CN104530221B - 一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法 - Google Patents
一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104530221B CN104530221B CN201410780852.7A CN201410780852A CN104530221B CN 104530221 B CN104530221 B CN 104530221B CN 201410780852 A CN201410780852 A CN 201410780852A CN 104530221 B CN104530221 B CN 104530221B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction
- phthalate compound
- adds
- phthalate
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法,以4‑硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原和酰胺化反应合成邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原,再将邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原与牛血清白蛋白偶联,即得到所述的邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原。采用本发明,制备了能够同时识别8种PAEs的广谱特异性抗体,抗体的通用性好、灵敏度高。本发明获得的抗原和抗体可用于发展酶联免疫吸附和生物传感分析技术,并应用于实际环境中多种PAEs的快速灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及人工抗原,具体指一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法,属于生物化工技术领域。
背景技术
邻苯二甲酸酯类化合物(phthalate esters, PAEs)又名酞酸酯,是邻苯二甲酸的酯化衍生物,为一类常用增塑剂,可提高塑料制品的塑性和强度。PAEs为无色油状粘稠液体,易溶于有机溶剂和类酯,难溶于水,不易挥发。在塑料制品中增塑剂与塑料分子的相溶性较好,两者间没有严密的化学结合键,而是由氢键或范德华力连接,彼此保持各自独立的化学性质。PAEs是一类环境内分泌干扰物质,含有较弱的雌激素成分,可通过呼吸、摄食和皮肤接触进入动物和人体内,具有致突变、致畸和癌细胞增殖等危害。
目前,国内外检测PAEs的主要方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)等。仪器分析法的样品前处理步骤复杂、操作繁琐,导致检测成本高、周期长,无法满足批量样品的快速筛选和现场检测的实际需要。ELISA法属于免疫分析技术,具有较高的灵敏度和特异性,检测时对样品的纯度要求低,操作简便、快捷,在现场筛选和大量样本的快速检测中具有独特的优势。
PAEs不能直接作为抗原与抗体产生特异性反应,发展免疫分析技术的关键在于制备能诱导动物产生特定抗体的人工抗原。目前,最常见的方法是在邻苯二甲酸酯的苯环上引入活性氨基,再通过重氮法或戊二醛法与载体蛋白偶联,暴露出PAEs的侧链基团为抗原决定簇,免疫动物获得完全抗原。但是,这些方法获得的抗原只与特定PAEs产生较好的抑制效果,交叉反应率较低,得到的抗体无法应用于PAEs的通用检测。
发明内容
针对目前PAEs抗原合成技术的缺陷和不足,本发明的目的在于提供一种PAEs通用人工抗原的合成方法,本方法合成的抗原能够制备出通用的、广谱的、可用于多种PAEs检测的多克隆抗体。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法,以4-硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原和酰胺化反应合成邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原,再将邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原与牛血清白蛋白偶联,即得到所述的邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原。
其中,以4-硝基邻苯二甲酸合成邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原的步骤如下,
① 在反应瓶中加入甲醇30 mL,冰浴冷却,用恒压滴液漏斗滴加9.52 g SOCl2,撤去冰浴,在室温下搅拌1小时,加入4.32 g 4-硝基邻苯二甲酸,转入70℃油浴加热回流;反应完毕,于50℃水浴旋蒸近干,加入20 mL乙酸乙酯和10 mL蒸馏水,用饱和NaHCO3溶液调节pH至7~8,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,每次10 mL,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,得到淡黄色粉末状固体,该淡黄色粉末状固体为4-硝基邻苯二甲酸二甲酯;
② 在反应瓶中加入3.35 g 4-硝基邻苯二甲酸二甲酯、7.29 g锌粉、1.498 gNH4Cl、甲醇30 mL,75℃恒温水浴回流反应,薄层色谱TLC监测至反应结束;趁热抽滤,除去锌粉,减压蒸馏去溶剂,加入10 mL蒸馏水,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,每次10 mL,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,加入石油醚和乙酸乙酯按体积比1:8构成的混合溶剂,搅拌,析出固体,抽滤,得到橘黄色粉末状固体,该橘黄色粉末状固体为4-氨基邻苯二甲酸二甲酯;
③ 在4-氧代戊酰氯中加入适量干燥的二氯甲烷,搅拌溶解,加入0.201 g 4-氨基邻苯二甲酸二甲酯,溶解,用恒压滴液漏斗缓慢滴加至反应瓶,再加入0.304 g三乙胺,室温下搅拌,TLC监测反应进程;反应完毕,加入10 mL蒸馏水,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,得到粗产品;用乙酸乙酯重结晶,得到产物A,产物A命名为4-(4-氧代戊酰胺基)邻苯二甲酸甲酯;
④ 在反应瓶中加入0.131 g羧甲基羟胺半盐酸盐、2.5 mL吡啶和2.5 mL甲醇,完全溶解后,再加入0.153 g产物A,室温下搅拌,TLC监测反应进程;反应完毕,旋蒸去溶剂,加入10 mL蒸馏水,用稀HCl调节pH至6~7,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,得到黄色油状物,该黄色油状物即为邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原。
以邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联得到邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的过程为,
称取1 mmol邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原,溶于4 mL N, N-二甲基甲酰胺DMF,加入2 mmol N-羟基丁二酰亚胺NHS、2 mmol二环己基碳二亚胺DCCI的盐酸盐,在室温下磁力搅拌反应24 h;反应完毕,3000 r/min离心分离10 min,弃去沉淀,上清液为反应液I;另取79 mg BSA溶于pH 7.4的7 mL磷酸盐缓冲液PBS中,此为反应液II;在室温条件下,将反应液I缓慢滴加到反应液II中,4℃磁力搅拌反应过夜;次日将反应液置于经处理的透析袋内,PBS中透析3天,除去小分子成分,初步纯化偶联蛋白,冷冻干燥,分装,在-20℃保存备用。
相比现有技术,本发明具有如下有益效果:
用本发明合成的抗原免疫新西兰大白兔,获得的抗血清效价为25600,对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)的半数抑制浓度(IC50)范围为17.12~102.57 ng/mL,检测限(LOD)为0.012~0.042 ng/mL,获得的抗体与其它7种PAEs的交叉反应率为16.69%~83.84%(DMP为100%)。采用本发明,制备了能够同时识别8种PAEs的广谱特异性抗体,抗体的通用性好、灵敏度高。本发明获得的抗原和抗体可用于发展酶联免疫吸附和生物传感分析技术,并应用于实际环境中多种PAEs的快速灵敏检测。
附图说明
图1-本发明PAEs通用抗原的合成路线图。
图2-PAEs通用人工抗原的紫外扫描图谱。
图3-抗体的效价曲线图。
图4-抗体的方阵滴定图。
图5-DMP的标准竞争抑制曲线。
具体实施方式
目前,国内外主要集中在针对单一PAEs的人工抗原合成与抗体制备研究,未见可检测多种PAEs的全抗原合成与抗体制备的报道。本发明根据PAEs的结构特点,旨在改进半抗原的合成路线,以4-硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原和酰胺化反应,合成PAEs的通用半抗原,暴露出该类化合物共同的苯环和部分侧链基团,作为抗原决定簇,再将半抗原与载体蛋白偶联,形成可抑制多种PAEs的人工抗原。这种全新的抗原设计路线与合成方法,能够为研发环境中多种PAEs的快速灵敏检测技术奠定基础。
本发明PAEs通用抗原的合成路线见图1,其具体步骤为,
1)PAEs通用半抗原的制备;
① 在100 mL圆底烧瓶中,加入30 mL甲醇,冰浴冷却,用恒压滴液漏斗滴加9.52 g(80 mmo1)SOCl2,撤去冰浴,在室温下搅拌1小时,加入4.32 g(20 mmo1)4-硝基邻苯二甲酸,转入70℃油浴加热回流。反应完毕,于50℃水浴旋蒸近干,加入20 mL乙酸乙酯、10 mL蒸馏水,用饱和NaHCO3溶液调节pH至7~8,30 mL乙酸乙酯分3次萃取(每次10 mL,下同),合并有机相,无水Na2SO4干燥。旋蒸,得到淡黄色粉末状固体,即为4-硝基邻苯二甲酸二甲酯,收率为97.7%,熔点为72.8~73.7℃。
② 在100 mL圆底烧瓶中,加入3.35 g(14 mmo1)4-硝基邻苯二甲酸二甲酯、7.29g(112 mmo1)锌粉、1.498 g(28 mmo1)NH4Cl、30 mL甲醇,75℃恒温水浴回流反应,薄层色谱(TLC)监测至反应结束。趁热抽滤,除去锌粉,减压蒸馏去溶剂,加入10 mL蒸馏水,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,加入石油醚:乙酸乙酯混合溶剂(1:8, V/V),搅拌,析出固体,抽滤,得到橘黄色粉末状固体,即为4-氨基邻苯二甲酸二甲酯,收率为81%,熔点为79.1~80.3℃。
③ 在4-氧代戊酰氯中加入适量干燥的二氯甲烷,搅拌溶解,加入0.201 g(1mmol)4-氨基邻苯二甲酸二甲酯,溶解,用恒压滴液漏斗缓慢滴加至反应瓶,再加入0.304 g(3 mmol)三乙胺,室温下搅拌,TLC监测反应进程。反应完成后,加入10 mL蒸馏水,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,合并有机相,无水Na2SO4干燥。旋蒸,得到粗产品;用乙酸乙酯重结晶,得到纯产物A,命名为4-(4-氧代戊酰胺基)邻苯二甲酸甲酯,收率为79%,熔点为147~149℃。
④ 在100 mL反应瓶中,加入0.131 g(0.6 mmol)羧甲基羟胺半盐酸盐、2.5 mL吡啶和2.5 mL甲醇,完全溶解后,再加入0.153 g(0.5 mmol)化合物A,室温下搅拌,TLC监测反应进程。反应完成后,旋蒸去溶剂,加入10 mL蒸馏水,用稀HCl调节pH至6~7,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,得到黄色油状物,即为PAEs通用半抗原,收率为92%。
本发明PAEs通用半抗原的分子结构式为:
2)PAEs通用人工抗原的制备;
采用活性酯法,将合成的半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备相应的人工抗原和包被原。准确称取0.380 g(1 mmol)半抗原,溶于4 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF),加入0.23 g(2 mmol)N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、0.383 g(2 mmol)二环己基碳二亚胺(DCCI)的盐酸盐,在室温下磁力搅拌反应24 h。反应完毕,3000 r/min离心分离10min,弃去沉淀,上清液为反应液I。另取79 mg BSA溶于7 mL磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)中,此为反应液II。在室温条件下,将反应液I缓慢滴加到反应液II中,4℃磁力搅拌反应过夜。次日将反应液置于经处理的透析袋内,PBS中透析3天,除去小分子成分,初步纯化偶联蛋白,冷冻干燥,分装,在-20℃保存备用。包被原(半抗原-OVA)的合成方法与人工抗原类似,仅改变载体蛋白。
3)PAEs通用人工抗原的鉴定;
图2为本发明合成的PAEs通用人工抗原的紫外扫描图谱。本发明PAEs通用人工抗原的鉴定:透析人工抗原后的蛋白液中同时存在蛋白质、蛋白质-蛋白质偶联物、半抗原-蛋白质偶联物,采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度,紫外光谱扫描法鉴定人工抗原,并测定偶联物中半抗原与载体蛋白的结合比,即偶联比。具体过程如下:
① 人工抗原的蛋白含量测定:
配制0.25 mg/mL的BSA标准溶液,用PBS稀释至0.025~0.25 mg/mL,加入5 mL考马斯亮蓝溶液,充分振荡混匀2 min,以无蛋白溶液为空白,测定595 nm处的吸光值(OD)。将人工抗原稀释至标准曲线的浓度范围,取1.00 mL稀释液与考马斯亮蓝溶液反应,测定其OD值。配制1.00 mg/mL的OVA标准溶液,用PBS稀释至浓度为0.05~0.35 mg/mL,其余步骤同上。
② 人工抗原的偶联比测定:
采用紫外分光光度法测定人工抗原的OD值,计算偶联比。将半抗原、人工抗原和载体蛋白分别配成质量浓度为0.02、0.3、0.3 mg/mL的溶液,在波长220~400 nm扫描,获得紫外吸收光谱,选择在274 nm处测定OD值。
4)PAEs抗血清的制备;
选用质量为1.5~2 kg的雄性新西兰大白兔5只,免疫前饲养1周,耳缘静脉采血,获得阴性血清。每种人工抗原免疫2只兔子,另1只为空白对照。将制备的完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化,使抗原浓度为0.5 mg/mL。采用背部皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式,每只兔子注射1 mL抗原与弗氏完全佐剂的混合物。2周后,用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再次进行注射,每只兔子注射1 mL;再过2周后,同上次注射。在第2次加强免疫后第8天耳缘静脉采血,测定抗血清效价。当效价稳定后,用等体积生理盐水稀释2倍量抗原,耳缘静脉注射,进行最后一次冲击免疫。1周后心脏采血,分离抗血清(室温下静置30min,4℃冰箱中过夜后,4000 r/min离心15 min)。采用辛酸-(NH4)2SO4沉淀法纯化抗血清,透析后冷冻干燥成粉末,-20℃下保存备用。
5)PAEs抗血清的测定:
① 采用间接ELISA法检测血清效价,具体操作步骤为;
包被:用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(CBS, pH 9.6)将包被抗原稀释成不同浓度,包被96孔酶标板,每孔100 μL,4℃孵育过夜。
洗涤:将板内溶液倾去,甩干,并用洗涤液洗涤3次,每次3 min。
封闭:拍干后,每孔加入200 μL封闭液,37℃反应1 h,洗涤,烘干备用。
加样:加入经PBS稀释的一系列浓度的抗血清,每孔100 μL,37℃反应1 h,洗涤3次;再加入经PBS稀释2000倍的羊抗兔IgG-HRP溶液,每孔100 μL,37℃反应1 h,洗涤3次。
显色:将酶标板取出,充分洗涤,每孔加入100 μL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺(TMB)显色液,37℃避光反应15 min。
终止和测定:每孔加入50 μL浓度为2 mmol/L的H2SO4溶液,终止反应。用酶标仪测定各孔的OD450值。
结果:以OD450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍(即P/N ?? 2.1)所对应的血清最高稀释倍数为血清效价。图3为本发明抗体的效价曲线图。
② 最低检测限、半数抑制浓度和特异性;
采用上述间接ELISA方阵滴定法,确定包被原和抗体的工作浓度,以OD450在1.0附近所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度,图4为抗体的方阵滴定图。具体操作步骤为:
包被:将包被原用CBS稀释至最适工作浓度,100 μL/孔,4℃孵育过夜。
洗涤和封闭:方法和操作同上。
配制PAEs标准溶液:将DMP、DEP、DBP、DnOP、DEHP、BBP、DNP、DCHP标准品用甲醇溶液配制成1 mg/mL的贮备溶液。加样前,再用0.01 mol·L-1的PBS(pH 7.4)稀释至0.01、0.1、1、1、100、1000 ng/mL的系列标准溶液。
加样:每孔加入50 μL稀释的DMP、DEP、DBP、DnOP、DEHP、BBP、DNP、DCHP系列标准溶液,再加入100 μL最适稀释倍数的抗血清,37℃反应1 h。充分洗涤,加入1:2000稀释的羊抗兔IgG-HRP溶液,每孔100 μL,37℃反应1 h。
显色反应:取出酶标板,充分洗涤,每孔加入100 μL的TMB显色液,37℃避光反应15min。
终止和测定:每孔加入50 μL浓度为2 mmol/L的H2SO4溶液,终止反应,用酶标仪测定各孔的OD450值。
数据处理:以空白OD值为B 0,相应浓度PAEs抑制时的OD值为B,以抑制率(B/B 0)为纵坐标、PAEs浓度的对数值为横坐标,绘制标准抑制曲线(见图5),计算半数抑制浓度(IC50值),判定抗血清对8种PAEs是否具有特异性。结果显示,5次免疫后,兔抗血清效价为25600,对DMP、DEP、DBP、DnOP、DEHP、BBP、DNP、DCHP的IC50值范围为17.12~102.57 ng/mL,检测限为0.012~0.042 ng/mL,获得的抗体与其它7种PAEs的交叉反应率为16.69%~83.84%(DMP为100%),产生的抗体通用性好、灵敏度高。
本发明的上述实例仅仅是为说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化和变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (2)
1.一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法,其特征在于:以4-硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原和酰胺化反应合成邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原,再将邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原与牛血清白蛋白偶联,即得到所述的邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原;
以4-硝基邻苯二甲酸合成邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原的步骤如下,
① 在反应瓶中加入甲醇30 mL,冰浴冷却,用恒压滴液漏斗滴加9.52 g SOCl2,撤去冰浴,在室温下搅拌1小时,加入4.32 g 4-硝基邻苯二甲酸,转入70℃油浴加热回流;反应完毕,于50℃水浴旋蒸近干,加入20 mL乙酸乙酯和10 mL蒸馏水,用饱和NaHCO3溶液调节pH至7~8,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,每次10 mL,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,得到淡黄色粉末状固体,该淡黄色粉末状固体为4-硝基邻苯二甲酸二甲酯;
② 在反应瓶中加入3.35 g 4-硝基邻苯二甲酸二甲酯、7.29 g锌粉、1.498 g NH4Cl、甲醇30 mL,75℃恒温水浴回流反应,薄层色谱TLC监测至反应结束;趁热抽滤,除去锌粉,减压蒸馏去溶剂,加入10 mL蒸馏水,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,每次10 mL,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,加入石油醚和乙酸乙酯按体积比1:8构成的混合溶剂,搅拌,析出固体,抽滤,得到橘黄色粉末状固体,该橘黄色粉末状固体为4-氨基邻苯二甲酸二甲酯;
③ 在4-氧代戊酰氯中加入适量干燥的二氯甲烷,搅拌溶解,加入0.201 g 4-氨基邻苯二甲酸二甲酯,溶解,用恒压滴液漏斗缓慢滴加至反应瓶,再加入0.304 g三乙胺,室温下搅拌,TLC监测反应进程;反应完毕,加入10 mL蒸馏水,30 mL乙酸乙酯分3次萃取,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,得到粗产品;用乙酸乙酯重结晶,得到产物A,产物A命名为4-(4-氧代戊酰胺基)邻苯二甲酸甲酯;
④ 在反应瓶中加入0.131 g羧甲基羟胺半盐酸盐、2.5 mL吡啶和2.5 mL甲醇,完全溶解后,再加入0.153 g产物A,室温下搅拌,TLC监测反应进程;反应完毕,旋蒸去溶剂,加入10mL蒸馏水,用稀HCl调节pH至6~7,合并有机相,无水Na2SO4干燥,旋蒸,得到黄色油状物,该黄色油状物即为邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原。
2.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法,其特征在于:邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联得到邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的过程为,
称取1 mmol邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原,溶于4 mL N, N-二甲基甲酰胺DMF,加入2 mmol N-羟基丁二酰亚胺NHS、2 mmol二环己基碳二亚胺DCCI的盐酸盐,在室温下磁力搅拌反应24 h;反应完毕,3000 r/min离心分离10 min,弃去沉淀,上清液为反应液I;另取79 mg BSA溶于pH 7.4的7 mL磷酸盐缓冲液PBS中,此为反应液II;在室温条件下,将反应液I缓慢滴加到反应液II中,4℃磁力搅拌反应过夜;次日将反应液置于经处理的透析袋内,PBS中透析3天,除去小分子成分,初步纯化偶联蛋白,冷冻干燥,分装,在-20℃保存备用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410780852.7A CN104530221B (zh) | 2014-12-17 | 2014-12-17 | 一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410780852.7A CN104530221B (zh) | 2014-12-17 | 2014-12-17 | 一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104530221A CN104530221A (zh) | 2015-04-22 |
CN104530221B true CN104530221B (zh) | 2017-09-01 |
Family
ID=52845883
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410780852.7A Expired - Fee Related CN104530221B (zh) | 2014-12-17 | 2014-12-17 | 一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104530221B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085297A (zh) * | 2015-08-20 | 2015-11-25 | 上海交通大学 | 邻苯二甲酸二甲酯半抗原及其制备方法和用途 |
CN110317263B (zh) * | 2019-07-04 | 2021-03-23 | 华北电力大学 | 基于同源建模的高效检测PAEs的牛血清蛋白改造方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103204925A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-07-17 | 江南大学 | 一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法 |
CN103698504A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-02 | 华南农业大学 | 邻苯二甲酸酯类总量elisa酶联免疫检测试剂盒及其使用方法 |
CN104130144A (zh) * | 2014-07-30 | 2014-11-05 | 新疆农垦科学院 | 酞酸酯类塑化剂通用半抗原、抗原的合成方法及应用 |
-
2014
- 2014-12-17 CN CN201410780852.7A patent/CN104530221B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103204925A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-07-17 | 江南大学 | 一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法 |
CN103698504A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-02 | 华南农业大学 | 邻苯二甲酸酯类总量elisa酶联免疫检测试剂盒及其使用方法 |
CN104130144A (zh) * | 2014-07-30 | 2014-11-05 | 新疆农垦科学院 | 酞酸酯类塑化剂通用半抗原、抗原的合成方法及应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Development of a time-resolved fluoroimmunoassay for phthalate esters in water;A. Ius等;《Fresenius J Anal Chem》;19930831;第345卷(第8期);第589页右栏第3-5段,第590页左栏1-2段,图1,表1,第591页左栏第3段、右栏第1-2段 * |
半抗原的设计、修饰及人工抗原的制备;宋娟等;《分析化学(FENXIHUAXUE)评述与进展》;20100831;第38卷(第8期);第1211-1218页 * |
小分子半抗原抗体制备技术的研究进展;晁博等;《中国兽医科学》;20061017;第36卷(第9期);第757-762页 * |
环境荷尔蒙邻苯二甲酸二甲酯的人工全抗原合成与表征;庄惠生等;《化学试剂》;20050928;第27卷(第9期);第559页右栏第1段,第560页左栏第1.3节 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104530221A (zh) | 2015-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104004719B (zh) | 一株邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
TR201911272T4 (tr) | Paliperidon haptenleri. | |
CN104017070A (zh) | 一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法 | |
CN105548553B (zh) | 快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用 | |
CN102206270B (zh) | 石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
CN103588661A (zh) | 尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备 | |
CN104530221B (zh) | 一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法 | |
CN105503632A (zh) | 一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原的制备方法及其应用 | |
CN107014993B (zh) | 一种检测动物源性食品中头孢类抗生素的间接竞争elisa试剂盒及其应用 | |
CN109265401A (zh) | 一种异菌脲半抗原与抗原的制备方法及应用 | |
CN105838681A (zh) | 一株抗地塞米松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株c3及其应用 | |
CN105624119B (zh) | 杂交瘤细胞株yqqd8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体 | |
CN108517317A (zh) | 一种抗氯丙那林单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN104710488B (zh) | 一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法 | |
CN112574956B (zh) | 一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN104383889B (zh) | 一种二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用 | |
CN107652343A (zh) | 化合物、缀合物、试剂盒及其在检测雌醇中的用途 | |
CN109307761A (zh) | 一种检测糠氨酸的间接竞争elisa方法 | |
CN102627628B (zh) | 氯虫苯甲酰胺抗原及其制备方法与应用 | |
CN109097338A (zh) | 一种分泌硝呋索尔残留标志物单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
CN111763658A (zh) | 一株分泌抗二硝托胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN108456661A (zh) | 一株抗苯并芘特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN110343669B (zh) | 一株分泌抗三氯苯达唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株dnc及其应用 | |
CN109438424B (zh) | 利巴韦林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 | |
CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170901 Termination date: 20201217 |