CN114705794A - 一种生物样本的蛋白质组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物样本的蛋白质组学分析方法。所述方法基于多肽同位素标记技术以及LC‑MS分析技术,包括在目标生物样本中添加信号增强样本的步骤,其中,所述信号增强样本包含目标生物样本蛋白种类的50%以上的蛋白种类,且不包含高丰度蛋白。由于无需去除待测样本的高丰度蛋白,本发明所提出的方法不会造成低丰度蛋白的损失,从而提高了待测样本中低丰度蛋白鉴定量。
Description
技术领域
本申请属于生物化学领域,具体涉及一种生物样本的蛋白质组学分析方法,所述方法能够提高生物样本的蛋白质鉴定量。
背景技术
蛋白质组学分析是以蛋白质为基本研究对象,用系统生物学的方法,研究生物体的细胞、组织的组成和变化规律的科学。经过二十来年的发展,基于质谱的蛋白质组学以其灵敏度、准确度、自动化程度高等优点已经大规模地应用于生物医药领域的研究。
然而,在基于质谱的自下而上的(bottom-up)蛋白质组学中,质谱分析技术的发展虽然提高了样本检测的灵敏度和通量,但捕获整个蛋白质组的信息仍面临多种挑战,其中最大的挑战之一是血清和血浆中低丰度蛋白的检测。造成这个难题的原因,一方面是低丰度蛋白的检测受限于质谱仪的灵敏度;另一方面是由于高丰度蛋白的“遮蔽”。在血清和血浆样本中通常含有10000多种不同的蛋白质,最大浓度与最小浓度相差在10个数量级以上。而丰度最高的数十种蛋白质占总蛋白质含量的95%以上,在质谱分析过程中,这些蛋白质会掩盖低丰度和超低丰度蛋白质的信息。质谱分辨率的提高需要较大成本投入,短时间内难以有较大改善,因此,在样本制备过程中通常需要消除高丰度蛋白的影响,以提高低丰度蛋白定性定量结果的可靠性。
目前,消除高丰度蛋白影响的策略主要有以下几种:
(1)去除高丰度蛋白。选择性地去除高丰度蛋白是蛋白质组学的关键技术之一,方法包括超滤法、色谱分离、化学试剂沉淀提取、免疫亲和提取等。其中,基于亲和技术的分离方法选择性最好,相关的商品有Thermo Scientific的High-SelectTMTop14高丰度蛋白去除试剂盒等,可以特异性去除样本中的高丰度蛋白。这类方法虽然能够有效去除高丰度蛋白,但是在样本处理过程中,也有可能同时造成低丰度蛋白的损耗,影响低丰度蛋白的检测和准确定量,而且仅适用于已知高丰度蛋白的情况。另外一种类似的方法是富集低丰度蛋白,这种技术是采用修饰有组合六肽文库的珠子能结合不同种蛋白的原理,在复杂生物样本中,少量的低丰度蛋白被珠子结合,过量的高丰度蛋白质则因为缺少结合位点未被珠子捕获而在洗脱过程中被除去,从而有效地降低样本中蛋白的浓度差。这种方法适用于高丰度蛋白未知的情况,但同样的,在处理过程中也有可能造成低丰度蛋白的损失。
(2)样本预分级。这种方法是在样本进行LC-MS分析前,根据肽段的不同性质将样本分离成多个组分,以降低肽段的共流出效应,从而提高鉴定。根据分离原理不同分为以下几种策略:SCX(Strong Cation Exchange强阳离子交换)、SAX(Strong Anion Exchange强阴离子交换)和RPLC(Reverse Phase Liquid Chromatography反相色谱)等。这种方法虽能有效提高样本鉴定量,然而将一个样本分离成多个组分进行分析,会显著增加分析时间,影响样本分析的通量,且对于易降解的肽段不利。
总之,目前尚缺少在消除高丰度蛋白影响的同时,不造成样本损耗的蛋白质组样本制备方法。因此,需要开发一些既能高效消除高丰度蛋白影响,又能提高低丰度蛋白定性定量结果可靠性的蛋白质组学分析方法。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种生物样本的蛋白质组学分析方法,所述方法基于多肽同位素标记技术,用于高效消除样本中高丰度蛋白的影响,并提高低丰度蛋白鉴定量。
本发明中,多肽指的是蛋白质经过蛋白酶作用后产生的肽段。
本发明中,蛋白指的是待分析样本含有的蛋白质。
一方面,本发明提供一种生物样本的蛋白质组学分析方法,所述方法基于多肽同位素标记技术以及液相层析法-质谱联用(LC-MS)分析技术,包括在目标生物样本中添加信号增强样本的步骤,其中,所述信号增强样本包含目标生物样本的蛋白种类的50%以上,且不包含高丰度蛋白。
这里,高丰度蛋白指的是生物样本中相对丰度排前,且质量比例达到样本中蛋白总质量10%以上的蛋白质,如白蛋白、IgG、IgA、纤维蛋白原、转铁蛋白等。
在具体实施方式中,所述信号增强样本可为去除了高丰度蛋白的生物样本或来源于本身不包含高丰度蛋白的生物样本,例如,所述去除了高丰度蛋白的生物样本源自血清、血浆或尿液样本,所述本身不包含高丰度蛋白的生物样本源自细胞样本。
所述目标生物样本包括其中需要进行蛋白质组学分析的含有蛋白的生物样本,例如可以为血清/血浆样本、尿液样本或细胞样本,但不限于此。
在具体实施方式中,所述方法在鉴定目标生物样本中的蛋白质时,不去除目标生物样本中的高丰度蛋白。
在具体实施方式中,所述方法包括以下步骤:
1)制备信号增强样本,
制备去除高丰度蛋白的生物样本或本身不包含高丰度蛋白的生物样本作为信号增强样本;
2)提取多肽
分别提取目标生物样本和信号增强样本的多肽;
3)样本标记及混合
选用多肽标记试剂标记步骤2)提取的多肽并且将由此获得的同一批次标记的目标生物样本和信号增强样本混合成一个样本;
4)制备LC-MS分析样本
对步骤3)的经多肽标记试剂标记的样本进行处理以制备LC-MS分析样本;
5)LC-MS分析
对步骤4)中获得的LC-MS分析样本进行LC-MS分析得到蛋白和多肽种类信息。
下文中对上述各步骤进行详细描述。
步骤1)
在步骤1)中,制备去除高丰度蛋白的生物样本作为信号增强样本。
作为信号增强样本,可以从血清、血浆、尿液、细胞等来制备。
从生物样本中去除高丰度蛋白可以通过本领域中的任何适合的方法进行操作来实现。例如可以采用在背景知识部分提及的去除高丰度蛋白的方法。特别地,可以采用高丰度蛋白去除微型离心柱(例如High SelectTMTop14)去除生物样本中的高丰度蛋白制得所述信号增强样本。
在具体实施方式中,步骤1)中,对于血清/血浆样本,采用以下方式制备信号增强样本:
使血清/血浆样本通过填充去高丰度蛋白树脂材料的高丰度蛋白去除微型离心柱(例如High SelectTMTop14)得到去除血清/血浆样本中的高丰度蛋白的信号增强样本。
例如,在High SelectTMTop14高丰度蛋白去除微型离心柱中填充去高丰度蛋白树脂材料,向其中添加灭活血浆样本,充分混合后,将装有充分混合样本的微型离心柱置于离心管中离心,将滤液收集至离心管中,滤液即为去除了白蛋白、IgG和其他高丰度蛋白质的信号增强样本。
信号增强样本保存在PBS溶液中,可以根据需要平行制备多组信号增强样本。处理后的信号增强样本可以即刻使用,也可以贮存在冰箱(例如-20℃)中备用。使用前用PierceTM蛋白浓缩管对信号增强样本进行浓缩,并测量蛋白质浓度。
在具体实施方式中,步骤1)中,对于尿液样本,采用以下方式制备信号增强样本:提取尿蛋白后,采用填充去高丰度蛋白树脂材料的高丰度蛋白去除微型离心柱(例如HighSelectTMTop14)去除其中的高丰度蛋白。
提取尿蛋白可以使用本领域中的任何适合的方法进行操作来实现,例如可以采用预冷丙酮沉淀。收集沉淀物作为信号增强样本。
或者,在具体实施方式中,步骤1)中,可以采用以下方式制备信号增强样本:选取一种或若干种含有与目标生物样本中蛋白质种类近似蛋白质的细胞(例如人白血病细胞系K562、molm13、HEL细胞系和/或血小板),经过细胞裂解获得蛋白提取液,确定浓度后、将它们混合到一起(例如等比例混合,混合比例也可根据样本的实际存留量或实验要求确定)制得信号增强样本。该方法特别适合于细胞样本。信号增强样本可分出若干份以备后用、作为定量参照系(pool)。
对于细胞样本,信号增强样本也可以直接购买商品化的细胞蛋白提取物,如HeLa或HEK293蛋白消化液等。所述含有与血清中蛋白质种类近似蛋白质的细胞选自人白血病细胞系K562、molm13和HEL细胞系,但不限于此。
步骤2)
在步骤2)中,分别提取目标生物样本和信号增强样本的多肽。
提取多肽的方法没有特别限制,可以采用本领域中任何合适的方法而没有特别限制。例如,可以经过例如蛋白质变性、还原、酶解消化等步骤来提取多肽。
在具体实施方式中,步骤2)中,可以设置多个目标生物样本,目标生物样本不去除高丰度蛋白。
步骤3)
在步骤3)中,选用多肽标记试剂标记步骤2)提取的多肽并且将由此获得的同一批次标记的目标生物样本和信号增强样本混合成一个样本。
在具体实施方式中,步骤3)中,所述多肽标记试剂可以是本领域中任何适合使用的多肽标记试剂。例如,多肽标记试剂可以选自TMT-6plex、TMT-10plex、TMT-16plex、iTRAQ和iCAT。
在具体实施方式中,步骤3)中,可以根据选定多肽标记试剂的说明书或实际情况(例如根据试剂盒说明书的试剂用量无法标记,则需要探索更优的试剂用量)优化标记实验,包括试剂用量、标记时间等。
信号增强样本占多肽标记试剂的其中一个标签,其它标签可以全部用于标记目标样本,也可以空出若干标签用于质量控制。
在具体实施方式中,步骤3)中,在混合前确认每一个样本的标记效率合格。
确认每一个样本的标记效率合格指的是多肽的标记率达90%以上,可以如下操作:取少量标记后的样本于LC-MS分离分析后,得到的结果进行数据搜索,查看样本的标记情况。
同一批次标记的目标生物样本和信号增强样本指的是一组多肽标记试剂标记的目标生物样本和信号增强样本,如一组TMT-16plex试剂的标签种类为16种,则由这16种标签分别标记的16个样本为同一批次。
对于目标生物样本和信号增强样本混合的方式可以采用本领域中任何适用的方式而没有特别限制。建议可以先进行预实验,根据与实验结果中的蛋白鉴定数目来确认。例如信号增强样本的量可以为目标生物样本量的1-10倍,例如1、2、5、10倍。如在本申请的实施例中,5倍混合后得到的结果最优,则在正式实验中沿用5倍的混合比例。
此外,在步骤3)还可以设置对照组或空白组。对照组即经过多肽标记试剂标记的不包含信号增强样本的测试样本组。空白组即不加任何多肽。它们可以用于结果的质量控制。
步骤4)
在步骤4)中,对步骤3)的标记样本进行处理以制备LC-MS分析样本。
所述处理可以采用本领域中任何适用的从标记样本制备用于蛋白质组学分析的LC-MS分析样本的方式而没有特别限制。例如,可以对标记样本进行除盐、旋干以及复溶来制备LC-MS分析样本,但不限于此。
在具体实施方式中,步骤4)中,混合的样本可以不进行预分级,或者可以进行预分级。
在具体实施方式中,步骤4)中,将混合的样本进行预分级,将一个混合样本分成多个组分,减少肽段的共流出,进一步消除高丰度蛋白的影响。
进行预分级的方法没有特别限制,可以采用本领域中任何适用的方式而没有特别限制。例如,可以采用在背景技术部分介绍的样本预分级方法。
步骤5)
在步骤5)中,对步骤4)中获得的样本进行LC-MS分析以得到蛋白和多肽种类信息。
LC-MS分析可以采用本领域中任何适用的方式而没有特别限制。
在LC-MS分析中,通过液相色谱对步骤4)中获得的样本进行梯度分离和洗脱后采用质谱进行信号数据采集。
在具体实施方式中,步骤5)中,液相色谱可以采用预柱-分析柱串联模式或分析柱模式。
在具体实施方式中,步骤5)中,可以采用反相色谱,并用纯水和有机溶剂作为流动相,梯度设置为低有机相到高有机相。纯水和有机溶剂的比例可以为以体积比计20%至80%。在低有机相的情况下,有利于亲水性肽段的洗脱,在高有机相的情况下,有利于疏水性肽段的洗脱。由此,采用梯度洗脱的方式可以获得更多更全面的肽段信息。
所述有机溶剂可以为乙腈等。
在具体实施方式中,步骤5)中,可以采用串联质谱采集质谱信号。
在信号数据采集后,可以按照本领域中任何适用的方式进行数据处理,以得出蛋白和多肽种类信息。
例如,可以选用人工注释和审查的智人蛋白质fasta数据库(SwissProt),在Proteome Discoverer软件中进行质谱数据搜索,从而得到样本中肽段及对应蛋白质的定性和定量信息。
有益效果
本发明的方法由于在待测样本中混合信号增强样本,无需去除待测样本的高丰度蛋白,即可检测到低丰度蛋白。另外,本发明的方法由于无需去除待测样本的高丰度蛋白,因此,不会造成低丰度蛋白的损失,从而提高了待测样本中低丰度蛋白鉴定量。
附图说明
图1:A示出实施例1中对照组的MS2信号,B示出实验组的信号。
图2示出实施例1中对照组和实验组样本鉴定到的多肽数目。
图3示出实施例1中对照组和实验组样本鉴定到的蛋白数目。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细描述本发明的技术方案,然而下述实施例并不用于限定本发明的范围。
实施例1:可行性测试
本实施例中例示本发明设计的方法操作的具体步骤,同时通过设置对照组证实了本发明方法的可行性。
(1)选用人白血病细胞系K562、molm13和HEL细胞系以及血小板的多肽提取物作为信号增强样本。首先经过细胞裂解、蛋白提取操作得到几种细胞系的蛋白质。
(2)从步骤(1)中获得的多种细胞的蛋白提取液经过多肽提取操作分别获得这几种细胞系的多肽提取液,检测浓度后将它们等量混合,得到混合信号增强样本。从14个待测的健康人血清样本(志愿捐献、已知情同意)中取少量血清,等量混合,制成一个混合样本,作为多肽定量参照系;无需进行去高丰度蛋白的操作,分别提取14个待测血清样本和混合样本的多肽,检测浓度。
(4)分别取等质量的14个待测样本、混合样本和5倍质量的信号增强样本,使用TMT-16plex试剂(Thermo ScientificTM,#A44520)进行多肽标记,TMT试剂和标记样本的质量比为8:1。分实验组和对照组进行标记,样本用量和标记通道见下表1,对照组不包含信号增强样本,S1-S14为待测样本。确认标记效率合格后,将标记好的样本按照组别分别混合成两个样本,即表1中对照组的样本混合成一个样本,实验组亦然。
表1
(4)步骤(3)中得到混合样本经过脱盐、旋干操作后,用质谱缓冲液A(98%水,2%乙腈,0.1%甲酸)分别复溶。
(5)使用nanoflow DIONEX UltiMate 3000RSLCnano系统液相色谱及QExactiveHF-Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific,San Jose,USA)分别对对照组和实验组样本进行数据依赖采集(DDA),具体参数为:质谱缓冲液A同上,质谱缓冲液B是98%乙腈,2%水,0.1%甲酸。使用反相亲和液相色谱,80分钟色谱梯度进行分析。在Proteome Discoverer软件中进行质谱数据搜索,选用人工注释和审查的智人蛋白质fasta数据库(SwissProt,2020年4月27日)。参数设置如下:酶消化参数为具有两个缺失切割的全特异性胰蛋白酶;静态修饰包括赖氨酸残基和N端肽的TMTpro,以及半胱氨酸的氨基甲基化;动态修饰设置为蛋氨酸氧化和N端肽乙酰化;前体离子和子离子的质量容差分别是10ppm和0.02Da;肽谱匹配允许1%的目标错误发现率(FDR)(严格)和5%的目标错误发现率(宽松)。数据搜索结果能够得到样本中含有的多肽序列及其对应的蛋白质。比较两组样本的多肽和蛋白的鉴定量。
实验结果:
图1A示出对照组的MS2质谱信号,图1B示出实验组的质谱信号,根据质谱信号对比,在对照组实验结果中不存在134N通道的信号,即信号增强样本的信号。而在实验组的谱图中,信号增强样本的信号强度几乎是其它通道强度的5倍,与上文加入的样本量相符。
图2和图3分别示出对照组和实验组样本鉴定到的多肽和蛋白数目。比较发现,相比对照组,实验组中所有待测样本鉴定到的肽段和蛋白数目均显著增加,且实验组中各待测样本的多肽总量仅为对照组的一半,说明本申请设计的实验方法能在未去除高丰度蛋白的情况下,显著提高血清样本的多肽和蛋白鉴定量。
Claims (10)
1.一种生物样本的蛋白质组学分析方法,所述方法基于多肽同位素标记技术以及液相层析法-质谱联用(LC-MS)分析技术,包括在目标生物样本中添加信号增强样本的步骤,其中,所述信号增强样本包含目标生物样本的蛋白种类的50%以上的蛋白种类,且不包含高丰度蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述信号增强样本为去除了高丰度蛋白的生物样本或来源于本身不包含高丰度蛋白的生物样本。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述信号增强样本源自血清、血浆、尿液或细胞。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述目标生物样本选自血清样本、血浆样本、尿液样本或细胞样本。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法在鉴定目标生物样本中的蛋白质时,不去除目标生物样本中的高丰度蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
1)制备信号增强样本,
制备去除了高丰度蛋白的生物样本或本身不包含高丰度蛋白的生物样本作为信号增强样本;
2)提取多肽
分别提取目标生物样本和信号增强样本的多肽;
3)样本标记及混合
选用多肽标记试剂标记步骤2)提取的多肽并且将由此获得的同一批次标记的目标生物样本和信号增强样本混合成一个样本;
4)制备LC-MS分析样本
对步骤3)的经多肽标记试剂标记的样本进行处理以制备LC-MS分析样本;
5)LC-MS分析
对步骤4)中获得的LC-MS分析样本进行LC-MS分析得到蛋白和多肽种类信息。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,在步骤1)中,采用高丰度蛋白去除微型离心柱去除生物样本中的高丰度蛋白制得所述信号增强样本;或者
在步骤1)中,选取一种或若干种含有与目标生物样本中蛋白质种类近似蛋白质的细胞,经过细胞裂解获得蛋白提取液,确定浓度后,将它们混合到一起制得信号增强样本。
8.根据权利要求6所述的方法,其中,在步骤2)中,通过蛋白质变性、还原、酶解消化提取多肽。
9.根据权利要求6所述的方法,其中,在步骤3)中,所述多肽标记试剂选自TMT-6plex、TMT-10plex、TMT-16plex、iTRAQ和iCAT;在所述混合中,信号增强样本的量为目标生物样本量的1至10倍。
10.根据权利要求6所述的方法,其中,在步骤4)中,对步骤3)的混合样本进行预分级;和/或
在步骤5)中,液相色谱采用预柱-分析柱串联模式或分析柱模式;和/或
在步骤5)中,采用反相色谱,并用纯水和有机溶剂作为流动相,梯度设置为低有机相到高有机相;和/或
在步骤5)中,选用人工注释和审查的智人蛋白质fasta数据库,在ProteomeDiscoverer软件中进行质谱数据搜索,从而得到目标生物样本中肽段及对应蛋白质的定性和定量信息。
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刘怡君 等: "利用肽配体库分析蛋清中低丰度蛋白质组", 《分析测试学报》 * |
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN115128285A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-09-30 | 西湖大学 | 一种蛋白质组合对甲状腺滤泡性肿瘤鉴别评估的试剂盒、系统 |
CN115144599A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-10-04 | 西湖大学 | 蛋白组合在制备对儿童甲状腺癌进行预后分层的试剂盒中的用途及其试剂盒、系统 |
CN115144599B (zh) * | 2022-09-05 | 2023-01-06 | 西湖大学 | 蛋白组合在制备对儿童甲状腺癌进行预后分层的试剂盒中的用途及其试剂盒、系统 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN114705794B (zh) | 2022-12-02 |
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