稀释为蛋白质浓度为50～150μg蛋白质/mL的工作溶液，进行还原反应、烷基化反应后，胰蛋白酶酶切，得到待测样品肽段。优选的，将待测样品稀释为蛋白质浓度为100μg蛋白质/mL的工作溶液。
更进一步的，S1所述还原反应具体操作为：取工作溶液，加入500mM的碳酸氢铵溶液，所述碳酸氢铵溶液与工作溶液的体积之为1:3～4，再加入50mM溶于500mM碳酸氢铵溶液的二硫苏糖醇溶液，所述二硫苏糖醇溶液与工作溶液的体积之比为1:3～4，涡旋混匀后60℃反应60min。
更进一步的，所述烷基化反应具体操作为：在还原反应结束后，加入二硫苏糖醇溶液2～3倍体积的50mM溶于500mM的碳酸氢铵的碘乙酰胺溶液，避光反应30min。
更进一步的，所述胰蛋白酶酶解具体操作为：烷基化反应之后，加入胰蛋白酶进行酶解反应，所述胰蛋白酶与底物蛋白的量之比为1:20～50，37℃下酶解8小时；加入甲酸终止酶解，所述甲酸与工作溶液的体积之比1：8～10，得到所述骆驼奶标准样品肽段。
进一步的，S2色谱条件如下：采用液相色谱(某个特殊的实施例中，所述液相色谱为岛津的EXION AC-LC系统)进行色谱分离，色谱柱为C8或C18柱(内径2.1mm×柱长100mm，粒径1.7μm)；柱温为：40-60℃；流速为0.3-0.5mL/min；进样体积为5-20μL；流动相A选用0.1％或0.2％甲酸水，流动相B选用0.1％或0.2％甲酸乙腈；梯度洗脱：0-1min(98％流动相A，2％流动相B)，1.1-4min(60％流动相A，40％流动相B)，4.1-7min(10％流动相A，90％流动相B)，7.1-10min(98％流动相A，2％流动相B)；
优选的，柱温为：60℃；流速为0.40mL/min；进样体积为5μL。
进一步的，S2质谱条件如下：采用三重四极杆串联质谱仪(某个特殊的实施例中，所述三重四极杆串联质谱仪为SCIEX
Figure BDA0003435947520000051
6500+质谱系统)进行检测，电喷雾离子源，正离子反应模式；检测方式为MRM模式；喷雾电压为5500V；离子源温度为350-500℃；喷雾气为45-55psi；辅助加热气为45-55psi；气帘气为35-40psi；碰撞气压力为Medium；
优选的，离子源温度为500℃；喷雾气为55psi；辅助加热气为55psi；气帘气为40psi。
进一步的，S2质谱条件还包括以下参数：
Figure BDA0003435947520000052
Figure BDA0003435947520000061
本发明的第三个目的是提供一种基于前述特征多肽组合鉴定骆驼奶为单峰骆驼奶或双峰骆驼奶的方法，所述检测方法以SEQ ID No.6所示特征多肽为鉴定标准，所述鉴定方法包括如下步骤：
S1：制备待测样品肽段；
S2：用液相色谱-三重四极杆串联质谱MRM模式对待测样品肽段进行检测，并与特征多肽组合的检测结果进行比较，获得待测样品液相色谱-串联质谱结果；
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.6所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本包含单峰骆驼奶；
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.1-5以及SEQ ID No.7-8中任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图，且未出现与SEQ ID No.6所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本包含双峰骆驼奶；
进一步的，所述待测样品为包括骆驼奶和/或其他动物源性的奶类的液态奶或奶粉；
进一步的，所述其他动物源性的奶类为牛奶、羊奶中的一种或多种；所述牛奶来源于奶牛和/或牦牛和/或水牛；所述羊奶来源于山羊和/或绵羊。
进一步的，S1所述制备待测样品肽段的具体操作为：对待测样品进行总蛋白质含量测定，将待测样品稀释为蛋白质浓度为50～150μg蛋白质/mL的工作溶液，进行还原反应、烷基化反应后，胰蛋白酶酶切，得到待测样品肽段。优选的，将待测样品稀释为蛋白质浓度为100μg蛋白质/mL的工作溶液。
更进一步的，S1所述还原反应具体操作为：取工作溶液，加入500mM的碳酸氢铵溶液，所述碳酸氢铵溶液与工作溶液的体积之为1:3～4，再加入50mM溶于500mM碳酸氢铵溶液的二硫苏糖醇溶液，所述二硫苏糖醇溶液与工作溶液的体积之比为1:3～4，涡旋混匀后60℃反应60min。
更进一步的，所述烷基化反应具体操作为：在还原反应结束后，加入二硫苏糖醇溶液2～3倍体积的50mM溶于500mM的碳酸氢铵溶液的碘乙酰胺溶液，避光反应30min。
更进一步的，所述胰蛋白酶酶解具体操作为：烷基化反应之后，加入胰蛋白酶进行酶解反应，所述胰蛋白酶与底物蛋白的量之比为1:20～50，37℃下酶解8小时；加入甲酸终止酶解，所述甲酸与工作溶液的体积之比1：8～10，得到所述骆驼奶标准样品肽段。
进一步的，S2色谱条件如下：采用液相色谱(某个特殊的实施例中，所述液相色谱为岛津的EXION AC-LC系统)系统进行色谱分离，色谱柱为C8或C18柱(内径2.1mm×柱长100mm，粒径1.7μm)；柱温为：40-60℃；流速为0.3-0.5mL/min；进样体积为5-20μL；流动相A选用0.1％或0.2％甲酸水，流动相B选用0.1％或0.2％甲酸乙腈；梯度洗脱：0-1min(98％流动相A，2％流动相B)，1.1-4min(60％流动相A，40％流动相B)，4.1-7min(10％流动相A，90％流动相B)，7.1-10min(98％流动相A，2％流动相B)；
优选的，柱温为：60℃；流速为0.40mL/min；进样体积为5μL。
进一步的，S2质谱条件如下：采用三重四极杆串联质谱仪(某个特殊的实施例中，所述三重四极杆串联质谱仪为SCIEX
Figure BDA0003435947520000071
6500+质谱系统)进行检测，电喷雾离子源，正离子反应模式；检测方式为MRM模式；喷雾电压为5500V；离子源温度为350-500℃；喷雾气为45-55psi；辅助加热气为45-55psi；气帘气为35-40psi；碰撞气压力为Medium；
优选的，离子源温度为500℃；喷雾气为55psi；辅助加热气为55psi；气帘气为40psi。
进一步的，S2质谱条件还包括以下参数：
Figure BDA0003435947520000072
Figure BDA0003435947520000081
在某个特殊的实施例中：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现(1)与SEQ ID No.6所示特征多肽色谱图和质谱图相同的谱图；或者出现(2)与SEQ ID No.6，以及SEQ ID No.1-5以及SEQ ID No.7-8中任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样品为单峰驼奶或单峰驼奶与其他奶掺杂。是否与其他奶掺杂可采用本发明第二个目的提供的方法进行检测。
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.1-5以及SEQ ID No.7-8中任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图，且未出现与SEQ ID No.6所示特征多肽色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样品为双峰驼奶或双峰驼奶与其他奶掺杂。是否与其他奶掺杂可采用本发明第二个目的提供的方法进行检测。
本发明的第四个目的是提供另一种基于前述特征多肽组合鉴定骆驼奶为单峰骆驼奶或双峰骆驼奶的方法，所述检测方法以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示特征多肽为鉴定标准，所述鉴定方法包括如下步骤：
S1：制备待测样品肽段；
S2：用液相色谱-三重四极杆串联质谱MRM模式对待测样品肽段进行检测，并与特征多肽组合的检测结果进行比较，获得待测样品液相色谱-串联质谱结果；
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，计算AI/AM，当比值小于0.62816时，则判断待测样本包含单峰骆驼奶；当比值大于0.62816时，则判断待测样本包含双峰骆驼奶；
所述AI为SEQ ID No.8所示特征多肽的质谱检测峰面积，所述AM为SEQ ID No.7所示特征多肽的质谱检测峰面积。
进一步的，所述待测样品为包括骆驼奶和/或其他动物源性的奶类的液态奶或奶粉；
进一步的，所述其他动物源性的奶类为牛奶、羊奶中的一种或多种；所述牛奶来源于奶牛和/或牦牛和/或水牛；所述羊奶来源于山羊和/或绵羊。
进一步的，S1所述制备待测样品肽段的具体操作为：对待测样品进行总蛋白质含量测定，将待测样品稀释为蛋白质浓度为50～150μg蛋白质/mL的工作溶液，进行还原反应、烷基化反应后，胰蛋白酶酶切，得到待测样品肽段。优选的，将待测样品稀释为蛋白质浓度为100μg蛋白质/mL的工作溶液。
更进一步的，S1所述还原反应具体操作为：取工作溶液，加入500mM的碳酸氢铵溶液，所述碳酸氢铵溶液与工作溶液的体积之为1:3～4，再加入50mM溶于500mM碳酸氢铵溶液的二硫苏糖醇溶液，所述二硫苏糖醇溶液与工作溶液的体积之比为1:3～4，涡旋混匀后60℃反应60min。
更进一步的，所述烷基化反应具体操作为：在还原反应结束后，加入二硫苏糖醇溶液2～3倍体积的50mM溶于500mM的碳酸氢铵溶液的碘乙酰胺溶液，避光反应30min。
更进一步的，所述胰蛋白酶酶解具体操作为：烷基化反应之后，加入胰蛋白酶进行酶解反应，所述胰蛋白酶与底物蛋白的量之比为1:20～50，37℃下酶解8小时；加入甲酸终止酶解，所述甲酸与工作溶液的体积之比1：8～10，得到所述骆驼奶标准样品肽段。
进一步的，S2色谱条件如下：采用液相色谱(某个特殊的实施例中，所述液相色谱为岛津的EXION AC-LC系统)系统进行色谱分离，色谱柱为C8或C18柱(内径2.1mm×柱长100mm，粒径1.7μm)；柱温为：40-60℃；流速为0.3-0.5mL/min；进样体积为5-20μL；流动相A选用0.1％或0.2％甲酸水，流动相B选用0.1％或0.2％甲酸乙腈；梯度洗脱：0-1min(98％流动相A，2％流动相B)，1.1-4min(60％流动相A，40％流动相B)，4.1-7min(10％流动相A，90％流动相B)，7.1-10min(98％流动相A，2％流动相B)；
优选的，柱温为：60℃；流速为0.40mL/min；进样体积为5μL。
进一步的，S2质谱条件如下：采用三重四极杆串联质谱仪(某个特殊的实施例中，所述三重四极杆串联质谱仪为SCIEX
Figure BDA0003435947520000091
6500+质谱系统)进行检测，电喷雾离子源，正离子反应模式；检测方式为MRM模式；喷雾电压为5500V；离子源温度为350-500℃；喷雾气为45-55psi；辅助加热气为45-55psi；气帘气为35-40psi；碰撞气压力为Medium；
优选的，离子源温度为500℃；喷雾气为55psi；辅助加热气为55psi；气帘气为40psi。
进一步的，S2质谱条件还包括以下参数：
Figure BDA0003435947520000092
Figure BDA0003435947520000101
在某个特殊的实施例中：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示特征多肽色谱图和质谱图相同的谱图，且计算得AI/AM比值小于0.62816时，则判断待测样本为单峰骆驼奶或单峰驼奶与其他奶掺杂。是否与其他奶掺杂可采用本发明第二个目的提供的方法进行检测。
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示特征多肽色谱图和质谱图相同的谱图，且计算得AI/AM比值大于0.62816时，则判断待测样本为双峰骆驼奶或双峰驼奶与其他奶掺杂。是否与其他奶掺杂可采用本发明第二个目的提供的方法进行检测。
本发明的第五个目的是提供一种基于前述特征多肽组合的骆驼奶掺假检测试剂盒，所述试剂盒至少包括如下骆驼奶特征多肽之一：
序列号 氨基酸序列
SEQ ID No.1 GLHPVPQPLVPVIA
SEQ ID No.2 LLQLEAIR
SEQ ID No.3 INEDNHPQLGEPVK
SEQ ID No.4 YFPIQFVQSR
SEQ ID No.5 NICDISCDK
SEQ ID No.6 ILDLAVVSPIQFR
SEQ ID No.7 AMPVQAVLPFQEPVPDPVR
SEQ ID No.8 AIPVQAVLPFQEPVPDPVR
在某个特殊的实施例中，所述试剂盒包括SEQ ID No.1至SEQ ID No.8的全部骆驼奶特征多肽。
在另一些特殊的实施例中，所述试剂盒还包括其他动物乳的特征多肽。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
(1)本发明最大的益处在于选择了骆驼奶中的不同蛋白质来源的多条蛋白酶解肽段作为标志物，严格筛选出有别于其他常见掺假物种奶(如牛奶和羊奶等)的8条高灵敏度、高稳健性的可用特征肽段(SEQ ID No.1-8)，排除酶解性质、蛋白修饰及基质效应对检测的影响。采用高效液相色谱-串联质谱技术实现了对骆驼奶的精准鉴别，建立的方法灵敏度高，准确度好，可操作性强。为乳制品市场的掺假监管提供多样化的选择。
(2)本发明从能表征各个物种奶的稳定特征肽段入手，提出以α-s1-酪蛋白和β-酪蛋白酶解肽段作为标志物，筛选出3条高灵敏度、高稳健性的可用特征肽段用于鉴别单双峰骆驼奶(SEQ ID No.6-8)，填补了国内外骆驼奶亚种类鉴别的技术空白，为乳制品质量安全监管提供有力的技术支持。
(3)本发明对模拟掺假样品和标准骆驼奶粉样品进行了验证，证明选择蛋白质酶解后的特征肽段作为标志物进行检测，且可用于定量检测低于1％的掺假奶粉，证明了该发明适用于变性蛋白质的检测，可以满足同时检测不同工艺样品中变性和非变性蛋白质，不受蛋白稳定性和深加工的影响，可满足样品中的非变性与变性蛋白检测，方法的适用性强。确保了方法的稳定性和准确度。
附图说明
图1单双峰奶样品酶解所得肽段的UPLC-Q-TOF MS检测的典型总离子流图
图1A.单峰骆驼奶样品；图1B.双峰骆驼奶样品；
图2MRM模式下区别骆驼奶和其他常见掺假奶的特征肽段的提取离子流色谱图
图2A.单峰骆驼奶样品；图2B.双峰骆驼奶样品；图2C.奶牛奶样品；图2D.牦牛奶样品；图2E.水牛奶样品；图2F.山羊奶样品；图2G.绵羊奶样品；
图3MRM模式下鉴别单双峰骆驼奶粉的特征肽段的提取离子流色谱图
图3A.单峰骆驼奶样品；图3B.双峰骆驼奶样品；
图4单峰骆驼奶与双峰骆驼奶鉴别的ROC曲线图
图5骆驼奶中常见掺假奶百分含量(1％-99％)的相关情况图
图5A.骆驼奶中掺假牛奶；图5B.骆驼奶中掺假羊奶。
具体实施方式
本发明所述“MRM”模式是指：多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)模式。
本发明所述“mM”模式是指：mmol/L。
实施例1骆驼奶特征多肽的筛选。
步骤1.骆驼奶标准样品前处理
(1)对纯骆驼奶粉溶液进行总蛋白含量测定
分别取单峰骆驼纯奶粉和双峰骆驼纯奶粉作为骆驼奶标准样品，将纯骆驼奶粉与纯水以0.01g/mL浓度混合，涡旋混匀，在37℃条件下震荡30分钟，使其充分溶解后，稀释20倍制备为工作溶液，进行总蛋白含量测定；采用考马斯亮蓝法(Bradford蛋白浓度测定试剂盒)测定总蛋白浓度，以牛血清白蛋白(BSA，5mg/mL)作为标准蛋白，用PBS稀释剂配制标准溶液50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，800μg/mL，1000μg/mL，然后按试剂盒操作说明书检测样品总蛋白含量，结果显示，作为骆驼奶标准样品的单峰骆驼纯奶粉和双峰骆驼纯奶粉工作溶液的总蛋白含量分别为125μg/mL和132.5μg/mL。
(2)奶粉中蛋白质的酶解
分别取单峰骆驼奶粉和双峰骆驼奶粉各100mg分别进行复溶，加入10mL纯化水后涡旋混匀，在37℃中震荡30min，配成奶粉溶液样品，之后根据(1)测得的总蛋白含量稀释成工作溶液。
分别取每种工作溶液200μL(约100μg蛋白质/mL)至1.5mL离心管中，进行还原反应：加入65μL 500mM的碳酸氢铵溶液，再加入60μL 50mM溶于500mM碳酸氢铵溶液的二硫苏糖醇溶液(DTT)涡旋混匀后60℃反应60min。
反应结束后进行烷基化反应：加入120μL 50mM溶于500mM的碳酸氢铵溶液的碘乙酰胺溶液(IAA)避光反应30min。
之后再进行胰蛋白酶酶切：加入5μL 100μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃下酶解8小时，加入20μL甲酸终止酶解。酶解结束后，得到所述骆驼奶标准样品肽段，过滤膜取续滤液于内插管中，内插管放入进样小瓶进行UPLC-Q-TOF MS和UPLC-MS/MS检测。
步骤2.UPLC-Q-TOF MS检测的色谱和质谱条件
色谱条件为：将步骤1.(2)得到的骆驼奶标准样品肽段溶液在Waters ACQUITYUPLC I-Class上进行色谱分离，色谱柱为C18(2.1×150mm，1.7μm)；柱温为60℃；流速为0.25mL/min；进样体积为10μL；流动相A选用0.1％甲酸水，流动相B选用0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱：0-1min(99％流动相A，1％流动相B)，1-65min(65％流动相A，35％流动相B)，65-68min(10％流动相A，90％流动相B)，68.01-75min(99％流动相A，1％流动相B)。
质谱条件为：将经超高效液相色谱分离得到标准样品肽段溶液在Waters SynaptXS QTOF高分辨质谱上进行质谱检测，电喷雾离子源电离模式为ESI+；毛细管电压为3kV；锥孔电压为30V；离子源温度为120℃；脱溶剂温度为450℃；锥孔气为25L/h；脱溶剂气流量为800L/h；碰撞能量为20-50V。(图1)
步骤3.数据库建立及数据分析
(1)根据各物种名称在Uniprot数据库中检索，奶牛关键词：Bos taurus、牦牛关键词：Bos mutus、水牛关键词：Bubalus bubalis、山羊关键词：Capra hircus、绵羊关键词：Ovis aries下载蛋白质序列信息FASTA文件，导入Progenesis QI for proteomics v4.1软件，建立背景蛋白数据库；
(2)在Uniprot数据库中检索，单峰骆驼关键词：Camelus dromedarius、双峰骆驼关键词：Camelus bactrianus，下载蛋白质序列信息FASTA文件，导入Progenesis QI forproteomics v4.1软件建立单双峰骆驼奶蛋白数据库，再将步骤2经UPLC-Q-TOF MS检测得到的结果文件导入；进行单峰骆驼奶标准样品组和双峰骆驼奶标准样品组分析，得到蛋白质信息，并对鉴定到的前5种高丰度蛋白进行下一步分析，丰度最高的5种蛋白分别为：α-乳白蛋白；β-酪蛋白；α-s1-酪蛋白；κ-酪蛋白；α-s2-酪蛋白。
(3)对这5种蛋白进行模拟胰蛋白酶酶切得到83条肽段，筛选出氨基酸个数为6～25个的肽段43条，同时搜索背景蛋白数据库将预选肽段进行物种间的比对，去除其他物种同源序列的肽段，得到骆驼特征肽段36条。
(4)最后根据骆驼奶标准样品检测后经UNIFI软件处理选取响应高、无修饰或修饰比例稳定且无漏切或漏切稳定的24条骆驼奶特征肽段和3条区分骆驼种属奶的特征肽段。
UNIFI软件处理的方法设置为：胰蛋白酶酶切；允许漏切位点数目为1；Oxidationof Met设为可变修饰；母离子匹配容差为10ppm；碎片离子匹配容差为20ppm。
(5)将这27条特征肽段，使用Skyline软件进行理论肽段信息构建得到理论离子对，并与单峰骆驼奶标准样品组和双峰骆驼奶标准样品组检测的谱图进行比对，选择响应值高的特征肽段。
对选择出的响应值高的特征肽段用UPLC-MS/MS串联质谱SCIEX
Figure BDA0003435947520000143
6500+的多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)模式进行验证，从中选择酶解较稳定且酶解效率高的8条作为定量特征肽段，即SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示骆驼奶特征多肽。
液相色谱-串联质谱条件为：
色谱条件：所述液相色谱采用岛津的EXION AC-LC系统进行色谱分离；色谱柱为2.1×100mm，1.7μm的C8或C18柱；柱温为：60℃；流速为0.4mL/min；进样体积为5μL；流动相A选用0.1％或0.2％甲酸水，流动相B选用0.1％或0.2％甲酸乙腈；梯度洗脱：0-1min(98％流动相A，2％流动相B)，1.1-4min(60％流动相A，40％流动相B)，4.1-7min(10％流动相A，90％流动相B)，7.1-10min(98％流动相A，2％流动相B)；
质谱条件：所述质谱采用SCIEX
Figure BDA0003435947520000141
6500+质谱系统进行检测，电喷雾离子源，正离子反应模式；检测方式为MRM模式；喷雾电压为5500V；离子源温度为500℃；喷雾气为55psi；辅助加热气为55psi；气帘气为40psi；碰撞气压力为Medium。
质谱条件还包括MRM离子对的具体参数：
Figure BDA0003435947520000142
Figure BDA0003435947520000151
通过实验对比其他发明所提出的骆驼鉴定的特征肽段(SEQ ID No.11～SEQ IDNo.13)，本发明所提出的特征肽段消除蛋白结构变化、蛋白修饰及基质效应等对检测的影响，具有准确、精密和灵敏等优点。在同一样品浓度(约2.5μg蛋白质/mL)下，按本实施例步骤1的骆驼奶标准样品前处理方法和步骤3(5)中所述的液相色谱-串联质谱条件进行样品检测，结果显示本发明所提供的特征肽段质谱检测响应较高，残留较小，酶解稳定性和检测稳定性均更佳；证明了本发明所述肽段在区别骆驼奶与其他常见掺假奶(如牛奶和羊奶)上具有优越性。同时，本发明的肽段还具有区分单双峰骆驼奶的独创性。
而已公开的3条骆驼奶的特征肽段IASEDGGK(SEQ ID No.11)、NEDNHPQLGEPVK(SEQID No.12)、FLDDDLTDDK(SEQ ID No.13)，经实验验证，其中前两条肽段不能稳定测定，后1条酶切性质不稳定，导致结果偏差，且此方法仅能区分骆驼奶和牛奶，不足以区分单双峰骆驼奶粉，因此存在一定的局限性。实验结果如下表1.所示。
表1.本发明所提供鉴别骆驼奶的特征肽段与其他发明的比较结果
Figure BDA0003435947520000152
Figure BDA0003435947520000161
步骤4.筛选鉴别单双峰骆驼奶的特征肽段
本发明筛选得到的SEQ ID No.6～SEQ ID No.8所示3条骆驼奶特征多肽是能鉴别单双峰骆驼奶的特征肽段。
(1)采用SEQ ID No.6所示骆驼奶特征多肽鉴别单双峰骆驼奶的验证：
SEQ ID No.6所示骆驼奶特征多肽仅存在于单峰骆驼奶中，可直接用于鉴别单双峰骆驼奶，即谱图出现与SEQ ID No.6所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本为单峰骆驼奶；
验证实验：
取10个不同来源单峰骆驼奶和10个不同来源双峰骆驼奶，按本实施例步骤1的骆驼奶标准样品前处理方法和步骤3(5)中所述的液相色谱-串联质谱条件进行样品检测。
结果显示：单峰骆驼奶样品谱图出现与SEQ ID No.6所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图(图3A)，而双峰骆驼奶谱图无与SEQ ID No.6所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图(图3B)。
(2)采用SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示骆驼奶特征多肽鉴别单双峰骆驼奶的验证：
当出现SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示骆驼奶特征多肽，以质谱检测峰面积比值(AI/AM)来鉴别。所述AI为SEQ ID No.8所示特征多肽的质谱检测峰面积，所述AM为SEQ IDNo.7所示特征多肽的质谱检测峰面积。
验证实验：单双峰骆驼奶的AI/AM测定方法如下：
取10个不同来源单峰骆驼奶和10个不同来源双峰骆驼奶，按本实施例步骤1的骆驼奶标准样品前处理方法和步骤3(5)中所述的液相色谱-串联质谱条件进行样品检测，以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示肽段的离子对进行峰提取和积分，得到样品对应的峰面积AI和AM。
10个不同来源单峰骆驼奶和10个不同来源双峰骆驼奶的AI/AM结果进行统计分析，即绘制ROC曲线分析，用约登指数(Youden’s index)来确定最佳的指标阈值(0.62816)，使区分单双峰骆驼奶的效果最好，具体结果如表2.和图4.所示。
当出现与SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图，且SEQ ID No.8质谱检测峰面积AI比上SEQ ID No.7质谱检测峰面积AM所得结果，即AI/AM小于0.62816时，则判断待测样本为单峰骆驼奶；
当出现与SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图，且SEQ ID No.8质谱检测峰面积AI比上SEQ ID No.7质谱检测峰面积AM所得结果，即AI/AM大于0.62816时，则判断待测样本为双峰骆驼奶。
表2.单峰骆驼奶和双峰骆驼奶AI/AM结果的统计分析(ROC曲线分析)
Figure BDA0003435947520000171
Figure BDA0003435947520000181
实施例2特征肽段定量检测参数筛选及对实际样品、模拟掺假奶粉进行检测
1.优化特征肽段定量参数
将实施例1筛选到的定量特征肽段用实施例1步骤3(5)所述液相色谱-串联质谱的MRM模式进行调谐优化反应离子对、碰撞能量、去簇电压、保留时间等重要参数，所有定量特征肽段质谱参数详见表3.。
具体的，采用岛津的EXION AC-LC系统进行色谱分离，色谱柱为ACQUITY UPLC BEHC8(2.1×100mm，1.7μm)；柱温为：60℃；流速为0.4mL/min；进样体积为5μL；流动相A选用0.2％甲酸水，流动相B选用0.2％甲酸乙腈；梯度洗脱：0-1min(98％A，2％B)，1.1-4min(60％A，40％B)，4.1-7min(10％A，90％B)，7.1-10min(98％A，2％B)。
采用SCIEX
Figure BDA0003435947520000182
6500+质谱系统进行优化的质谱源参数为：电喷雾离子源，正离子反应模式；检测方式为MRM模式；喷雾电压为5500V；离子源温度为500℃；喷雾气为55psi；辅助加热气为55psi；气帘气为40psi；碰撞气压力为Medium。
每一特征肽段保留了两对离子对，多离子对及保留时间的确认可以有效消除假阳性的MRM峰，增加了检测结果的准确性。
表3.特征肽段信息及其MRM检测参数
Figure BDA0003435947520000183
Figure BDA0003435947520000191
2.进行实际样品及模拟掺假奶粉样品检测，以验证定性判别及定量掺假比例的可行性
为验证本发明中特征肽段作为标志物对骆驼奶样品定性判别及定量检测掺假奶粉的可行性，设计实验步骤如下：
(1)定性验证：
选择了标准纯骆驼奶、奶牛奶、牦牛奶、水牛奶、山羊奶和绵羊奶，及市场购买的样品(市售样1～4)，按照实施例1步骤1的骆驼奶标准样品前处理方法和步骤3(5)中所述的液相色谱-串联质谱条件进行检测，结果如下表4.，图2.所示：
表4.实际样品中掺假定性鉴别检测结果
Figure BDA0003435947520000192
Figure BDA0003435947520000201
可以看出，本发明检测方法能够对实际样品中的掺假情况进行准确的定性鉴别。
(2)定量验证：
制备牛奶模拟掺假奶和羊奶模拟掺假奶样品：取标准牛奶粉、羊奶粉分别与标准骆驼奶粉按总蛋白质量比例1：99、5：95、10：90、25：75、50：50、75：25、90：10、95：5、99：1混合制备模拟掺假奶粉样品，即分别得到质量比例分别为1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％的牛奶模拟掺假奶；质量比例分别为1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％的羊奶模拟掺假奶。
按照实施例1步骤1的骆驼奶标准样品前处理方法和步骤3(5)中所述的液相色谱-串联质谱条件进行检测，结果显示：1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％的牛奶模拟掺假奶和羊奶模拟掺假奶样品分别如图5所示，由图可见，牛奶模拟掺假奶和羊奶模拟掺假奶均线性良好，R2为0.9991、0.9971，可用于骆驼奶中掺假奶的定量。检测值与实际值比较结果如表5.和表6.所示。
表5.不同比例的混合牛奶粉和骆驼奶粉样品的测定(n＝5)
Figure BDA0003435947520000211
表6.不同比例的混合羊奶粉和骆驼奶粉样品的测定(n＝5)
Figure BDA0003435947520000212
Figure BDA0003435947520000221
经以上UPLC-MS/MS检测，结果表明本发明可用于定量检测低于1％的掺假奶粉，证明了该发明具有定量检测可行性和高的灵敏度(图5)。
本发明不限于以上实施方式，在不脱离本发明实质的情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省食品药品监督检验研究院
<120> 一种骆驼奶特征肽段组合及鉴定方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus dromedarius × Camelus bactrianus)
<400> 1
Gly Leu His Pro Val Pro Gln Pro Leu Val Pro Val Ile Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus dromedarius × Camelus bactrianus)
<400> 2
Leu Leu Gln Leu Glu Ala Ile Arg
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus dromedarius × Camelus bactrianus)
<400> 3
Ile Asn Glu Asp Asn His Pro Gln Leu Gly Glu Pro Val Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus dromedarius × Camelus bactrianus)
<400> 4
Tyr Phe Pro Ile Gln Phe Val Gln Ser Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus dromedarius × Camelus bactrianus)
<400> 5
Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys Asp Lys
1 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus dromedarius)
<400> 6
Ile Leu Asp Leu Ala Val Val Ser Pro Ile Gln Phe Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus dromedarius)
<400> 7
Ala Met Pro Val Gln Ala Val Leu Pro Phe Gln Glu Pro Val Pro Asp
1 5 10 15
Pro Val Arg
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus bactrianus)
<400> 8
Ala Ile Pro Val Gln Ala Val Leu Pro Phe Gln Glu Pro Val Pro Asp
1 5 10 15
Pro Val Arg
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 牛(Bos taurus × Bos mutus × Bubalus bubalis)
<400> 9
Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg
1 5
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 羊(Capra hircus × Ovis aries)
<400> 10
Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp
1 5 10 15
Val Glu Lys
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus)
<400> 11
Ile Ala Ser Glu Asp Gly Gly Lys
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus)
<400> 12
Asn Glu Asp Asn His Pro Gln Leu Gly Glu Pro Val Lys
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 骆驼(Camelus)
<400> 13
Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Lys
1 5 10

Claims (12)

1.一种用于骆驼奶检测的特征多肽组合，其特征在于，所述特征多肽组合包括骆驼奶特征多肽；所述骆驼奶特征多肽的氨基酸序列如下：
序列号 氨基酸序列 SEQ ID No·1 GLHPVPQPLVPVIA SEQ ID No·2 LLQLEAIR SEQ ID No·3 TNEDNHPQLGEPVK SEQ ID No·4 YFPIQFVQSR SEQ ID No·5 NICDISCDK SEQ ID No·6 ILDLAWSPIQFR SEQ ID No·7 AMPVQAVLPFQEPVPDPVR SEQ ID No·8 AIPVQAVLPFQEPVPDPVR
2.一种基于权利要求1所述特征多肽组合检测骆驼奶掺假情况的方法，其特征在于，所述特征多肽组合还包括其他动物乳的特征多肽；所述检测方法包括如下步骤：
S1：制备待测样品肽段；
S2：用液相色谱-三重四极杆串联质谱MRM模式对待测样品肽段进行检测，并与特征多肽组合的检测结果进行比较，获得待测样品液相色谱-串联质谱结果；
所述检测方法能够获得的待测样品信息包括(1)至(3)的其中至少一个：
(1)检测待测样品是否为骆驼奶：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果仅出现与其他动物乳的特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本为非来源于骆驼的其他动物源性的奶类；
(2)检测待测样品中是否为纯骆驼奶：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果仅出现与SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本为纯骆驼奶；
(3)定性和/或定量检测待测样品中是否掺假其他动物源性的奶类：
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图、且出现与其他动物乳的特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本为含有其他动物源性的奶类的掺假骆驼奶；进而定量计算待测样品中骆驼奶和/或其他动物源性的奶类的含量；
优选的，所述其他动物乳的特征多肽为牛乳的特征多肽和/或羊乳的特征多肽；
进一步优选的，所述其他动物乳的特征多肽为SEQ ID NO.9所示牛乳的特征多肽和/或SEQ ID NO.10所示羊乳的特征多肽。
3.一种基于权利要求1所述特征多肽组合鉴定骆驼奶为单峰骆驼奶或双峰骆驼奶的方法，其特征在于，所述检测方法以SEQ ID No.6所示特征多肽为鉴定标准，所述鉴定方法包括如下步骤：
S1：制备待测样品肽段；
S2：用液相色谱-三重四极杆串联质谱MRM模式对待测样品肽段进行检测，并与特征多肽组合的检测结果进行比较，获得待测样品液相色谱-串联质谱结果；
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.6所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本包含单峰骆驼奶；
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.1-5以及SEQ ID No.7-8中任意一条或多条所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图，且未出现与SEQ ID No.6所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，则待测样本包含双峰骆驼奶。
4.一种基于权利要求1所述特征多肽组合鉴定骆驼奶为单峰骆驼奶或双峰骆驼奶的方法，其特征在于，所述检测方法以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示特征多肽为鉴定标准，所述鉴定方法包括如下步骤：
S1：制备待测样品肽段；
S2：用液相色谱-三重四极杆串联质谱MRM模式对待测样品肽段进行检测，并与特征多肽组合的检测结果进行比较，获得待测样品液相色谱-串联质谱结果；
当待测样品液相色谱-串联质谱结果出现与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示特征多肽的色谱图和质谱图相同的谱图时，计算AI/AM，当比值小于0.62816时，则判断待测样本包含单峰骆驼奶；当比值大于0.62816时，则判断待测样本包含双峰骆驼奶；
所述AI为SEQ ID No.8所示特征多肽的质谱检测峰面积，所述AM为SEQ ID No.7所示特征多肽的质谱检测峰面积。
5.根据权利要求2至4任一条权利要求所述的方法，其特征在于，所述待测样品为包括骆驼奶和/或其他动物源性的奶类的液态奶或奶粉；
优选的，所述其他动物源性的奶类为牛奶、羊奶中的一种或多种；所述牛奶来源于奶牛和/或牦牛和/或水牛；所述羊奶来源于山羊和/或绵羊。
6.根据权利要求2至4任一条权利要求所述的方法，其特征在于，S1所述制备待测样品肽段的具体操作为：对待测样品进行总蛋白质含量测定，将待测样品稀释为蛋白质浓度为50～150μg蛋白质/mL的工作溶液，进行还原反应、烷基化反应后，胰蛋白酶酶切，得到待测样品肽段；优选的，将待测样品稀释为蛋白质浓度为100μg蛋白质/mL的工作溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S1所述还原反应具体操作为：取工作溶液，加入500mM的碳酸氢铵溶液，所述碳酸氢铵溶液与工作溶液的体积之比为1:3～4，再加入50mM溶于500mM碳酸氢铵溶液的二硫苏糖醇溶液，所述二硫苏糖醇溶液与工作溶液的体积之比为1:3～4，涡旋混匀后60℃反应60min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述烷基化反应具体操作为：在还原反应结束后，加入二硫苏糖醇溶液2～3倍体积的50mM溶于500mM的碳酸氢铵溶液的碘乙酰胺溶液，避光反应30min。
9.根据权利要求6所述的方法，所述胰蛋白酶酶解具体操作为：烷基化反应之后，加入胰蛋白酶进行酶解反应，所述胰蛋白酶与底物蛋白的量之比为1:20～50，37℃下酶解8小时；加入甲酸终止酶解，所述甲酸与工作溶液的体积之比1：8～10，得到所述骆驼奶标准样品肽段。
10.根据权利要求2至4任一条权利要求所述的方法，其特征在于，S2色谱条件如下：采用液相色谱系统进行色谱分离，色谱柱为2.1×100mm，1.7μm的C8或C18柱；柱温为：40-60℃；流速为0.3-0.5mL/min；进样体积为5-20μL；流动相A选用0.1％或0.2％甲酸水，流动相B选用0.1％或0.2％甲酸乙腈；梯度洗脱：0-1min(98％流动相A，2％流动相B)，1.1-4min(60％流动相A，40％流动相B)，4.1-7min(10％流动相A，90％流动相B)，7.1-10min(98％流动相A，2％流动相B)；
优选的，柱温为：60℃；流速为0.40mL/min；进样体积为5μL。
S2质谱条件如下：采用三重四极杆串联质谱仪进行检测，电喷雾离子源，正离子反应模式；
检测方式为MRM模式；喷雾电压为5500V；离子源温度为350-500℃；喷雾气为45-55psi；
辅助加热气为45-55psi；气帘气为35-40psi；碰撞气压力为Medium；
优选的，离子源温度为500℃；喷雾气为55psi；辅助加热气为55psi；气帘气为40psi。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，S2质谱条件还包括以下参数：
Figure FDA0003435947510000031
Figure FDA0003435947510000041
12.一种基于权利要求1所述特征多肽组合的骆驼奶掺假检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括如下骆驼奶特征多肽之一：
序列号 氨基酸序列 SEQ ID No.1 GLHPVPQPLVPVIA SEQ ID No.2 LLQLEAIR SEQ ID No.3 INEDNHPQLGEPVK SEQ ID No.4 YFPIQFVQSR SEQ ID No.5 NICDISCDK SEQ ID No.6 ILDLAVVSPIQFR SEQ ID No.7 AMPVQAVLPFQEPVPDPVR SEQ ID No.8 AIPVQAVLPFQEPVPDPVR
。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110531019A (zh) * 2019-09-25 2019-12-03 南京农业大学 一种基于不同动物源性肉类特征多肽的肉样掺假定量检测方法
CN111766323A (zh) * 2020-07-10 2020-10-13 中国检验检疫科学研究院 一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110531019A (zh) * 2019-09-25 2019-12-03 南京农业大学 一种基于不同动物源性肉类特征多肽的肉样掺假定量检测方法
CN111766323A (zh) * 2020-07-10 2020-10-13 中国检验检疫科学研究院 一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116660443A (zh) * 2023-08-01 2023-08-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 假冒骆驼乳或骆驼乳中是否掺杂其它动物乳的鉴定方法
CN116660443B (zh) * 2023-08-01 2023-10-13 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 假冒骆驼乳或骆驼乳中是否掺杂其它动物乳的鉴定方法

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