TWI547686B - 醣胜肽之胺基酸定序及醣基鑑定雙功能方法及系統 - Google Patents

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Description

醣胜肽之胺基酸定序及醣基鑑定雙功能方法及系統
本發明係有關醣胜肽之胺基酸定序及醣基鑑定之方法及系統。具體而言，本發明係有關自動化醣胜肽定序方法。
醣化作用(glycosylation)為細胞內最常見及最複雜的轉譯後修飾作用(post-translational modification)。聚醣(glycans)以二種主要方式經由醣苷鍵鏈結至胺基酸，包括N-型鏈結至天[門]冬醯胺酸(asparagine)及O-鏈結聚醣附接至絲胺酸(serine)與蘇胺酸(threonine)。該蛋白質醣化作用係涉及許多重要的細胞活性，例如蛋白質折疊、免疫反應及細胞與細胞間之溝通。許多研究已顯示異常的醣化作用在癌細胞生長及轉移上扮演重要角色。因此，發展精確及有效的醣蛋白分析方法作為診斷工具變得重要。
質譜(mass spectrometry)目前在醣化作用的研究上扮演不可或缺的角色。鑑定醣化作用位置及決定聚醣結構之標準步驟包括醣胜肽之富集(enrichment)、聚醣之酵素或化學釋出，隨後進行釋出之聚醣及留存之胜肽的結構確定。近年來，液相層析/質譜(liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS)技術被廣泛使用。不同的胜肽分段(fragmentation)技術包括碰撞誘導解離(collision induced dissociation，CID)、紅外線多光子解離(infrared multi-photon dissociation，IRMPD)、電子捕獲解離(electron capture dissociation，ECD)及電子轉移解離(electron-transfer dissociation，ETD)皆常用於串聯式質譜(MS/MS)以獲得聚醣結構及該醣胜肽之胜肽骨架胺基酸序列。一般而言，IRMPD及CID係基於振動激發(vibrational excitation)其主要將最不穩定的醣苷鍵分段以產生各種聚醣片段。ECD及ETD分段技術係基於電子激發能量其適用於胜肽鍵切割以獲得胜肽序列資訊。許多嘗試已藉由整合醣苷鍵鏈結(如CID結果)及胜肽序列(如ETD數據)之資訊以鑑定醣蛋白之醣化作用位置及聚醣結構來進行。醣胜肽鑑定的主要挑戰係因於MS2之碰撞型式中，如CID或HCD，缺乏胜肽片段。即使該ETD方法可將醣胜肽分段，因ETD對於醣胜肽之分段效率差、胺基酸序列鑑定困難、醣胜肽聚醣結構之複雜性及必須由多個實驗中進行手動數據分析，CID及ETD結果之整合用於醣胜肽結構決定仍是效率不佳且費時。
近來，針對醣苷鍵切割之高能量碰撞解離(higher-energy collisional dissociation，HCD)已被發展。Segu與Mechref證實以不同碰撞能量產生的醣苷鍵分段可能造成醣胜肽Y1離子(具有一個N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)的胜肽)及正氧離子(oxonium ions)之形成而非以Thermo LTQ-Orbitrap儀器進行胜肽骨架鏈分段所產生的b/y離子(Segu及Mechref,Rapid Commun Mass Spectrom,24：1217-1225,2010)。由於醣胜肽Y1離子可被正確決定，隨後的Y1離子串聯質譜可因而提供醣胜肽之胜肽骨架胺基酸 序列。然而，有兩個於儀器配置上的問題限制了以Y1離子於醣胜肽胺基酸定序之應用。第一個限制為常規之混合型質譜儀如Thermo LTQ-Orbitrap MS之HCD設計，在相同實驗中侷限了連續性MS3偵測，亦即無法用於相繼之HCD誘導MS2及HCD誘導MS3偵測，因此，其無法同時進行MS2醣胜肽之Y1離子鑑定及隨後的MS3胜肽胺基酸序列確定。第二個限制在於進行醣胜肽分段需要適當的碰撞能量。Segu與Mechref證實，醣胜肽Y1離子於HCD時之碰撞能量最大強度與醣胜肽胺基酸序列及其附加之聚醣結構相關聯。因此，使用習知方法最佳化不同醣胜肽分段時的碰撞能量並不實用。
現今可得之分段方法，例如CID、HCD及ETD，皆無法提供具有醣胜肽胺基酸序列資訊之MS2質譜。因此，仍需發展一更有效及有效率的方法及系統以用於醣胜肽之胺基酸定序。
本發明提供一種使用Y1離子於自動化醣胜肽定序(automatic glycopeptide sequencing by Y1 ions，以下稱為「AGSY方法」)之新穎策略，其中該醣胜肽資訊，包括胺基酸序列及醣基(glycoform)，可藉由雙功能離子阱質譜予以同時決定。
因此，在一方面，本發明提供一種藉由配備阱高能量碰撞解離(trap HCD)之質譜儀以用於胺基酸定序及醣基鑑定之雙功能方法，其步驟包含：- 將醣胜肽分段； - 藉由該阱高能量碰撞解離產生具有附加一N-乙醯胺基六碳醣(HexNAc)之離子(Y1離子)之胜肽；- 藉由該阱高能量碰撞解離產生該醣胜肽之質譜(trap HCD-MS2)；- 藉由一離子活化技術產生該Y1離子之質譜(MS3)；- 收集數據，包括一全質量範圍質譜掃描、一阱高能量碰撞解離誘導之MS2掃描(Trap HCD-MS2)，以決定該醣胜肽之聚醣部分之結構，及一MS3掃描(MS3)，以決定該醣胜肽之胜肽部分之胺基酸序列。
在本發明部分實施例中，該離子活化技術係選自由碰撞誘導解離(CID)、高能量碰撞解離(HCD)、紅外線多光子解離(IRMPD)、電子轉移解離(ETD)，及紫外光(ultraviolet，UV)與真空紫外光(vacuum ultraviolet，VUV)多光子解離所組成之群組。在本發明之一實例中，該離子活化技術為CID。
在另一方面中，本發明提供一種雙功能離子阱質譜儀以進行上述之方法，其包含：- 二種離子化源，包括電噴灑離子化(electrospray ionization；ESI)及基質輔助雷射脫附/離子化(matrix-assisted laser desorption/ionization；MALDI)，其中該二種離子化源以一通道相連接；- 二種質譜分析儀，包括一3D四極柱離子阱(quadruple ion trap，QIT)及線性離子阱(linear ion trap，LIT)，其中該QIT為用於產生Y1離子之阱高能量碰撞解離(trap HCD)，並產生一醣胜肽之質譜(MS2)，而該LIT為用於產生Y1離子質譜(MS3)之質譜儀； - 配備轉換倍增電極(conversion dynode)及甬道(channeltron)之偵測器，用於取得全質量範圍掃描(MS)、阱高能量碰撞解離誘導掃描(HCD-MS2)及MS3掃描(MS3)；- 一進樣盤，其安裝於腔室中以形成真空MALDI，其經由離子導(ion guide)連接至該QIT；- 一脈衝閥作為二個離子阱之間的電噴灑源介面以用於控制由該QIT至該LIT之離子；其中該MALDI、二個離子阱及偵測器係於真空系統中建置。
為了闡釋本發明之目的，圖式為目前之較佳具體實施例。然而，應被理解的是，本發明並未侷限於所示之較佳具體實施例。
在圖示中：
圖1顯示依據本發明使用雙功能離子阱系統於醣蛋白胺基酸定序之方法圖解。
圖2顯示本發明之一具體實施例之雙功能離子阱質譜儀及使用該質譜儀之本發明方法之性能；其中圖2(a)提供該雙功能離子阱質譜儀用於實施依據本發明之AGSY方法，及圖2(b)提供如圖2(a)所示之雙功能離子阱質譜儀之碰撞誘導解離方法的三階段時程圖解。
圖3提供一醣蛋白之校正後碰撞能量(normalized collision energy，NCE)數據，其中圖3(a)提供一顯示校正後碰撞能量對於醣胜肽Y1離子(MS2)強度影響之折線圖，其中校正後強度係定義為在m/z>800區域之最強尖峰 訊號下的醣胜肽Y1離子尖峰強度；及圖3(b)提供在m/z>800區域中除了以Y1離子作為校正後碰撞能量(NCE)之函數外，具有最強訊號尖峰之校正後強度的虛線圖，其顯示當NCE設定在HCD誘導MS2質譜中係介於70%與110%之間時，該醣胜肽Y1離子具有最強訊號。該醣類符號定義如下：藍色方形(■)：N-乙醯基葡萄糖胺；綠色圓形(●)：甘露糖；黃色圓形(　)：半乳糖；及紫色菱形(◆)：唾液酸。
圖4顯示該醣胜肽Y1離子之NCE數據。在圖4(a)中，實線代表該醣胜肽Y1離子之校正後強度以作為在m/z>800區域中具有用於所有訊號之TriS3結構於雙電荷(+2)、三電荷(+3)及四電荷(+4)N-鏈結醣胜肽LCPDCPLLAPLNDSR之NCE函數。在圖4(b)中，虛線顯示具有最強訊號之尖峰校正後強度而非該Y1離子作為在m/z>800質量範圍內具有用於所有訊號之TriS3結構於雙電荷(+2)、三電荷(+3)及四電荷(+4)N-鏈結醣胜肽LCPDCPLLAPLNDSR之NCE函數。該醣類符號如圖3所述。
圖5提供一N-鏈結醣胜肽146LCPDCPLLAPLNDSR160之MSn質譜，其中圖5(a)提供由HCD分段後之MS2質譜，其中該醣胜肽Y1離子為m/z>800區域之最強訊號及藉由AGSY可被自動選取以進行後續的CID分段(MS3)，及該醣胜肽之氧鎓離子係出現在m/z小於400之區域；及圖5(b)提供由CID分段後之MS3質譜，其中該醣胜肽之胺基酸序列可於Mascot資料庫搜索中直接由CID-MS3質譜尖峰列表決定。該醣類符號如圖3所述。
圖6提供一O-鏈結醣胜肽334TPIVGQPSIPGGPVR348之MSn質譜，其中圖6(a)提供該HCD誘導MS2質譜，其中該胜肽離子在m/z>800區域顯示最強訊號， 其可被自動選取以進行額外之CID分段MS3偵測，而MS2質譜中所觀察到的產物離子訊號係源自該O-連結醣胜肽之胜肽骨架片段；以及圖6(b)提供該CID誘導MS3質譜，其中該醣胜肽之胺基酸序列可於Mascot資料庫搜索中直接由CID-MS3質譜尖峰列表決定。醣類符號如圖3所述。
除非另有定義，本文使用之所有技術性及科學性術語具有如同本發明領域技術人員可常規理解之相同意義。
除非本文另有明確規定，本文所使用之單數形式「一」、「一者」及「該」包括複數形式。因此，舉例而言，「一樣本」包括複數個本領域技術人員習知之該同等樣本及其同等物。
本發明提供一種用於醣胜肽定序及醣基鑑定之方法，其特徵在於單次分析中決定醣化作用位置、鑑定醣胜肽之胺基酸序列，及顯示在每一醣化作用位置之該聚醣結構。
本發明提供一種藉由配備阱高能量碰撞解離(trap HCD)之質譜儀以用於胺基酸定序及醣基鑑定之雙功能方法，其步驟包含：- 將醣胜肽分段；- 藉由該阱高能量碰撞解離產生具有附加一HexNAc之離子(Y1離子)之胜肽；- 藉由該阱高能量碰撞解離產生該醣胜肽之質譜(trap HCD-MS2)；- 利用一離子活化技術產生該Y1離子之質譜(MS3)； - 收集數據，包括一全質量範圍掃描、一阱高能量碰撞解離誘導之MS2掃描(Trap HCD-MS2)，以決定該醣胜肽之聚醣部分之結構，及一MS3掃描(MS3)，以決定該醣胜肽之胜肽部分之胺基酸序列。
在本發明中，該離子活化技術係選自由碰撞誘導解離(CID)、高能量碰撞解離(HCD)、紅外線多光子解離(IRMPD)、電子轉移解離(ETD)及UV與VUV多光子解離所組成之群組。在本發明之一實施例，該離子活化技術為CID。
如圖1所示本發明具體實施例之方法圖解，該醣胜肽定序係藉由一包含使用Y1離子(附接一具有HexNAc之胜肽)之阱高能量碰撞解離(trap HCD)及碰撞誘導解離(CID)的雙功能離子阱質譜儀所完成。在本發明之方法中，該醣胜肽係分段並藉由阱高能量碰撞解離使該Y1離子係有效產生於MS2質譜中且該Y1離子可進行CID以取得MS3質譜。該Y1離子(針對N-鏈結醣胜肽)與胜肽離子(針對O-鏈結醣胜肽)可於MS2中被自動鑑定並接續進行以取得該醣胜肽之胜肽骨架片段之MS3質譜。本發明實現自動化決定醣胜肽之胺基酸序列及醣基之可能。
因此，本發明亦提供一種使用Y1離子之自動化醣胜肽定序方法(AGSY方法)以於單次LC-MS/MS分析中同時鑑定醣胜肽之醣化作用位置及決定醣胜肽之胺基酸序列。其係基於三階段質譜數據收集，包括(1)該全質量範圍MS掃描；(2)該HCD誘導的MS2掃描；及(3)該MS3掃描。圖2提供一依據本發明之自動化定序方法之圖解。如圖2(a)所示依據本發明一具體實施例之雙功能離子阱質譜儀，該三階段質譜數據收集係顯示於 圖2(b)，其中HCD係用於作為MS2之分段方法，以產生並選取Y1離子用於接續的CID-MS3偵測。該醣胜肽Y1離子含有附加一個乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)殘基的未分段胜肽序列；因此，該醣胜肽Y1離子之串聯質譜(MS3)提供醣胜肽胜肽骨架之胺基酸序列資訊。該醣胜肽之胺基酸序列可藉由僅提交MS3數據至任何的資料庫搜尋程式如Mascot或Sequest予以決定。此外，該醣化作用位置可藉由至資料庫中搜尋天[門]冬醯胺酸上的HexNAc可變修飾之指派予以決定。針對由非醣胜肽所產生之MS3質譜，其在數據庫搜尋中將顯示無符合的胜肽，係因該等MS3質譜係產生自MS2中片段胜肽之訊號。該醣胜肽之胺基酸序列可因此直接由本發明方法之CID-MS3數據決定而無須考慮樣本中非醣胜肽之存在。本發明之方法提供一種在MS2質譜中獨特醣胜肽Y1離子之自動化決定，其使該醣胜肽之自動化胺基酸定序確實可行。
此外，本發明亦提供一種特殊設計之質譜儀以進行上述之方法。該雙功能離子阱質譜儀包含：- 二種離子化源，包括電噴灑離子化(ESI)及基質輔助雷射脫附/離子化(MALDI)，其中該二種離子化源以一通道相連接；- 二種質譜分析儀，包括一3D四極柱離子阱(QIT)及線性離子阱(LIT)，其中該QIT為用於產生Y1離子之阱高能量碰撞解離(trap HCD)，並產生一醣胜肽質譜(MS2)，且該LIT為用於產生Y1離子質譜(MS3)之質譜儀； - 配備轉換倍增電極及甬道之偵測器，用於取得全質量範圍掃描(MS)、阱高能量碰撞解離誘導掃描(HCD-MS2)及MS3掃描(MS3)；- 一進樣盤，其安裝於腔室中以形成真空MALDI，其經由離子導連接至該QIT；- 一脈衝閥作為二個離子阱之間的電噴灑源介面以用於控制由該QIT至該LIT之離子；其中該MALDI、二個離子阱及偵測器係於真空系統中建置。
藉由該雙功能離子阱質譜儀，該AGSY方法可被實施。為了在MS2質譜中允許醣胜肽Y1離子之自動化選取，該儀器設定必須達到最佳化以用於最大化醣胜肽Y1離子尖峰之訊號強度。
依據本發明，任何具有不同胺基酸序列及不同聚醣結構之醣胜肽模型皆適用。在本發明之實施例中，牛胎球蛋白(bovine fetuin)、人類α1-酸醣蛋白及山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)之三種醣胜肽模型，係被選取以藉由本發明之方法進行定序；其中牛胎球蛋白代表一具有典型醣基聚醣結構之模型；人類α1-酸醣蛋白及山葵過氧化酶各為聚醣中主要含有去氧己醣(海藻糖)及五碳醣的二種模型。
相同醣化作用位置的醣基變化可完全改變醣蛋白的生物特性。該等變化中部分與腫瘤形成過程有關。因此，在相同醣化作用位置上不同醣基間的定量比較在生物應用上非常重要。
當該聚醣分子量係獲得自低質量準確性數據時，可能需要額外手動指派以決定每一聚醣之正確醣類組成。本發明之方法可利用該醣胜 肽之萃取離子層析法(extract ion chromatograms，XIC)及整合MASIC35以用於聚醣定量。傳統的聚醣定量方法係基於螢光團標記(例如，2-胺基苯甲醯胺(2-aminobenzamide，2-AB))之所有聚醣之釋放接續藉由液相層析分離法結合該螢光或質譜法偵測。因此，本發明之方法可進一步包含同位素標記與等壓標記(isobaric labeling)可被用於醣胜肽定量。
實施例1
三種醣蛋白模型包括牛胎球蛋白、人類α1-酸醣蛋白及山葵過氧化酶係被用於例示本發明之方法。醣蛋白係藉由一雙酵素分解系統(胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶)處理以增加蛋白質序列覆蓋率。經分解之醣蛋白胜肽係以無須進行任何醣胜肽富集程序之AGSY設定在雙功能離子阱質譜儀上直接分析。
針對以酵素分解牛胎球蛋白之醣胜肽，選取五種N-鏈結醣胜肽進行測試，其含有相同的胺基酸序列LCPDCPLLAPLNDSR，但不同的聚醣觸角結構及聚醣唾液酸數量。不同電荷狀態被使用於醣胜肽前驅離子(precursor ions)中。
在使用不同的校正後碰撞能量(normalized collision energies，NCEs)下，該醣胜肽Y1離子之訊號強度輪廓係被監測於以HCD誘導之MS2偵測，其結果顯示於圖3。圖3(a)顯示校正後碰撞能量相對於醣胜肽Y1離子強度之影響，其中該校正後強度係定義為在m/z>800區域之最強尖峰訊號下醣胜肽Y1離子之尖峰強度。圖3(b)顯示在m/z>800區域除了以Y1離子作為校正後碰撞能量之函數外具有最強訊號尖峰之校正後強 度。該相對應的聚醣觸角結構、唾液酸數量及醣胜肽電荷狀態係顯示於圖3中。舉例而言，BiS1+3代表包含具有一個唾液酸之雙觸角型聚醣之三電荷N型醣胜肽。由於所有五種醣胜肽模型皆含有相同胺基酸序列，其醣胜肽Y1離子係具有相同之HCD MS2質譜。其觀察用於該五種醣胜肽之醣胜肽Y1離子具有相同的胺基酸胜肽序列LCPDCPLLAPLNDSR。
一重要發現為當該m/z之偵測範圍限定為大於800，則當NCE值設定為介於70%與110%之間時，所有的醣胜肽Y1離子皆具有最強訊號(亦即，醣胜肽Y1離子之校正後強度為100%)，顯示該醣胜肽Y1離子訊號於HCDMS2質譜中僅受該施加之NCE所影響而非其相對應之聚醣結構或醣胜肽前驅離子之電荷狀態。因此，當施加適當NCE在較高之m/z區域以監測訊號時，在MS2中醣胜肽Y1離子之自動化選取確實可行。
為了確保該醣胜肽Y1離子可被正確選取，除了於MS2質譜之較高m/z區域的聚醣氧鎓離子外，該片段離子之訊號強度係予以偵測。
圖3(b)顯示其他以醣胜肽Y1離子作為NCES函數外具有最大量訊號之尖峰校正後強度的折線圖。當NCE值設定在HCD誘導MS2質譜中係介於70%與110%之間時，該醣胜肽Y1離子具有最強訊號；因此，在MS2中醣胜肽Y1離子之自動化選取以進行接續的MS3偵測係確實可行。此結果亦解釋了過往例行質量分析中，因典型NCE設定為30%所造成醣胜肽Y1離子之自動化辨識的不可行性。在AGSY方法中之其他關鍵設定係為該m/z偵測區域。為了避免來自聚醣氧鎓離子之訊號干擾，該m/z>800之限制可確保醣胜肽Y1離子選取之正確性。此係因聚醣結構已知在碰撞誘導分段過程 中易於分解且所產生之聚醣氧鎓離子通常具有高強度之訊號。因此，具有NCE之適當設定及正確的m/z偵測區域，本發明可確保其醣胜肽Y1離子於HCD誘導MS2質譜中具有最大量的訊號及可被自動化選取以進行接續的MS3偵測。
使用HCD以進行MS2偵測為本發明方法之另一關鍵因子。其發現該正確選取NCE以最大化醣胜肽Y1離子訊號強度僅於HCD觀察到而未出現於CID誘導MS2質譜(請見圖3)。因該MS3偵測為決定該醣胜肽之胺基酸序列所需，僅配備HCD與CID之雙功能分段技術之質譜儀可被應用於本發明之方法。其結論為該雙功能離子阱質譜儀係可用於進行本發明之方法。其利用一線性離子阱作為質量分析儀且能進行HCD與CID分段方法。
因施加於質譜儀以進行分段之碰撞能量係與前驅離子之電荷狀態及m/z值相關聯，前驅離子電荷狀態的錯誤判定將導致施加不適當的碰撞能量。為了評估上述效應，於HCD MS2監測具有聚醣結構TriS3之N-鏈結醣胜肽LCPDCPLLAPLNDSR之醣胜肽Y1離子的校正後強度。雖然此N-鏈結醣胜肽於MS之m/z 1945.31處顯示一三電荷前驅離子訊號，該雙、三及四電荷離子之電荷狀態為手動指派以於HCD MS2中監測醣胜肽Y1離子訊號。如圖4所發現，即使觀察到其他前驅離子，該醣胜肽Y1離子於NCE介於70%與110%之間顯示最高訊號強度。其可被斷定在MS質譜中，醣胜肽前驅離子之其他電荷狀態在HCD誘導MS2中之醣胜肽Y1離子決定不具有明顯影響。因此，來自MS2質譜之醣胜肽Y1離子自動化選取可藉由伴隨部分低質量解析度之雙功能離子阱質譜儀予以獲得。
三種醣蛋白模型包括牛胎球蛋白、人類α1-酸醣蛋白及山葵過氧化酶係被使用於證明本發明之AGSY方法。醣蛋白係利用雙酵素分解系統(胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶)處理以增加該蛋白質序列覆蓋率。經分解之醣蛋白胜肽係以AGSY方法製備而無須進行任何醣胜肽富集程序在雙功能離子阱質譜儀上直接分析。牛胎球蛋白、人類α1-酸醣蛋白及山葵過氧化酶經鑑定後之N-及O-鏈結醣化作用位置係分別列於表1至表3。
如圖5所示，該N-鏈結醣胜肽之MS2及MS3質譜顯示牛胎球蛋白A經胰蛋白酶水解後之胜肽具有胺基酸序列LCPDCPLLAPLNDSR及TriS3聚醣。該MS2質譜係獲自於在MS檢查掃描時於m/z 1535處選取三電荷前驅離子，隨後進行HCD分段(如圖5(a)所示)。該醣胜肽Y1離子，在HCD MS2中m/z 1944處之單一電荷訊號，當NCE設定為70%時其於m/z範圍大於800之區域具有最高訊號強度。依據該AGSY方法之設定，該醣胜肽Y1離子(m/z 1944)可被自動選取以進行後續的CID-MS3數據收集(如圖5(b)所示)。由該MS3質譜轉換之尖峰列表係直接提交至Mascot以進行MS/MS分析，其HexNAc被指定為可變修飾。該N-型醣胜肽LCPDCPLLAPLNDSR之胺基酸序列及醣化作用位置隨即由具有Mascot評分之MS3數據正確決定。
圖6提供該O-鏈結醣胜肽334TPIVGQPSIPGGPVR348之MSn質譜。圖6(a)顯示HCD誘導的MS2質譜。該胜肽離子顯示位於m/z>800區域最強訊號其可被自動選取以進行額外的CID分段MS3偵測。在該MS2質譜中觀察到的產物離子訊號係來自於O-鏈結醣胜肽之胜肽骨架片段。圖6(b)顯示CID誘導的MS3質譜。該醣胜肽之胺基酸序列可被直接以Mascot數據庫 搜尋中之CID-MS3質譜之尖峰列表而確定。如圖6所示，該NCE設定係以N-鏈結醣胜肽進行評估，該O-鏈結醣胜肽亦可藉由該AGSY方法進行自動化定序，因此，可獲得該O-鏈結醣胜肽TPIVGQPSIPGGPVR之鑑定。
該醣胜肽係取自由胰蛋白酶分解之牛胎球蛋白A且其絲胺酸上含有O-型聚醣，N-乙醯胺基六碳醣-六碳醣-唾液酸(HexNAc-Hex-Sialic acid)。在MS2質譜中於HCD分段後該O-鏈結醣胜肽之最大量訊號位於m/z 1475處(圖4(a))，其係由MS檢查掃描時在m/z 1066處之雙電荷前驅離子所產生。利用該相同步驟進行N-鏈結醣胜肽鑑定，將CID-MS3質譜(圖4(b))轉換之尖峰列表提交至Mascot伴隨HexNAc修飾，及以Mascot決定該O-鏈結醣胜肽之胺基酸序列，其評分為34。一重要發現為不同於含N-型聚醣之醣胜肽，O-鏈結醣胜肽於HCD MS2質譜中之最強訊號為胜肽離子而非該醣胜肽Y1離子。如所習知其醣苷鍵係易於碰撞誘導分段過程中斷裂，而O-鏈結醣胜肽中HexNAc與絲胺酸或蘇胺酸之間的化學鏈結具有與聚醣之醣苷鍵類似性質。因此，藉由HCD誘導的MS2以AGSY方法用於O-鏈結醣胜肽時，常觀察到胜肽離子形成。在檢視該N-與O-鏈結醣胜肽之MS2與MS3質譜後，我們結論是AGSY方法係能用於N-與O-型醣胜肽。唯一的差別係該用於後續CID-MS3之Trap-HCD誘導的MS2質譜之訊號源自醣胜肽Y1離子(N-型醣胜肽)或胜肽離子(O-型醣胜肽)。然而，該醣胜肽之胺基酸序列可隨時由後續的CID-MS3予以決定。
除了由胜肽骨架片段產生之訊號外，在MS2及MS3質譜亦可觀察到聚醣解構後之產物離子訊號。該等訊號係用於識別尖峰(signature peaks)以確認AGSY方法中醣胜肽之存在。舉例，如圖5(a)所示，在HCD MS2質譜中所觀察到由O-鏈結醣胜肽之連續醣類損失，包括一個唾液酸(-291,m/z 1841)、一個Hex(-162,m/z 1678)及一個HexNAc(-203,m/z 1475)的損失。此外，圖5(b)亦發現，在N-鏈結醣胜肽LCPDCPLLAPLNDSR之CID-MS3質譜中，該Y1-120(0,2X)及Y1-203(損失一個GlcNAc)位於m/z 1824及1742。
醣蛋白係經酵素分解並隨即以本發明方法分析。其顯示該醣化作用位置可被成功鑑定，而每一聚醣之醣類組合物及其相對量可基於具有相類似聚醣結構醣胜肽之類似的離子化效率之假設予以決定。舉例而言，藉由AGSY方法，TriS3、TriS2及BiS2係確定為牛胎球蛋白的主要聚醣結構類型，而TriS3為最大量的醣基(請見表1)。表2顯示山葵過氧化酶經胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙酵素分解後，由AGSY方法鑑定之醣胜肽及其相對應之醣基。表3顯示人類α1-酸醣蛋白經胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙酵素分解後，由本發明方法鑑定之醣胜肽及其相對應之醣基。如表1所示，分別鑑定出一新穎O-型醣化作用位置，即牛胎球蛋白B之T295，及一新穎N-型醣化作用位置，即山葵過氧化酶之N316。利用AGSY方法將包含該兩個新發現之醣化作用位置之醣胜肽進行自動化定序；此外，於該二者之HCD誘導的MS2質譜中鑑定出的聚醣氧鎓離子進一步確認該等發現。該等結果與先前的研究結論一致。
除了鑑定蛋白質之醣化作用位置外，本發明方法亦提供每一醣化作用位置之各種醣基定性及定量資訊。當以具有相同胺基酸序列但不 同相對應醣基之醣胜肽進行分析時，因MS2具有源自醣胜肽Y1離子(針對N-鏈結醣胜肽)或胜肽離子(針對O-連結醣胜肽)之相同前驅離子，其顯示相同的MS3質譜。因此，由其MS之前驅離子及MS3結果所決定之醣胜肽胺基酸序列可計算相對應之聚醣分子量。該聚醣分子量則提交至GlycoWorkBench以解析其醣類組成。因此，本發明提供用於醣蛋白之整體聚醣數量數據，並能分辨醣蛋白之每一醣化作用位置的不同醣基數量，以及藉由AGSY方法用於各種醣基的相對定量以提供如監測該生物樣本醣基變化時的之效資訊。
1習知之牛胎球蛋白A(FETUA_BOVIN)醣化作用位置為N99、N156、N176、S271、T280、S282、S341(http：//www.uniprot.org/uniprot/P12763)，而牛胎球蛋白B(FETUB_BOVIN)為N37、N137、N271(http：//www.uniprot.org/uniprot/Q58D62)。
2將每一聚醣之分子量提交至GlycoWorkBench34且隨後進行手動指派以決定聚醣之組成。醣類之單一字母代碼係定義如下，H：六碳醣、N：HexNAc、F：去氧六碳醣、P：五碳醣，及S：唾液酸。
3於MS鑑定前驅離子及其電荷狀態以進行後續的HCD MS2。
4選取HCD MS2之訊號及其類型(醣胜肽Y1離子或胜肽離子)以進行後續的CID-MS3。
5每一醣胜肽之CID-MS3質譜之最高Mascot搜尋評分。
6依據XIC藉由利用MASIC35確定尖峰面積。
7利用AGSY方法於牛胎球蛋白B鑑定出一新穎O-型醣化作用位置。
1習知之人類α1-酸醣蛋白(A1AG1_HUMAN)醣化作用位置為N33、N56、N72、N93及N103(http：//www.uniprot.org/uniprot/P02763)。
1習知之山葵過氧化酶(PER1A_ARMRU)醣化作用位置為N43、N87、N188、N216、N228、N244、N285及N298(http：//www.umiprot.org/uniprot/P00433)。
2利用AGSY方法鑑定出一新穎N-型醣化作用位置。
實施例2
牛胎球蛋白A係藉由trap HCD予以分段，且該具有附加一HexNAc之離子(Y1離子)之胜肽可於MS2質譜中有效產生，並隨即提交以取得額外之MS3質譜。以Mascot或Sequest進行質量數據分析時，該MS2質譜中的核心-胜肽離子可視為具有一HexNAc修飾之胜肽，因此關於該胜肽之胺基酸序列資訊，可由其MS3質譜決定。聚醣部分之部分結構係由trapHCD MS2質譜及附加一HEXNAc-HEX-Ner5Ac聚醣之O-鏈結醣胜肽TPIVGQPSIPGGPVR之胜肽離子之CID-MS3質譜所確定。因此，牛胎球蛋白A之N-與O-型醣胜肽可被成功鑑定，包括其聚醣部分及核心胜肽序列。以同樣方式分析牛胎球蛋白B。該牛胎球蛋白A與B之結果係列於表4。
綜上所述，本發明實施例示明牛胎球蛋白之N-與O-型醣胜肽之鑑定能力，不僅是核心-胜肽之胺基酸序列同時還有聚醣部分。鑑於上述，本發明提供一種用於醣胜肽序列決定之自動化及快速方法。

Claims (11)

  1. 一種藉由配備阱高能量碰撞解離(trap higher-energy collisional dissociation，trap HCD)之質譜儀以用於胺基酸定序及醣基鑑定之雙功能方法，其步驟包含：- 將醣胜肽分段；- 藉由該阱高能量碰撞解離產生具有附加一N-乙醯胺基六碳醣(HexNAc)之離子(Y1離子)之胜肽；- 藉由該阱高能量碰撞解離產生該醣胜肽之質譜(trap HCD-MS2)；- 藉由一離子活化技術產生該Y1離子之質譜(MS3)；- 收集數據，包括一全質量範圍質譜掃描、一阱高能量碰撞解離誘導之MS2掃描(Trap HCD-MS2)，以決定該醣胜肽之聚醣部分之結構，及一MS3掃描(MS3)，以決定該醣胜肽之胜肽部分之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其係實施於單一質譜運行。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該離子活化技術係選自於由碰撞誘導解離(collision induced dissociation，CID)、高能量碰撞解離(HCD)、紅外線多光子解離(infrared multi-photon dissociation，IRMPD)、電子轉移解離(electron-transfer dissociation，ETD)及紫外光(ultraviolet，UV)與真空紫外光(vacuum ultraviolet，VUV)多光子解離所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該離子活化技術為CID。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其係用於鑑定N-鏈結聚醣與O-鏈結聚 醣。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含可被用於醣胜肽定量之同位素標定(isotopic labeling)及等壓標定(isobaric labeling)。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該離子係以二種離子化源誘導，包括一電噴灑離子化(electrospray ionization，ESI)及一基質輔助雷射脫附/離子化(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其係進行利用Y1離子用於自動化定序一醣胜肽。
  9. 一種用於進行如申請專利範圍第1至8項任一項定義之方法之雙功能離子阱質譜儀，其包含：- 二種離子化源，包括電噴灑離子化(ESI)及基質輔助雷射脫附/離子化(MALDI)，其中該二種離子化源以一通道相連接；- 二種質譜分析儀，包括一3D四極柱離子阱(quadruple ion trap，QIT)及線性離子阱(linear ion tap，LIT)，其中該QIT為用於產生Y1離子之阱高能量碰撞解離(trap HCD)，並產生一醣胜肽(MS2)質譜，且該LIT為用於產生Y1離子質譜(MS3)之質譜儀；- 配備轉換倍增電極(conversion dynode)及甬道(channeltron)之偵測器，用於取得全質量範圍掃描(MS)、阱高能量碰撞解離誘導掃描(HCD-MS2)及MS3掃描(MS3)；- 一進樣盤，其安裝於腔室中以形成真空MALDI，其經由離子導(ion guide)連接至該QIT；- 一脈衝閥作為二個離子阱之間的電噴灑源介面以用於控制由該 QIT至該LIT之離子；其中該MALDI、二個離子阱及偵測器係於真空系統中建置。
  10. 如申請專利範圍第9項之雙功能離子阱質譜儀，其中該Y1離子(MS3)之質譜係以選自於由碰撞誘導解離(CID)、高能量碰撞解離(HCD)、紅外線多光子解離(IRMPD)、電子轉移解離(ETD)，及UV與VUV多光子解離所組成之群組之離子活化技術所誘導。
  11. 如申請專利範圍第10項之雙功能離子阱質譜儀，其中該MS3係以CID誘導。
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